Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Количественная гистохимия Ca-зависимой АТФ-азы миозина и некоторых ферментов энергетического метаболизма скелетного мышечного волокна при адаптации к изменениям условий функционирования

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Количественная гистохимия Ca-зависимой АТФ-азы миозина и некоторых ферментов энергетического метаболизма скелетного мышечного волокна при адаптации к изменениям условий функционирования"

На правах рукописи

Гутова Фатима Заурбиевна

Количественная гистохимия Са-зависимой АТФ-азы миозина и некоторых ферментов энергетического метаболизма скелетного мышечного волокна при адаптации к изменениям условий функционирования.

03 00 25 - Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2007 год -

003161034

Работа выполнена кафедре гистологии,цитологии и эмбриологии в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им И М Сеченова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ Член-корр РАМН, доктор медицинских наук, профессор С Л Кузнецов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ Академик РАЕН,доктор медицинских наук, профессор Г Г Автандилов Член-корреспондент РАЕН,доктор медицинских наук, профессор Т К Дубовая

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Московский государственный медико-стоматологический Университет

Защита состоится « £>А>ТЛ » 2007 года в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 212 203 08 при Российском университете Дружбы Народов (117198, Россия, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 8)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета Дружбы Народов (117198, Россия, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6)

Автореферат разослан «¿¿>у> « С&^С^тЛ » 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Саврова О Б

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Система энергообеспечения традиционно считается одним из факторов, лимитирующих проявления мышечной выносливости, изменение которой является закономерным и постоянно выявляемым следствием пребывания в условиях повышенной или пониженной двигательной активности Обычно этот процесс связывают с изменением количества соответствующих энергетических ферментов Однако, эти изменения часто не согласуются друг с другом, а для некоторых ферментов вообще отсутствуют Классические биохимические подходы не позволяют объяснить это явление, ведь свойства каждого фермента in situ (т е в клетке) зависят во многом от рН цитоплазмы, состояния структур, определяющих микроокружение фермента (например - структуры внутренней мембраны митохондрий) и т д , которые постоянно меняются в процессе функционирования клетки

Предшествующие исследования (Шенкман БС, Кузнецов С Л, 1994, Shenkman В S et al, 1994) показали, что даже такие функционально тесно связанные между собой ферменты, как сукцинатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа и изоцитратдегидрогеназа при изменении функционального состояния скелетного мышечного волокна изменяют свою активность (оцененную гистохимически) несинхронно и в разной степени, что несомненно требует дополнительных исследований

Цель и задачи исследования.

Цель работы состоит в исследовании количественных параметров активности АТФ-азы миозина и некоторых ферментов энергетического метаболизма в различных типах скелетного мышечного в зависимости от показателей рН и изменении этих параметров при адаптации к изменениям условий функционирования

Для достижения цели предполагается решить следующие задачи - изучить изменения количественных параметров изоферментной активности по показателям окрашивания АТФ-азы миозина при различных показателях рН преинкубационной среды,

изучить координацию активности различных пулов изоферментов АТФ-зы миозина в одном и том же волокне

изучить изменение активности ферментов энергетического метаболизма и различных пулов АТФ-азы миозина волокна в различных условиях активности

изучить динамику изменения активности НАДН и СДГ в зависимости от различных значений рН инкубационной среды

изучить динамику изменения рН-чувствительности НАДН и СДГ в различных типах скелетных мышечных волокон в зависимости от условий их функционирования

Научная новизна работы.

В работе изучена ранее неисследованная характеристика метаболизма скелетного мышечного волокна - рН-чувствительность АТФ-азы миозина и таких важных энергетических ферментов, как НАДН тетразолий редуктаза и сукцинатдегидрогеназа Полученные данные позволяют дополнить существующее представление о механизмах адаптации мышечных волокон к изменяющимся условиям функционирования

Предложена методика количественных исследований серийных

срезов скелетных мышечных волокон, позволяющая исследовать рН -чувствительность ферментов m situ

Впервые показано, что различные типы (изоферменты) АТФ-азы существуют одновременно в каждом волокне, составляя общий пул фермента, соотношение их количества в пределах этого пула и определяет свойства волокна, позволяющие отнести его к тому или иному типу Это состояние видимо генетически детерминировано

Доказано, что рН внутренней среды скелетного мышечного волокна является существенным фактором, оказывающим влияние на работу ферментов энергетического метаболизма, вне зависимости от их количества

Впервые показано, что диапазон рН-чувствительности ферментов (по крайней мере в отношении НАДН и СДГ) меняется в процессе функционирования волокна Более короткие нагрузки в большей степени ухудшают условия работы СДГ, более длительные - НАДН В условиях длительных хронических нагрузок (при тренировке), связанных с закислением внутренней среды наблюдается сдвиг рН-чувствительности волокон обоих типов, свидетельствующий о приспособлении волокон к функционированию в более кислой среде

Практическая значимость.

Данные о рН-чувствительности ферментов скелетного мышечного волокна и разработанная методика, позволяющая регистрировать изменения этого параметра, позволяет существенно расширить представления о механизмах адаптации скелетной мышечной ткани в условиях изменения ее функционирования

Полученные данные смогут помочь при разработке методик тренировочного процесса и контроля за их ходом у спортсменов, методов профилактики снижения функциональной нагрузки мышечной системы у человека (как у больных, так при особых видах деятельности)

Апробация и внедрение в практику работы.

Материалы диссертации доложены на на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 80-летию проф Первухина, МГАФК, М, 1-2 ноября 2001 г, на VI Конгрессе Международной ассоциации Морфологов, г Уфа, 2002 год, Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической медицины», посвященной 200-летию МИД России, Москва, 2002 г, международной научной конференции «Актуальные проблемы морфологии и клинической медицины», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Н А Курдюмова, Нальчик, 2003 г,

Связь задач исследования с планами научных исследований .

Работа является частью проводимых на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии ММА им И М Сеченова исследований по теме Влияние антропогенных факторов внешней среды на изменение реактивности органов и тканей» (№ госрегистрации 01970007196)

Публикация результатов исследования.

Результаты исследования опубликованы в 4-х печатных работах Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы Библиографический указатель включает 85 источников на русском и английском языках Работа изложена на 92-х страницах и содержит 13 рисунков и 10 таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Материалом для исследования послужила скелетная мышечная ткань мышц конечностей животных и человека

Способы получения ткани и ее предварительная обработка определялись требованиями гистохимии и необходимостью в дальнейшем производить количественную оценку изменений

Животные Белых беспородных крыс-самцов забивали декапитацией при эфирном наркозе, материал (миокард и двуглавые мышцы бедра) быстро замораживали в жидком азоте, в котором они сохраниялись при необходимости Свежие срезы толщиной 10 мкм размещали на предметном стекле и окрашивали

Человек Кусочки скелетной мышечной ткани латеральной головки четырехглавой мышцы бедра получали методом биопсии иглой под местной анестезией по Бергстрему (Bergstrom J 1962) Биопсии производились при добровольном согласии испытуемых в соответствии с рекомендациями Экспертного совета по медицине ВАК Минобрнауки РФ «О порядке проведения биомедицинских исследований у человека), опубликованных в журнале «Бюллетень ВАК», № 3, 2002 год, стр 73-76 После произведения манипуляции ни в одном из случаев не было зарегистрировано никаких осложнений

После получения кусочки быстро замораживали в жидком азоте и, при необходимости, хранились в нем

Для приготовления срезов образцы ткани переносили в криостат и приготавливали серийные срезы толщиной 10 мкм Контроль за толщиной срезов производился с помощью интерференционного микроскопа "Интерфакс" фирмы К Цейс

Методы исследования I Гистохимические методики

1 Выявление зависимости Са-зависимой АТФ-азы с использованием преинкубационных сред с pH 4,0 4,3,4,9 и 10,4

2 Выявление активности дегидрогеназ (НАДН-тетразолий редуктазы -НАДН и сукцинатдегидрогеназы - СДГ) (Лойда и др , 1982)

II Морфометрия

Приготовлялись рисунки, полученные зарисовкой препаратов окрашенных на Са-зависимую АТФ-азу миозина с помощью рисовального микроскопа Рисунки в дальнейшем использовались для определения типа волокон по АТФ-азе миозина на других серийных срезах

III Количественная гистохимия

Об активности ферментов судили по величине оптической плотности окрашенного препарата, измеренной с помощью сканирующего цитоспектрофотометра SMP-03 фирмы Оптон Для расчета каждой средней величины производили измерения 50-150 волокон Все данные получены в условных единицах Цитофотометрия осуществлялась одноволновым методом при следующих длинах волн.

1 Для АТФ-азы миозина -550 нм

2 Для дегидрогеназ с использованием HCT - 550 нм (Ковальский, 1978)

Для повышения надежности количественных методов исследования использовали следующие приемы: псе сравниваемые срезы монтировали на одно стекло и окрашивали и заключали одномоментно. Для обеспечения сравниваем ости результатов использовали не абсолютные значения, а относительные величины, полученные при сравнении в каждом случае с контролем (Детлаф, Детлаф,1982). Измерения кыражали в процентах к контролю в том случае, если при расчетах, производимых с абсолютными значениями с использованием критерия Стьюдента различия были статистически достоверны при Р < 0,05 и менее.

Для того, чтобы исследовать изменение различных параметров в одних и тех же волокнах с предварительно определенным фенотипом (по АТФ-азе) в работе применяли технику изучения серийных срезов (Рис. 1.).

Рис, 1. Схематическое изображение методики для определения активности

нескольких ферментов в одном волокне, предварительно тигшррванным по АТФ-азе миозина на серийных срезах.

Блок

замороженного

материала

Серийные срезы,одинаково ориентированные при наклейке йа стекла

НАДН

СДГ

АТФ-аза

АТФ-аза

М и к р о ф о т о м е т р и я (определение активности ферментов в одних и тех же волокнах с предварительно определенным типом по АТФ-азе миозина)

Приготовленные срезы один за другим (стараясь избежать потерь) накладывали па предметные стекла в определенном, строго соблюдаемом положении для того, чтобы облегчить в дальнейшем после окраски

идентификацию выбранного при окраске на АТФ-азу исследуемого участка ткани к микроскопе сравнения (Рис.2).

Рис. 2. Поле зрения микроскопа сравнения при исследовании серийных срезов после выявления ЛТФ - азы миозина (р![-4,3) и IГАДН.

АТФ-аза миозина НАДН-ТР

Участок зарисовывали с обозначением типов волокон и далее осуществляли фотометрию для каждого идентифицированного волокна по всем исследуемым параметрам. Таким образом получали гистохимический профиль волокна па небольшом участке (протяженностью до 20-30 мкм). Такая протяженность по данным литературы обеспечивает гомогенность структур волокна по длине. Метод серийных срезов позволяет оценить гистохимические характеристики отдельного конкретного волокна с предварительно определенным типом. В работе было принято разделение волокон скелетной мышечной ткани на два основных типа: I тип, "медленный", обнаруживающий интенсивную окраску на Са-зависимую ЛТФ-азу миозипа при р1Г преинкубационной среды 4,3 и слабую - при рП 10,4 и И тип, "быстрый" - с противоположными характеристиками. При окраске с использованием промежуточных значений рН преннкубанпонной среды (4.6) II тип подразделяли на ПА тип - "быстрый окислительный", со средней интенсивностью окраски на АТФ-азу миозина при рН 4,3-4,6 и 11В тип - "быстрый гликолитичеекий", со слабой интенсивностью окраски па Са-зависимую АТФ-азу миозина при рН 4,3-4,6.

Метод серийных срезов позволяет оценить гистохимические характеристики отдельного конкретного волокна с предварительно определенным типом. В работе было принято разделение волокон скелетной мышечной ткани па 2 основных типа: 1-Й тип, «медленный», обнаруживающий интенсивную окраску на Са-зависимую АТФ-азу миозина при р! I преинкубац ионной среды 4,3 и слабую - при рН 10,4 и 2-й тип, «быстрый» - с противоположными характеристиками. Методики постановки экспериментов и их особенности:

I .Однократные физические нагрузки осуществлялись у Животных ( крыс ) бегом на тредбане со скоростью 4,3 м/мип в течение 4-х часов. Забор осуществляли сразу после окончания бега и через 4, 8, 12 и 24 часа после окончания эксперимента. Материал хранили в жидком азоте и обрабатывали однОМоменгн® после окончания эксперимента.

2 Повторные физические нагрузки после первой (бег со скоростью 4,3 м/мин в течение 4-х часов) осуществляли бегом с аналогичной скоростью в течение 4-х часов сразу после окончания первой (суммарное время бега - 8 часов), через 4 часа и через 8 часов после окончания первой нагрузки Материал хранили в жидком азоте и обрабатывали одномоментно после окончания эксперимента 2 Генетическую детерминированность исследуемых признаков изучали на примере исследования биопсий скелетной мышечной ткани у трех пар гомозиготных близнецов (общее число наблюдений 6)

4 Длительная тренировка у человека была исследована у спортсменов, занимающихся академической греблей (п=6) спортсмены в течении 6 месяцев выполняли обычный тренировочный и соревновательный режим, принятый для этого вида спорта

Активность ферментов энергетического метаболизма (НАДН- тетразолий редуктазы и сукцинатдегидрогеназы) определяли тетразолиевым методом Серийные срезы окрашивали в стандартных (в соответствии с прописью) инкубационных средах, рН которых регулировалась в пределах от 2 до 12 при приготовлении фосфатных буферных растворов Окраска всех срезов производилась одномоментно

Особенности конкретных экспериментальных условий описаны в методическом разделе работы

Статистическая обработка Обработку количественных данных с учетом вариабельности признаков у отдельных особей для групп с числом наблюдений не менее 3-х (кроме отдельных случаев, когда ограничения были обусловлены условиями эксперимента - у человека), производили с использованием специальных программ для программируемого микрокалькулятора «Электроника» (Кузнецов С Л и др ,1987) Были использованы методы вариационной статистики, достоверность получаемых различий оценивали с помощью критерия Стьюдента Часть вычислений (преимущественно при использовании методов корреляционного, регрессионного анализов) проводили на ЭВМ НР 9825 А

Статистическую обработку и анализ полученных результатов проводили

методами вычисления средней арифметической X и ошибки среднеарифметической х вариационного ряда с использованием для определения достоверности разлиия критерия Стьюдента

методами корреляционного и регрессионного анализа попарносвязанных вариант с расчетом эмпирической формулы, наиболее полно описывающей связь двух процессов (вида у=а+вх, у=1/а+вх, у=а+в1пх, у=а+в/х, у=х/а+вх, у=а+вх+сх2) Выбор вида уравнения, наиболее достоверно описывающего исследуемый процесс производился по величине коэффициента корреляции г (выбиралось то уравнение, при котором значение коэффициента корреляции максимально приближалось к 1) (Кузнецов С Л , 1990)

Результаты собственных исследований и их обсуждение Методические подходы к количественному анализу серийных срезов.

Определение активности ферментов и содержания субстратов в клеточных структурах обычно проводятся в различных клетках (волокнах) одного вида без учета их индивидуальности При большом количестве используемых ферментов и субстратов это означает, что получаемый количественные показатели могут относиться к различным объектам (клеткам или волокнам) При определении одного показателя это не имеет значения, т к дальнейшая статистическая

обработка позволяет получать усредненный показатель для данного вида объекта (клетки) В дальнейшем, полученные средние значения сравниваются и делается вывод о наличии или отсутствии изменения активности исследуемого фермента

Однако возможен случай, когда изучается степень изменения активности одного и того же фермента при различных условиях Возникает вопрос истинное ли получаемое различие, или оно вызвано тем, что в статистической выборке участвовали различные объекты с различными изменениями показателей (математически проведен анализ независимых, несвязанных друг с другом, вариант)

Этот вопрос тем более актуален при изучении динамических процессов в клетке, например при исследовании взаимосвязи изменение активности двух и более ферментов и т д В этом случае часто применяется корреляционный анализ, позволяющий определить и оценить силу связи между явлениями (чаще всего при линейном характере этой связи) Характеристики этой связи можно изучить используя регрессионный анализ, позволяющий получить математическое выражение изучаемой связи (в виде уравнения регрессии) и вычислить числовые выражения элементов уравнения (Кузнецов С Л, 1990)

Корреляционный и регрессионный анализы требует исследования именно связанных переменных в нашем случае - показателей активности ферментов при нескольких значениях рН преинкубационной и инкубационной среды, для которых точно известно, что они измерены в одном объекте в одно и тоже время Обычными гистохимическими методиками и с использованием клетки как объекта, выполнить эти требования практически невозможно Была использована следующая методика

Маркировка волокон производилась визуально, с помощью микроскопа сравнения

Выбирался заметный ориентир (например - участок перимизия, сосуд, характерная группа волокон) и каждое поле зрение зарисовывалось с помощью рисовального аппарата Последовательность действий была следующей

1 Выявление активности АТФ-азы миозина

2 Результаты картирования на рисовальном аппарате

3 Маркировка идентичных волокон на серийных срезах (на среза при окраске на НАДН и СДГ)

Таким образом составлялись «топографические карты», позволяющие маркировать отдельные волокна «Карты» использовали при фотометрии, что позволяло для каждого определенного волокна получать совокупность значений активности выбранных ферментов в одном и том же волокне Полученные данные сводились в таблицы (матрицы) и использовались в дальнейшем для статистического анализа (корреляционного и регрессивного)

Таким образом, скелетное мышечное волокно, при применении выше изложенной методики, является адекватной моделью для исследования рН-чувствительности ферментов в одном и том же волокне с использованием корреляционного и регрессионного анализа

Вторым методическим вопросом, который было необходимо решить для достижения цели и задач данного исследования, стал вопрос о возможности проведения использованных в работе гистохимических методик, требующих определенных значений рН пре- и инкубационных сред, при искусственно созданных различных значениях рН Если в случае с выявлением АТФ-азы миозина такая возможность доказана (именно с помощью использования

преинкубационных сред с различным значением рН производится типирование мышечных волокон), то для дегидрогеназ (НАДН и СДГ) это предположение требовало проверки

Нами было проведено следующее исследование В серийных срезах активность ферментов выявляли с приготовлением инкубационной среды не только с известным оптимумом (7,0-7,2), но и в средах с со значение рН от 3 до 11 Исследование (на примере НАДН показало, что активность фермента изменяется в зависимости отрН инкубационной среды (таблица 1)

Таблица 1 Изменение активности НАДН-ТР (в уел ед) в волокнах скелетной мышечной ткани при экспозиции в инкубационных средах с различным значением рН

рН инкубационной среды

3 5 7 9 11

I 0,006+ 0,240 + 0,488+ 0,164+ 0,003 +

КРЫСА 0,002 0,018 0,020 0,010 0,012

II 0,004+ 0,160+ 0,0 0,260+ 0,02 0,144+ 0,01 0,104+

0,0011 20 0 0 0,012

Были рассчитаны уравнения регрессии для определения количественных показателей этого феномена Оказалось, что интенсивность прохождения реакции (выпадение гранул формазана) находится в зависимости от рН инкубационной среды и может описывается с достаточным уровнем достоверности как уравнением у = а + Ьх + сх2 как у человека, так и у крысы График зависимости при этом имеет классическую куполообразную форму, оптимум рН находится в границах значений 7-7,4

Однако, с достаточным уровнем достоверности этот же процесс может принимать выражение у = а +- Ьх ( г не менее 0,80) (Табл 2, Рис 3)

Таблица 2 Уравнения регрессии, описывающие кривые рН-чувствительности НАДН в волокнах скелетной мышечной ткани

Тип Уравнение значение г рН мин рНмах

волокна

I У = -0,481+0,252х-0,017x2 0,93 2,25 7,4

У = -0,082+0,041х 0,89 2Д

II У = -0,430+0,202х-0,013x2 0,91 2,60 7,8

У = -0,076+0,029х 0,92 2,60

Рис 3 Графики изменения активности НАДН в волокнах мышечной ткани в зависимости от значений рН инкубационной среды

Е

0,6-о,г

0,4" 0,3" 0,2 0 1

0 -1 |-1-1-1-1-1-1-1-1 |-1 -

2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12 рН

Коэффициенты корреляции уравнений у=а+Ьх+сх2 и у=а+вх были максимальными не было выявлено статистически достоверной разницы между ними (величина табличного параметра Z не превышала 1,8, что соответствует Р >0,05) (Кузнецов С Л ,1990)

При этом расчетные значения рНмин (при котором активность фермента не выявлялась) при использовании обоих типов уравнений практически были близки Можно предположить, что возможно использование обоих типов уравнений при нахождении значений рНмин, которые были использованы в работе, тк график вида у=а+вх представляет собой упрощенный вариант левой части графика вида у=а+Ьх+сх2

Исследование рН чувствительности АТФ-азы миозина в скелетных «медленного» и II «быстрого) типов.

Исследование проведено на материале биопсий m v lateralis человека и материале, полученном у крыс из области m b femoris Серийные срезы окрашивали для выявления Са-зависимой АТФ-азы миозина по Guth and Samaha (1970) при различных значениях преинкубационной среды 4,0, 4,3, 4,6, 4,9 и 10,4 Об активности фермента судили по величине оптической плотности, измеренной с помощью сканирующего микрофотометра SMP-03 (Оптон) На срезах, окрашенных при рН=4,3 определяли принадлежность того или иного волокна к "медленному" или "быстрому" типу и прослеживали изменение оптической плотности в каждом из волоком при других значения рН преинкубационной среды Анализировали отдельные значения оптической плотности при одном значении рН, а так же - суммарное значение при рН=4,3 и 10,4 (общая активность АТФ-азы)

Медленные волокна Е t

y=a+bx+cx2

y=a+bx

Быстрые волокна

y=a+bx+cx2

y=a+bx

При окраске на Са-зависимую АТФ-азу миозина при рН преинкубационной среды 4,3 у крысы и человека выявлено в основном два типа волокон темноокрашеннные ("медленные") и слабоокрашенные ("быстрые")

Медленные волокна частично не теряют способность окрашиваться при сдвиге рН в щелочную сторону, а быстрые - при сдвиге в кислую, например - 4,9

Серийный качественный и количественный анализ показал, что при использовании инкубационной среды с рН=10,4 , окраска в волокнах, идентифицированных при рН 4,3 как медленные, появляется, хотя и менее интенсивно, чем в быстрых (тн промежуточные волокна) Данное положение иллюстрируется подсчетом волокон разного типа при рН 4,3 и 10,4 (таблЗ) Суммарная активность фермента в медленных ж промежуточных волокнах выше, чем в быстрых

Таблица 3 Значения суммарной оптической плотности медленных и быстрых волокон и их количественное соотношение при значениях рН преинкубационной среды 4,3 и 10,4

рН 4,3 рН 10,4

Е % Е %

Медленные 0,929+-0,029 29% 0,851 +-0,028 14% Медленные

0,908+-0,071 18% Промежуточные

Быстрые+ 0,571 +- 0,001 71% 0,566+-0,012 68% Быстрые промежуточные

Было прослежено изменение оптической плотности окраски волокон при выявлении актвности Са-зависимой АТФ-зы миозина (в соответствии с выделенными группами - только «медленные» и только «быстрые» волокна) в зависимости от величины рН преинкубационной среды На ЭВМ с помощью специальной программы были расчитаны модели этого процесса Оказалось, что динамика этого процесса для разных типов волокон различна (Таблица 4 )

Таблица 4 Значения уравнений регрессии активности АТФ-азы миозина в различных типах скелетных мышечных волокон у человека (Ч) и у крысы (К) в зависимости от рН преинкубационной среды

Тип волокна Вид уравнения г

К I у= - 0,384 + 0,179х - 0,002x2 0,8

II у=- 0,058 +0,211/х 0,9

Ч I у= - 0,146 + 0,071х- 0,008x2 0,85

II у= - 0,063 + 0,245/х 0,98

Для медленных волокон зависимость изменения оптической плотности от значения рН наиболее полно описывается и у крысы и у человека уравнением вида у = а + вх + сх2 (рис 4) Кислотоустойчивая АТФ-аза медленных волокон выявляется в довольно ограниченные пределах значений рН преинкубационной среды У человека они несколько шире, у крысы - уже

Для быстрых волокон эта зависимость носит другой характер и наиболее достоверно описывается уравнением вида у = а + Ь/х Активность фермента довольно быстро нарастает при изменении рН от 4,3 до 5 и далее растет уже более медленно Оптимум рН АТФ-азы быстрых волокон лежит ближе к щелочным значениям

Таким образом, можно выделить два типа Са-зависимой АТФ-азы АТФ-аза медленного миозина, активность которой ограничена жесткими рамками рН преинкубационной среды, и АТФ-аза быстрого миозина, активность которой проявляется при достаточно широких значениях рН

Рис 4 Изменения активности АТФ-азы мозина в скелетных мышечных волокон различного типа при изменении рН преинкубационной среды

Е

Рис 5 Изменение активности АТФ-азы «быстрого» миозина (У), выявляемой при РН 10,4 в зависимости от автивности АТФ-азы «медленного» миозина (X), выявляемой при рН 4,3 в одном и том же волокне

Математический анализ зависимости активности АТФ-азы разного типа в одном волокне от значений, выявляемых при рН 4,0 и 10,4 показал, что эти изоферменты существуют в пределах одного волокна в тесной количественной связи, имеющей характер обратной пропорциональности, чем выше активность фермента одного вида, тем ниже - другого, причем независимо от типа волокна, т к в пределах популяции волокон одного типа такая зависимость не выявляется (рис 5)

Таким образом, различные типы (изоферменты) АТФ-азы существуют одновременно в каждом волокне, составляя общий пул фермента, соотношение их количества в пределах этого пула и определяет свойства волокна, позволяющие отнести его к тому или иному типу

Динамика изменения рН-чувствительности АТФ-азы миозина и ферментов энергетического метаболизма (НАДН и СДГ) в скелетных мышечных волокнах при изменении условий функционирования.

Исследования у монозиготных близнецов.

Известно, что генотип клеток у монозиготных близнецов идентичен, поэтому любые возможные различия, наблюдаемые у взрослых особей, следует относить к проявлениям фенотипических адаптационных реакций в связи с различием в конкретных условиях существования Это в полной мере относится и к показателям активности АТФ-азы миозина и ее изоферментной характеристики, выявленной при определении характеристик рН-чувствительности фермента в различных типах волокон

Были исследованы некоторые гистохимические характеристики различных типов волокон трех пар монозиготных близнецов Ни один из испытуемых не был высококвалифицированным спортсменом, однако необходимо отметить, что по данным анамнеза физическая активность индивидов во всех обследованных парах отличалась друг от друга За исходные значения в каждом случае принимались показатели одного из близнецов, выбранного случайно

Исследование мышечной композиции в пробах скелетной мышечной ткани у близнецов (взятых из латеральной головки четырехглавой мышцы бедра) не выявила статистически достоверной разницы ни у одной из обследованных пар (таблица 5 )

Таблица 5 Содержание волокон 1 типа (в %) в латеральной головке четырехглавой мышцы бедра у монозиготных близнецов

№№ наблюдение пары % волокон I типа X +-х Р Е уел ед Р

1 1 -ый близнец 2-ой близнец 54,7+-1,27 54,4+-1,00 >0,1 0,65 +- 0,064 0,63 +- 0,095 >0,1

2 1-ый близнец 2-й близнец 55,4+- 0,71 57,8+-2,78 >0,1 0,55 +- 0,073 0,53+-0,111 >0,1

3 1 -й близнец 2-й близнец 62,6+-1,72 65,6+-1,5 9 >0,1 0,57 +- 0,100 0,56 +-0,078 >0,1

Таблица 6 Виды уравнений регресии

1-й близнец _

Тип волокна Вид уравнения Значение г

1-Й у = -0,146- 0,071х- 0,008x2 г = 0,89

2-й у=0,061 - 0,245/х г = 0,98

2 близнец

Тип волокна Вид уравнения Значение г

1-й у = - 0,142 -0,07х- 0,075x2 г = 0,90

2-й у = - 0,063 + 0,249/х г = 0,984

Полученные данные (Табл 5 и 6) свидетельствуют о том, что представленные показатели для обоих типов волокон мало различаются у представителей одной пары близнецов, что свидетельствует о том, что по этим характеристикам скелетные мышечные волокна при одинаковых наследственных качествах организма генетически детерминированы

Изменение рН чувствительности ферментов окислительного метаболизма у человека и крысы при изменении функциональной нагрузки.

Животные

Опыты были поставлены на 60 белых беспородных крысах самцах Животных заставляли осуществлять бег на тредмиле с умеренной интенсивностью в различных режимах в течение 4 часов - 1-я серия (1), в течение 8 часов (до отказа) - 2 серия (2), в течение 8 часов с 4-х часовым перерывом после первых 4-х часов бега - 3 серия (3), в течение 8 часов с 8 часовым перерывом после первых 4-х часов бега (4), Контрольную группу составляли небегавшие крысы (К) Животных забивали декапитацией при эфирном наркозе, материал (миокард и двуглавые мышцы бедра) быстро замораживали в жидком азоте Свежие срезы толщиной 10 мкм размещали на предметном стекле и окрашивали стандартным тетразолиевым методом для выявления активности НАДН-тетразолий редуктазы (НАДН-ТР) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) при значениях рН инкубационной среды(Ллойда и соавт,1982) и Са-зависимой АТФ-азы миозина (Guth and Samaha,1970) Об активности ферментов судили по величине оптической плотности окрашенных структур, измеренной на микрофотометре SMP-ОЗ (фирмы Opton) Все данные статистически обработаны с помощью ПК Hp 9825А (фирмы Хьюлет Паккард, США) Зависимость активности ферментов и значений рН инкубационной среды исследована с применением специальных программ регрессионного анализа

В миокарде контрольных животных активность НАДН-ТР и СДГ прогрессивно уменьшалась при снижении значений рН Нижний предел значений рН, при котором активность фермента практически не выявлялась для НАДН-ТРР

составил примерно 3,0, для СДГ - примерно 5 Регрессивный анализ показал, что наиболее достоверна зависимость активности ферментов от значений рН инкубационной среды описывается уравнением вида у = а + Ьх (где у-активность фермента, х - значение рН, Ь и а - коэффициенты) Однако, цифровые выражения соответствующих коэффициентов в уравнениях для НАДН-ТР и СДГ -различны Одинаковый вид уравнения для обоих ферментов показывает, что динамика математическое моделирование процесса показывает, что минимальное значение

рН при котором практически исчезает активность, для НАДН-ТР составляет 2,4, для СДГ - 5,3 Вид нагрузки во всех сериях эксперимента не влиял на вид уравнения, т е на динамику процесса по сравнению с контролем, однако реальные значения коэффициентов менялись, особенно для НАДН (Таблица 7 )

Таблица 7

№ серии Вид уравнения Коэффициент корреляции Значения рНмин

К У=0,084х-0,2 0,85 2,4

1 У=0,080х-0,15 0,83 1,9

2 У=0,070х-0,14 0,87 2,0

3 У=0, 080х-0,17 0,77 2,2

4 У=0, 080х-0,15 0,74 1,9

Для СДГ минимальное значение рн, при котором исчезла активность фермента, осталась стабильной во всех сериях опыта (= 5,3)

В волокнах скелетной мускулатуры активность НАДН-ТР и СДГ так же уменьшалась с уменьшением значений рН инкубационной среды Этот процесс также наиболее достоверно описывается уравнением вида у = вх - а для всех серий и обоих типов волокон

У контрольных животных уравнения имели несколько различных коэффициентов для различных типов волокон для НАДН-ТР характерны следующие значения для волокон 2В типа (гликолитических), рНмин = 0,64, для волокон 2А типа (окислительно-гликолитических) рНмин = 1 6, для волокон 1 типа (окислительных) рН мин = 2 Для СДГ рН мин у всех типов волокон было примерно одинаковым - 5,3 и - 5,2 для типа 2А и 2В)

Динамическая нагрузка в течение 4 часов вызвала некоторое уменьшение значения рН мин для НАДН-ТР волокон 1 и 2 В типа (до соответственно - 1,7 и 1,3 ) и мало влияла на рН чувствительность волокон 2А типа Для СДГ, напротив, рН мин во всех типах волокон увеличивалось примерно в равной степени (до 5,85 в среднем) Проведенные исследования показали, что существует прямая зависимость активности НАДН-ТР и СДГ и значений рН инкубационной среды по крайней мере в интервале рН от 2 до 9 Во всех случаях как для миокарда, так и для волокон скелетной мышечной ткани эта зависимость описывается уравнением типа у = вх - а Однако, конкретные цифровые выражения коэффициентов у для каждого случая различно и отражает индивидуальную динамику процесса для конкретного фермента в конкретных условиях Так, диапазон значений рН, когда активность фермента еще проявляется, для НАДН-ТР более широк, чем для СДГ и в миокарде и в скелетной мышечной ткани В миокарде границы рН чувствительности НАДН-ТР могут изменяться после физической нагрузки в

сторону увеличения (рН мин становится меньше), рН чувствительность СДГ не меняется В волокнах скелетной мышечной ткани увеличение границ рН чувствительности для НАДН-ТР наблюдается только в волокнах 1 и 2А типа (окислительных), в волокнах 2В типа они не меняются СДГ ведет себя несколько мягче Граница рН мин при физической нагрузке меняется в щелочную сторону во всех трех типах волокон СДГ более чувствительна к значениям рН среды, рН мин как в миокарде, так и в скелетной мышечной ткани имеет одинаково более высокие значения Падение активности при значении рН для СДГ при физической нагрузки более чувствительны, чем для НАДН-ТР Изменения рН на 0,4 единицы ( по данным литературы ) вызывает падение активности СДГ в среднем на 20-30%, НАДР-ТР - только на 8-10% (Масс1опаЫ ег а!, 1977)

Таким образом, рН чувствительность фермента является существенным показателем, характеризующим условия выработки энергии в мышечной ткани Для каждого фермента это показатель индивидуальности может быть различным в различных тканях (например в_миокарде и скелетной мышце) В условиях физической нагрузки рН чувствительность у различных ферментов ведет себя по-разному, что очевидно отражает различные условия функционирования системы фермент-субстрат и может служить из регуляторных внутриклеточных механизмов, определяющих особенности метаболизма мышечной ткани в условиях физической нагрузки У человека.

Длительная тренировка у человека была исследована у спортсменов, занимающихся академической греблей Спортсмены в течении 6 месяцев выполняли обычный тренировочный и соревновательный режим, принятый для этого вида спорта

В результате длительной (на протяжении 6 месяцев) тренировки у человека (тренировка имела преимущественно аэробный характер - в соответствии с видом спорта) были выявлены следующие изменения рН-чувствительности ферментов энергетического метаболизма (НАДН и СДГ) (Таблица 8,9)

Табл 8 Уравнения регрессии, описывающие кривые рН-чувствительности НАДН в волокнах скелетной мышечной ткани в контроле и после тренировки

Тип Вид Уравнение рН мин рНмах

волокна воздействия

До тренировки У = -0,639+0,ЗОЗх-0,020x2 2,50 7,6

I После тренировки У = -0,481+0,252х-0,017x2 2,25 7,4

До тренировки У = -0,430+0,202х-0,013x2 2,60 7,8

II После тренировки У = -0,426+0,211х-0,014x2 2,40 7,5

НАДН минимальные значения рН, при которых исчезала активность фермента в волокнах I типа (медленных, окислительных) уменьшались (до 2,25 при исходных -2,5), р < 0,05 Аналогичные изменения выявлены в волокнах II типа - они снижались (до 2,4, при исходных - 2,6), р < 0,05 При этом, значения рН, при котором активность фермента была максимальной, в волокнах обоего типа также сдвигалась в сторону более кислых значений (до 7,4 для I типа и 7,5 для волокон II типа)

Полученные данные могут свидетельствовать о наличие сдвига рН-чувствительности волокон обоих типов, свидетельствующие о приспособлении волокон к функционировать в более кислой среде

Табл 7 Уравнения регрессии, описывающие кривые рН-чувствительности СДГ волокнах скелетной мышечной ткани в контроле и после тренировки

Тип волокна Вид воздействия Уравнение рН мин рНмах

I До тренировки После тренировки II II -0,812+0,233х-0,014x2 -0,767+0,224х-0,013x2 5,0 4,7 8,3 8,6

II До тренировки После тренировки У = У = -0,576+0,158х-0,009x2 -0,499+0,147х-0,008x2 5,2 4,4 8,8 9,2

СДГ минимальные значения рН, при которых исчезала активность фермента в волокнах I типа (медленных, окислительных) так же, как и для НАДН, уменьшались (до 5,0 при исходных - 4,7), р < 0,05 Аналогичные изменения выявлены в волокнах II типа - они снижались (до 4,4, при исходных - 5,2), р < 0,05 При этом, значения рН, при котором активность фермента была максимальной, в волокнах обоего типа, в отличие от НАДН сдвигалась в сторону более щелочных значений (до 8,6 при исходных 8,3 для I типа и 9,2 при исходных 8,8 для волокон II типа), что может свидетельствовать о расширении диапазона рН - возможностей СДГ после тренировки

Известно, длительные аэробные нагрузки сопровождаются закислением внутренней среды волокна (8аЫт К , 1978, 8аЫт К, е1 а1,1978) Полученные нами данные о сдвиге рН-чувствительности в волокнах обого типа, как окислительных (медленных), так и гликолитических (быстрых) можно расценивать как приспособительные изменения этой характеристики деятельности исследованных ферментов в условиях хронического дефицита кислорода, сопровождающего длительные нагрузки (Папское Я, Ьасоиг .1Я, 1977, Никтап Е е[ а!, 1986)

Общее заключение.

Зависимость активности фермента от рН внутренней среды клетки особенно высока для мышечной ткани поскольку известно, что в процессе мышечного сокращения рН внутри волокна способна изменяться сдвигаясь чаще всего в кислую сторону Так, у человека рН уменьшалось от нормальной величины 7 0 до 6 4 после нагрузки (8аЫш е1 а1,1978) Возможно, это связано с накоплением кислых продуктов метаболизма, например, лактата (ЭаЫш е1 а1,1978), что особенно проявляется при угнетении аэробного метаболизма (с!е Нетрйппе А, Шщиешп Р, ¡984), например, при ишемией, вызванной пережатием питающей ткань артерии (О.БоппеН е! а1,1976) или развитии респираторного ацидоза и ацидоза смешанного типа (Уагёт е1 а1,1977)

Учитывая, что теоретический оптимум рН для большинства ферментов энергетического метаболизма лежит в области 7,2-7,6 (3 Ллойд и др 1982), можно предположить, что закисление внутриклеточной среды должно снижать активность ферментов и тем самым ухудшать условия выработки энергии в мышечной ткани особенно при физической нагрузке Действительно, после инкубации портняжной

мышцы лягушки в растворе при рН=7, утомление прямым раздражением электрическим током наступало быстрее, чем при рН равном 8 (Stevens F D 1980)

Однако для ферментов энергетического метаболизма неясно, меняется ли кинетика ферментативных реакций в случае изменения рН внутренней среды волокна, то есть насколько возможно m vivo приспособление энергетического метаболизма к новым условиям жизнедеятельности волокна с точки зрения такого фундаментального для них свойства, рН-чувствительность

Тем более, что в волокнах скелетной мышечной ткани имеется уникальный фермент, чей оптимум рН при одинаковой функции очень сильно различается (от 3 до 11) - т н АТФ-аза миозина Использование классической методики выявления этого фермента в скелетных мышечных волокнах у человека (Guth L, Samaha F J 1970) и метода серийных срезов показало, что изоформы этого фермента присутствует во всех волокнах Однако, т к рН-чувствительность изоформ неодинакова - при преинкубации в средах с крайними значениями рН от 3,3 до 11 выявляются волокна только с одним изоформой АТФ-азы (кислотоустойчивой или щелочеустойчивой), а при использовании промежуточных значений - множество т н промежуточных волокон - в которых выявляется различная степень активности фермента, неясно, в какой пропорции они содержаться в одном и том же волокне7 Учитывая, что границы рН чувствительности достаточно широки, можно предположить, что промежуточные волокна - это волокна, имеющие в своем составе изоферменты обоего типа Измерение активности фермента и применение математического моделирования кинетики фермента в пределах рН от 3,3 до 11 показало, что этот процесс носит линейный характер и описывается уравнением обратной линейной регрессии Это значит, что в каждом волокне, независимо от его типа, имеется примерно одинаковое количество фермента, являющееся суммой различных его изоформ

Опыты с тренировкой показали, что ни общее количество, ни соотношение изоформ фермента в физиологических условиях у человека и животных не меняется Это свидетельствует о том, что преобладание одного из типов АТФ-азы миозина в каждом конкретном волокне является врожденным и не меняется при изменении функциональной нагрузки (в отличие от ферментов энергетического метаболизма)

При окраске на Са-зависимую АТФ-азу миозина при рН преинкубационной среды 4,3 и у крысы и у человека выявлено в основном два типа волокон темноокрашенные («медленные») и слабоокрашенные («быстрые») Было прослежено изменение оптической плотности волокон обоих типов при использовании различных значений рН преинкубационной среды Оказалось, что динамика этого процесса для различных типов волокон различна Математическое моделирование процесса показало, что для медленных волокон зависимость изменения оптической плотности от значений рН наиболее полно описывается и у крысы и у человека уравнением вида у = а + вх + сх

Таким образом, АТФ-аза медленных волокон выявляется в довольно ограниченных пределах рН преинкубационной среды, при этом у человека эти границы примерно в два раза шире, чем у крысы Для быстрых волокон эта зависимость носит иной характер и описывается уравнением вида у = а + в/х Активность фермента быстро нарастает при изменении рН от 4,3 до 5,0 и далее растет уже более медленно Оптимум рН АТФ-азы быстрых волокон лежит в области, сдвинутой в сторону щелочных значений

Таким образом, АТФ-за медленного и быстрого миозина имеет различные свойства АТФ-за медленного миозина ограничена жесткими рамками рН преинкубационной среды, АТФ-аза быстрого миозина имеет более широкие рамки Исследование суммарной активности фермента в различных типах волокон показал, что данный показатель в медленных и близким к ним промежуточных волокнах выше, чем в быстрых Математический анализ связи показателей активности АТФ-азы различного типа в одном и том же волокне показал, что эти изоферменты существуют в пределах одного волокна в тесной связи, имеющей характер обратной пропорциональности чем выше активность ферментов одного вида, тем ниже - другого Уравнение зависимости имеет вид у = а - вх и свидетельствует о существовании в скелетном мышечном волокне некоторого суммарного пула АТФ-зы миозина, состоящего из всех видов изоферментов Внутри одного типа волокон (быстрого или медленного) закономерность приобретает непропорциональный характер, свидетельствующий о неравномерности содержания различных изоформ миозина в волокнах определенного типа, что и определяет его функциональные свойства и позволяет различать гистохимически функционально различные типы волокон

При изменении функционального состояния скелетной мышечной ткани данное свойство волокон не меняется, что показывает ее фундаментальный характер, по-видимому, закрепленный генетически

Как известно, ферменты активны только в определенном интервале рН Влияние рН на активность ферментов осуществляется путем изменения в состоянии ионизированности отдельных компонентов систем фермент-субстрат-микроокружение (Диксон М, Уэбб Э, 1982, Тривен МД983) Кривая, описывающая рН-зависимость ферментов, имеет сложную форму (рис 1 ), однако в начальном периоде (при значениях рН от 0 до 8) характер ее приближается к к форме линейной зависимости, что получило подтверждение в наших исследованиях

Поэтому при анализе данных, характеризующих рН-зависимость некоторых ферментов в наших исследованиях была выбрана именно эта часть кривой и по уравнению линейной регрессии типа у = а + вх были вычислены минимальные значения рН, при которых активность ферментов не выявлялась (исчезала)

Однократная 4-хчасовая нагрузка мало влияет на изменение рН-чувствительности НАДН и СДГ, более продолжительная нагрузка вызывает более существенные сдвиги, расширяя границы деятельности СДГ и уменьшая - НАДН (в кислом диапазоне значений рН) Повторная нагрузка и удлинение интервала между нагрузками существенно отражается в основном на волокнах ИВ типа, сдвигая значения рНмин для СДГ в щелочную сторону после 4-часового интервала и для НАДН-ТР - после 8-часового

Полученные данные свидетельствуют о том, что диапазон рН-чувствительности ферментов (по крайней мере в отношении НАДН и СДГ) меняется в процессе функционирования волокна Более короткие нагрузки в большей степени ухудшают условия работы СДГ, более длительные - НАДН Учитывая что активность НАДН является более интегративным показателем энергетического метаболизма, можно предположить, что данный процесс играет определенную роль в развитии утомления на уровне волокна Характер изменений при повторных нагрузках зависит от продолжительности интервала, вида фермента и типа волокна Более короткий интервал положительно сказывается на рН -чувствительности СДГ в волокнах I и II типов, резко ухудшая условия работы

этого фермента в волокнах IIB типа 8- часовой интервал для данного фермента более благоприятен

Таким образом, одним из существенных факторов, которые оказывают влияние на работу ферментов энергетического метаболизма, вне зависимости от их количества, является рН внутри скелетного мышечного волокна

Действительно, этот показатель существенно меняется в сторону закисления в процессе функционирования волокна, особенно при достаточно длительных нагрузках на выносливость (Tandon et а, 1978, Sahhn К, 1978) Показано, что при закислении внутренней среды волокна утомление развивается быстрее (Stevens Е , 1980) Снижение рН наблюдается не только в момент функционирования, но и через некоторое время после окончания работы, причем в волокнах II типа восстановление нормальных значений рН происходит медленнее, чем в волокнах I типа (Sahhn К, 1978)

Полученные нами кривые зависимости активности ферментов от значений рН инкубационной среды показывают, что при изменении рН, например на 0,5 единицы, активность фермента значительно снижается Как было показано ранее (Тривен M, 1983), рН-чувствительность фермента зависит от состояния его микроокружения Так, активность СДГ в различных условиях зависит в значительной степени от липидного компонента ферментативного комплекса (Hazel J R, 1972), пространственные взаимоотношения компонентов которого под влиянием рН могут меняться, при этом активные центры будут открываться и закрываться, регулируя активность фермента Нами впервые показано, что рН-чувствительность не является для фермента внутри волокна постоянной, но может меняться при перестройке волокна в различные периоды после физической нагрузки, что является свидетельством структурных перестроек на суборганоидном уровне Мы расцениваем это явление как один из возможных механизмов, обеспечивающих фенотипические адаптационные реакции

Важность изменения рН внутри волокна для уровня активности фермента хорошо иллюстрируется следующим теоретическим расчетом Если взять за основу полученные нами уравнения у интактных крыс ( У =-0,445+0,084х), то сдвиг значения рН внутри волокна, описанный по данным литературы после тетанического сокращения до утомления (Renoud et al, 1986), вызовет уменьшение активности СДГ на 24%

Более того, изменения рН-чувствительности могут закреплятся, в процессе эволюции Так, показано, (Хочачка П , Самеро Д , 1977), что у ряда глубоководных животных, например - черепах, обладающих способностью длительное время обходиться без кислорода при нырянии, оптимум рН ферментов энергетического метаболизма равен 3-4 в отличие от наземных животных с оптимумом рН около 7,0 (Sahhn К, 1978)

ВЫВОДЫ

1 Количественные исследования серийных срезов скелетных мышечных волокон позволяют создать виртуальную гистохимическую модель клетки, позволяющую исследовать рН - чувствительность ферментов m situ

2 В скелетном мышечном волокне можно выделить два типа Са-зависимой АТФ-азы АТФ-аза медленного миозина, активность которой ограничена жесткими рамками рН преинкубационной среды, и АТФ-аза быстрого миозина, активность которой проявляется при достаточно широких значениях рН

3 Различные типы (изоферменты) АТФ-азы существуют одновременно в каждом волокне, составляя общий пул фермента, соотношение их количества в пределах этого пула и определяет свойства волокна, позволяющие отнести его к тому или иному типу Это состояние видимо генетически детерминировано

4 Одним из существенных факторов, которые оказывают влияние на работу ферментов энергетического метаболизма, вне зависимости от их количества, является рН внутри скелетного мышечного волокна

5 Диапазон рН-чувствительности ферментов (по крайней мере в отношении НАДН и СДГ) меняется в процессе функционирования волокна Более короткие нагрузки в большей степени ухудшают условия работы СДГ, более длительные -НАДН

6 Характер изменений при повторных нагрузках зависит от продолжительности интервала, вида фермента и типа волокна Более короткий интервал положительно сказывается на рН - чувствительности СДГ в волокнах I и II типов, резко ухудшая условия работы этого фермента в волокнах IIB типа 8-часовой интервал для данного фермента более благоприятен

7 В условиях длительных хронических нагрузок, связанных с закисление внутренней среды наблюдается сдвиг рН-чувствительности волокон обоих типов, свидетельствующий о приспособлении волокон к функционировать в более кислой среде

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Кузнецов С Л, Паппас Е А, Гутова Ф, Влияние pH на активность ферментов энергетического метаболизма миокарда и скелетной мышечной ткани в норме и при адаптации Мат Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 80-летию проф Первухина, МГАФК 1-2 ноября 2001 г М «Советский спорт», 2001 г , стр 31-34

2 Гутова Ф 3 , Папас Е А , Кузнецов С JI Механизмы адаптации энергетического метаболизма волокон скелетной мышечной ткани // Морфология - 2002 - т 121 - № 2-3 -с 84

2 Гутова Ф , Кузнецов С Л , Паппас Е А pH и активность ферментов энергетического метаболизма мышечной ткани при адаптации к физическим нагрузкам // в сб «Актуальныевопросы клинической медицины» - Москва -2002 -т2 -с 258-261

3 Гутова Ф 3, Кузнецов С Л Некоторые свойства Са-зависимой АТФ-азы миозина у человека и животных //Материалы международной научной конференции «Актуальные проблемы морфологии и клинической медицины», Нальчик, 2003 -с - 73-75

Гутова Фатима Заурбиевна (Россия)

Количественная гистохимия Са-зависимой АТФ-азы миозина и некоторых ферментов энергетического метаболизма скелетного мышечного волокна при адаптации к изменениям условий функционирования.

В настоящей работе представлены данные, позволяющие рассматривать изменение рН-чувствительности ферментов скелетного мышечного волокна как фактор, лимитирующий эффективность энергетического метаболизма, а стойкие изменения этого параметра - как один из механизмов адаптации скелетного мышечного волокна при изменениях функциональной нагрузки, что можно использовать в качестве диагностического показателя эффективности работы системы энергетического метаболизма (например - после цикла тренировок у спортсменов)

Fatima Z. Gutova (Russia)

Quantitative hystocamistry of Ca-dependent myosme АТФ-ase and some enzymes of a power metabolism of a skeletal muscular fibre at adaptation to changes of conditions of functioning.

The data are submitted m the present work, allowing to consider change of pH-sensitivity of enzymes of a skeletal musculai fibre as the factoi limiting efficiency of a power metabolism, and pi oof changes of this parametei - as one oi mechanisms of adaptation of a skeletal musculai fibre at changes of functional loading that it is possible to use as a diagnostic parameter of an overall performance of system of a power metabolism (for example - after a cycle of trainings at sportsmen)

Заказ № 220/09/07 Подписано в печать 24 09 2007 Тираж 100 экз Уел п л 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 TV^* www cfr ru , e-mail info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гутова, Фатима Заурбиевна

1.Введени е.

2.Глава 1. Обзор литературы

1.Структурно-метаболичнсеие изменения в скелетной мышечной ткани при адаптации к нагрузкам.

2.Регуляция мышечного сокращения

2.1. Мйо'зин и его изоформы.

2.2. Влияние рН

2.2.1. Общие вопросы.

2.2.2. рН- чувствительность АТФ-азы миозина.

2.2.3.рН и активность ферментов волокон мышечной ткани при изменении условий функционирования.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Глава 3. Собственные данные и их обсуждение.

3.1 .Методические подходы к количественному анализу серийных срезов.

3.2. Исследование рН чувствительности АТФ-азы миозина в скелетных мышечных волокнах I «медленного» и II «быстрого) типов.

3.3.Динамика изменения рН-чувствительности АТФ-азы миозина и ферментов энергетического метаболизма (НАДН и СДГ) в скелетных мышечных волокнах при изменении условий функционирования.

3.3.1.Исследования у монозиготных близнецов.

3.3.3. Изменение рН чувствительности ферментов окислительного метаболизма у человека и крысы при изменении функциональной нагрузки.

3.3.2.1. Животные.

3.2.3.2. У человека.

Глава 4. Общее заключение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Количественная гистохимия Ca-зависимой АТФ-азы миозина и некоторых ферментов энергетического метаболизма скелетного мышечного волокна при адаптации к изменениям условий функционирования"

Система энергообеспечения традиционно считается одним из факторов, лимитирующих проявления мышечной выносливости, изменение которой является закономерным и постоянно выявляемым следствием пребывания в условиях повышенной или пониженной двигательной активности. Обычно этот процесс связывают с изменением количества соответствующих энергетических ферментов. Однако, эти изменения часто не согласуются друг с другом, а для некоторых ферментов вообще отсутствуют. Классические биохимические подходы не позволяют объяснить это явление, ведь свойства каждого фермента in situ (т.е. в клетке) зависят во многом от рН цитоплазмы, состояния структур, определяющих микроокружение фермента (например - структуры внутренней мембраны митохондрий) и т.д., которые постоянно меняются в процессе функционирования клетки.

Предшествующие исследования (Кузнецов СЛ., Кучма В.Р.1987, Афанасьев Ю.И.,Кузнецов С.Л.,1988, Кузнецов С.Л. Степанцов В.В., 1990, Кузнецов С.Л., Талис В.Л., 1990, Шенкман Б.С., Кузнецов С.Л., 1994,Shenkman B.S. et al., 1994) показали, что даже такие функционально тесно связанные между собой ферменты, как сукцинатдегидрогеназа (СДГ), малатдегидрогеназа (МДГ) и изоцитратдегидрогеназа (ИцДГ) при изменении функционального состояния скелетного мышечного волокна изменяют свою активность (оцененную гистохимически) несинхронно и в разной степени.

Для изучения этого явления был разработан метод серийных срезов для скелетного мышечного волокна, позволяющий определять активность нескольких ферментов энергетического метаболизма в одном и том же волокне. Показана его пригодность для количественных гистохимических исследований. Проведен ряд уникальных исследований, связанных с новой методикой исследования ферментативной активности непосредственно в волокнах скелетной мышечной ткани в условиях повышения и снижения функциональной активности, в частности - изменение границ рН, в которых данные ферменты наиболее активны, позволило выявить такой механизм адаптации (в дополнение к изменению количества фермента), как изменение рН - чувствительности ферментов энергетического метаболизма, что существенно влияет на выработку энергии в волокне.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состоит в исследовании количественных параметров активности АТФ-азы миозина и некоторых ферментов энергетического метаболизма в различных типах скелетного мышечного волокна в зависимости от показателей рН и изменении этих параметров при адаптации к изменениям условий функционирования.

Для достижения цели предполагается решить следующие задачи: изучить изменения количественных параметров изо ферментной активности по показателям окрашивания АТФ-азы миозина при различных показателях рН преинкубационной среды, изучить коррдинацию активности различных пулов изоферментов АТФ-зы миозина в одном и том же волокне, изучить изменение активности ферментов энергетического метаболизма и различных пулов АТФ-азы миозина волокна в различных условиях активности и у различных типов млекопитающих. изучить динамику изменения активности НАДН и СДГ в зависимости от различных значений рН инкубационной среды - изучить динамику изменения рН-чувствительности НАДН и СДГ в различных типах скелетных мышечных волокон в зависимости от условий их функционирования.

Научная новизна работы. В работе изучена ранее неисследованная характеристика метаболизма скелетного мышечного волокна - рН-чувствительность АТФ-азы миозина и таких важных энергетических ферментов, как НАДН тетразолий редуктаза и сукцинатдегидрогеназа. Полученные данные позволяют дополнить существующее представление о механизмах адаптации мышечных волокон к изменяющимся условиям функционирования.

Впервые предложена методика количественных исследований серийных срезов скелетных мышечных волокон, позволяющая исследовать рН - чувствительность ферментов in situ.

Впервые показано, что различные типы (изоферменты) АТФ-азы существуют одновременно в каждом волокне, составляя общий пул фермента, соотношение их количества в пределах этого пула и определяет свойства волокна, позволяющие отнести его к тому или иному типу. Это состояние видимо генетически детерминировано.

Доказано, что рН внутренней среды скелетного мышечного волокна является существенным фактором, оказывающим влияние на работу ферментов энергетического метаболизма, вне зависимости от их количества

Впервые показано, что диапазон рН-чувствительности ферментов (по крайней мере в отношении НАДН и СДГ) меняется в процессе функционирования волокна. Более короткие нагрузки в большей степени ухудшают условия работы СДГ, более длительные -НАДН. В условиях длительных хронических нагрузок (при тренировке), связанных с закислением внутренней среды наблюдается сдвиг рН-чувствительности волокон обоих типов, свидетельствующий о приспособлении волокон к функционированию в более кислой среде.

Практическая значимость.

Данные о рН-чувствительности ферментов скелетного мышечного волокна и разработанная методика, позволяющая регистрировать изменения этого параметра, позволяет существенно расширить представления о механизмах адаптации скелетной мышечной ткани в условиях изменения ее функционирования.

Полученные данные смогут помочь при разработке методик тренировочного процесса у спортсменов, методов профилактики снижения функциональной нагрузки мышечной системы у человека (как у больных, так при особых видах деятельности).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Гутова, Фатима Заурбиевна

ВЫВОДЫ

1. Количественные исследования серийных срезов скелетных мышечных волокон позволяют создать виртуальную гистохимическую модель клетки, позволяющую исследовать рН -чувствительность ферментов in situ.

2. В скелетном мышечном волокне можно выделить два типа Са-зависимой АТФ-азы: АТФ-аза медленного миозина, активность которой ограничена жесткими рамками рН преинкубационной среды, и АТФ-аза быстрого миозина, активность которой проявляется при достаточно широких значениях рН.

3. Различные типы (изоферменты) АТФ-азы существуют одновременно в каждом волокне, составляя общий пул фермента, соотношение их количества в пределах этого пула и определяет свойства волокна, позволяющие отнести его к тому или иному типу. Это состояние видимо генетически детерминировано.

4. Одним из существенных факторов, которые оказывают влияние на работу ферментов энергетического метаболизма, вне зависимости от их количества, является рН внутри скелетного мышечного волокна.

5. Диапазон рН-чувствительности ферментов (по крайней мере в отношении НАДН и СДГ) меняется в процессе функционирования волокна. Более короткие нагрузки в большей степени ухудшают условия работы СДГ, более длительные - НАДН.

6. Характер изменений при повторных нагрузках зависит от продолжительности интервала, вида фермента и типа волокна. Более короткий интервал положительно сказывается на рН чувствительности СДГ в волокнах I и II типов, резко ухудшая условия работы этого фермента в волокнах IIB типа. 8-часовой интервал для данного фермента более благоприятен.

7. В условиях длительных хронических нагрузок, связанных с закислением внутренней среды наблюдается сдвиг рН-чувствительности волокон обоих типов, свидетельствующий о приспособлении волокон к функционировать в более кислой среде.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гутова, Фатима Заурбиевна, Москва

1. Афанасьев Ю.И.,Кузнецов C.JL Некоторые аспекты адаптации поперечно-полосатой сердечной и скелетной мышечной ткани. В кн."Общие закономерности морфогенеза и адаптации", Тбилиси, "Мецниереба", 1988.

2. Афанасьев Ю.И., Кузнецов C.JL, Горячкина B.JI. Реакция скелетного мышечного волокна на однократную физическую нагрузку. Биологические науки, 1988, № 6.

3. Виру М.А. Влияние физической тренировки на анаэробный обмен в скелетных мышцах разного типа. Автореф.дисс.канд.биол.наук.Тарту,1990.

4. Детлаф Т.А., Детлаф А.А. Безразмерные критерии как метод количественной характеристики развития животных. В кн. Мат.биол. развития, Москва, 1982 г., стр. 25-39.

5. Диксон М.,Уэбб Э.Ферменты.-М.:Мир, 1982.-Т. 1 .-390 с.

6. Ковальский Г.Б. Количественная гистохимия дегидрогеназ. В кн. Введение в количественную гистохимию ферментов. Медицина, Москва, 1978, стр. 58-114.

7. Кузнецов C.JI. Методические рекомендации по информатике. М. 1990 г.

8. Кузнецов С.JI. Роль адаптациогенеза и адаптациоморфоза в формировании фенотипа скелетного мышечного волокон скелетной мышечной ткани. В кн."Проблемы биомедицины на рубеже XXI века", Москва, изд. РАЕН, 2000 г. стр. 121-128.

9. Кузнецов С.Л., Кучма В.Р. К вопросу о механизмах, влияющих на эффективность энергетического метаболизма мышечного волокна животных при различных нагрузках. "Гигиена и санитария", 1987, №2.

10. Кузнецов С.Л., Кучма В.Р. Изменение активности ряда ферментов скелетного мышечного волокна крысы и содержание гликогена при различных нагрузках "Гигиена и санитария", 1987, №3.

11. Кузнецов С.Л., Степанцов В.В., Реакция волокон скелетной мышечной ткани человека на 370-суточную антиортостатическую гипокинезию, сочетанную с физическими нагрузками, Косм.биол. и авиакосм, медицина, 1989, № 5, стр. 30-34.

12. Кузнецов С.Л., Талис В.Л. К вопросу о моделировании физиол. эффектов невесомости методом "антиортостатическоговывешивания"мелких лабораторных животных. Косм.биол. и авикосм. 1989, No. 1, стр.74-76.

13. Кузнецов C.JL, Талис B.JL Состояние скелетных мышечных волокон крысы при физических нагрузках на фоне «антиортостатического вывешивания» при моделировании невесомости. Косм.биол. и авиаком. медицина, 1990, No.6, стр. 31-34.

14. КузнецовС.Л.,ГорячкинаВ.Л., МисюлинС.С.Индивидуальные особенности реакции у спортсменов на однократную физизическую нагрузку до отказа. Мат. XIII Респ.конф."Совр.вопросы спорт, мед. и леч. физ-ры" Таллин, 1986.

15. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Москва, Мир, 1982, стр. 270.

16. Триве М., Иммобилизованные ферменты, М., Мир, 1983, стр. 213.

17. Шенкман Б.С., Кузнецов С.Л., Некрасов А.Н., Ширковец Е.А., Ростовцева М.Ю. Влияние оздоровительных упражнений на композицию мышц, размеры и окислительный потенциал мышечных волокон у человека. Теория и практика физ. культуры., 1994,№2,с.40-42.

18. Шенкман Б.С., Кузнецов С. Л. Трансформация мышечных волокон у обезьян в условиях невесомости. В кн. "Эколого-физиологические проблемы адаптации" , Мат. Симпозиума 26 -28 апреля 1994 г. Москва, 1994 , стр. 327.

19. Хочачка П., Самеро Д., Стратегия биохимической адаптации, М., Мир. 1977, стр. 320.

20. Aunola S., Marnieemi J., Alanen E. et al. Muscle metabolic profile and oxygen transport capacity as determinants of aerobic and anaerobic thresholds. Eur . J. Appl. Physiol., 1988,v. 57 p.726-734.

21. Bagshaw C.R.Muscle Contraction,Chapman and Hall,London, 1982.

22. Baldwin K.M. Winder W., Terjung R.L., Holloszy J.O. Glycolitic enzymes in different types of skeletal muscle: adaptation to exercise.Am.J.Physiol.l973, v. 225,№4.

23. Bauman H.,Cao H.K.,Howald H.-Analit.Biochem.,1984,v.l37,p.517-522.

24. Benzi O. Endurance training and enzymatic activities skeletal muscle. Med. Sport., 1981 , v. 13,p. 165-174.

25. Bergstrom J. Muscle electrolytes in man: determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens study on normalsubjects, kidney patients and patients with chronic diarrhea. Scand.J.Clin.Lab.Invest.(Suppl.), 1962, v.68, p. 7-110.

26. Billeter R.,Heizmann C.W.,Howald H.,Senny E.-Eur.S.Biochem., 1981 ,v.l 1 б.р.З 89-395.

27. Blomstrand E., Ekblom B. and Newsholme E., A. Maximum activities of key glycolitic and oxidative enzymes in human muscle from differently trained individuals. J. Physiol (London), 1986, v.381, №1,p.111-118.

28. Bronson D.D.,Schachat F.M.-S.Biol.Chem., 1982,v.257,p.3937-3944.

29. Brooke M.N.,Kaiser K.K.-Arch.Neurol.,1970,v.23,p.369-379.

30. Brooke M.N.,Kaiser K.K.-Ann.N.-Y.Acad.Sci.,1974,v.228,p.l21-144.

31. Bylund F.-C.,Bjuro T.,Cederblad G.,Holin J.,Lundholin K.,Sjostrom M.,Anguist K.A.,Scherstin T.-Eur.J.Appl.Physiol.,1977,v.36.p.l51-169.

32. Coyle E.F., Feltner M., E.,Kautz S.A. et al Physiological and biomechanical factors associatied with elite endurance cycling performance. Med. Sci Sports., Exers.,1991,v.23 №l,p.93-107.

33. Dubowitz V.-Ann.Clin.Res., 1974,v.6,2,p.69-79.

34. Engel W.K.-Neurology, 1962,v. 12.p.778-794.

35. Essen B.,Jansson E.,Henriksson J.,Tailor A.W.,Saltin B.-Acta Physiol.Scand.,1975,v.95,p. 153-165.

36. Fitzsimons R.B.,Hoh S.F.Y.,-S.Physiol.(London).,1983,v.343,p.539-550.

37. Garnett R.,Donavan M.,Stephens J.,Taylor A.J.Physiol. , 1979,v.287,p.33-43.

38. Gollnick P.D.,Armsrong R.B.,Saltin B.Effect of training on enzyme activity and fibre composition of human skeletal muscle. J. Appl. Physiol., 1973.,v.34, №1,pi07-111.

39. Gollnick P.D., Armstrong R.B., Saubert C.W.4 et al. Enzyme activity and fiber composition in skeletal muscle. J.Appl. Physiol., 1972,v.33№3,p.312-319.

40. Gollnick P.D.,Parsons D.,Oakley C.R.-Histochemistry,1983,v.77,4,p.543-555.

41. Green H.,Heliar R. ,Ball-Burnett M., et.al.Metabolic adaptations to training precede changes in muscle mitochondrial capacity. J.Appl. Physiol., 1992,v.72 №2,p.484-491.

42. Green H.,Jones S.,Ball-Burnett M.,Smith D.,Livesey J.,Farrance B.W.Early muscular and metabolic adaptations to prolonged exercise in humans.J.Appl.Physiol., 1991 ,v.70,№5 p.2032-2038.

43. Guth L.,Samaha F.J.Procedure for the Histochemical Demonstration of Actomiosin ATP-ase.Experim/Neurol.,1970,v.28,p.365-367.

44. Harmon M., Nimmo M. Quantitative histochemicalanalysis of skeletal muscle adaptation to endurance in man. J. Physiol., (Lond.),1987,v. 394,p.72.

45. Henriksson J.,Galbo H. and Blomstrand E. Role of the motor nerve in activity-induced enzymatic adaptation in skeletal muscle .Am. J.Appl. Physiol., 1982,v.242 №1 l,p.C 272-C277.

46. Henriksson J., Reitman J. Time course of changes in human skeletal muscle succinate dehydrogenase and cytochrome oxidase activities and maximal oxygen uptake with physical activity. Acta Physiol.Scand., 1977,v.99,p.91-97.

47. Henriksson J., Svedenhag J., Richter E.A.,Christensen N.J. and Galbo H. Skeletal muscle and hormonal adaptation to physical training in the rat: role of the sympathoadrenal system. Acta Physiol.Scand., 1985,v.l23,p.l27-138.

48. Henriksson J. Training-induced adaptation of skeletal muscle and metabolism during submaximal exercise. J. Physiol., (Lond.),1977, v.270,p.661-675.

49. Hoffman S.J.,Roy R.R.,Blanco C.E. and Edgerton V.R.Enzyme profits of single muscle fibers never exposed to normal neuromuscular activity.J. Appl. Physiol.,1990,v.69,№3,pp.1150-1158,1150-1158.

50. Holloszy J.O., Coyle E.F. Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences. J. Appl. Physiol., 1984, v.56.p. 831-838.

51. Holloszy J.O. Muscle metabolism during exercise.Arch.Phys.Med., 1982,v.63,p.231-233.

52. Hoppeler H., Exercise-induced ultrastructural changes in skeletal muscle .Int, J.Sports Mtd., 1986, v. 7,p. 187-204.

53. Hoppeler H., Howald H.,Conley K., et.al. Enurance training in humans aerobic capacity and structure of skeletal muscle . J.Appl. Physiol.,1985, v.59,№2,p.320-327.

54. Ingjer P . Effects of endurance training on muscle fiber ATP-ase activity, capillary supply and mitochondrial content in man. J. Physiol., (Lond.),1979, v. 294,p.419-432.

55. Jasson E., Dudley G.A., Norman В., Tesch P.A., Relationship of recovery from intense exercise to the oxidative potential of skeletal muscle. Acta Physiol. Scand., 1990.,v. 139, №1,p. 147-152.

56. Kahn R.A.,Katada T.,Bokoch A.M.,Northup I.K.,Gilman A.,G.Post-translational Covalent Modifications of Proteins for Function(B.C.Jonson,ed.).Academic Press,New York and London, 1983.

57. Katsuta S., Kanao Y., Aoyagi Y., Aoyagi Y. Is exhaustive training adequate preparation for endurance Performance. Eur. J. Appl. Physiol., 1988. ,v.58,p.68-73.

58. Kugelberg E.-J.Neurol.Sci., 1973,v.20,p. 177-198.

59. Kushmerick M. Patterns in mammalian muscle energetics. J.Exp.Biology, 1985,v. 115,p. 165-177.

60. Mabushi K.,Pinter K.,Allen P.,Gergely J.,Sreter F.A.Characteristics of human and rabbit single fibers.Budapest;Oxford, 1981,p.69-78.

61. Mabuchi K.,Sreter F.A.-Muscle Nerve, 1980,v.3,3,pp.227-232,233-239.

62. Muller W. Subsarcoplemmal mitochondria and cappilariziation of soleus muscle fibers in yong rats subjected to an endurance training.

63. A morphometric study of semithin sections. Cell Tissue Res., 1976, v. 174(3),p.367-389. 65. Muntener M.-Histochemistry,1979,v.62,p.299-304.

64. O'Donnell T.F.,L'Italien G.,Raines J.,Dignan W.,Hebert N.,Warnock D.,R.C.The significance of impedance changes on clinical measurements of muscle surface pH.Proc.29-th Annu.Conf.Eng.Med. and Biol.,Boston,mass.,1976,v.l8,p.367.

65. Padykula H.,Herman E.-J.Histochem.Cytochem.,1955,v.3,p.l70-195.

66. Peter J.B.,Barnard R.J.,Edgerton V.R.,Gillespie C.A.,Stempel K.E.-Biochemistry, 1972,v. 11 ,p.2627-2633.

67. Reichman H.,Hoppeler H.,Mathicu-Costello 0.,van Bergen F.,Pette D.-Pfluger Arch., 1985,v.404,p. 1-9.

68. Pons F.,Leger J.O.C.,Chevallay M.,Tome F.M.S.,Fardeau M.,Leger J. J.-J.Neurol. Sci, 1986,v.76,2-3,p. 151 -163.

69. Rosier K.,Conley K.E.,Claassen H.,Hovald H.,Hoppeler H.Eur J.Appl.Physiol., 1985,v.54,p.355-362.

70. Rusko H., Havu M., Karvinen E. Aerobic performance capacity in athletes. Eur. J. Appl. Physiol., 1978, v.38,p.l51-159.

71. Sahlin Kent.Intracellular рН and energy metabolism in skeletal muscle of man. With special referens to exercise.Acta physiol.Scand.,1978,v.455,p.56.

72. Saltin B.,Gollnick P.D. In "Handbook of Physiology" ed.Peachy L.D.,Adrian R.H.,Geiger S.R.,Skeletal muscle.Baltimore,Williams and Wilkinson, 1983,p.555-631.

73. Shenkman B.S., I.B.Kozlovskaya, Kuznetzov S.L., T.L.Nemirovskaya D.Desplanches. Plasticity of skeletal muscle fibers in space-flown primates. J. of Gravitational Physiology, 1994, v.l, No.l, may, p. P64-P66.

74. Soukup T.,Vydra J.,Gerny M.-Histochem.,1979,v.60,p.71-84.muscle.Can.J.Physiol. and Pharmacol.,1980,v.58,№5,p.568-570.

75. Suzuki A.,Cassens R.G.pH sensitivity of myosin adenosine triphosphatase and subtypes of myofibres in porcine muscle.Histochem.J.,1980,v.l2,№6,p.687-693.

76. Swynghedauw B. Physiol.Rev.,1986, v.66,3, p.710-771.

77. Tandon J.K., Pont M.C., Negy U.K., et al., Effect of light and exhanstive ergometric exercise on blood sugar, total cholesterol and pH in untrained young human subjects. Indian J. Physiol. And Pharmacol., 1978, v.22, 1, p. 81-87

78. Tesch P. A., Wright J. E. Recovery from shot-term intense exercise; its relation to capillary supply and blod lactat concentration. Eur. J. Appl. Physiol., 1983 .,v.52,p.98-103.

79. Tesch P.A.Muscle fatigue in man with special reference to lactate accumulation during short term intense exercise., «Acta physiol.scand.», 1988.

80. Yamaguchi M.,Jzumimoto M.-J.Mol.Biol.,1985,v.l84,4,p.621-643.