Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и молекулярный анализ генов glnB и glnA у пурпурной несерной бактерии RHODOBACTER SPHAEROIDES 2R

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и молекулярный анализ генов glnB и glnA у пурпурной несерной бактерии RHODOBACTER SPHAEROIDES 2R"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМ.Н.И.ВАВИЛОВА

ШЕСТОПАЛОВ ВАЛЕРИЯ ИВАНОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ И ЮЛЕКУЛЯРНЬЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ е1пВ И й1пА у ПУРПУРНОЙ НЕСЕРНОЙ БАКТЕРИИ ЙЮЕЮВАСТЕЗ? БРНАЕЮШЕЗ 2Я

03.00.15 - генетика

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

!.5ссква 1993

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции биологического факультета Московского Государственного Университет« имени М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук ЗИНЧЕНКО В.В.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук ЦЫГАНКОВ Ю.Д.

кандидат биологических наук РОМАНОВА Ю.М.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита состоится"_"_1993г. в_часов

на заседании специализированного Ученого Совета Д002.49.1 при Институте Общей Генетики им Н.И. Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва. В-333, ул.Губкина,3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Общей Генетики юл.Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан"_"__1993г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

ПОЛУХИНА Г.Н.

«туальность проблемы Одним из актуальных вопросов современной 'енетики микроорганизмов является изучение генетического контроля процессов ассимиляции азота и его соединений. Проблема меет не только фундаментальное теоретическое, но и большое рактическое значение в связи с задачами повышения продуктив-ости сельскохозяйственных культур, биосинтеза белков и неза-;енимых аминокислот, снижения затрат на производство азотных добрений.

В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении енетического контроля азотистого метаболизма у бактерий. Цен-ральная роль в этом процессе отЕедена глутаминсинтетазе (ГС), одируемой геном glnA. Наиболее полно механизмы регуляции син-еза и активности глутаминсинтетазы и сопряженные процессы зотистого метаболизма изучены у представителей энтеробактерий Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Klebsiella neumoniae. Экспрессия гена glnA контролируется системой общей егуляции азотистого метаболизма - ntr-системой. Гея ginА вхо-ит в состав оперона glnAntrBC (Pahel,Tyler, 1979). ГС энтеро-актерий подвержена регуляции и на посттрансляционном уровне утем ковалентной модификации ее субъединиц, осуществляемой денилилтрансферазой, а также путем катаболитной репрессии родуктачи метаболизма глутамина. У К. pneumoniae, способной иксировать молекулярный азот, ntr-система принимает участие в егуляции экспрессии nif-генов, координируя, таким образом, се пути ассимиляции азота в клетке.

Азотистый метаболизм у бактерий может быть сопряжен с раз-ичной энергетикой, и прежде всего с фотосинтезом. В связи с тим в последнее время активно ведется исследованиие регуляции зотистого метаболизма у фототрофных азотфиксирующих бактерий емейства Rhodospirillaceae. Интерес к пурпурным бактериям бусловлен их уникальными физиологическими и биохимическими войствами. Они могут расти фотоавтотрофно, фотогетеротрофно и емогетеротрофно, способны ассимилировать молекулярный азот и глекислый газ, выделять молекулярный водород. Модельными объ-ктами для изучения генетического контроля азотистого мета">о-изма " пурпурных бактерий стали R.capsulatus и R.sphaeroides. R.capsulatus и R.sphaeroides клонированы и частично секвени-овакы многие гены, контролирующие азотистый метаболизм: glnA, InB, nifRl, nifR2, nifR4, nifR5, adg ( Шестаков и др.. 1935;

- г -

Avtges et.al. ,1985-, Kranz, Haselkorn, 1985; Jones, Haselkorn, 1989). Обнаружена заметная гомология между генами glnA, glnB, ntrC, ntrB и ntrA(rpoN) этих бактерий и энтеробактерий (Avtgeí et.al.,1985; Kranz,Haselkorn,1985; Jones,Haselkorn, 1989). Показано, что y R.capsulatus экспрессия nif-генов (кроме ген; nlfА) контролируется ntr-подобными генами: nlfRl(ntrC), nlfRí (ntrB), nifR4 (ntrA), а также геном adgA, функция которого пока не ясна (Zlnchenko et.al.,1989). У фототрофных диазотрофо} в отличие от гетеротофных диазотрофов ntr-подобные гены 'ш принимают участия в регуляции ассимиляции связанных источнико! азота. Единственным известным (у пурпурных бактерий) к настоящему времени геном, продукт которого вовлечен не только в регуляцию азотофиксации,- но и в регуляцию азотистого метаболизме в целом, является ген nifR5 (glnB), который входит в состаз оперона glnBA (Kranz et. al., 1990).

Ген glnA y R.capsulatus организован в оперон glnBA, ere экспрессия регулируется в зависимости от наличия в среде дос-• тупкых соединений азота. Показано, что у пурпурных бактерш инактивация гена glnA приводит к появлению мутантов с плейот-ропным нарушением азотистого метаболизма. Кроме того, что эй мутанты являются ауксотрофами по глутамину, синтез и активность нитрогеназы (фермента, осуществляющего фиксацию молекулярного азота) у них утрачивают способность к регуляции ионам! аммония (V/all,West 1979; Shestakov et.al.,1988). Исследование регуляции синтеза и активности ГС у пурпурных бактерий наряда с изучением Gin-мутантов поможет глубже понять молекулярнук природу процессов азотистого метаболизма этих фототрофных бактерий.

Цель работы. Диссертация посвящена изучению молекулярно-ге-кетической организации фрагмента хромосомной ДНК пурпурной бш терии R.sphaeroldes, содержащего ген глутаминсинтетазы glnA.

В задачи данной работы входило: клонирование гена glnA R.sphaeroldes и определение его нуклеотидной последовательности, а также нуклеотидной последовательности прилежащих к нем} районов хромосомы; выявление открытых рамок с лтывания секве-нированного фрагмента ДНК и анализ кодируемых им белков в системе мини-клеток; сравнение белков R.sphaeroldes, кодируемы> открытыми рамками считывания в пределах секвенированного фрагмента, с гомологичными белками других микроорганизмов; клони-

ование и определение нуклеотиднсй последовательности мутант-ой копии гена glnA мутанта Gln83.

Научная новизна и практическая ценность работ»- Клонированы ¡рагменты хромосомной ДНК R.sphaeroides, содержащие ген glnA. 'становлено, что у R.sphaeroides ген glnA входит в состав one-юна glnß-glnA, в лидернсм районе которого обнаруяены последо-(ателыюсти нуклеотидов, сходные с каноническими регуляторными юследовательностями: промотором glnApl E.coli, NTRC-связываю-;им сайтом, UAS-последовательностью. С помощью секвенирования остановлено, что мутация glnA83 обусловлена заменой G->A в {ентральной части гена glnA, что должно приводить к преждевременной терминации трансляции. Установлено, что 3'-концевая íacTb гена glnA может транскрибироваться с внешнего промотора з образованием укороченного белка, способного комплементиро-вать мутацию glnA83 по механизму мекаллельной комплементации.

Полученные результаты позволяют по-новому рассматривать систему регуляции азотистого метаболизма у пурпурных бактерий.

Клонированные гены могут быть использованы как зонды для выявления гомологичных генов у других микроорганизмов.

Объеи и структура дкссертацш. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, изложения ре- ■ эультатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на _стр. машинописного текста и содержит рисунков и таблиц.

Апробгазоз пзботм. Материалы диссертации доложены на 17 конференции молодых ученых,МГУ,Москва; на семинаре "Молекулярные основы генетических процессов" ЙОГ РАН, на международном конгрессе "Nitrogen fixation:100 years after", Кельн. ФРГ,1988г.

?:р:аяхк'э сокрацзии-я. ГС-глутасасиптетааа; т.п.л.- тысяча nao нуклеотидов; ORF-открытая рамка считывания; а. о.-аминокислотный остаток; кСа-килодачьтон.

НАТЕРШШ И f 'STOZy Бактериальные штаммы. В работе использовали штаммы R.sphaeroides дикого типа 2R, и полученный из него ауксотрофный по глута?-;;:ну мутант Gln83 (Shestakov et.al, 1983) и штаммы E.coli: С600, HBlOl, Q358, Q359. ВНБ2688, BHB26S0, LE392, T61, из коллекций кафедры генетики и селекции МГУ и ЗКМ ВНИИГенетика. Сведения о плазмидач, использованных в работе, представлены

в таблице 1.

В качестве полноценной использовали среду LB, в качестве минимальной - среду А с необходимыми добавками витаминов и аминокислот (Миллер, 1S76). В экспериментах по определению ферментативных активностей клетки R.sphaeroldes выращивали на среде Ормерода (Ormerod et.al. ,1961), содержащей в качестве источника азота сульфат аммония или одну из аминокислот (глу-тамат натрия, глутамин) в концентрациях ЮптМ.

Таблица 1 Бактерпзльвыб щцемиду. использованные в работе.

плазнкда генотип источних/ссилка

г. г г

рвюг5 Ар le Cm БоИтаг,ЕоЛг1еиег. 1978

р?Б71 Саг, ntrA de Brul+Q et.al., 1387

рОЕЮЛ Арг ntrBC Espla et.al., 1S82

PJV27 Apr, glnA (R.capsulatua) Scolnic et.si.,1983

г г г +

PYZ209 IncQ. Su Si la Kob Zlnchenlca et al..1335

M13tg130.131 Kieng et al., 1983

Р152 * * + IncQ, Su Km, liob данная работа

р2ог IncQ, Su Soi .ghjBAlE.sphaerolSes) данная работа

р229 IncQ, Su Ko .glcBÍE.sphaeroides) данная.работа

г г +

PASO-121D3 IncP Ap Km Sra дубе&соасхиз, 1334

г г +

EÎ1-7 IncP Ар Тс Ira коллекция кафздра

генеттая к сежкцет КГТ

Аятибиоиао! добавляли в следующих концентрациях (ыкг/ыл для E.coll: ашициллин - 50, канамицин - 50, хлорамфенккол -20, стрептомицин - 50, тетрациклин - 10; для R.sphaeroldes: канамицин - 50, стрептомицин - 50, тетрациклин - 1.

Каньюгацно;;нц& скриццЕання проводили на мембранных фильтрах на среде LB, как описано ранее (Zinchenko et al., 1984).

Вцдэлгюзэ идазмидпой Д8К из клеток E.coll, трансформации клеток E.coll, а такяе электрофорез ДНК в горизонтальной ага-розном геле проводили по стандартным методикам (Ыгниаткс и др., '1984). ДНК из агарозньсс гелей элюировали по описанной методике Дрейпер и др.(1991).

Для опредакгикя вуклзоЕздаой сооподавахел^изстн фрагменты ДНК клонировали в составе фаговых векторов Ы13 серии tz- Сек-венироЕание проводили методом тершгнировакиа синтеза цепи на

одноцепочечкой ДНК-матрице в присутствии дидезоксинуклеотидов (Sanger et al., 1977; Tabor et al., 1987).

Получение мини-клеток штамма E.coll рб78-54 и трансляцию полипептидоз, кодируемых плазмвдой, проводили по стандартной методике (Хеймс, Хиггинс, 1987). Электрофорез в ПААГ-ДСН проводили по методике описанной ранее (Hames, 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Конструирование банков генов R.sphaeroides. Для конструирования банков генов R.sphaeroides был использован фаговый вектор замещения AL47.1 (Loenen, Вгатлшг,1980). Было сконструировано два банка: в одном клонирование производилось по сайтам узнавания рестриктазы EcoRI, в другом - по сайтам рестриктазы BamHI(Sau3A). Расчетная вероятность обнаружения индивидуального однокопийного гена в них превышает 99%.

Скриннинг банков генов R.sphaeroides проводили мотодом гибридизации 'амплкфицировачных In situ гибридных бактериофагов с радиоактивным ДНК-зондом. В качестве зонда использовали плаз-миду pJV27, содержащую структурный ген glnA R.capsulatus (Scolnlc et.al.,1983). Было выявлено несколько независимых клонов гибридных фагов,содержащих вставку хромосомной ДНК, гомо-погиичную структурной части гена glnA R.capsulatus. Для дальнейшего анализа были отобраны три гибридных фага: Е91, Е101 и 3215. Для этих трех фагов были построены физические карты и определен размер клонированных фрагментов, который составил 3,4 т.п.н., 4,4 т.л.н. и 12,6 т.п.н., соответственно (рис.1).

Клонированные фрагменты хромосомы R.sphaeroides гибридизо-зали с известными генами других бактерий, продукты которых участвуют в азотистом метаболизме бактериальной клетки. Этот этап работы имел целью определить генетическую структуру исс-недуемого локуса хромосомы R.sphae.oiaes. В качестве зондов в. зпытах по блот-гибридизации использовали фрагменты нуклеотид-шх последовательностей генов ntrB, ntrC и ntrA. Источником фрагментов. в этом случае, явились: плазмида pGE104 (Espin et. al.,1982), содержащая гены ntrB и ntrC Klebsiella pneumoniae, i плазмида pFB71, содержащая ген ntrA (de Bruijn et.al.,1987). (гк в случае ntrB и ntrC, так и в случае ntrA гомологии с исс-гедуемыми гибридными фагами обнаружено не было.

Локализация гена glnA ка клонированных фрагментах

При помощи гибридиззциониого и рестрккционного анализов Ош установлено, что EcoRI-фрагменты 3,4 и 4,4 т.к.п тесно сцегш ны и перекрываются ЗаиЗА-фрагментом из фага S215 размером 12, т.н.п.. Для изучения клонированных в гибридных фагах Е91, Е1С и S215 фрагментов хромосомной ДНК в клетках R.sphaeroides, oi были переклонирозаны в плагмвду pV2209 с широким кругом xoss ев. В результате были получены плазмиды: р152 и р22Э, содер.ти иле EcoRI-фрагменты з 3,4 и 4,4 т.п.н., соответственно, р202, ■ содердацая Hindi 11-фрагмент размером 10,9 т.п.н.(рис.1!

Рис. 1 Фязхчесхи Ж2рта ДНК ИзрИаегоЫгз » рехэхбаягятяых фзггх в агаз.чяддг. а результаты кохвземеатзпиоавого «заяаэл мутаят» С!л23. Обозначения: И • НииИИ: Е - 3 - Р • РпД; - В$Ш: В - ВяпН1.

Комплемэнтационный анализ мутанта 61п83 с использованием i лученных плазиид был проведен на кафедре генетики и селекг Биологического факультета МГУ ( Чурин, 1992 ). Введение гш мид р202 и р152 в клетки мутанта 61п83 приводит к восставав, нию свойств штамма дикого тала у этих мутантов (рис.1). Вве; ние в клетки ыутанта 61п83 плазмилы р229 не приводило к е< становление! свойств штамма дикого типа. Плаахшды р202 и р

имеют гомологичный участок BsmHI - EccRI длиной 2.2 т.п.н., следовательно, ген glnA домен находиться на этом фрагменте. Яелешганннй анализ показал, что минимальный комплементирувщий фрагмент локализован в предела* фрагмента EcoRI-PvuII, клонированного в составе плазыилы рИОЕР и имеет размер 1.0 т.п.н..

Известно, что субъединица глутаминсингетазы R.sphaeroldes имеет молекулярный вес около 50 kDa (Engelhardt. Klerraie.lS82). Таким образом, размер гена гена glnA R.spaeroldes должен составлять не менее 1.3 т.п.н., что соответствует размерам известных glnA-генов различных микроорганизмов. По данный секве-кирования, полученным Ю.Н.Чуринкм ка кафедре генетики я селекции МГУ. ¡гаьотлементируяздй EcoRI - PvuII фрагмент содержит З'-концегув последовательность гена glnA R.sphaeroldes (1005 н.п.). Надей задачей явилось определение нукяеоткдной последовательности 5*-концевой части гена glnA. расположенной на Фрагменте ВаггШ - EcoRI (1.40 т.п.н.). примыкающей к минимально:'«-/ комплементирухжему фрагменту и отделенной от него сайтом узнавания'EcoRI. Нуклэащдагя ассг-едова1ал5кост& §рзпгггяа ЕссШ-ЗггШ Секвенирсвагае проводили по методу Сзнгера ( Sanger, 1977). Фрагмент сссто::? из 1385 aap оснований, на кем было обяарудг-

гкъ.г Сгггз t,3írt í:-rrii EcaSI-f^sll, ешячюза* CRTglna, 0*Гд1пД с^гз м Энизу nojssaíífo аиэгчзиса рвспзловгнна р«гугтя-

лкмитоз я юзгрим райе»« елероиа glnSA. ЗаваазчссЛ (•) огыгагкз мутгс-'-з glnMJ; u:*Spt.te>t -3Í и -ta огизч»ш сбп'стк ^".^'¿rwíwro ras;<OTC5í.

но три открытые рамки считывания (ORF), обозначенные 0RF1, 0RF2 и 0RF3 (рис.2). ORF1, начинающаяся с кодона GTG в положении 569 и оканчивающаяся стоп-кодоном TGA в положении 905, была идентифицирована как последовательность гена glnB по признакам нуклеотидной гомологии с последовательностями glnB гено! других бактерий. ORFglnB кодирует синтез полипептида, состоящего из 112 аминокислот с молекулярным Бесом 12,067 kDa. 0RF2, расположенная дистально по отношению к ORFglnB, считывается ] том же направлении, начинаясь с кодона ATG в положении 990 j не прерывается стоп-кодоначи вплоть до сайта EcoRI (положение 1386), ограничивающего исследуемую область ДНК хромосом! R.sphaeroldes. 0RF2 идентифицирована как 5'-концевая часть гена glnA по признаку гомологии с нуклеотидными последовательностями структурных генов ГС различных бактерий. В даяьнекше! мы будем говорить об 0RF2 как об ORFglnA. Стартовым кодона обеих ORF предшествует последовательность, сходная с последовательностью Шайн-Дельгарно: AAAGG3.

Третья ORF, обозначенная 0RF3, считывается в прстизополо>;ию: ORFgnlB направлении, начиная с кодона ATG в положении 418 \ обрывается в сайте BamHI, ограничивающем исследуемый фрагмент хромосомной ДНК.R.sphaeroldes (рис.2 ). 0RF3 кодирует полипептидный фрагмент, состоящий из 139 аминокислот, ¡алеет заметну! гомологию с N-концевым фрагментом неидентифхцировгнкого ген: R.capsulatus, расположенного перед геном gln3 (Kranz et al.,1930). Подоено ORFglnB и ORFglnA, 0RF3 R.sphaeroldes клее-перед стартовыми кодоном последовательность схоэдга с последовательностью Шайн-Дельгарно.

Amusss иуглгопююХ нослэйсшагель^осхи здздегэя&его ёрагмоита EcoRI-BarJiï R.sphasroidcs.

Исследуемый EcoRI-ВайИ Фрагмент хромосомной ДНК R. sphaerol-des, содержащий три трансляционных элемента: ORFcinB, §rxsr?»';;r ORFglnA и фрагмент неидектифадированной 0RF3, имеет &С сс-сха; 62,7%. что ¡¡¡ко среднего для хромосомы R.sphaeroldes (67". п< K!arrr.ür,Doty, 1S52). Различные участки изучаемого фрйгь'гита ох-лич&этея по 6+С составу ДНК, варьирующему от '3..-.Х дик Окг^Хгь до 03.GZ для ORFglnB. Меадистроаиыг района ki.voï ею ссс;& ДНК в различных участках от 57,3% до 65.82. tueo^ü грэц-жтйК сснозачяй ь ДНИ изучаемого фрагмента хгс:.:ее.)//; К.ср-^зто!^-. определяет предпочтение в испол/.зовйянк kc,;.i0U0l. ¡.-'.cx-gw, G t.,.-

3 а третьем положении для практически всех аминокислот трех исследуемых 0RF. за исключением тирозина, у которого не обнаружено очевидного предпочтения ТАС перед ТАТ. В качестве стоп-кодояов в ORFglnB и ORFglnA используется TGA (Чуркн,1992).

В пределах изучаемого фрагмента ДНК не удалось идентифицировать каких-либо заметных элементоз вторичной структуры, одна-4" ко, анализ участка ДНК, расположенного ниже стоп-кодона гена jlnA по течению транскрипции, позволил выявить шпилечную структуру в районе 2413-2436, представляющую потенциальный rho-независимый терминатор.

Анализ лидярикх районов генов glnB и glnA.

Последовательность секвенированного EcoRI - ВатШ фрагмента 5ыла изучена на наличие консервативных последовательностей, представляищих собой сайты связывания с известными регулятор-кыми бел!сами , такими как NTPA, NTRC, NIFA, САР у энтеробакте-ркй (Reltser.^ag-asanic, 1685; ATies.Nicado, 1S85; Fophan et.al., 1989), и различных диазотрофов (Carlson et.al., 1987; Martin et.al., 1989; Jones, Haselkorn, 1989, Hubner et.al,1991). Кроме того, проводился поиск консенсусов известных бактериальных промоторов и энхансерсз (Foster-Harnett Kranz,1992, Preker et.al., 1992).

В нуклеотидной последовательности, предшествующей ORFglnB, было найдено несколько характерных последовательностей(рис.2). Нуклеотидная последовательность GCAC-N5-TAGGGC, локализованная между 444 и 453 нуклеотидами изучаемого фрагмента ДНК R.sphaeroldes, имеет 80% гомологии с сайтом связывания белка NTRC в ДНК S.typhircurium (Dixon, 1984).

В промотсрной области гена gnlB R.sphaeroldes мы идентифицировали последовательность TTGCAC-N23-ТТСССС, расположенную между 442 и 476 нуклеотидами и тлеющую высокую степень гомологии с промотором glnApl E.coll(-35): TTGCAC-ril8-(-Ю)ТТССАТ. Предполагаемая последовательность -35 у R.sphaeroldes, так де как л в случае glnApl, перекрывается предполагаемым сайтом связывания с белком NTRC (рис 2).

Последовательность TGTTG-N6-CCGCA R.sphaeroldes, локализованная положении 226-241, тлеет 80% гомологии с последовательностью UAS (сайтом связывания белка NIFA) TGTYR-N6-YRACA у К.pneumoniae (Cannon et.al., 1991; SussIn et.al.,1986). Поиск

последовательности TCTGCCAGA, который предположительно участвует в связывании белка NTRC R.capsulatum (Preker et.al.Д992) в лидерной области генов glnB к glnA, результатов не дак. Анализ гомшшгии ORFglnB к ORFglnA R.spbaeroides с известными генами других бактерий

С целью идентификации открытых рамок считывания, обнаруженных в EcoRI - ВатШ (1,40 т.п.н.) фрагменте хромосомной ДНК R.sphaeroides» а также определения степени гомологии glnB и glnA генов с уже изученными последовательностями этих генов у других бактерий, ш осуществили поиск гомологичных последовательностей нуклеотвдов в базах данных GenBank и N3RF с использованием программы DMASIS. В результате была обнаружена гомология 0RF1 (glnB ген).с glnB генами R.capsulatus. Azospirilitim brasllense, Bradyrhizobium Japonicum, Rhizoblum legusninosarua», K. pneumoniae и E.coli. Размер полипептида GLNB составляет у R.sphaeroides 112 a.o.; теоретически вычисленный молекулярный вес - 12,06? kDa, что сопоставимо с белками GLNB у других микроорганизмов (см. таблицу 2).

fsöjицз 2. Гсаодэгея ггдяг £1вЗ rc-поа Р.. sjbacroiüj» к gln3 пыш хз ргалэтныз tssxpasprsiuinas.

Шщххргзхлзп Sxazs ' aojscaeirnEAS Процагг rt*soj!ora, S (Вз-шг)

EhcCob&cter

Capsulatos izoipirlUm na

fcrtalltaj 112 тз.г

ErsÄlrhtio&lM TO.S

Japcalcus Kiliotlua Sil

1егиа1тгагда Klebsiella 111 72.3

рпвгиьа1ь 112 63 .£

2sch»ri.cMJs

coli III Ё4Л

В случае 0RF2» бьна обнаружена гомология ее нуклеотидной последовательности с генаш glnA генов A.brasilensae, R.legu-mlnosarum, E.coli, S.typhlmurlum. A.vinelaidll.T.ferrooxldans, M.capsulatus, Anabaena sppt B.cereus, B.subtllls, C.acetobuty-Ucum; M.voltae и R.capsulatus. Последователь кость из 307 пар нуклеотвдов, составляющих дачную ORF, гомолс! ..чна 5'-концевой части glnA - генов перечисленных еьзш микроорганизмов. Степень гомологии определялась в расчете на полную последовательность гена glnA R.sphaeroides, полученную путем добавления к 5'-конце бой части гена, определенней в дачной работе, ее 3'-концевой

[асти. определенной ранее (Чурии.1992). Для дальнейшего аналн-¡а попользовали полную последовательность ORF glnA, что являйся необходимы;,{ для возможности объективно оперировать данны-5И всех проведенных с ней исследований. Длина полипептида glnA J.sphaeroides, полученного компьютерной трансляцией ORF glnA, ¡оставила 467 аминокислотных остатков, что соответствует средой длине полипептида ГС у грач-отрицательных бактерий и на 23 юиования презирает среднюю длину полипептидов ГС у грам-положительных бактерий (таблица 3).

Приведенные вьше данные позволяют с уверенностью идентифи-шровать изучаемую нуклеотидную последовательность 0RF2 ?.sphaeroides как часть структурного гена glnA,кодирующего ГС.

Срашзенкз £:лз?о?шслсгггиг последователь костей белков Сравнение аминокислотных последовательностей изучаемых бел-сов GLNB и CLNA R.sphaeroides, полученных компьютерной транс-шцией нуклеотидиых последовательностей соответствующих ORF с таеюзватся з базах данных GenBank и NBRF аналогичными белками, »елось в программах PR0SI5 и бепеБеэ. После попарного опреде-:ения процента совпадающих аминокислотных остатков (данные при-зедены в таблицах 2,3). было проведено выравнивание аминокислотных последовательностей белков GLKB» GLNA R.sphaeroides и зругих бактерий друг относительно друга.

УеЯия 3. Пжолядо ка^ЕГ £laA гэает fLipfeasroldes и gin* «чкая из рвапгсЕЯ ¡тарзоугавазааз.

Дггез Проэдат гсвоязгая. S

(EaJWK)

рлгж^ггяи

Csdcbacter

caps^litae(1 soso) ? SO.O

isofpirtilta brssllims«

AS3 62.0

JrcbericMi

coli ¿69 53.S

ISttiUlcfcacUlra

amsalatüj Ebixitlm eS9 55.3

legiislnoEäxrai m 59.0

iiotbbictsr

iST 53.2

Suln^alla

tTTblaarlm ¿S3 sa.z

ЯНеЬгсШха 5T.2

ГеттеПймш ¿S3

Jtob&sas

sp. m 52 .T

Ess Ulus

«гагз IM 3«.T

ÜKUIM

caötllis ¿Ai 3t..

Cl0«tnH!29

seetocritUlcus Ai3 33. *

j TOltae tli ........ 30 л

a. Консервативные участки, характеризующиеся высокой степенью гомологии у Есех бактерий, встречаются практически равномерно по всей длине полипептзда GLNB . Всего нами выделено четыре таких участка (рис. ЗА), наиболее протяженный из которых (33 а.о.) расположен в средней части GLNB в .районе- сайта уридилирования (тирозиновый остаток з положении 51, согласно Son, Rhee, 1987). Сайт уридилирования присутствует во всех изученных GLNB-белках и занимает в них одинаковое положение.

b. Выравнивание аминокислотных последовательностей глутамин-синтетаз различных микроорганизмов было выполнено на базе аналогичных работ (Rawlings et.al., 1987; Possot et.al.» 1989).

В аминокислотной последовательности ГС R.sphaeroldes обнаружено пять консервативных участков, схематично-представленных на рис.ЗБ. Участки I. II, III, IV к V, характеризующиеся еысо-кой консервативностью аминокислотных остатков, были выделены по тем же признакам, что и з аналогичных исследованиях (Janson -t.al.. 1935; Rawllngs et.al.,1967; Possot et.al.,1989). Идентифицированы сайт модификации ГС R.sphaeroldes аденилированкеы (Туг395) и сайт, чувствительный к окисления ккслородсм(Н15£69)

(А)

J-jj- » —jjjj-î СЬКВ (112 ао)

(Б)

¡«7 as)

II III IV V

»—□—о—о-

ЦП-

■щ-

100 _1_

Ibc.3 Схехо XDSScptxnœna: гася&а бсхгзз г GL44. Рымазшя щтфрллс: обозллчсш хзрлггер£5&

УЧГСТХЯ бсЛХй GLÎÙL. СОПИСЗО irpSKTTOMj J.-^r ЕСГУ

сллзу (RjwKngj cLCL.198Q: злсзяэиахл отмечены сайт тр-алтгл^^сззииз (UD) Д2? GIM3 s ся£т 43tii2Jifpo£ia2J ÇiD) дл GLSA. ЦП - «м^"-

EST£J>. /ХЯЛШЛ it ZbGXXCXZGZOTZbZX

oçtstxsx (ао).

- 13 -

Кясшфовапие к секвенирсвакке мутантной копии гена glnA

Для определения природы мутации glnA83 и ее локализации была клонирована мутантная копия гена glnA ' R.sphaeroides. С этой целью мы сконструировали мини-кяонотеку EcoRI-фрагментов хромосомы мутанта Gln.83, размером 3.4 т.п.н. на векторе M13tgl8.

Рекомбинантные клоны гибридизовали с радиоактивным зондом на основе EcoRI-фрагмента плазмиды р152 размером 3,4 т.п.н. Было отобрано 5 кленов, обнаруживших гомологию с использованным зондом, обозначенных pG83-l, р683-2, pG83-3, pG83-4 и р683-5. Для дальнейшей работы мы взяли pG33-l и pG83-3, и использовали их для: секвенирования ДКК методом Сзнгера.

Нуклеотидная последовательность обоих клонов была идентична 5'-концевой части гена glnA и содержала трачзицгао G->A в положении 1459. Зта замена приводит к возникновению стоп-кодона 7GA вместо триптсфанового кодона TGG в гене glnA в клетках штамма дикого типа.

/шалкз полипоптикоп» кодкрузмыя ихзешал&иин конплэкегакрув-

щгэ.1 фрагк-Э'ЛТС/

Анализ полипептидоз, кодируемых плазмидой (pllOEP), содержащий донимадьнй комллемеяткруащнй мутацию glnA83 фрагмент, проводили в системе мини-клеток E.coli. Показано, что по сравнен;:» с контрольной векторной плазмидой pVZ209, плазмида pllGZP кодирует синтез только одного добавочного полипептида с молекулярным весом о::сла 30 kDa. Как указывалось выше, EcoRI -PvuII фрагмент, размером 1..0 т.п.н., клонированный в составе шгэзмады рИССР, содержит только 3'-концевую часть гена glnA без 397 первых ну>гяеотидоз \i собственных регуляторных элементов. Та'а:м образом, инициация- транскрипции 3'-концевой части гена glnA на данной плазмиде может осуцествляться только с внесшего (плазнидного) прсмотсра. Таким промотором на плазмиде рИСЕР мо.г.ет служить промотор гена, кодирующего устойчивость к расположенный перед 3'-концевой частью гена «"1пА, Анализ ну i и. с о и ин ой последовательности 3'-концевой чгюти гена çlnA выявгл в его проксимальной части несколько внутренних ATG кодеков, перед которыми расположены последовательности сводные с последовательность'? И;:^";н-Дельгерно. Приведенные дан-liiw исзЕсли";' 1!ден?и$"!ц:;ровя~ь на данном РvuП-EcoRI фрагменте oii'pwi'yso r;avicy считывании, сбогкачекнуэ 0RF4. На рис. 4 щ-иве-

дена схема открыты;-; рамок считывания оперояа gln3A и белков кодируемых его различными вариантами.

ОБСУЖДЕНИЕ

В отличие от E.coli, К. pneumoniae и многих других бактерий где ген glnA находится в составе оперона glnAntrBC, а ген glri не сцеплен с этими генами, у R.capsulaus гены glnA и glri сцеплены и образуют единый оперон glnBA (Kranz et.al., 1990) По данным, полученным на кафедре генетики и селекции ¡.-ГУ, де леция 5'-концевой части гена glnB R.sphaeroides имеет полярны эффект, и плазмиды, несущие оперон glnBA с такой делецкей, н способны комплементировать мутацию glnA83 (Зинченко В.В., кео публикованные данные). Косвенным подтверждением атегду служат тагасе, данные компьютерного анализа, свидетельствующие об oi сутствии между генами glnB и glnA структур, сходных с яермина торными.

0.0 418 SS9 ■ 9J5 930 135t 23.«

I

k

CRPglnB

OKi-glnA TO.

Сикий тип

мутант Cln83

> С

12 кХ>

>

>

ппазмода рисёР

>

fat. 4 Оптовые рсязз osizixzszs (Cüf) essfsm ¡LSA itsp^arrcidiz s б&сщ Iащ?г&аи sx sspszsraai

У энтеробактерий ген glnA транскрибируется с тандеиных i моторов: дистальный промотор glnApl подвержен негативной реп ляции ntr-скстемой клетки, прокс:гмалькый промотор glnAp2,- п<

зитиекой (Reitzer, Magasanlc, 1985). У R.sphaeroides, по нашим данным, лидерный район оперона glnBA содержит лишь один, сходный с glnApl, промотор. Подобно промотору glnApl, консенсус -35 б R.sphaeroides перекрывается последовательностью, схожей с сайтом связывания регуляторного белка NTRC (рис. 2).

Последовательность нуклеотидов, гомологичная сайгу связывания белка NIFA(UAS) К.pneumoniae, обнаружена в лидерной области гена glnB R.sphaeroides. В соответствии с моделью "петлеобразования ДНК",' продукт гена nifA связывается с ДНК в районе UAS л входит в контакт с комплексом сигма-фактор RH054-PHK-nc-лимерзза в районе -24 и -12, свертывая ДНК в петлю(Buck et.al, 1987). Однако, перед геном ginB R.capsulatus нами не обнаружено последовательности, напоминающей -24 и -12 К.pneumoniae, характерной для консенсусной последовательности NTRA-регулируем!« промоторов.

Отсутствие HTRA-3ac5;cK'.for-o промотора с консенсусом -24 и -I-i з лидерной области glnBA согласуются с данными,. полученными аа R.capsulatus и сзидетельсвующими о независимом от NTRA (NIF34) характере экспрессии этого оперона (Kranz et.al. ,1990). У пурпурных бактерий синтез ГС репрессируется в среде с избытком аммония и активируется в среде с его недостатком (Johansson ,Gost,1976;Sakhno et.al.,1881;Caballero et.al.,1985).Оперой jlriFíA y .-¡тих бактерий активируется продуктом гена ntrC (nlfRI) (Kr.'TíS et.al.. 1990), что позволяет нам предположить сущестьо-зание у него второго, негативно регулируемого, промотора.

Сопоставление аминокислотных последовательностей белшв SLN3 R.sphaeroides и других бактерий выявило высокую степень их гомологии. ' Все белки GLK3 имеют консервативный тирозин 51, предполагаемый сайт уридияирования, а также четыре выделенных нами участка, характеризующихся высокой межвидовой гомологией аминокислотной последовательности (рис.ЗА). Эти данные предполагает наличие консервативного механизма передачи информации азотного статуса клетки у различных бактерий (Kranz et.al., 1990). Пурпурные бактерий, tow не менее, могут иметь заметные отличия в структурно-функциональной организации систем регуляции азотистого метаболизма по сравнению с семейством Entero-bacterlaceaa постольку у пурпурных бактерий гены glnB и glnA сцеплены в один оперон и, следовательно, имеат координированную экспрессию.

ГС принадлежит к необычному типу белков, активный центр ко торых формируется в зоне взаимодействия соседних субъедини: (Almassy et.al., 1986). С этим, очевидно, связано наличие пят; консервативных участков (рис.ЗБ), принимающих участие в форми ровании активного центра (Almassy et.al.,1986; Janson et.al. 1986). Участки II и V представляют собой ß-спирали, тесно ассоциированные с двумя Мп2+-ионами одной субъединицы, в то время как участок I содержит триптофан в положении 57, который предположительно, завершает формирование активного сайта н< стыке^соседних субъединиц. У R.sphaeroides триптофановый остаток присутствует на том же месте - в положении (Тгр58). Участок III принято относить к сайту связывания АТФ по признаку наличия последовательности GXXGXGKT, характерной для многю АТФ-связывающих белков (Walker et. al., 1982). Этот же участо! белка имеет между аминокислоными остатками 268 и 272 последовательность Met-His-Cys-His-Met глутаминсинтетазы E.coll, гд( остаток Hls269 модифицируется (окисляется) кислородом (Lewir et.al., 1978; Lewin 1984). Предполагается участие этого гисти-динового остатка в формировании активного центра ГС (Almassi et.al., 1986).

Ранее было показано, что у E.coll активность ГС регулируется ковалентной модификацией тирозинового остатка Туг397 (Shapiro, Stadtman, 1968). Глутаминсинтетазы, регулируемые аденили-рованием, облада-от высокой степенью гомологии участков из 12 остатков, примыкающих к этому сайту (Janssen et.al., 1988). ГС R.sphaeroides также регулируется аденилированием (Engelgardt, Klemme, 1981), имеет тирозиновый остаток е соответствующем положении (Tir395) и 10 из 12 совпадающих остатков в консервативном участке. Участок IV, является глутамат-сзязыва-ощим сайтом исходя из гомологии с последовательностью DRGASIY (Raw-ling's et.al., 1987). Изучение ГС S.typhimurium позволило идентифицировать гидрофильный участок в районе остатков 156-173, чувствительный к ряду протеаз и названный "центрачьной петлей" (Almassy et.al.. 1986).В ГС R.sphaeroides ш также обнаружили подобный участок (рис.ЗБ).

Сравнение ГС грам-отрицательных и грач-положительных бактерий позволило еыявить различия в длине и в среднем количестве консервативных остатков, при этом степень гомологии аминокислотной последовательности ГС R.sphaeroides и грам-положитель-

- 17 -

ых бактерий не превышало 34%.

Из вышеизложенного можно заключить, что ГС Р.зрЬаего1с1ез вляется типичной прокариотической глутаминсинтетазой, харак-ерной для грам-отрицатель ных бактерий и обладающей рядом от-ичий от ГС грам-положительных бактерий.

Анализ нуклеотидной последовательности мутантной аллели 1пА83 показал, что образование стоп-кодона Т6А вместо Тгр159 районе "центральной петли" ГС должен привести к образованию олипептида, представляющего И-концевую часть белка ГС с моле-улярным весом около 17 кЮа. В то же время, плазмиды р152 и 110ЕР, способные восстанавливать мутантный фенотип мутанта 1п83, содержат лишь З'-концевую часть гена д;1пА, с делецией ервых 397 пар нуклеотидов. В экспериментах с мини-клетками ыло показано, что этот 3'-концевой фрагмент кодирует полипеп-ид размером около 30 кОа. Транскрипция этого фрагмента иници-руется с плазмидкого промотора, при трансляции в качестве тартового используется, по-видимому, один из имеющихся внут-енних АТв кодонов в 3'-концевой части гена £1пА, которому редшествует последовательность, сходная с поледовательностью айн-Дельгарно. Анализ нуклеотидной последовательности гена 1пА И.БрЬаего^еэ выявил наличие нескольких АТЭ кодонов, рас-оложенных ниже сайта ЕсоК1 по течению транскрипции в полоке-иях 1491, 1578, 1590,1599, 1605, и кодирующих метионин. Всем ТО кодонам предшествуют последовательности, сходные с после-овательностью ШайнДельгарно. Таким образом, 3'-концевая часть ена г1пА представляет собой открытую рамку считывания, обэз-аченную нами 0КР4, кодирующую укороченный белок ГС, лишенный -концевой части (рис.4). Это подтверждает наше предположение тносительно участия 3'-концевого фрагмента гена (?1пА, содер-ащегося на плазмидах р152 и рНОЕР, в комплементации мутанта 1пА83.

По дачным, получешагм на кафедре генетики и селекции МГУ, олекулярный вес ГС из клеток дикого типа и клеток мутанта 1п83, содержащих плазмкду р152 или рНОЕР, определенный ГАА-злектрофорезом з неде.чатурирующих условиях, неразличим и с.ос-авляет около 600 кОа. Сопоставление этих данных с результлта-•л, полученными с мини-клетками и при секвенировачии ДНК,' яоз-оляет сделать еыеод о тсы, что полипептид размером 33 кОа яв-яетсл С-концевым Фрагментом ГС R.sphaeгoídes. .4- и С-фрагМен-

ты белка ГС, суммарный вес которых сходен с весом протомера ГС, по-видимому, способны реассоциировать с образованием сначала протомера, затем додекамера и восстановлением активных центров. Подобный феномен характерен для межаллельной комплементации.

ВЫВОДЫ

1. Из банка генов фототрофной пурпурной бактерии R.sphaero-Ides 2R изолирован фрагмент хромосомной ДНК, содержащий reí glnA,' кодирующий глутачинсинтетазу.

2. Молекулярный анализклонированных фрагментов выявил, что перед геном glnA расположен ген glnB. Установлено, что эти гены являются тесно сцепленными, и составляют оперон glnB-glnA.

3. В лидерном районе оперона glnBA выделены последовательности, которые могут принимать участие в регуляции транскрипции этого оперона: последовательность, сходная с проыоторо» glnApl E.coli, которая перекрывается сайтом связывания регуля-торного белка NTRC и последовательность сайта связывания белк; NIFA (UAS-последователь ность).

4. Сравнительный анализ продуктов генов glnB и gla R.sphaeroides 2R с аналогичными белками других микроорганизмо: показал, что они обладают структурной организацией, типично: для прокариотических GLNB-белков и глутаминсинтетаз,

5.При помощи секвенкрования выявлено, что мутация glnA8: обусловлена заменой 6~>А в положении 1462, что приводит к образованию стсп-кодона UGA и преждевременной термина ции трансляции полипептидной цепи.

G. Минимальный фрагмент ДНК, коыплекентирукящй мутацк glnA83 обеспечивает в системе мини-клеток синтез полшептвда соответствующего продукту 3'-концевого района гена glnA Транскрипция этого 3'-концевого района инициируется с вектор ного промотора с использованием в качестве стартового - одког из внутренних ATG-кодонов гена glnA. Таким образом, восстанов ление активности ГС при введении в клетки мутанта Gln83 плаз миды рИОЕР можно объяснить за счет феномена ыежаллельнс комплементации.

Основные результаты диссертации отралени в следующих сообщениях:

1. Шестопалов В.И., Зинченко В.В."Векторы прямой селекции юкомбинантных клонов на основе IncQ плазмиды R89S"- сб."Пробами современной биологии", Труды 17 научной конференции молода ученых биологического факультета МГУ, Москва, МГУ, 1986г., тр. 55-59.

2. Шестопалов В.И., Фонштейн М.Ю."Новый фазмидный вектор с епликоном RSF1010 и селективным маркером устойчивости к кана-!ицину", тезисы всес.конф."Новые направления биотехнологии", 987-,. Пущино- на- Оке.

3. Shestakov S., Zlnchenko V., Babykln М., Kopteva А., Ка-eneva S., Frolova Т., Shestopalov V., Bondarenko S. "Genetic tudies on the regulation of nitrogen fixation in Rhodobacter phaeroides" - in "Nitrogen fixation: 100 years after", Koln, RG, Stuttgart. New York, Fisher-1988, pp.163-169.

„4. Zinchenko V.V., Churin U.N., Shestopalov V.I., Shesta-ov S.Y."Molecular organisation and characterisation of the InBA operon of the purple non-sulfur bacterium Rhodobacter phaeroides 2R", J.Gen.Microbiol., 1993 (in press).