Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование кДНК гормонов роста курицы м свиньи

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование кДНК гормонов роста курицы м свиньи"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

1 I

ЖВИРБЛИС ГИНТАУТАС СТАНИСЛОВОВИЧ

^ ' , УДК 577.21

КЛОНИРОВАНИЕ кДНК ГОРМОНОВ РОСТА КУРИЦЫ И СВИНЬИ

\ 1

03.00.03-молекулярная биология

А В ТОР ЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степ кандидата биологических наук

МОСКВА-1987

Работа выполнена в отдало генетической инженерии (зав. отделом - академик.А.А. Баев) Института молекулярной биологии АН СССР. ' - - .

Научны а1- р у к о в о д и I е ли :

доктор биологических наук,, профессор К.Г. Скрябин - • . кандидат биологических наук З.Г. Горбулев

Официальные о л п о н а н т,;ы :

доктор биологических наук Ю.И. Козлов

кандидат биологических'наук Г .Н-; Ениколопов 5

Ведущая организация: Институт биохиыии и физиологии микроорганизмов АН СССР. . ,

оащита диссертации состоится "Ж." 198,? Г.

в час. на заседании специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии АН СССР,по адресу; 117984 • !,'осква, В-334, ул. Вавилова, д. 32,

С диссертацией моено ознакомиться в научной библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР. у

Автореферат разослан . ■ у

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наугс

;Ак1уад^ноеЦ проблемы. Совершенствование методов генетической инженерии, накопление данных о клонировании и экспрессии гонов позволяв? успешно решать задачи получения в бактериальных клетках белков и полипепзидов, важных как для фундаментальных исследований, так и необходимых в народном хозяйства. 8д последние годы были клонированы и экспрессированы гены таких ценных в практической медицине и сельском хозяйства балков, как интерферон (Goeddel et al., I980j Taniguohi et al., 1980), ИНСулИН (Goeddel et al., 1979)/гормон роста человека (Martial et al., 1979; Goeddel et al., 1979), быка (Miller at al., I980{ Seeburg et al., 1933), СВИНЬИ-(Beeburg et al., 1983; Vize and Wella, 1987) И целый ряд других.,

Одни« из подходов к изучение структуры генов является клонирование кДНК, синтезированной с использованием в качестве матрицы тотальной цРНК, получанной из специализированной ткани. Анализ полученной "библиотеки" кДНК позволяв! выделить из нее клоны, содержание индивидуальные гены - копии соответствующих иРНК. Использование данного подхода позволяет в настоящее время синтезировать кошшшшторныа копии генов (кДНК) таких важных для сельского хозяйства пептидных гормонов, как гормоны роста (ГР) курицы и свиньи. Клонирование генов данных гормонов открывает принципиально новый путь к получению ценных препаратов для интенсивного сельскохозяйственного производства.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось получение штаммов е.coli , несущих плазмиды с полноразмерными кДНК генов гормонов роста свиньи и курицы, а также получение гена зре-яого гормона роста свиньи, пригодного для дальнейшей экспрессии л E.coli.

Лля достижения поставленной цели необходимо было решить еле-

дуювда 4 основныа задачи:

- выделение поли(А)+-РНК из гипофизов курицы и свиньи и синив двухцапочечной кДНК (дц кДНК),

- клонирований и отбор клонов, содержащих кДНК гормонов' роста курицы И' свиньи,

- секванированио кДНК гормонов роста курицы и свиньи,

- конструирование гена зрелого гормона роста свиньи, пригодного для последующей экспрессии в е.соН .

Научная новизна к практическая ценность работы. Получены банки клонированной кДНК из гипофизов курицы и свиньи. Идентифицированы клоны, содержащие полноразиарную копию гена гормона роста курицы, установлена полная первичная структура этой кДНК. Из банка клонированной кДНК гипофизов свиньи выделены два клона, содержащие неполные, ко перекрывающиеся последовательности кДНК гормона:роста. Не основе этих фрагментов реконструирована кДНК, кодирующая весь зрелый гормон свиньи с вестью кодонаин для сигнального пептида. При секвениривании полученных кДНК впервые установлен полиморфизм нуклаотидной последовательности кДНК горцона роста свиньи, приводящий к замене одно!! аминокислоты в зрелом гормоне. Путем заыаны 5*-концовой части реконструированной кДНК гормона роста свиньи на синтетический фрагмент, кодирующий первые 15 ашшокислог зрелого белка, поручена конструкция гона зрелого гормона роста, которая мокзг быть эффективно экспрессирована в клетках бактерий.

' Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1584 и 1986 гг.), на 8-м двухстороннем симпозиуме СССР-Франция "Молекулярная биология балков и нуклеиновых кислот" (Москва, 1986), на республиканской конференции "Фундаментальные аспекты и практическое применение в медицине и сельской хозяйства достижений био-гехгологии" (Тарту, 1984).

Публикация. По материалам диссертации опубликованы 4 тезиса, докладов и одна статья. Две статьи находятся 2 печам.

Объем диссертации. Диссертация иалонвна на /о/ страницах машинописного текста, включая ¿¿"рисунков, 3 таблицы. Рабата состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов а описка литературы ссылки).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выделения поли(А)+-РНК из гипофизов курицы и свиньи и синтез чв-ухцепочочной кДНК

Из всего многообразия методов выделения кРНК из эукариотача-ской ткани ни остановили свой выбор на методе Чиргвина и др. (Cbirgwin st al., 1979). Предложенный ими сильный денатурирующий сгзнг - гуанидинизотиоцианат - чрезвычайно эффективно ингибирует рибоиуклеазную активность, присутствующую в разрушаемых тканях, и диссоциирует комплексы белок-нуклеиновая кислота. Поскольку инги-вярозание РНКаз обраишо посла удаления Денатурирующих соединений, з том число я гуанидинизотиоцианага, эааио, чтобы денатурация РНКзз поддерживалась до» момента физического разделения РНК и бел-коз., Это достигается центрифугированием гоасгената,'находяцеггся з гуанидинйзотиоцианате, через "подуыку" с хлоридом цезия. Плотя ость раствора - 1,711 - подобрана таким образом, что белки и ДНК из способны пройти чэраз "подушку", а РНК проходит и в результате центрифугирования на дна пробирки оказывается осадок, состоящий почти исключительно из РНК.

Для выделения мРНК из гипофизов свиньи мы брали 5 г замороженной ткани, из которой было получено около 15 цг суммарной РНК. В свою очередь из этого количества РНК посла двухкратной хроматографии на олиго (йТ)-целлюлоэа (Aviv ond Leder, 1972) мы собрали

примерно 300 мкг поли(А)+-РКК.

В случае выдалания ыРНК из гипофизов курицы в нашей распоряжении было всего 400 иг завороженной ткани, из которой мы получили 1,2 иг суммарной РНК и 100 мкг поли(А)+-РНК. (Ввиду ограниченности исходного материала был проведан лишь один цикл хроматографии на олиго(с1Т)-цбллюлоз8.) Конечно, такой препарат поли(А)+-РШ содержал, кроме иРШ», определенное количаство примесей рибосомаль-ных РНК, однако они не должны были помешать в дальнейшей работе, поэтому ыы не ставили задачи полностью освободиться от примесных РНК.

Основным критерием качества выделенной ыРНК. служила ее способность направлять синтез кДНК в равортазной реакции. Эффективность синтеза кДНК и размер образующихся продуктов анализировали олакгрофоразом в 5 % ПААГ в присутствии 7 М ыочавины.

Для синтеза дц кДНК на основе мРНК гипофизов свиньи ыы приманим стандартную схему с использованием нуклоазц 51 (Маа1а£1е а1., 1932).

После синтеза первой цепи кДНК с помощью обратной граискрип-тазы в присутствии олигоСйТ^^д в качестве затравки, матрицу, т.е. ыРНК, удаляла щелочныи гидролизом, а вторую цепь достраивали с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Б.со11 . Эффективность сингзза второй цепи кДНН также проверяли электрофорезом в 5 % ПААГ. Петлю между двуыя цепями кДНК- удаляли нуклеазой 31 После этого к "затупленным" концам дц кДНК присоединяли насинили ВаиН1 -линкеры, обрабатывали препарат соответствующей рзст-риктазой и фракционировали в 5 $ПААГ.

Из литературных данных было известно, что лодноразмерные кЛНК гормонов роста позвоночных имеют размер около 800 и.о., поэтому из ПААГ'мн вырезали зону, соответствующую 500-900 п.о. Данная стадия является важной с точки прения обогащения препарата

молекулами кДНК, кодирующими гормон роста. Выделаннуа из геля фракцию дц кДЙК лигировала о линеаризированной рестриктазами Hindill и BaiaHi и дзфосфорилированной ллазмидой рвязгг.

Традиционная схема синтеза дц кДНК кизет ряд существенных недостатков. Синтез второй цапи с использование!! самопроизвольно образующихся шпилек на 3* - конца первой цепи кДНК происходит о невысокой эффективностью, а использование нуклеазы S1 существенно cHHsaaï качвогао полноразыврных молекул дц кДНК. Кроаа того, при згой схама возможно возникновение разного рода перастро-ЭК В структуре клонированной кДНК (Segen et al., I9S0; Volokaert et al., 1981; Plstner et al., 1933). Поскольку при клонировании кДНК гипофизов свиньи мы действительно толкнулись с такого рода проблемами (см. иинз), го для синтеза дц кДНК гипофизов курицы ин выбрали метод Гублера-Хоффыаиа (Gut>ler and Hoffnan, 1283), который позволяет обойти вышеуказанные трудности.

Первая стадия - синтез первой цепи кДНК - в обоих использованных методах одинакова. Различается методика синтеза второй цапи кДНК. Поело синтеза первой цепи кШ и освобождения от избытка дезокситрифосфатов втору» цопв синтезировали с помощью РНКазы H а ДНК-полимерозы I е.coli . Последняя стадия яда! по механизму "ник-граноляции", i.e. РНК в комплекса "первая цепь кДНК-поли(А)+-РНК" заменяется вюрой ,^апью кДШС, причем ДЖ-пСлимераза I в качества затравок использует фрагменты РНК, которые образуются при действии РНКазы Н, К полученной дц кШ присоединяли HindiII-линкеры и фракционировали препарат электрофорезом в 5 % препаративном ПААГ. Фрагменты размером 700-1000 п,о. элюировали и встраивали в плазмиду PER327, расщепленную рестриктазой HindIII и дефосфори-лированную, как и в случае кДНК гипофизов свиньи.

2. Клонирование и отбор клонов, содержащих кДНК гормонов роста курицы и свиньи

Лигированную с плазмидой кДНК трансформировали в иташх е.coli HB I Ol. При клонировании в Hind III- или Baa Iii-сайты плазмид pBR 322 и рБй 327 нарушается ген устойчивости и тетрациклину. Подтоку первую стадию отбора рекомбикантиых клонов осуществляли перекалыванием полученных трансформантов на чашки с ампициллином

(Ар) я тетрациклином (Тс). Таким образом отбирали 400-1000 коло-г й

ний с фенотипом Ар Тс . На еле.дующем этапа отбор рекомбинантныг. клонов проводили гибридизацией колоний, выращенных и зафиксированных на нитроцаллюлозных фильтрах с вксокомечеиной пробой кДНК гормона роста быка (Gorbulev et ca., 1984). Можно было скидать, что колоний, содержащие плазииды со встроенной кДНК гормонов роста свиньи к курицы, будут гибридизироваться с пробой кЗНК гормона роста быка, т.к. было известно о высокой межвидовой гомологии этих гормонов И ИХ генов ( Miller аш! Eberhardt, 1986).

По результатам гибридизации было отобрано 25 кйовов с фрагип-тами кДНК гормона роста курицы и 2 клона с фрагментами кДНК гормона роста свиньи. Из литературных данных было известно, что в кДНК ГР курицы содержится один сайт для рестршстазы Вав HI (Боииа and . Boone, 1984), поэтому клоны, давшие положительный ответ при гибридизации, проверяли на присутствие этого сайта. Из 25 клонов для дальнейшего анализа были отобраны два-, которые обозначены pCGH I и pCGH 2. Они содержали вставку около 800 п.о. и внутренний Ваи Н1~сайт. Остальные клоны либо не содержали зтого сайта (3 клона), либо размер их вставки был меньше 800 п.о. (20 клонов).

Как оказалось из дальнейшего рестрикционного анализа, ориентация вставок в клонах pCGH I и pCGH 2 противоположная. В плазмиде pCGH 2 ориентация фрагмента кДНК ГР курицы совпадает с направлением гена устойчивости к тетрациклину в pBR 327, а в pCGH I- - орион-

гация обратная.

. Ситуация с клонами кЛНК ГР свиньи сложилась менее удачно. Два кпона, обозначенные pPGH I и pPGH 2, содаржали вставки разиарои 500 и 760 л.о., соответственно. Рестрикционный анализ показал, чго оба вставки имеют по одному сайгу для ресгриктаз Cfr9, Pvuii, Acol, а клон рран 2, крома того,'имел сайг для Hinfi.

Сравнивая результаты растрикционного анализа кДНК ГР свиньи С литературными данными (Seeburg et al., 1983; Mowa and Schulz, X984), мы обнаружили, что расстояния между сайтами рестрикции в полученной нами вставке клона рК»н 2 на совпадают с опубликованными ранее. Кроме того, размер вставка клона pPGH I показывал отсутствие 5' - концевой последовательности кДНК ГР свиньи (рис. I).

В то ае время нри гибридизации этих клонов с 17-членным синтетическим олигонуклзотидом, соответствующем кодонам от -7 до -3 аминокислот сигнального пептида (5' cctggactcaggaggtg 3'), один клон, а именно ркш2, дал положительный ответ.

Суммируя все эти данные, мы предположили, что клон pPGH I содержит неполную кДНК ГР свиньи, а клон рКЖ 1 - кДНК, близкую к полной, но каким-то образом перестроенную. Окончательную ясность могло внести только сакванированиа кДНК из отобранных клонов.

3. Сакванированиа кДНК гормонов роста курицы и свиньи

Определение первичной структуры кДНК ГР курицы вели методом Максама-Гильберта (Иахат and Gilbert, 1980). Вставка клона pCGH I была сзквенирозана полностью. Стратегия сэквонироваяия приведена на рис. 2.

В-разультато сакйенирования было установлено, что вставка клона pCGH I содержит 5'-некодирующую область мРНК ГР курицы (35 п.о.), полную последовательность, кодирующую прегормон (648 п.о.), З'-нетранслируемую область (96 п.о.) и поли(А^последовательность

ВапШ Hlrif I

Accl Kaal

-9ак

10вак

PvuII ВашНГ

, А

поли а

HlndlII • Accl »nal

ббак lOSai<

PvuII HlndHI

> В

поли А

BairflI Xmal Accl

з'

Hlnfl

Нбак

10вак

-9ак Шок

PvuII BamHI

поли А

Рис. I. Сравнение растрикционных карг кДНК ГР свиньи из разных клонов.

Стрелки показывают направленна кодирующей цепи кДНК os? 5'-конца к 3'-концу. Локализация кодонов, соответствующих некоторым аминокислотам, указана цифрами, обозначаю- ' щиш положение данной аминокислоты в гормона роста свиньи. Нумерация идет с первой аминокислоты зрелого балка, аминокислоты сигнального пептида омочены отрицательными цифрами.

А - кДНК ГР свиньи по Сибургу и др. (Saebuíg et t.X. ,1933), Б - кЛНК из клона pPGH I, В - кДНК из клона ppgh 2.

(16 п.о.) (рис. 3). Были проанализированы и концельгз участки вставки клона рсон 2. Оказалась, ч.'о кДНК этого клона содержит дополнительные 4 нуклаогида АААС на 5'-концз вставки и 19-членную последовательность поли(А) в З'-конца вставки.

Слздуат огмегигь, что наибольшие трудности возникли при определении первичной структуры области кДНК, соотвзтс.твуйщай 151135 аминокислотам ГР курицы.' В этой области расположена длинная последовательность, содержащая 15 GC пар подряд, поэтому на структурных голях при соклонировании с З'-конца наблюдалась сильная компрессия (аномальная подвижность фрагментов). Лкаь путем сакве-

feoff/

als

s>-2

■S a:

1 .1 II. .

* ШШ:

CeoHV

Рис. 2. Стратегия ееквапирования вставки-клона pCGH i.

нирования другой (комплементарной) цапи от Ваи щ-сайта внутри кДНК удалось четко и однозначно прочитать данную область вставки.

Из особенностей первичной структуры З'-нетранслируемой части кДНК ГР курицы представляет интарэс про5я:язнний полипиримидиновый зрак в 24 нуклеотида, содараащий монотонную последовательность из остатков цитидина.

Нуклеотидная-последовательность клонированной нами кЛНК ГР курицы имеет 3 отличия от опубликованной ранее (Souza end Boone, 1984)» Одно из отличий локализовано в З'-нетраислируемой обласги мРНК (С вместо Т), два других затрагивают кодирующую часа* кРНК, но попадают в третье положение кодонов и на меняют аминокислотную последовательность балка. Эти два замены в кодирующей части кРНК (Дай87-СТО вместо СТС и Тра88-АСТ вместо АСС) создавт в кДНК уни-

-зо -го -to о ю го

GTTCAAGCAACACCTGAGCAACTCTCCCGGCAGGA ATO GCT CCA GGC TCG TGG TTT TCT

KET Ala Pro Gly Ser Trp Phe Ser -25 -го

30 40 50 60 70

CCT CTC СТС АТС GCT GTG GTC ACG CTG GGA CTG CCG CAG GAA GCT GCT GCC Pro Leu Leu Ile Ala Val Val Thr Leu Gly Leu Pro Gin Glu Ala Ala Ala -15 * -10 -5

60 90 100 110 120

ACC TTC CCT GCC ATG CCC CTC ТСС AAC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTG AGG Thr Phe Pro Ala НЕТ Pro Leu Ser Asn Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu Arg 15 10 15

130 140 150 160 170 GCT CAG CAC CTC CAC CTC CTG GCT GCC GAG ACA ТЛТ AAA GAG TTC GAA CGC

Ala Gin His Leu His Leu Leu Ala Ala Glu Thr Туг Lys Glu Phe Glu Arg

20 . 25 30

160 190 гоо ню гго

ACC TAT ATT CCG GAG GAC CAG AGG TAC ACC AAC AAA AAC TCC CAG GCT GCG Thr Tyr Ile Pro Glu Asp Gin Arg Tyr Thr Asn Lys Asn Ser Gin Ala Ala 35 40 45 50

230 240 250 260 270

TTT TGT TAC ТС A GAA ACC АТС CCA GCT CCC ACG GGG AAG GAT GAC .GCC CAG Phe Cys Tyr Ser Glu Thr He Pro Ala Pro Thr Gly Lys Asp Asp Ala Gin 55 60 65

280 290 300 310 320 330

CAG AAG TCA GAC ATG GAG CTG CTT CGG TTT TCA CTG GTT CTC АТС CAG TCC Gin Lys Ser Asp HCT Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Va} Leu Ile Gin Ser 70 75 CO 65

340 350 360 370 380

TGG CTG ACT CCC GTG CAA TAC СТА AGC AAG CTG TTC ACG AAC АЛС TTG GTT Trp Leu Thr Pro Val Gin Tyr Leu Ser Lys Vil Phe Thr Asn Asn Leu Val 90 95 100

390 400 410 420 430

TTT GGC ACC TCA GAC AGA GTG TTT GAG AAA СТА AAG GAC CTG GAA GAA GGG Phe Gly Thr Ser Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly 105 110 115

440 450 . 460 ' 470 460

АТС CAA GCC CTG ATG AGG GAG CTG GAG GAC CGC AGC CCG CGG GGC CCG CAG Ile Gin Ala Leu НЕТ Arg Glu Leu Glu Asp Arg Ser Pro Arg <?ly Pro Gin ISO 125 130 135

490 500' 510 520 530

• CTC CTC AGA CCC ACC TAC GAC AAG TTC GAC АТС CAC CTG CGC AAC GAG GAC Leu Leu Arg Pro Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Ile His Leu Arg Asn Glu Asp 140 145 150

540 550 . 560 570 560

GCC CTG CTG AAG AAC TAC GGC CTG CTG TCC iGC TTC AAG AAG GAT CTG CAC Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu His 155 160 165 170

590 600 610 620 630

MG CTG GAG ACC TAC CTG AAG GTG ATG AAG TGC CGG CGC TTC GGA GAG AGC • Lys Val Glu Thr Туг Leu Lys Val НЕТ Lys Cys Arg Arg PMe Gly Glu Ser 175 160 185

640 650 660 670 680 690

AAC TGC ACC АТС TGA GGCCCCGTGCCTGCGCCATGGCTGATGGCCCTCTCCCCCCCCCCCCC АЕП Cys Thr île Stop 190

700 710 720 730 740 750 760

CrrCCTCCCCGTCACCAAAAACACGAGGAATAAACCCCACAGCGCCAAAAAAAAAAAAAAAA

Рис. 3. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность

• кДНК гр курицы из клона pCGH i.

кальный сайт для растриктазы Hinf I. Данный сайг присутствует во вставках обоих изученных нами клонов - pCGH I и pCGH 2. Отличия в парвичной структура кДНК ГР курицы, получанных нами и зарубежными авторами, могут бить следствием полиморфизма нуклеотидной последовательности ыРНК, кодирующей ГР курицы у различных пород кур.

Секвенирование кДНК ГР свиньи из клонов pPGH I и pPGH 2 проводили "экие методом Максама-Гильбертд. Сравнение установленной нуклеотидной последовательности кДНК клона pPGH I с опубликованной ранее (Sesburg et al., 1983; Mowa and Sohulz, 1984) подтвердило, что эта вставка представляет собой неполную копию ыРНК ГР свиньи и начинается с кодона для 66-й аминокислоты зрало-го белка. Вставка- содержит две трети кодирующей области ыРНК ГР свиньи, всю 3'-нетранслируемую область (105 п.о.) и закапчивается поли(А^последовательностью (18 п.о.). .

При секвенировании вставки из клона pPGH 2 выяснилось, что она, как и предполагалось из данных рестрикционного и гибриди-зационного анализа, содержит последовательность, кодирующую весь зрелый ГР свиньи, а также 9 кодонов сигнального пептида. Вмосте

с гам, оказалось, что в процессе клонирования кЫК клона рКЗЯ 2 произошли серьезные перестройки, нарушившие структуру кодирующей части кДНК.

Анализ нуклеотидной последовательности в области, расположенной рядом с участком, в котором произошла перестройка, выявил взсьма просяйонную зону комплементарности манду 5»-концевой частью мРНК (кодоны от -II до -6 аминокислот) и средней частью мРНК (колоны 131-135 аминокислот) ГР свиньи (рис. 4). Столь сильная комп-ленонтарпость (16 п.б. из 20) привела, видимо, к образованию шпильки в процессе синтеза-кДНК к вызвала, в конечном итога, перестройку клонированной кДНК, Подобного рода осложнения возникали И у других авторов (Pagan ей al., 1980;-Volekaert st al., 1981} Pletnsv ot al., 1983). Предложен целый ряд молокулпрных механизмов, приводящих к возникновению перестроек в ходе синтеза it клонирования кДНК (Fagan ot al., 1980; Fields and Winter, 1981). Bee они основана ua существовании шпилечных структур в кДПК.

Сравнение пуклеотидних последовательностей вставок кДНК из ^слонов pPGH I и pPGn 2 между собой, а такка с первичной структурой кДНК ГР свиньи, опубликованной ранза двумя группами авторов (Soеburg et al., 1983; How® and Sahulz, 1984),показало, что кДНК pPGH I и рРОН 2 отличаются не только от опубликованных кЛНК, но и друг от друга (табл. I). Замены затрагивают как нетранслируемую область, гак и кодирующую часть кДМ. Одна из таких замен, обнаруженная в рран I в кодоне, соответствующем 136-й аминокислоте зрелого ГР свиньи, приводит к исчезновению одного из двух San ЗА-сайтов (отсутствие Sau ЗА-сайта доказано рестрикционньш анализом и секвенированио;.; данного участка). Эта замена к тому ке меняет значение кодона, и ^озультато чего в балке вместо иаолойцина появляется треонин. В icflilK из клона pPGH 2 такая замена огсутству-

-11 -6

5---G CTCTGCCTGCCCTGGAC T---з'

3---С T A G A CAG GACGGGCCCCG А---5

136 131

Рис. Сэчокомплементарный участок кДНК гормона роста свиньи. Нумерация кодонов такая же, что у. на рис, I

ет* Обнаружение данного факта показывает, что э случае ГР свиньи существует полиморфизм, проявляющийся не только'на уровно мРНК, но и па уровне белковой молекулы.

Конструирование гена зрелого гормона роста свиньи, пригодного для дальнейшей экспрессии в B.coli

Из данных сакванирования стало ясно, что вставка клона pPGîf 2 несет полную, но перестроенную последовательность кДНК зрелого ГР свиньи, а вставка клона pPGn I содержит неперестроенную, но укороченную копию ыРНК ГР свиньи.

'Проанализировав рестриктные каргы р?он I и рроя 2, мы обратили внимание на то,-что имеется возможность реконструировав правильную и полную последовательность, кодирующую зралый ГР свиньи, используя для этого уникальные- сайты для рестриктаз Hlnf I И Асс I.

Все операции по восстановлению структуры кДНК проводились на препаративно выделенных вставках клонов pPGH I и pPQH Н. Вставку последнего расщепляли рестриктазой Hinf I, концы полученных фрагментов затупляли фрагментом Кленова Д^-полимараэы I Е.ооН и пришивали синтетические Eco йх-линкары. Далеа препарат гидролизировали рестриктазой Асс I и выделяли большой фраг-

- Ik -

Таблица I

Сравнение нуклеотидной последовательности кДНК . прегормона роста свиньи, полученной разными авторами

Места Варианты кДНК прегормона роста свиньи

отличий л Сибург и др. Мовва и др. PPGH1 PPGH2

-гак 25ак 48ак 5бак ЮОак 127ак 134ак 1 Збак 190ак 44-51Н 83-ö7h 94-97к 105-Í07H GGA GCC CAG АСС CTG GAA GGA АТС ТТС GGTGCCCT ТССССТ АССА TCG GGC GCT CAA ACG TTG GAG GGC АТС ТСС GACCT ТССТ АСА TCG CTG GAG GGA АСС ТТС GACCCT ТССТ АССА TTG GGA GCC CAG АСС CTG GAA GGA АТС ТТС GACCCT ТССТ АССА • TTG

Места отличий в кодирующей части кДНК прегормона обозначены номером кодона соответствующей аминокислоты. З'-концевая не-транелируеыая часть нумеруется начиная с первого нуклеотида стоп-кодона по варианту Сибурга и др. (Seeburg et al., 1983)

мент Асс I- EcoRi после электрофореза в препаративном 5 ¡6-м ПААГ. Этот фрагмент лигировали с фрагментом EindIII-AccI, полученным из ДНК клона pPGH I. Схема, иллюстрирующая реконструкцию кДНК ГР свиньи, показана на рис. 5.

В результате был получен ген зрелого ГР свиньи, в котором 5'~концавая часть гена, включающая б зсодонов сигнального пептида, была взята из вставки клона ррвн 2, а З'-концевая част£ (вместе с З'-нетранслируемой областью) - из вставки клона pPGH I. Конечная конструкция была клонирована в плазмиде рис 19 по сайтам ЕсоМ и Hind III. Отбор клонов, содержащих вставку, вели на индикаторных чашках с x-gal и йПТГ. Клоны со вставкой EcoRi-Hind III размером около 700 п.о. подвергали рестрикционноыу анализу. Большинство полученных клонов содержало уникальные сай-

PPGH2

BamHl : ^ i BamHI

Xmal AccI Htnfl PvuII

\ Hinil i

pPffll </

imam .. „ ~7~' Hindin BamHi : ~ ' " : Hinfi

PvuII Xmal AccI Xmal AccI

| ¡EcoRI-линкер

! ^

¡AccI EcoRI I J! EcoRI

J Xmal AccI

| ¡AccI

V ^

Klrull 11 —: AccI AccI : EcoRI

PvuII Xmal

J ДНК-лигаза j

i i

3' Hindin : ' .........." ecori s'

PvuII xmal AccI

"pPGK-rec

Рис. 5, Схема реконструкции полной и правильной последователь-иосги кДНК, кодирующей зрелый ГР свиньи с шестью кодо-наыи, соответствующий части сигнальгого пептида

ты кЛНК ГР свиньи: Асе I, хша I, Pvu II, Вставка одного из клонов, названного ррон-гес,' была просаквенирована полностью мато-дои Сэигара (Sanger et ai., 1977) в модификации Хатгори и Сака-ки (Hattori and Sakaki, 1986) с использованием меченых прайма-ров и денатурированной плазмидной матрицы (рис. б). Результаты секзенирования представлены на рис. 7..

Из приведенных в литературе данных (Seaburg et al., 1983) было известно, что кДНК ГР свиньи, содержащая природную 5»-концевую часть кодирующей области мРНК, экспрессируегся в E.coli

Лов! Хса1 ГтиИ

Рио. 6. Стратегия свквакирования кДНК ГР свиньи из клона рРОН-

гес

с низкой эффективностью. Для преодоления возникших трудностей существуев несколько подходов. Мы остановили свой выбор па ые-тоде, который хорошо зарекомендовал себя при создании эффективно акспрессирующихся конструкций кДНК ГР человака (Сое<1с1о1 еь а1,, 1979), ГР быка Н СВИНЬИ (ЗвеЪиге et а!., 1983) и ГР лосося (За-к!пе et а1., 1985). Мэгод основан на зашие 5»-част кДНК, кодирующей сигнальный пепкид и парвыо аминокислот зрелого балка, па оиитетаческий фрагмент, кодирующий только первые аыинокиолояы аралого белка с учетом оптимального употребления кодонов в е.соН и снабженный сайгами раогрикции, необходимыми для дальнейшей работы по встраиванию эгнх фрагыенгов в плаэыиды с сильный промого-рок. В нашем случае мы заменили 5*-концевую область кДНК из клона

15 30 45

ААТ 1er АТС ACT CAG GAG CTG GGA GCC TTC CCA GCC АТС CCC TXG TCC AGC СТА НЕТ Thr Gin Glu Val Gly Ala Phe Pro Ala НЕТ Pre Leu Ser Ser Leu

-5 15

*

60 75 90 105

ТГГ GCC AAC GCC GTG CTC CGG GCC CAG CAC CTG CAC CAA CTG GCT GCC GAC ACC Phe Ala Asn Ala Val Leu Arg Ala Gin His Leu Н1з Gin Leu Ala Ala Asp Thr

ío is го гь

120 135 150

TAC AAG GAG ТГТ GAG CGC GCC TAC АТС CCG GAG GGA CAG AGG TAC ТСС АТС CAG

Tyr Lys Glu №8 Glu Arg Ala Туг Ile Pro Glu Gly G' i Arg Туг Ser Ile Gin 30 35 40 45

165 . 180 195 210

AAC GCC CAG GCT GCC TTC TGC TTC TCG GAG ACC АТС CCG GCC CCC ACG GGC AAG

Asn Ala Gin Ala Ala Phe Cys Phe Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro Thr Gly Lys 50 55 60

225 240 255 270

GAC GAG GCC CAG CAG AGA TCG GAC GTG GAG CTG CTG CGC TTC TCG CTG CTG CTC f.sp Glu Ala Gin Gin Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu 65 70 ' 75 60

E65 300 315

АТС CAG TCG TGG CTC GGG CCC GTG CAG TTC CTC AGC AGG GTC TTC ЛСС AAC AGC lie Gin Ser Trp Leu Gly Pro Val Gin Phe Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser 85 • ' 90 95

330 345 360 375

CTG GTG TTT GGC ACC TCA GAC CGC Gît TAC GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAG Leu Val Phe Gly Thr Ser Asp Arg Val Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu 100 • 105 110 115

390 405 ■ 420

GGC АТС CAG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAG GAT GGC AGC CCC CGG GCA GGA CAG Gly Ile Gin Ala Leu КЕТ Arg Glu Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Ala Gly Gin 120 125 130 • 135

435 450 465 4S0

ЛСС CTC AAG CAA ACC TAC GAC AAA TTT GAC ACA AAC TTG CGC AGT GAT GAC CGC

Thr Leu Lys Gin Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Thr Asn Leu Arg Ser Asp Asp Arg 140 145 150

495 510 , 525 540

CTG CTT AAG AAC TAC GGG CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC CTG CAC MG GCT Leu Leu Lys Asn Тут Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu His Lys Ala 155 160 165 170

555 . 570 585

GAG ACA TAC CTG CGG GTC ATG AAG TGT CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC TGT GCC G lu Thr Tyr Leu Arg Val НЕТ Lys Cys Arg Arg Phe Val Glu Ser Ser Cys Ala 175 160 135

600 610 620 630 640 650 660

TTC TAG TTCCTGGGCATCTCTGTTGCCCCTCCCCAGTACCTCCCCTGACCCTGGAAACTGCCACCC Phe Stop 190

670 680 690 700 710 720

CAATGCCTGCTGTCCTTTCCTAATAAAACCAGGTTGCATIGTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Рис. 7. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность кДНК гормона роста свиньи из клона ркзн-гес

ГР свиньи на синтетический фрагмент» кодирующий первые 15 аминокислот зрелого ГР свиньи.

Синтетический фрагмент 5»-концевой части гена зрелого ГР свиньи собирали из 10 олигонуклеотидов (cu. рис. 8) путам ли-

гирования их ДНК-лигаaoil фага ТЧ. Посла сииваиия фрагментов ре-

i

акционную смесь обрабатывали рестриктазами 2со ri и Apa I и всграивали в плазыидный вектор. В качестве вектора мы иопользо-. вали плазмиду pPGH-rec, расщепленную eco hi и Apa I и освобожденную от внутренних фрагментов е=о ri -Apa I и Apa I - Apa I электрофорезом в агарозе.

Клоны, содержащие фрагменты Eco Ri - Apa I нужной длины, оеквенировали методом Максама-Гильберта (Maxam and Gilbert, 1980), Из tepex проанализированных клонов лишь один, обозначенный pPGH-syn, имел правильную структуру. Два других содержали по одной замена в нуклеотидной последовательности синтетического фрахчшн та, что связано, вероятно, с присутствием примесей олигонуклеотидов неправильной структуры в прешаратах синтетических олиго-нуклеотидов, служивших субстратом для лигирования.

На следующем этапе работы синтетический фрагмент Eco ri -Apa I, выделенный из плазмиды pPGH-syn, мы лигировали с фрагментом Apa I - Hind III, полученным в результате частичного гидро-

1 3 5 7 9 <------------><---------------><-------------><--------------><--------------->

MTTCTATGTTCCCAGCTATGCCTCTATCTAGTCTATICGCTAACGCTGrrCTTCGGGCCCAGCATCTICATCÍ.GCTGA

GATACAAGGGTCGATACGC/iGATAGATCAGATAAGCGATTGCGACAAG/.AGCCCGGGTCGTAGAAGTAGTCGACTTCGA <--------------><---------------><-------------><--------------><------------->

г 4 б е ío

Рис. 8. Синтетический 5»-концевой фрагмент кДНК ГР свиньи.

Стрелками и номерами указаны олигинуклаотиды, из которых при лигирояании был собран данный синтетический фрагмент

л$1за вставки из плаэмиды ррон-гео с помощью рзстриктази Apa I. Продукт лигирования этих двух фрагментов был встроен в плазмиду рис 19 по Eco ri- и Hind Ill-сайтам. Правильность полученной гаки» образом гибридной кДНК ГР свиньи была проверена при помощи сскванирования на денатурированной плазмидной матрица с Использованием меченых Прайморов (Hattori and Sakaki, 1986). Схема конструирования гена зралого ГР свг.ньи прадстаалена на рис. 9.

Сконструированный.нами гибридный геп зралого ГР свиньи мо-гат быть использоваг для эффективной зкспрассин этого гормона в к.coli или других бактериях после встраивания полученного rana в плазмиды с сильным промотором.

. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из банка клонированной кДНК гипофизов курицы выделаны клоны» содержащие полноразмарную кДНК праг'ормона роста. Установлена полная первичная структура кДНК гормона роста курицы,ногорак«включает в себе 5*-н9транслируемую область (35 п.о.^последовательность, кодирующую 25 аминокислот сигнального пептида, аминокислоты зрелого гормона, 3'-нетранслируемую область (96 п.о.). Было показано существование "молчащих" замен в нуклеотидной последовательности кДНК гормона роста курицы, приводящих к образованию уникального сайта для растриктазы Hinf I, который огсут-

рРШ-гес

5'- ЕссЯ!

.! кшаш 3'

Ара! Ара1 Хиа! . РуиП

Ара1

частичный гидролиз

Ара1

тмт

Ара!

Хпи! РУТШ*

¡синтетический Фрагмент

; ЕсоГЛ !_; Ара!

; \ ; ДЛК-лигаза

V

у Есокх '. : • : ншаш з*

Ара1 Ара1 Хша1 РшП

рРШ-ауп

Рис. 9. Схема конструирования кЯНК гормона роста свиньи о • заменой 5»-концевой области на синтетическую

ствует в ранее опубликованных последовательностях кДНК ГР курицы.

Из банка клонированной-кДНК гипофизов свиньи выделены два клона, содержащие неполные, но перекрывающиеся последовательности кДНК ¡гормона роста. На основе этих фрагментов реконструирована кДНК, кодирующая весь зрелый гормон роста свиньи с шестью ко-донами для сигнального пептида. При сокванировании полученных кДНК впервые установлен полиморфизм нуклеотидной последовательности кДНК гормона роста свиньи, приводящий к замене одной аыи-

нокислоты б зрелом гориона. Получена конструкция кЛНК зрелого гормона роста свиньи, которая монзт быть эффективно экспрасси-рована в платках, бактерий. С этой целью из клонирозанной кДНК удалены кодоны для сигнального пептида, а последовательность, кодирующая первые 15 аминокислот зрелого белка, заманена на синтетическую.

ВЫВОДЫ

1. Из библиотеки клонированной кДНК гипофиза курицы выдалз-пы клоны, содержащие полноразнарную копию кДНК прегормона роста.

2. Установлена-полная первичная структура кДНК прегормона роста курица.

3. Из библиотеки клонированной кДНК гипофиза свиньи выделена клоны, содарзащиз неполные, ко перекрывающиеся последовательности кДНК гормона роста.

Определена первичная структура кДНК гормона роста свиньи Обнарунзн полиморфизм этой кДНК, проявляющийся на только на уровне нуклеотидной последовательности, но и приводящий к замене аминокислоты изолейцина на треонин в зралоц балгэ.

5. На основа полученных клонов реконструирована кДНК гормона роста свинья, кодирующая весь зралый белок с иэстью кодонами для сигнального пептида.

6. Путем замены 5*-концазой части реконструированной кДНК гормона роста свиньи на синтетический фрагмент получена конструкция гана зрелого гормона роста, которая мскет быть эффективно экспрассирована ъ клетках бактерий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Рубцов ПЛ., Горбулев В.Г., Парсаданян А.Ш., Чернов БД.,

Свердлова П.С., Чупаена В.В., Голова Ю.Б., Квирблис-Г .С., Баг-

чикова H.В., Скрябин К.Г., Баав A.A. Получение пептидных и полипелгидных гормонов методами генетической инженерии. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". Тезисы докладов. Пущино, 1984, с. 49-50.

2. Рубцов ПЛ., Горбулев В.Г., Чернов БД., Батчикова Н.В., Голова Ю.Б., Хвирблас Г.С., Поаыогова Г.Б., Свердлова П.С., Чу-паава В.В., Скрябин КД1., Баев A.A. Клонирование и экспрессия s Е.соIi генов, кодирующих пептидные гормоны. 8-ой двусторонний симпозиум СССР-франция "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот". Тезисы докладов. Москва, 1986, с. 21.

3. Рубцов ПЛ., Горбулев В.Г., Евирблцс Г.С., Чернов BJC«, Голо- . ва Ю.Б., Позмогова Г.Е., Свердлова П.С., Чупеева В.В., Скрябин К.Г., Баев АЛ, Гормоны сельскохозяйственных лшвотных, Еоесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". Тезисы докладов. Пущано, 1986, с. 30,

4. Горбулев BJ., 2вирблис Г.С., Рубцов ПЛ., Скрябин К.Г. Получение клонов содержащих кДНК пептидных гормонов сельскохозяйственных животных. Республиканская конференция "Фундаментальные аспекты и практическое применение в медицине и сельском хозяйстве достиканий биотехнологии". Тезисы докладов. Тарту, 1986, с. 95-100.

5. Рубцов ПЛ., Чернов BJC., Горбулев В.Г., Парсаданян А.Ш., Свердлова П.С., Чупеева В.В., Голова Ю.Б., Батчикова Н.В.', Евирблис Г.С., Скрябин К.Г., Баев A.A. Генетическая ннЕонерпя пептидных горнонов. - Молек. биология, 1985, т. 19, I, с. 267-277, •

6. ^вирблис Г.С., Горбулев В.Г., Рубцов ПЛ., Скрябцн KJ\, Баев A.A. Генетическая инженерия пептидных гормонов. I. Клонирование кДНК гормона роста курицы. - Молек. биология, 1987, т.

21, 6» С. 1620-1624. ?. Явирблис Г.С,, Горбулев В.Г., Рубцов ПЛ., Чарнов BJC., Го-лоза Ю.Б., Псзмогова Г.Е., Скрябин К.Г., Баав A.A. Генетическая инженерия паптидиых гормонов. III. Клонирование кДНК гормона роста свиньи и конструирование гена для экспрессии гормона л бактериях. - Молек. биология, 1988, г. 22, I, с.145-150.

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

ЖВИРБЛИС ГИНТАУТАС СТАНИСЛОВОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ ÍÍ11K ГОРМОНОВ РОСТА КУРИЦЫ И СВИНЬИ

БУМАГА ТИПОГРАФСКАЯ 60x84 1/16. ТИРАЖ 100 ЭКЗ. ЗАКАЗ 2196. ЛВ 11947. УСЛ.ПЕЧ.Л.1.00. ОТПЕЧАТАНО РОТАПРИНТОМ В ЦЕНТРЕ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ И ПАТЕНТНЫХ УСЛУГ.232000.ВИЛЬНЮС,Ю.ПАЛЕ11КИСА 27.