Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование кДНК гетерогенной ядерной РНК 19 хромосомы человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование кДНК гетерогенной ядерной РНК 19 хромосомы человека"

Гл<л

-а ■ "

РОССИЙСКАЯ АКАДЗШ НАУК ' ИНСТИТУТ БИООРГАНйЧЕСКОЙ 2Н ЛИ. М.и.ПНйШИНА и Ю.А.ОВЧ5СИКСОВА

Нэ правах рукогаси

ВАГНЕР ЛОРА ЛАУРЕНСОЕНА

КлОНИРОВАШ? кДНК ГЕТЕРОГЕННОЙ ЯДЕГНОЯ РЖ 19 ХРОМОСОМ! ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой- степени кандидата биолоютгских наук

\

Москва, 1994

Работа была выполнена в Институте биоорганической химии им. К.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель: члон-корреспоядент РАН, доктор химических наук Свердлов Е.Д.

Официальные оппоненты: члэн-корреспондент РАН, доктор медицинских наук Норочкин Л.К. кандидат биологических наук Эльдаров H.A.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится "/3 ¡У94- г. в "./¿9" часов

на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биооргашческой химии им. М.Ы.Шемлкина и Е.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганнческой химии им. М.т.Шмккинь и Ю.А.Сзчинникова РАН

Автореферат разослал 9/О ¡394 1'.

Гченмй секретарь сгодиалкзеровэянэго соьета кандидат xjMTieciüx наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Настоящая работа является частью проводили в рамках Государственной программы "Геном человека" исследований по физическому картированию хромосом человека. Конечной целью программы является шяввенпе и характеристика более 100000 генов человека, что позволило бы поставить дальнейшие биологические исследования на новый качественней уровень.

Прикладное значение программ заключается в идентификации тех гоноз, которые играют ключевую роль в наследгтвенных заболеваниях и в заболеваниях, связанных с приобретенными нарушениями генома.

Программа изучения 19 хромосомы человека включает картирование и секвеотрование функционально важных участков хромосома (в тон числе и зкспре с струящихся последовательностей), определение их роли и в конечвэм счете использование полученной информации для решения праиячоских задач, главным образом медицинских.

19 хромосома относится к числу наиболее изученшх: более 80S генетического материала хромосомы представлено в космидннх кензигах различной длины. Это определяет уникальную базу для получения физической карты хрхшсокы с локализованными, функциональными участкам. Сконструированы YAC библиотеки из гибридных клеток челоизк х грызун, содержащп из геномного материала человека только 19 хромосому. Секвенированпе гякДНК и кДЗК библиотек дает представительные наборы IST и STS маркеров 19 хрсаосоми и коллекции зондов для выделения соответствуйте генов.

Цель работа. Целью настоящей работа явилась разработка эффективного кетода акстр акции _ транскрибгфущихся человек-специфических последовательностей из гибридных плеточных линий человек х грнзун; получение хрокэсон-спецЕЗкчесигх библиотек гякДНК из гибридннг клеток, содераадих 19 хромосому человека.

Езучпгя nops3Hs н практическая цапность работы. Разработан ыэтод получения хромосоа-спзцп£ичвсянх йяблиотэк гжДНК из гибридных клеток, содержащих огдельякз хрсмосомц чзлоБэха, освовслшш па РСН амшшфикациз продуктоз обратяой травскряпцзи гяРНК с прз^ерами, специфэтшг.зт к Alu зовторам человека. Из гибридной клеточной линии GL-12-42, оодараащей 19 хрсмосэ?;у человека и фрагмента 22 и X хрокосои. получены бкбхиотел! гяк.ЕЛК, содорга^пе фрагмента Alu повторов н пралегакщче к ним фланкирующие участки.

Анализ последовательностей полученных клонов 'PCR цраймерами, сконструированными на основе этих последователностей, гибридизация полученных клонов с Alu-PCR ампмфшсатами гибридшхх клеток, содержащих различные хромосома чело зека, Саузерн блот-гибридиззция с рестриктами ДНК человека и китайского хомячка позволяют заключить, что с помощью данного метода можно получать- обогащенные библиотеки, содержащие до 98% человэк-специфгаеских транскрибирующихся последовательностей.

Из 59 прсзнализированних последовательностей 58 оказались различными ж не имеющими аналогий в EHBL банке. Можно предполагать, что в библиотеках представлена большая часть участков, акружапцих Alu повторы в экстре ссирующихся областях гении человека.

Для кДНЕ четырех последовательностей была определена хромосомная принадлежность соответствующих генов: три из них отнесены к 19 хромосоме и одна - к 22 хромосоме человека.

Фрагмента экспрессирующихся генов 19 хромосомы человека могут быть использованы в качестве STS/E3T маркеров хромосомы, в качестве проб для выделения полноразмврных генов и в качестве зондов в HFLP анализе.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТ РАБОТЫ

I. Стратегия клонирования человеческих транскрибирующихся последовательностей из гибридах клеток.

В данной работе использовалась гибридная клеточная линия GL-12-42, которая была получена путем субклонирования исходной гайридвой линии человек х китайский хомячок 6L12, содержащей t9, 22 и X хромосомы человека. Линия GL-12-42 содержала штериад 19 хромосомы человека, а также фрагменты длинного шэча 22 хромосомы и фрагменты короткого плеча X хромосомы, травслоцированные на хромосомы хомячка. Линия GL-12-42 бвяа любезно предоставлена Копанцевым Е.П. (ИБХ РАН).

' Схема дайной: работы приведена на рисунке 1. Человеческая гяРНК из зибрвдяых клеток отличается от гяРНК китайского хомячка наличием специфических Alu повторов. Это позволяет проводить специфический синтез человеческой гякДНК путем использоваия олигонуклеогадных праймеров, соответствующих определенна! областям Alu повтора (праймер Е, стадия 1). К

Гибридная клеточная' линия

КЛОНИРОВАНИЕ

I

СЕКВЕНИРОВАНИ Е

Стялия 1

Стадия 2

Стадия 3

Рис.!. Обцся схема создания обсащэЕзсй. глкДНК Сзблиотекя.

3' концу полученной первой цепи гякДНК добавляется олиго^dG)

- тэйл, и эта цепь служит матрицей для первого раунда PCR с использованием в качестве праймеров олиго(йС)2д - праймера ЕС и затравочного праймера £ для синтеза первой цепи гякДНК. Оба эти пра&вра содержали сайты для рестриктазы EcoRI. Во втором раунда PCR (стадия 2) использовали опять олиго (dC)20

- прийавр-, а и- mvsvra» вторит пршвира« вшггутоиг жзпий* праймар В, хараятеризупцийся двумя свойствами: 1) ■ его 5* -концевая последовательность перекрывается с 3'-концевой последовательность» первого внешнего праймера Е; 2) он содержит на 5'-конце сайт для рестриктазы BamHI (или Sau3A). Таким образов, продукт второго раунда PCR отличается от продукта первого раунда PCR тем, что он содержит на концах уже два разних сайта рестрикции, а не один. Благодаря этому продукт-Ii шкет быть дискриминирован от продукта-I в процессе клонирования (стадия 3). Для этого суммарный продукт PCR I и И расщепляли двумя рестриктазами EcoRI и BamHI (или БаиЗА) и клонировали в вектор, расщепленный этими же рестриктазами. Продукт PCR I при этом исключается из клонирования, а спеадфгшость клонирования транскрибирующихся человеческих последовательностей увеличивается.

Праймеры, использованные в данной работе, соответствовали З'кобцэвой части Alu повтора человека (рисунок 2); при этом использовались два варианта клонирования человеческих последовательностей. В первом варианте ("внутреннее" клонирование, рисунок 3) в качестве затравочного праймера для синтеза первой цепи гякДНК использовали модификацию известного праймера 517 (Nelson, 19911 с сайтом рестрикции EcoRI на б'-концэ (рисунок 2, таблица 1); при этом синтез гяфЩК шел внутрь Alu повтора. В качестве внутреннего первкрывапцагося праймера использовали праймер AIN3, содержащий BamHI сайт (рисунок 2, таблица. 1). Во втором варианте ("внешнее" клонирование, рисунок 4) в качестве затравочного праймера использовали праймер ALN1 (рисунок 2, таблица 1), содержащий сайт рестрикции EcoRI; при этом синтез гякДК вел наружу от Alu повтора. В качестве внутреннего праймера использовали модификацию праймера ТС-65 [Kelson, 1991] с сайтом рестрикции BamHI на Б'-конце (рисунок 2, таблица 1).

10!

100

_I

200

517

3' 5'

aacgtcactcggctctagcuCTTAAGac

î " ~~I

TGAACCCGGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCGCGCCAOTGOiCTCCA.

201

225

cctccgtctccaacgtcactcgCCTACGaac ALN3

Î50

TC-65

5' 3'

ggaGGATCCggttgcagtgaoccgagat

] ! i GCTTGAACCCGGGAGSTGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCGCGCCACTSCACTCCA...

201

225

.250

3'

cttGAATICcaggaggcagaggttgcagtga ALN1

Rio.2. KcscoHcyc Alu-no3iopoB и распологганиэ слигснуклзотздвнх праймароз, использующихся в Alu-PCR.

V

а о

О, 12-42

{ СЬт 19 )

кАМЙ рг«раг«ь!1оп

1Пг»1 >1гап<1 оМ) п|п1К>«1«

»■_=_ с517 ?

У-

1ЯО (<)С)-1»1ПГЗ.

5,......<И I__у

РСЯ-1

317 „

. 517

-

1 та

*

517

РСЯ-Н (1п1«гп*1>

НЮ

а_'_

и» .

I

СооМ • ЬыЭ« <11«п11оп, о|ап1п* 1п1в газлрде у*о1ог < ЕсоШ ♦ ><Ж1 )

I

5 С О 1] С N С 1 N0

<

Рис.3. Схвиа создания "внутренней" библиотеки.

2. Создание "внутренней" гякДНК библиотеки транскрибирупцихся последовательностей.

2.1. Анализ последовательностей клонов кз "внутренней" библиотеки.

Данная библиотека была получена главным образом для того, чтобы показать, что предложненный метод действительно позволяет избирательно получать человек-специфические последовательности путем сравнения Alu последовательностей из полученной библиотеки с известными Alu последовательностями. В данной схеме. (рисунок 3) использовали пару перекрывгщихся праймероз 517 и ALN3, направлявших синтез гякДНК внутрь Alu повторов.

Для ускорения секвестрования клонирование проводили непосредственно в вектор М13гар10. После второго раувда PCR ашиифицирсзанную смесь обрабатывали рестрнктазами EcoRI и Sau3A и клонировали в вектор М13шр10, обработанный EcoRI и BamHI рестриктазами. Поскольку Alu повтори чзсто содержат внутренние сайты SauSA, можно было отдать, что большая часть полученных клонов будет содержать только правую часть Alu повторов. Клоны для анализа выбирали случайным образом и секвенировали по методу Сенгера. Результата анализа приведены в таблице 2. Все последовательности, полученные в данной работе, депонировали в ЕИВЬ Data Bank. Полученные последовательности были разделены на две группы: содержащие и не содержащие Alu последовательности. Клона, содержащие Alu,имели характерные длины Alu последовательностей до Saii3A сайта: 60 п.о. (клоны 11, 12, 13, 17, 34, 50), Т4 п.о. (клон 47), 37 п.о. (клон 20) и 52 п.о. (клон 37). Эти данные соответствуют положению сайтов рестрикции Sau3A в различных вариантах человек-специфических Alu повторов .

Сопоставление Alu-подобных последовательностей из полученной библиотеки с ' последовательностями, депонированными в ЕИВЬ банке, показало высокую степень гомологии как с общей консенсусной последовательностью, так и с последовательностями отдельных представителей семейства, относящихся к различным классам Alu повторов. Это обстоятельство свидетельствует о том, что клонн "внутренней" библиотеки, содержащие Alu подобные повтори, являются человек-специфическими. Тем не менее нельзя, считать этот вывод неопровержимым, поскольку нельзя исключить существование в геноме китайского хомячка некоторого числа последовательностей с более высокой гомологией с Alu повторами человека, чем у описанной в литературе консенсусной последовательности "Alu-llKe" повторов хомячка.

Таблица 1

Структуры олштшуклсотмдных прянмероя, использованных я ргботс"^

П райнер С т руктура

В, ТС-65 ББ А С С АТС СБбТТБСАБТБЛбССбАБАТ ;

Е, AI.N1 СТ Т С Л ЛТТ ССАББАББСАБ АББТТБСАБТБА

Е, 517 САв Л Л *ГТС 6 СБАТСТСББС1САСТБСАА

В, А1Ю СА А С С АТССБСТСАСТБСААССТСТБССТСС

ЕС БАС Л Л ттС С сссссссссссссссссс

161 БАТ С Т С А Т ББССБАБСТТБТ

1 6Й БАА Т Т С А А ТТБААаТТБбАТТАТСАбБ

4 21 СТ А Т Б Б А Б АБББПСБААТСА

4 2Й ТБА Т Т ССТСССТБААТСТСАБ

551 БАТ С С А Б С С СБТБТББСТТСТСТБ

5 5Й АЛА 6 Л 6 Б С АААТАСБССААБТСАТС

Жирным шрифтом пыпелонм участки уэнаоания рестриктаз 8апН1 ■ ЕсоШ

Таблица 3.

Хромосомная локализация клонов из библиотек.

Клон Хромосома Метод локализации

12 19 Анализ гибридных клеток человек х китайский хомячок

42 22

55 19

249 19 Вют-гибридизация_ продуктов Ии-РСИ с ДНК из гибридных клеток

2.2. Анализ клонов, которые не содержат Alu повтори.

На основании трех известных последовательностей клоноз t6, 42 и 55, не содержащих Alu повторы (рисунок 5), были синтезированы праймерн (таблица 1), которге были использованы для PCR анализа ДНК гибридных клэток CL-12-42, ДНК исходной линии Iслеток китайского хомячка Ag-17-1 и ДНК фибробластов человека. Результаты данного анализа приведены на рисунке б. В случае клона 42 ДНК гибридного клева давала одну PCR полосу, размер которой (237 п.о.) в точности совпадал с с кидаемым для амплификации соответствующего фрагмента в геноме человека; при этом ДНК китайского хомячке не амплифицировалась.

В случае клона 55 также только ДНК гибридах клеток дазала продукт амплификации требуемого размера (198 п.о.); полосы соответствующего размера наблюдались тага» и в ДНК человека. Хотя в ДНК хомячка амгшфщировались некоторые дополнительные последовательности, их размеры не соответствовали окидаемым, поэтому можно считать, что вставка в клона 55 1акхе является человегс-сшвйической. Следует отметить, что помимо основной полосы в ДИК человека наблидалэсь вщэ одна полоса приблизительно в 450 п.о., отсутствующая в ДНК гибридных клеток. Возможно, что праймерц, использованные в амплификации, в этом случае детектируют семейство генов, только один член которого локализован на 19 хромосоме человека. То, что амплифицировалась ДНК хомячка, говорит о том, что данное сэмейство существует в данном случав с изменениями, естественники для сильно дивергировавших видов. Несмотря на сильные изменения, последовательности членов семейства достаточно консервативны; поэтому использованные праймеры способны их амшшфицировать даже в различных видах.

Другая картина наблвдалась з случае 16 клоза. Полоса ожидаемой длины (162 п.о.) выявлялась только при PCR амплификации ДНК, выделенной из клеток китайского хомячка и из гибридных клеток, но пе человеческой ДНК. Следовательно, этот клон содержал фрагмент генома китайского хомячка.

В целок из 1А проанализировнннх клонов "внутренней" библиотеки 13 оказались человек-специфическими (2 клона - по данным PCR анализа, остальные - по нэличзю Alu повторов) и один представлял собой хомячок-специфический клон. Таким образом, коихо счлтать, что полученная наш "внутренняя" гякДНК библиотека 19 хромосом: содержат приблизительно Э2% человек-специфиче ских последовательностей.

3. Созданас "пнешней" гякДНК библиотеки трапсхркбяругвдгсх: последовате.чьностей.

В нашем методе полуьчниь "внешней" гякДНК библиотеки 19 хромосомы (расунск 4) мы роаагзовал: в гаиной степени возможности пренчуще еденного использовании переетизавдихся прайкеров (см. шлэ), а именно использование во втором рэунде ?СН перекрывалиегося внутреннего прайисра для увеличения специфичности амплификации з возможность осуществлять клою»ровинио конечлл'о ам.хтафвдгрсзанпого продукта, дшфИтпнаруя при этом клонирование продукте PCR I благодаря величию в лра2мврах (для первого и второго раундов PCR) различна сайтов узнавши» рестриктаз.

Следуя данной схеме, мы использовала пару перокрывакзшхея праймероз АШ л ТС-65, направлявших синтез гякДНК наруяу от Л1и поЕтороз. Благодаря этому наи удалось получись последовательности, в которых только небольшая часть (вз ц.о.) приходилась на Alu повторы, а остальная часть захватывала последовательности, пркмжащиэ к 3'-кошту Alu повторов. Сукларный продукт амплификации после второго раунда PCR is расщепляли рветриктазами EcoRI и ЕашНТ, а затем клонировали в плазшщный вектор pGBI-3Z, обработанный этими же рветриктазами. Для дальнейшего секвенировяттия вставку из вектора pGSi-3Z мы переклонировывачи в вектор М13шр10, расщепленный EcoRI и BamHI эндонуклеазами рестрикции. Поп использовании данной схемы мы планировали получить большее обогащение библиотеки специфическими человеческими последовательностями, чем в случае "внутренней" библиотеки, и кроме того, средний размер клонированных вставок во "внешней" библиотеке должен был быть выше, чем во "внутренней", так как были использованы редкощепящие рестриктазы.

3.1. Анализ последовательностей клонов из "внешней" библиотеки.

Некоторые случайно отобранные клоны из "внешней" библиотеки были просеквенированы. Большинство клонов содержало на одьон из концов последовательность ТС-65 праймера, за которой следовала ожидаемая короткая последовательность, соответствующая правой 3'-концевой части Alu повторов с характерным poly(A) треком, а затем следовали уникальные последовательности генома человека, примыкающие к Alu повторам справа. Отсутствие Alu последовательностей в некоторых клонах, видимо, связано с наличием BamHI сайтов в последовательностях, примыкающих к Alu повторам.

//

5'

СМ

СМ сн

СИ ЦТ-

( СЪя- 19 )

НЫЭД рггр.г»! 1 ол

1Пп| <1гал4 етя *уп1Ьм1а

_е^у

3«-э.

|о1 (<*С>-|а111п>.

л .... ""О

РСЙ-1

сМ ом

юо

-

I тс-сз

1РСЯ-П (1п1ггл

ПН! |гл«1)

ЕооИ ♦ ВяЖ1 <11x111оп, «1оп1»9 1п1о рСЕМ-31 мо)»- ( СюЯ1 ♦ МП >

С1оо1л1» 1п1о №3лр1в СЕеоП*»лЫа>

ЗЕЧиСНС|НС

5

Рис.4. Схема создания "внешней" библиотеки.

3.2. Анализ клоноз, иупцих два участка гомологии с Alu повторами.

■ В случзе ряда клонов в последовательностях вставок наблюдались дза участка гомологии с Alu повторами (таблица 2). К таким клонам относятся клоны 12R, 37R, 80R, 122R из "внешней" библиотеки. Причины этого требуют дополнительного анализа. К настоящему времени такой анализ прозоден для одного глот из такой серии; это клон 11 из "внутренней" библиотеки. В целях анализа были синтезированы два праймера, соответствовавшие концевым последовательностям вставки и проведена PCR амплификация чэлсвеческой ДНК; при этом длина продукта ашлификации соответствовала ожидаемой (на основании расстояния между праймэрами). Следовательно, эта проклонированная последовательность со сдвоенным Alu повтором действительно содержится в геноме человека.

Таким образом, полученная "внешняя" библиотека, так же как и "внутренняя", является человек-специ$ической библиотекой. В этой библиотеке мы не обнаружили ни одного хомячок-спещфпеского клона среди 45 проанализированных клонов. Два клона из данной библиотеки оказались полностью идентичными. Полученные результаты свидетельствуют о том, что "внешняя" библиотека, как мы и ожидали, представляет собой более специфическую библиотеку, чем "внутренняя" библиотека.

4. Доказательство происхождения клонов из гяРНК.

Использованный в данной работе метод выделения гяРНК в значительной степени обеспечивает отсутствие в ней примесей ДНК и, .следовательно, гарантирует и происхождение большей части клонов в полученных библиотеках из транскрибируемой части генома. Однако, принимая во внимание, что первичная структура полученных образцов гяРНК полностью совпадает с соответствующими участками геномной ДНК, мы проводили дополнительные эксперименты для подтверждения того, что клоны полученных библиотек действительно происходят из гяРНК.

С этой целью ш получали PCR-фрагменты ДНК с использованием специфических праймеров, синтезированных на основе уникальных последовательностей .42 и 55 клонов (рисунок 5), на матрице гяРНК, которую подвергали серии обработок. Применение уникальных праймеров гарантирует отсутствие артефактов, связанных с отжигом на повторяющиеся последовательности патрицы. В лаяннт экспериментах в качестве затравки для синтеза первой цепи гякДНК

в

а). рШ6/1ЛВ 10

20

GATCTGATGC CCGAGCTTGT С

30 40 50 .60

ACAGGGC Т Т ATACTGAAGC ATCTCTCAGA AATCATAAAG

L

7 0 КО У 0 100 110 120

СТАТТАТСТТ AAAGAAAGCC АТТТТПТАА CTTACTAGGG AGAGGGCATG GTGAAAAATG

130

CATTGGCAGT TTAG

!)). рН42/1ЛВ 10

GATCC

140

150

160

ССТСАТ ААТССААА G Т TCAATTGAAT ТС

20

30

43

.50

60

CTATG GAGAGGGTTC GAATGA

GGAG CGCTGGGCAG GGCAGGAGTG AGGAAGGAGG

711 XII чч юо но 120

TAATGGCACC AACTGGCCTC TGC Т ТТТАТС TTGGGGTATT САСССААССТ TTTCTGGAAA

13(1 N1) ISO 1Ö0 170° 180

CCATCTGCAA AATGTCTCCC ' ATTTTGTGTG AGGACTAGGA GCTAGACCAG GCTGGGGCTG

190

TGGTCTATGG AGA

200

210

CTGAGAT TCAGGGAGGA АТСА

220 230 237

TTCAGA TTCAGTAACC AGAATTC

c). pHSS/lAB. 10

20

GATCCAGCCC GTGTGGCTTC TCTG

30 40 50

AGCTCA GCCCCTAAAA CTACCCTCTC

I.

60 711 ХП 90 100

CGTCACTCAA CTCACAGGGG ACTTCTGATT CTGCCTCAAA CGTTGGCCAG

110 120 130 140 150 GCTACCCCAC TCCTCAGACT ATTGGCGTCC CACGTCCTTC TCCTrGGAAC

160 170 ISO 190 . 198

GCTGCTCTCT CAGATTGGCC

CATGACTTGG CCTATTTGCC TCTTT

CAA <

Рис.5. Структуры некоторых Alu-несодерхащих клонов. В рамки заключены участки, соответствуйте спвцифгавским праймерам (см. таблицу 1). Стрелками обозначены направления синтеза новых цепей в реакции PCR.

и

1 2345678 9 М

Рис.6. PCR-анализ некоторых клопов "внутренней" библиотеки:' •■

Матрицей служила геномная ДНК китайского хомячка (дорожи 1.4;?). человека (дорожки 2,5,8) или гибридной клеточной линии (дорожки 3,6,9) в реакции PCR со спещфгеоскими праймерами для клонов'16 (1,2,3), 55 (4,5,6) и 42 (7,8,9). Дорожка М - молекулярный маркер длин.

1 2 3 4 5 6 М ■нваннн ьР

-198

Рис.7, Доказательство происхождения клонов из гяРНК.

Получение РСЙ-фрагм^нтов ' с использованием пари специфических праймеров. В качестве матрицы для синтеза первой , цепи гя^ЩК использовали гяРНК, предварительно обработанную ДНКазой (1); гяШС, обработанную РВКазой А (2) и гяРНК без каких-либо специальных обработок (3). Дорожка 4 - исходная гяРНК; дорожка 5 - геномная ДНК человека; дорожка б - геномная ДНК китайского хомячка. Дорожка и молекулярный маркер длин.

исяольз'озался внешний 517 лраймэр. На рисунке 7 приведены результаты для случая 55 клона. Kaie видно на рис ржа, ггрэдизрйтвлъняя обработка препарата матрицы гяРНК РККазой прлводрлз к полному отсутствия PCR атллифжацют, в то время как обрасютка препарата матрица гяРНХ ДНКазой не влияла на эффективность PCR амплифякатдаи. Сопост&злзпне данных результатов о контрольными образцами позволило сделать вивод о том, что нами бил получен к использован свободный от ДНК образец гяРНН, о -также, что последоБатэлькости 42 и 55 клоноз присутствуют среди молекул гяРНК. Два этих клона были выбраны для данного анализа слзиаЯвкм образом.

5. Подтворздеше человек-спецгфячности клопов из "внепЕяей" глкДНК библиотека.

5.1. Ехот-гибридизация с Alu-PCK. фрагментам ДНК гибридных клеток.

С помощью nppöv.opa ТС-65 были полученн Alu-PCR фрагмепты кз ДНК клеток человека, китайского хомячка и мыши (использованные в качестве контроля), а также из гибридных клеток человек х мышь (Hag Go-4, Rag Aril у-1, Rag 194-7, MS2 E82-1a-14-1, V79 Iy~3-2), любезно предоставленные профессором Гржешиком К.-Х. (Институт генетики человека, Марбург, ФРГ) и Копанцевым Е.П. (ИБХ РАН). Эти полученные Alu-PCR фрагменты гибрвдизовали на блотах с мечеными вставками из "внешней" библиотеки клонов 2R, 7R, 31R, 21 OR. 249R, 261R, 263R, 273R, 280R, 286R, 316R, 320R и 357R (рисунок 8). Все пробы гибридизовались с Alu-PCR фрагментами из ДНК человека и гибридных клеток и не гибридизовались с Alu-PCR фрагмэнтами из ДНК китайского хомячка или мыши. Эти результата явились подтверждением того, что данные клоны являлись человек-специфическими. Более того, вставка 249R клона гибридизовалась с одиночным А1ц-РСЯ фрагментом ДНК человека и с ДНК линии гибридных клеток, содержащей 19 хромосому, и не гибридизовалась с Alu-PCR фрагментами ДНК других клеточных линий, которые 19 хромосому человека не содержали. Этот факт позволил локализовать последовательность 249R клона на 19 хромосоме человека.

5.2. Саузерн блот-гибрцдизация.

Для клонов 239R, 244R, 257R, 263R, 326R и 338R была проведена Саузерн блот-гибридизация меченых вставок с EcoRI гидролизатами геномной ДНК человека, китайского хомячка и мыши. В использованных условиях гибридизации пробы гибридизовались только с одиночными фрагментами геномной ДНК

1 2 3 4 5 6 7 М

Рис.8. Подтверждение человек-спещфганости клонов.

Блот-гибридизация Alu-PCR фрагментов ДНК человека (1), ДНК линии клеток мшпт RAG (2), ДНК линии клеток китайского хомячка РЗ (3), ДНК гибридного клона HS2 £82 (4), ДНК гибридного клона Rag Anlyl (5), ДНК гибридного клона Rag GO-4 (б), ДНК габраднсго клона 779 Ьу-3-2 (Т) с меченной вставкой 249R клона из "внешней" библиотеки. Дорожа М -молекулярный маркер длин.

123 123 123 123 123

-244- -263- -269- -326- -338-

Рис.9. Подтверждение человек-специфичности клонов. Геномная ДНК человека (1), китайского хомячка (2) и мыши (3) была обработана растриктазой ЕсоКГ и бнл проведен Саузерн блот-анализ меченными вставками клонов 244Н, 263Н, 269Н, 32611, 338Н из "внешней" библиотеки.

человзка (рисунок 9). Эти данные еще раз свидетельствуют о весьма существенном обогащении полученных библиотек человек-специфическими кДНК последовательностями, которое было достигнуто при использовании нашей схемы клонирования и получения гякДНК.

Суммарные данные по клонам из "внутренней" и "внешней" библиотек приведены в таблице 2.

6. Хромосомная специфичность клонов из полученных библиотек.

Для хромосомной локализации клонов 12, 42 и 55 из "внутренней" . библиотеки были использованы гибриды соматических клеток человек х грызун, содержащие различные наборы хромосом человека. Панель гибридных клеток была любезно предоставлена Копанцевым Е.П. (ИБХ РАН). В результате кДНК последовательности клонов 12 и 55 были отнесены к 19 хромосоме человека, а последовательность 42 клона - к 22 хромосоме человека (таблица 3).

На основании онтогенетических и биохимических характеристик гибридная клеточная линия ИМ 2-42 считалась первоначально моноссжком по 19 хромосоме человека, однако факт обнаружения фрагмента 22 хромосомы среди проанализированных клонов дал основание предположить, что гибрид Я«-12-42 содержал человеческий материал не только 19 хромосомы, но и 22 хромосомы.

Цриведенные данные свидетельствуют о том, что обе полученные гякДНК библиотеки высоко специфичны. Предложенный в данной работе метод РСН-экстракции можно использовать с высокой эффективностью для выделения транскрибирующихся человек-специфических последовательностей из гибридных клеток человек х грызун, содержащих индивидуальные хромосомы или фрагменты индивидуальных хромосом человека.

Действительно, из 59 проанализированных клонов в обеих наших библиотеках только один (т.е. около 21) оказался хомячок-специфическим, тогда как все остальные клоны были охарактеризованы как человек-специфические. В предыдущих работах получали максимально 80$ человек-специфических клонов в гякДНК библиотеках; при атом 12% клонов являлись хомячок-специфическими ССогЬо е^а].., 1990),

Итак, нами был разрзботан достаточно • простой и очень эффективный метод получения библиотек, обогащенных человеческими транскрибирующимися последовательностями, метод, основанный на специфической РСН амплификации

продуктов обратной транскрипции гяРНК с последующим клонированием гякДНК из гибридных клеток человек х грызун.

7. Ожидаемое число независима клонов в библиотеках.

Исходя из того, что в геноме человека присутствует около

500 тысяч копий Alu повторов, из которых около 2% находится на 19 хромосоме, а также полагая, что в гибридных клетках экспрессируется от 105 до 305 генов, можно ожидать, что число независимых клонов во "внутренней" и "внешней" библиотеках может варьировать от 1000 до 3000.

К настоящему времени нами проанализированы последовательности 14 клонов из "внутренней" библиотеки и 45 клонов из "внешней" библиотеки. Только два клона (из "внешней" библиотеки) оказались идентичными.

8. Получение и анализ упорядоченной библиотеки транскрибирующихся последовательностей 19 хромосомы человека из гибридных клеток человек х китайский хомячок.

При использовании описанного выше метода экстракции человек-специфических транскрибирующихся последовательностей была получена упорядоченная библиотека гякДНК ("внешняя") 19 хромосомы человека. Мы считали, что библиотека должна содержать от 1000 до 3000 независимых клонов (см. выше раздел 7), и поэтому создали упорядоченную гякДНК библиотеку, содержащую 2400 клонов (25 планшетов по 96 лунок). Приблизительно 75% клонов этой библиотеки содержит вставки, длина которых варьирует от 100 и.о. до 600 п.о.

2.0

Таблица 2.

Характеристика клонов из библиотек.

Номер клона HJBL acces- slon number Общая длина (н.о.) Сравнение с Alu консенсусом

Комплементарная Координаты консенсуса % гомологии ) с консенсусом

11 Z22523 225 + 1-61 85,2

12 Z22531 172 + 1 - 63 85,7

13 Z22530 87 + 1 - 76 75,0*

14 Z22529 181 - - -

15 Z22524 244 - - -

16 Z22581 162 - - -

17 Z22578 78 + 1 - 44 79,5

20 222582 193 + 134 - 170 94,5

34 Z22580 195 + 1 - 62 87,1

37 Z22583 257 + 23-85 93,7

42 222575 237 - -

47 222579 172 + 1 - 71 81,6

50 Z22584 206 + 1 - 62 85,5

55 Z22585 198 - - -

2R Z22609 298 + 8 - 77 90,0

3R Z22634 343 - - -

7R 222.62.5 395 + 1 - 58 63,8"

12R Z22589 283 + 79 - 283 85,3

13R Z22593 276 + 1-76 89,04

14R 222597 327 + 1 - 71 91,5

21R 222599 320 + 1 - 72 93,0

22R 222602 218 . + 1 -73 89,0

29R 222608 243 4 1 - 71 89,0

31R Z22610 344 + 1 - 73 76,7***

37R 222626 280 + + 1 - 51 109 - 263 80,4 87,9

Номер клона EHBL accession number Общая длина (н.о.) Сравнение с Alu консенсусом

Компле-иентар-ная Координаты консенсуса % гомологии с консенсусом

51R Z22632 263 + 1 -73 86.3

80R Z22622 311 + 118 - 311 87,5

122R Z22586 316 + 1 - 67 237 - 275 86,0 79,6

202R Z22623 194 + 3-75 91,7

206R 222628 123 + 3-75 86,3

21 OR 223123 .600 + 8-69 85,2

21 IR 222633 307 + 7-70 92.2

213R 222946 304 + + 7-72 171 - 269 87,9 87,9

216R Z22624 227 * 3-60 86,0

218R НО 375 + 7-71 87 - 341 90,8 83,1

220R Z22627 64 1 - 53 84,9

221R 222939 371 + 8-72 89,4

224R Z22630 105 + 19 - 79 80,3

225R 222629 119 + 3-75 87,7 •

239R Z22960 331 + 7-71 92,3

244R 223124 380 + 8-69 93,5

249R Z23150 500 + + 7-80 159 - 424 76,7 72,2

25TR Z22631 163 + 3-76 87,8

261R 222962 262 + 7-69 82,5

263R 222941 392 + 7-67 78,7

269R Z22943 367 + 7-71 73,8****

270R Z23120 300 + 8-69 87,1

273R Z22940 368 + 7-70 88,9

280R Z23122 293 + + 7-70 94 - 290 93,7 79,0

2e6R 222942 313 + 7-70 92,2

Номер клона EMBL accession number Общая длина (н.о.) Сравнение с Alu консенсусом

Комплементарная Координаты консенсуса % гомологии с консенсусом

291R Z22938 363 + + 7-72 159 - 347 87,8 85,2

298R Z22961 318 + 7-72 86,4

301 Р. Z22944 291 + 8-72 86,1

316R ■ НО 489 НО ■ НО НО

320R 223125 500 + 7-70 87,3

326R 222945 348 + | 8-71 84,4

338R НО 320 НО i НО НО

357R Z22963 283 + ! 7-48 + j 87 - 276 92,8 86,8

F - Клоны из "внешней" библиотеки, остальные клоны из "внутренней" библиотеки.

НО - Последовательность не определена.

В таблице приведена длина отсеквенированной части последовательности.

+ Последовательность комплементарна обычно приводимой в статьях последовательности.

Координаты даются относительно начала нашей последовательности.

- Последовательность не содержит фрагмента, гомологичного Alu-последовательности.

* Гомология в 82,92 наблюдалась ^последовательностью НОМЕРА -Н tJurka and Smith. 19881.

** Гомология в 89,455 наблюдалась с последовательностью . H0MAP0AI1.

*** Гомология в 82,2% наблюдалась, с последовательностью E0MIPA 9. ' *'

**«* Гомология в 87,7% наблюдалась,с. последовательностью Н01ШВА4-3.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод высокоспециЗического клонирования транскрибирующихся последовательностей человека из гибридных клеточных линий, содержащих определенные хромосомы человека.

2. На основе развитого метода созданы две библиотеки гякДНК, обогащенные специфическими транскрибирующимися последовательностями 19 хромосомы человека.

3. Три кДНК из обогащенных гякДНК библиотек отнесены к 19 хромосоме человека и одна т- к 22 хромосоме человека.

Основные результаты диссертации излогены в следуицкх публикациях:

1. Kopantzev Е., Launer G., Lebedev Y., Wagner I., Borodin A., Sverdlov E. Construction сЬготгсэошс-вресШс libraries of transcribed sequences. Chr 19 - specillc hncDlIA and сША libraries. - in: Abstract of genome mapping and sequencing conference. Cold Spring Harbor, Kay 12-16, 1993, p.134, CSH, NY.

2. Вагнер Л.Л., Бессараб Д.А., Копанцев Е.П., Бородин A.M. АШ1 и А1Л5 - новые олигонуклэотидные прайкеры для Alu-FCR - анализа ДНК человека. Биоорганкчеисая химия, 1993, т.19, ШО, с.1013-1016.

3. Обрадович Д., Бородин A.M., Копанцев Е.П., Вагнер Л.Л., Волик С.В., Ермслзбва О.Д., Лебедев В.Б., Монастырская Г.С., Свердлов Е.Д. Получение и характеризация упорядоченной библиотеки транскрибируемых последовательностей человека из гибридных, клеток человек-хомяк. Биоорганическая химия, 19Э4, в печати.