Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и молекулярный анализ генов ginB и ginA у пурпурной несерной бактерии Rhodobacter Sphaeroides 2R

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и молекулярный анализ генов ginB и ginA у пурпурной несерной бактерии Rhodobacter Sphaeroides 2R"

РГ6 од

в / ноя шз

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им.Н.И.ВАВИЛОВА

на правах рукописи . УДК 575.113.579.8.03

ШЕСТОПАЛОВ ВАЛЕРИЙ ИВАНОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ И ЮДЕКУЛЯРНЬЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ £1пВ и glГlA у .пугатной НЕСЕРКОЙ БАКТЕРйИ ИЮШВАСТЕК БРНАЕНОШЕБ 2Я

03.00.15 - генетика

Автореферат ' Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук ЗИНЧЕНКО В.В.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук ЦЫГАНКОВ Ю.Д.

кандидат биологических наук РОМАНОВА Ю.М.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита состоится" V 1993г. в ^ О часов

на заседании специализированного Ученого Совета Д002.49.1 при Институте Общей Генетики им Н.И. Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва, В-333, ул.Губкина,3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Общей Генетики им.Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан" Л " Й ОАьРЛ 1993г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

ПОЛУХИНА Г.Н.

Актуальность проблемы Одним.из актуальных вопросов современной генетики микроорганизмов является изучение генетического контроля процессов ассимиляции азота и его соединений. Проблема имеет не только фундаментальное" теоретическое, но и большое практическое значение в связи с задачами повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, биосинтеза белков и незаменимых аминокислот, снижения затрат на производство азотных удобрений.

В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении генетического контроля азотистого метаболизма у бактерий. Центральная роль в этом процессе отведена глутаминсинтетазе (ГС), кодируемой геном glnA. Наиболее полно механизмы регуляции синтеза и активности глутаминсинтетазы и сопряженные процессы азотистого метаболизма изучены у представителей энтеробактерий Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Klebsiella pneumoniae. Экспрессия гена glnA контролируется системой общей регуляции азотистого метаболизма - ntr-системой. Гея glnA входит в состав оперона glnAntrBC (Pahel,Tyler, 1979). ГС энтеробактерий подвержена регуляции и на посттрансляционном уровне путем ковалентной модификации ее субъединиц, осуществляемой аденилилтрансферазой, а также путем катаболитной репрессии продуктами метаболизма глутамина. У К.pneumoniae, способной фиксировать молекулярный азот, ntг-система принимает участие в регуляции экспрессии nii'-генов, координируя, таким образом, все пути ассимиляции азота в клетке.

Азотистый метаболизм у бактерий может быть сопряжен с различной энергетикой, ,и прежде всего с фотосинтезом. В связи с этим в последнее время активно ведется исследованиие регуляции азотистого метаболизма у фототрофных азотфиксирующих бактерий семейства Rhcdospiriliaceae. Интерес к пурпурнш бактериям обусловлен их уникальными физиологическими и биохимическими свойствами. Они могут расти фотоавтотрофно, фотогетеротрофно и :гсг.;огетеро?роф1Ю, способны ассимилировать молекулярный азот и углекислой газ, выделять молегсулярный водород. Моделькики объектами для изучения генетического контроля азотистого метаболизма " пурпурных бактерий стали R.capsulatus и R.sphaeroides. У R.capsulatus и R.sphaeroides клонированы и частично секвени-рованы многие гены, контролирующие азотистый метаболизм: glnA, glnB, nifRl, nifR2, nifR4, nifR5, adg С Шестаков и др., 1989;

Avtges et.al.,1985; Kranz, Haselkorn,1935; Jones, Haselkorn, ■1989). Обнаружена заметная гомология между генами glnA, glnB, ntrC, ntrB и ntrA(rpoN) этих бактерий и энтеробактерий (Avtges et.al.,1985; Kranz,Haselkorn,1985; Jones,Haselkorn, 1989). Показано, что у R.capsulatus экспрессия nif-генов (кроме гена nlfА) контролируется ntr-подобными генами: nifRl(ntrC), nifR2 (ntrB), nlfR4 (ntrA), а также геном adgA, функция которого пока не ясна (Zinchenko et.al. ,1989). У фототрофных диазотрофов в отличие от гетеротофных диазотрофов ntr-подобные гены 'не принимают участия в регуляции ассимиляции связанных источников азота. Единственным известным (у пурпурных бактерии) к настоящему времени геном, продукт которого вовлечен не только в регуляцию азотофиксации,- но и в регуляцию азотистого метаболизма в целом, является ген nifR5 (glnB), который входит в состав оперона glnBA (Kranz et. al., 1990).

Ген glnA у R.capsulatus организован в оперон glnBA, его экспрессия регулируется в зависимости от наличия в среде доступных соединений азота. Показано, что у пурпурных бактерий инактивация гена glnA приводит к появлению мутантов с плейот-ропным нарушением азотистого метаболизма. Кроме того, что эти мутанты являются ауксотрофами по глутамину, синтез и активность нитрогеназы (фермента, осуществляющего фиксацию молекулярного азота) у них утрачивают способность к регуляции ионами аммония (Wall.West 1979; Shestakov et.al.,1988). Исследование регуляции синтеза и активности ГС у пурпурных бактерий наряду с изучением Gin-мутантов поможет глубже понять молекулярную природу процессов азотистого метаболизма этих фототрофных бактерий.

Цель работы. Диссертация посвящена изучению молекулярно-генетической организации фрагмента хромосомной ДНК пурпурной бактерии R.sphaeroides, содержащего ген глутаминсинтетазы glnA.

В задачи данной работы входило: клонирование гена glnA R.sphaeroides и определение его нуклеотидной последовательности, а также нуклеотидной последовательности прилежащих к нему районов хромосомы; выявление открытых рамок с ^итывания секве-нированного фрагмента ДНК и анализ кодируемых им белков в системе ыини-клегок; сравнение белков R.sphaeroides, кодируемых открытыми рамками считывания в пределах секвенированного фрагмента, с гомологичными белками других микроорганизмов; клони-

рование и определение нуклеоткдной последовательности мутант-ной копии гена glnA мутанта Gln83.

Научная новизна и практическая ценность работа. Клонированы фрагменты хромосомной ДНК R.sphaeroides, содержащие ген glnA. Установлено, что у R.sphaeroides ген ginA входит в состав опе-рона glnB-glnA, з лидерном районе которого обнаружены последовательности нуклеотидов, сходные с каноническими регуляторными последовательностями: промотором glnApl E.coli, NTRC-связываю-¡цкм сайтом, УАЗ-последовательностью. С помощью секвенирования установлено, что мутация glnA83 обусловлена заменой G->A в центральной части гена glr.A, что до&кнс приводить к преждевременной терминации трансляции. Установлено, что 3'-концевая часть гена glnA может транскрибироваться с Енешнего промотора с образованием укороченного белка, способного комплементиро-вать мутацию glnA83 по механизму межаллельной комплементации.

Полученные результаты позволяют по-новому рассматривать систему, регуляции азотистого метаболизма у пурпурных бактерий.

Клонированные гены могут быть использованы как зонды для выявления гомологичных генов у других микроорганизмов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературу. Работа изложена на ____стр. машинописного текста и содержит рисунков и таблиц.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 17 конференции молодых ученых .МГУ .Москва; на семинаре ".Молекулярные основы генетических процессов" ЙОГ РАН, на международном конгрессе "Mitrciccr: fixation: löO years after", Кельн, ФРГ, 1988г.

Принятий? corttiaiiycHhM. ГС-глутаминсинтетаза; т.п.н.- тысяча пар нуклеотидов; ORF-открытая рамка считывания; а.о.-аминокислотный остаток; кБа-килОдальтон.

1ШЕРИШ И МЕТОДУ

Б&ч-»рианьчкэ ятатды. В работе использовали штамыи R. sphaeroides дикого типа 2R, и полученный из него ауксотрофный по глутачину мутант Gln83 (Shestakov et.al,1988) и штаммы E.coli: С600, НВ101, Q358, Q359, BHB2688, BHB2690, LE392, TGI, из коллекций кафедры генетики и селекции МГУ и ЗКМ ВНИИГенетика.

Сведения о плазмидах, использованных в работе, представлены

в таблице 1.

В качестве полноценной использовали среду ЬВ, в качестве минимальной - среду а с необходимыми добавками витаминов и аминокислот (Миллер, 1976). В экспериментах по определению ферментативных активностей клетки К.грЬаепЛйез выращивали на среде Ормерода (ОппешЗ е1.а1., 1961), содержащей в качестве источника азота сульфат аммония или одну из аминокислот (глу-тамат натрия, глутамин) в концентрациях 10Ш.

Табдш'з 1 Еактетоалъша гслззмди, использованный в сзботе. плазмида генотип_источяик/ссыжз

PER325 р?В?1 рСЕ104 PJV27 pVZ209 *i3tgi 30,131

Р152

ргог Р229

PAS3-121D3 RJ1-7

Г. г г

Ар Те Ca

Св.г, ntrx АрГ ctrEC

ipr, gl л Л (R.capsulatum)

Г Г Г + Inoq, Sa Sa ia Bob

Ео11таг,Ео<1г1ги£Х,197а de Bruijn et.al., 1987 Espin «t.al., 1932 Ecolnie «t.al.,1933 Zinchenko et al.,1535 Kien« et al., 1983 дакаая работа

гг.

Incq, Su Юа, КоЬ г г

IncQ, Su Sn ,glnBA(P..epliaeroides) Д&нагя раЗотз г г

IncQ, Sa fcs ,glnB(R.3phaaroidea) дзянал. работа г р +

IncF Ар Ка Ira ЯубеШювоша, IS04

г г +

Ine? Ар le ira хашшя каЗДн

_генэтазд я евлеидя ИГУ

Актибксюсш добавляли в следующих концентрациях (ют/мл): для E.coll: ампициллин - 50, каначицин - 50, хлорамфеникол -20, стрептомицин - SO, тетрациклин - 10; для R.sphaeroides: каначицин - 50, стрептомицин - 50, тетрациклин - 1.

Коныогадколыкз скрещивания проводили на мембранных фильтрах на среде LB, как описано ранее (Zinchenko et al., 1S34).

Вцделеамэ пдагниднай Ш' из глеток E.coli, трансформации клеток E.coli, а такие электрофорез ДНК в горизонтальной ага-розном геле проводили по стандартным методикам (Манкаткс и др., '1984). ДНК из агарозкых гелей элюировади по описанной мотодике Дрейпер и др.(1991).

Для онродашвш вукхгогвдгой послэдавдгезьпосп! фрагменты ДНК клонировали в составе фаговых векторов М13 серии tg. Сек-венировачие проводили методом терминирования синтеза цепи па

одноцепочечной ДНК-матрице з присутствии дэдезоксинуклеотидов (Sanger et al., 1977; Tabor et al. , 1987).

Получение мини-клеток штамма E.coli Р678-54 и трансляцию

полипептидов, кодируемых плазмидой, проводили по стандартной методике (Хеймс, Хиггинс, 1937). Электрофорез в ДААГ-ДСН проводили по методике описанной ранее (Hanes, 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Конструирование банков генов R.sphaeroides. Для конструирования банков генов R.sphaeroides был использован фаговый вектор замещения XL47.1 (Loenen, Вгатапаг,1980). Было сконструировано два банка: в одном клонирование производилось по сайтам узнавания рестриктазы EcoRI, в другом - по сайтам рестриктазы BamHI(Sau3A). Расчетная вероятность обнаружения индивидуального однокопийного гена в них превышает 99Z.

Скриннинг банков генов R.sphaeroides проводили мзтодом гибридизации" амплифицированных in situ гибридных бактериофагов с радиоактивным ДНК-зондом. В качестве зонда использовали плаз-миду pJV27, содержащую структурный ген glnA R.capsulatus (Scolnic et.al.,1983). Было выявлено несколько независимых клонов гибридных фагов,содержащих вставку хромосомной ДНК, гомо-логиичную структурной части гена ginA R.capsulatus. Для дальнейшего анализа были отобраны три гибридных фага: Е91, Е101 и S215. Для этих трех фагов были построены физические карты и определен размер клонированных фрагментов, который составил 3,4 т.п.н.. 4t4 т.п.н. и 12,6 т.п.н., соответственно (рис.1).

Клонированные фрагменты хромосомы R.sphaeroides гибридизо-вали с известными генами других бактерий, продукты которых участвуют в азотистом метаболизме бактериальной клетки. Этот этап работы имел целью определить генетическую структуру исследуемого локуса хромосомы R.sphaeroides. В качестве зондов в опытах по блот-гибридизации использовали фрагменты нуклеотид-ных последовательностей генов ntrB, ntrC и ntrA. Источником фрагментов, в этом случае, явились: плазмида р5Е104 (Espin et. al. ,1582), содержащая гены ntrB и ntrC Klebsiella pneumoniae, и плазмида pFB71, содержащая ген ntrA (de Bruijn et.al.,1987). Как в случае ntrB и ntrC, так и в случае ntrA гомологии с исследуемыми гибридными фагами обнаружено не было.

Локализация гена glnA на клонированных фрагментах

При помощи гибридизационного и рестрикщюнного анализов было установлено, что EcoRI-фрагменты 3,4 и 4,4 т.н.п тесно сцеплены и перекрываются эаиЗА-фрагментом из фага S215 размером 12,6 т.н.п.. Для изучения клонированных в гибридных фагах Е91, Е101 и S215 фрагментов хромосомной ДНК в клетках R.sphaeroides, они были переклонированы в плазмиду pYZ209 с широким кругом хозяев. В результате были получены плазмиды: р152 и р229, содержащие EcoRI-фрагменты в 3,4 и 4,4 т.п.н., соответственно, и р202, содержащая HindiIi-фрагмент размером 10,9 т.п.н. (рис.1).

} гг_I $% » t t у в »

J £91

J Е101

-? 5215

Коьаиаюгзша

(PVZ209) '_lj_■ ■ • ■■ 1 ........Г p202 *■

(JVZ209) "_a_. ■■ . f pHJ

<pVZM9) I I i' .„I_li «Ш +

5 <pvz»0) pi 10 IP +

Pik.1 Фюичссхая tsprz ДНК Rjpkaeroides в рехомбянзяпщх фагах я шпзмяддх. в результаты комЕдгмеяпшгокисгх) ы&шм мутаяп GlnSS. Обозяатеял.с И • HindlH: Е • EcoRI: S - &nal: Р - PvuII: В$ - 8$1П: В - &эпЩ

Комплементационный анализ мутанта Gln83 с использованием полученных плазмэд был проведен на кафедре генетики и селекции Биологического факультета МГУ ( Чурин, 1992 ). Введение плаз-мид р202 и р152 в клетки мутанта Gln83 приводит к восстановлению свойств штамма дикого типа у этих мутантов (рис.1). Введение в клетки мутанта <31п83 плазмиды р229 не приводило к восстановлению свойств штамма дикого типа. Плазмиды р202 и р152

имеют гомологичный участок BamHI - EccRI длиной 2.2 т.п.н., следовательно, ген glnA должен находиться на этом фрагменте, Делециснный анализ показал, что минимальный комплементирующий фрагмент локализован з пределах фрагмента EcoRI-PvuII. клонированного в составе плазмиды pllOEP и имеет размер 1.0 т.п.н..

Известно, что субъединица глутаминсинтетазы R.sphaeroldes имеет молекулярный вес около 50 kDa (Engelhardt, Klemme, 1982). Таким образом, размер гена гена glnA R.spaeroldes должен составлять не менее 1.3 т.п.н., что соответствует размерам известных glnA-генов различных микроорганизмов. По данным секве-нировглкя, аолучбянш Ю.Н.Чуриным на кафедре генетики и селекции МГУ, комплементируящий EcoRI - PvuII фрагмент содержит З'-концевув последовательность гена glnA R.sphaeroldes (1005 н.п.). Нааей задачей явилось определение нуклеотидной последовательности 5'-концевой части гена glnA, расположенной на фрагменте BamHI - EcoRI (1,40 т.п.н.), примыкающей к минимальному комплементирующему фрагменту и отделенной от него сайтом узнавания'EcoRI. Муял-еотадвая исследователь кость фрагмента EcoRI-SaШ1 Секвенироваяие провод;ии по методу Сэкгера ( Sänger, 1977). Фрагмент состоит из 1386 пар оснований» на нем было обкаруяе-

Рме.З Схем фрагкскт! EcoSI-rvtill. »»ransas* oxrglaa. OKFglnA овп н OR?4. В»иэу помзеж) тзтдео« picnoповекиэ pjryrm-торнмх ineBtHTos о 1юаерио» р«£он« епвром« glnSA. Зовмочлой (•) опжчет нутшия jlnXSJ; u:«Spswi "35 а -10 стизчана oür.rcTfc пэилап&пеисго превотор».

но три открытые рамки считывания (ORF), обозначенные 0RF1, 0RF2 и 0RF3 (рис.2). 0RF1, начинающаяся с кодона GTG в положении 569 и оканчивающаяся стоп-кодовом TGA в положении 905, была идентифицирована как последовательность гена glnB по признакам нуклеотидной гомологии с последовательностями glnB генов других бактерий. ORFglnB кодирует синтез полипептида, состоящего из 112 аминокислот с молекулярным весом 12,067 kDa. 0RF2, расположенная дистально по отношению к ORFglnB, считывается в том же направлении, начинаясь с' кодона ATG в положении 990 и не прерывается стоп-кодонами вплоть до сайта EcoRI (положение 1386), ограничивающего исследуемую область ДНК хромосомы R.sphaeroides. 0RF2 идентифицировала как 5'-концевая часть гена glnA по признаку гомологии с нуклеотидными последовательностями структурных генов ГС различных бактерий. В дальнейшем мы будем говорить об 0RF2 как об ' ORFglnA. Стартовым кодонам обеих ORF предшествует последовательность, сходная с последовательностью Шайн-Дельгарно: AAAGGG.

Третья ORF, обозначенная 0RF3, считывается в противоположном ORFgnlB направлении, начиная с кодона ATG в положении 418 и обрывается в сайте BamHI, ограничивающем исследуемый фрагмент хромосомной ДНК.R.sphaeroides (рис.2 ). 0RF3 кодирует полипептидный фрагмент, состоящий из 139 аминокислот, имеет заметную гомологию с N-концевым фрагментом неидентифицированного гена R.capsulatus, расположенного перед геном glnB (Kranz ét. al.,1990). Подобно ORFglnB и ORFglnA, 0RF3 R.sphaeroides имеет перед стартовым кодоном последовательность сходную с последовательностью Шайн-Дельгарно.

Анализ ?|укяэотидг:ой последовательное^ гроыосомиого фрагмента EcoRI-БапШ R.sphaeroides.

Исследуемый EcoRI-BamHI фрагмент хромосомной ДНК R.sphaeroides, содержащий три трансляционных элемента: ORFglnB, фрагмент ORFglnA и фрагмент неидентифицироЕанной 0RF3, имеет G+C состав 62,7%, что ниже среднего для хромосомы R.sphaeroides (67% по Marmúr.Doty, 1962). Различные участи? изучаемого фрагмента отличаются по G+C составу ДНК, варьирующему от "3,1% для ORFglnA до 63.9% для ORFglnB. Мехцистронные районы имеют G+C состав ДНК в различных участках от 57,3% до 65.9%. Высокий процентО+С оснований в ДНК изучаемого фрагмента хромосомы R.sphaeroides определяет предпочтение в использовании кодонов, имеющих G или

С в третьем положении для практически всех аминокислот трех исследуемых ORF, за исключением тирозина, у которого не обнаружено очевидного предпочтения TAC перед TAT. В качестве стоп-кодонов в CRFglfiB и DRF&IrA используется TQA (Чурин, 1992),

В пределах изучаемого фрагмента ДНК не удалось идентифицировать каких-либо заметных элементов вторичной структура, одна--' ко, анализ участка ДНК, расположенного ниже стоп-кодона гена ginA по течению транскрипции, позволил выявить шпилечную структуру в районе 2413-2456, представляющую потенциальный rho-независимый терминатор.

Апазгз д«дсрпиг püäcüob гопст glnB и glnA. Последовательность секвенированного EcoRI - BatiHI фрагмента была изучена на наличие консервативных последовательностей, представляющих собой сайты связывания с известными регулятор-ными белками , такими как NTRA, MTRC, NIFA, САР у энтеробакте-рий (Reitzer,Magasanic,1985; Ames.Nlcado, 1985; Popham et.al., 1989), и различных диазотрофов (Carlson et.al., 1987; Martin et.al., 1989; Jones, Haselkorn. 1989, Hubner et.al,1991). Kpo-:*e того, проводился поиск консенсусов известных бактериальных промоторов ¥ онхавсерОЕ ■.Foster-Harnett Кгаг.2,1992, Ргекег ее.al s 1992),

В н/клеотидной последовательности, предшествующей ORFglnB, было найдено яеешльио характерных последовательностей (рис. 2). Нуклеотиднзя последовательность GCAC-N5-TAGGGC, локализованная медду 444 и 453 нуклеотидами изучаемого фрагмента ДНК R.sphae-roldss, имеет 80% гомологии с сайтом связывания белка NTRC в ДНК S.typhimurium (Dixon,1984).

В проvoTop"оif области гена gnlБ' R. spbaeraides ш идентнфя-Щфоазли последоажгельЕосгь TiSCAC- 1J23- ТТСССС, расположенную между 442 и 476 нуклеотидами и имеющую высокую степень гомологии с Промотором glnApl Е.coli(-35): ТТ6САС-П18-(-Ю)ТТССАТ. Псгдаслсгагмал ¡.оследсва^ельность -35 у ?..sphasroides, так яе ;сак к в случае glnApl, перекрывается предполагаемым сайтом связывания с белком ntrc (рис Z).

Последовательность TGTTG-N5-CCGCA R.sphaeroides. локализованная положении 226-241, имеет öüZ гомологии с последовательностью UAS (сайтом связывания белка NIFA) T6TYR-N6-YRACA у К.pneumoniae (Cannon et.al., 1991; Gussln et.al.,1986). Поиск

последовательности TCTGCCAGA, который предположительно участвует в связывании белка NTRC R.capsulatus (Preker et.al. Д992) в лидерной области генов glnB и glnA, результатов не дал. Анализ гомологи» ORFglnB н ORFglnA R.sphaeroldes с известными генами других бактерий

С целью идентификации открытых рамок считывания, обнаруженных в EcoRI - BamHI (1,40 т.п.н.) фрагменте хромосомной ДНК R.sphaeroides, а также определения степени гомологии glnB и glnA генов с уже изученными последовательностями этих генов у других бактерий, мы осуществили поиск гомологичных последовательностей нуклеотидов в базах данных GenBank к NBRF с использованием программы DNASIS. В результате была обнаружена гомология 0RF1 (glnB ген).с glnB генами R.capsulatus, Azosplrlllum brasllense, Bradyrhlzobium japonicum, Rhlzobium legumlnosarura, K. pneumoniae и E.coli. Размер полипептида GLNB составляет у R.sphaeroldes 112 а.о.; теоретически вычисленный молекулярный вес - 12,067 kDa, что сопоставимо с белками GLNB у других микроорганизмов (см. таблицу 2).

Таблица 2. Гсымзгаг шют £1вВ гекои R.sph&aroidM в £lo3 rqs S3 раздавал маироорггякзаоа.

Д№• Проци» гтатлогаз. S

Ь&ОфооргаяяэЕз

вашшггкдэ СБахж)

Hhodobacter

capsulites 112 Ы.&

А2овр1гШда

ЬгаяИеш® 112 тз.г

BradlrhltoMm

Japonic™ 111 T0.S

ЙЦгоМия

legal тиягш 111 72.3

n«b«iei!a

таеикийа E*ch»rlcM» 112 «¡.г

SOU 111 &S.3

В случае 0RF2, была обнаружена гомология ее нуклеотидной последовательности с генами glnA генов A.brasilensae. R.legu-mlnosarum, E.coli, S-typhimurium, A.vlnelandll.T.ferrooxldans, M.capsulatus, Anabaena spp, B.cereus, B.subtllls, C.acetobuty-llcum, M.voltae и R.capsulatus. Последовательность из 397 пар нуклеотидов, составляющих данную ORF, гомолог ..чна 5'-концевой части glnA - генов перечисленных вызе микроорганизмов. Степень гомологии определялась в расчете на полную последовательность гена glnA R.sphaeroldes, полученную путем добавления к 5*-кон-цевой части гена, определенной в данной работе, ее З'-концевсй

части, определенно;* ранее (Чурин,1992). Для дальнейшего анализа использовали полную последовательность ORF glnA, что является необходимым для возможности объективно оперировать данными всех проведенных с ней исследований. Длина полипептида g-lnA R.sphaeroldes, полученного компьютерной трансляцией ORF glnA, составила 45? ?д®кокислотных остатков, что соответствует средней длине полипептида ГО у грям-отрицательных бактерий и на 23 основания превышает среднюю длину пслипептидов ГС у грам-поло-¿кительных бактерий (таблица 3).

• Приведенные выше дачные позволяют с уверенность»? нденгкфтг-цироватъ изуиэ емуж? яуклесткднут! последовательность 0RF2 R.sphaeroldes как часть структурного гена glnA.кодирующего ГС.

Сравнение гышогасдотных последовательностей белков Сравнение аминокислотных последовательностей изучаемых белков SLNB и (ЗЛА R.sphaeroldes, полученных компьютерной трансляцией нуклеотндных последовательностей соответствующих ORF с имеющимися в базах данных GenBank и NBRF аналогичными белками, велось в программах PRGSIS к бспеВсе. После попарного определения процента созпадаюеих амикокислотньрс остатков Сданные приведены в таблицах 2,3). было проведено выравнивание аминокислотных последовательностей белков GLNB, GLNA R.sphaeroldes я других бактерий друг относительно друга.

T55-JSTS 3» Гок&лСГЕ.5в к-пКэ ГтгЬсм я {ilni.

rsH-тш «з fpisspsste. ¡ажрос'ргеааэкиа.

РОЛЖЖТЯО Продает геиологгж, S (Бело*)

t&oäcbaetcr

сзрза1а*М2(1ЭСзо) 90.0

kzaspirilltz:

tü"i" »i -TT'.SÜ Ш «г.о

BBCholcaia.

coli ss.s

KstMloßaelllus

capsulata «S3 55.3

Bhlzofclie

1 tgtjcsli»»jirai m 59.G

Acotshicter

Tlasilsaill tST 53.2

Selnexalia.

typnutlfun Ш 58 .2

BiiobiellHu

fsro3xlite3s iSS 57.2

teCasüK

sc. «T1 52.7

Eacllles

CS! 9US IM 3*.7

ЕясШдм

KülllU Ш 3*..

Clcstrlila

siiioöatlilccs из 33.4

SbttKiococcvi

| TOltaa «s 30.7

a. Консервативные участки, характеризующиеся высокой степенью гомологии у всех бактерий, встречаются практически равномерно по всей длине полипептида GLNB . Всего наш выделено четыре таких участка (рис. ЗА), наиболее протяженный из которых (33 а.о.) расположен в средней части GLNB в .районе' сайта уридилирования (тирозиновый остаток в положении 51, согласно Son, Rhee, 1S87). Сайт уридилирования присутствует во всех изученных GLNB-белках и занимает в них одинаковое положение.

b. Выравнивание аминокислотных последовательностей глутамин-синтетаз различных микроорганизмов было выполнено на базе аналогичных работ (Rablings et.al., 1987; Possot et.al., 1989).

В аминокислотной последовательности ГС R.sphaeroldes обнаружено пять консервативных участков, схематично-представленных на рис-ЗБ. Участки I, II, III, IV к V, характеризующиеся высокой консервативностью аминокислотных остатков, были выделены по тем же признакам, что и в аналогичных исследованиях (Janson et.al., 1985; Rawllngs et.al.,lS37; Possot et.al.,1983). Идентифицированы сайт модификации ГС R.sphaeroldes аденилированием (Туг395) и сайт, чувствительный к окислению кислородом(Н1з2б9).

(Л)

I-JJ- » -j}]}-! Gura 1112 aoî

(S)

■—D-

И III Г/ V

aux

J4Î7 SO)

цл-

■il—0-Щг

м>

100

200 300 .

J_,_L

«00 «67

Рис.3 Схема ховссршгзвых тагов белков CLUS я GLNA. Teucaaa тфрзки обозжжевы хврвегерзхе учгегха бела США. corneae арвятыу лаж вето влзят (НамСпр et.al.J93S); зхзхочхамз отмечезы cixm даяалцрсмяиг (VD) для GLNB s air адеяигаромает (AD) ди GLNA. ЦП- .^еят-рияввз петяя*. Даша |шш в аигаавгаотнкг осгзпах (ао).

- 13 -

Клонирование к секвенирование мутантнсй копии гена glnA

Для определения природы мутации glnA83 и ее локализации была клонирована мутантнал копия гена glnA R.sphaeroides. С этой целью мы сконструировали мини-клонотеку EcoRI-фрагментов хромосомы мутанта Gln83, размером 3.4 т.п.н. на векторе M13tgl8.

Рексмбинанть'ыэ клоны гибридизовали с радиоактивным зондом на основе EcoRI-фрагмента плазмиды р152 размером 3,4 т.п.н. Было отобрано 5 клонов, обнаруживших гомологию с использованным зондом, обозначенных pG83-l, pG33-2, р683-3, PG83-4 и р683-5. Для • дйпьн^йше^ п?лоть! уи взяли ОП83-1 и pt>83-3, и использовали их

Нуклеотидная последовательность обоих клонов была идентична 5'-концевой части гена glnA и содержала транзицию G->A в положении 1469. Эта 3ai.ie.ua приводит к возникновению стоп-кодона TGA вместо триптофанового кодона TGG в гене glnA в клетках штамма дикого типа.

Анализ полипепткдов, кодируемых минимальным комплементнруи-

Анализ яа:иц«ггкдо£, колируемых плаьмэдой (рИОЕР), содер-лсахи'.з ксмллто^н'.-ипую'цйй мутацию ginA33 фрагмент,

нгочсдглл г< с« :?ем-! 'чини-клеток E.coli. По^ааано, что по срав-нэхпз) с пзпгрзллкой г^кторно* плгзмялой pVZ209, плазмида си-:?сс :'0;:i4-:0 дсбзвочкогс "сл;:псптида с

могекудлоным ее?о.м о ¡соло 33 Как указывалось выше, EcoRI -Pv'i.4 ¿;;?,ГИеН.: , OLK1.}'.-:. £ Гл.! 1 О Т.П.Н., КЯСНИРСЗЗШШЙ В СОСТЗВе

плазмиды pilOEP, • содержит только 3*-концевую часть гена glnA бс? зт* г^рг'.т*' " с^бст!?""!";" регуляторга"

с^раг;чись!!'*.:;/^ ч'к'лскг iu;n З'-кошкесй части гена glnA на данной плазмиде может осуществляться только с внешнего (плазмидного) промотора. Таким промотором на плазмиде рИОЕР монет слуяить промотор гена, кодирующего устойчивость к

v. е.,-л г,.'-.-""!.'-. ч.аа v часть;:. :'с:.а

'¿V.'-.. '•;-:'.,.':.•: чуа".с:;; :;•.". v . ч-.ч-ач;е.-3" -к:улиз\'.оь аасаг

- г---?''..' г .г-ч а ■ чгч ч-- '-гчсг;= ¡к-с ачачч: с;:ут '•"'ч Лс" чччча.":. аач;; ч:с,о;. ->ч ачччигоч^ча г.ачаачсрагеаанчстн сходные с последовательностью Шайн-Дельгарно. Приведенные данные позволили идентифицировать на данном PvuII-EcoRI фрагменте открытую рамку считывания, обозначеннуа 0RF4. На рис. 4 призе-

дена схема открытых рамок считывания оперона д1пВА и белков, кодируемых его различными вариантами.

iciK'/t.'taan

В отличие от E.coli, К. pneumoniae и многих других бактерий, где ген glnA находится в составе оперона glnAntrBC, а ген glnB не сцеплен с этими генами, у R.capsulaus гены glnA и glnB сцеплены и образуют единый олерон glnBA (Kranz et.al., 1990). По данным, полученным на кафедре генетики и селекции МГУ, де-леция 5'-концевой части гена glnB R.sphaeroides имеет полярный эффект, и плазмиды. несущие оперон glnBA с такой делецией, не способны коыплементировать мутации glnA83 (Зикченко В.В., неопубликованные данные). Косвенным подтверждением этому служат, также, данные компьютерного анализа, свидетельствующие об отсутствии между генами glnB и glnA структур, сходных с термина-торными.

0.0 41В SM • 905 330 13Si 2»

L-II-ЛJ.—

ОГО | | 08F3lnB^>l [ORFglnA ТОЙ1-------О»

X

ВНКИЙ тип

мутант С1п»

nnaiuwu Р110ЕР

>

>

>

>

1? kD

17 Ы>

>

30 kO

fac.4 Огхриаге paxza саапаявя ¡OXF) отрава flaEi E-splmtroida в биа ащ^тшм £хрш!гшш

У энтеробактерий ген д1пА транскрибируется с тандешых пр моторов: дистальный промотор glnApl подвержен негативной регуляции пЬг-системой клетки, проксимальный промотор е1пАр2,- по-

зитивной (Reitzer, Magasanic, 1985). У R.sphaeroides, по нашим данным, лидерный район оперона glnBA содержит лишь один, сходный с glnApl, промотор. Подобно промотору glnApl, консенсус -35 в R.sphaeroides перекрывается последовательность», схожей с сайтом связывания регуляторного белка NTRC (рис.2).

Последовательность нуклеотвдов, гомологичная сайту связывания белка NIFA(UAS) К.pneumoniae, обнаружена в лидерной области гена glnB R.sphaeroides. 3 соответствии с моделью "петлеобразования ДНК", продует гена nifA связывается с ДНК в районе UAS и входит з контакт с комплексом сигма-фактор RH054-PHK-nc-лимзраза в районе -24 и -12, свертывая ДНК в петлю(Виск et.al, 1987). Однако, перед геном glnB R.capsulatus нами не обнаружено последовательности, напоминающей -24 и -12 К.pneumoniae, характерной для консенсуской последовательности NTRA-регулируемых промоторов.

Отсутствие NTRA-зависимого промотора с конценсусом -24 и -12 в лидерной области glnBA согласуются с данными,. полученными на R.capsulatus и свидетельсвующкми о независимом от NTRA (NIFR4) характере экспрессии этого ояерока (Kranz et.al.,1990). У пурпурных бактерий aweo ГС репрессируется в среда с избытком аммочия у, активируется в среде с его недостатком (Johansson, Gest..1976;Sakhno et.al.,198!;Caballero et.al.,1985).Олерон glnBA у o-xiix сектеркк активируется продуктом гена ntrC (nifRI) (Kranz et,a.1., 1590), что позволяет нам предположить существование у него второго, негативно регулируемого, промотора.

Сопоставление аминокислотных последовательностей белков GLNB R.spbavroides »«. яруги:: бактерии выявило высокую степень :гл гомологи;;. Все ös-rj« 6LNB имеют консервативный тирозин 51, предполагаемый сайт уридилирования, а также четыре выделенных нами участка, характеризующихся высокой межвидовой гомологией аминокислотной последовательности (рис.ЗА). Эти данные предпо-«агазт наличие коксервауивного механизма передачи информации азо'гасгс статуса клетки у различных бактерий (Kranz et.al., 1S90). Пурпурные бекгерии, тем не менее, могут иметь заметные отличия в структурно-функциональной организации систем регуля-. ции азотистого метаболизма по сравнению с семейством Entero-bacterlaceae поскольку у пурпурных бактерий гены glnB и glnA сцеплены в один оперон и, следовательно, имеют координированную экспрессию.

ГС принадлежит к необычному типу белков, активный центр которых формируется в зоне взаимодействия соседних субъединиц (Almassy et.al., 1986). С этим, очевидно, связано наличие пяти консервативных участков (рис.ЗБ), принимающих участие в формировании активного центра (Almassy et.al.,1986; Janson'et.al., 1986). Участки II и V представляют собой ß-спирали, тесно ассоциированные с двумя Мп2+-ионами одной субъединицы, в то время как участок I содержит триптофан в положении 57, который, предположительно, завершает формирование активного сайта на стыке^соседних субъединиц. У R.sphaeroides триптофановый остаток присутствует на том же месте - в положении (Тгр58). Участок III принято относить к сайту связывания АТФ по признаку наличия последовательности GXXGXGKT, характерной для многих АТФ-связывающих белков (Walker et.al., 1982). Этот же участок белка имеет между аминокислоными остатками 268 и 272 последовательность Met-HIs-Cys-His-Met глутаминсинтетазы E.coli, где остаток H1S269 модифицируется (окисляется) кислородом (Lewin et.al., 1978; Lewin 1984). Предполагается участие этого гисти-динового остатка в формировании активного центра ГС (Almassy et.al., 1986).

Ранее было показано, что у E.coli активность ГС регулируется ковалентной модификацией тирозинового остатка Туг397 (Shapiro, Stadtman, 1968). Глутаминсинтетазы, регулируемые аденили-рованием, обладают высокой степенью гомологии участков из 12 остатков, примыкающих к этому сайту (Janssen et.al., 1988). ГС R.sphaeroides также регулируется аденилированием (Engelhardt, Klemme, 1981), имеет тирозиновый остаток в соответствующем положении (Tir395) и 10 из 12 совпадающих остатков в консервативном участке. Участок IV, является глутамат-связывающим сайтом исходя из гомологии с последовательностью DRGASIV (Raw-lings et.al., 1987). Изучение ГС S.typhimurium позволило идентифицировать гидрофильный участок в районе остатков 156-173, чувствительный к ряду протеаз и названный "центральной петлей" (Almassy et.al., 1986).В ГС R.sphaeroides мы также обнаружили подобный участок (рис.ЗБ).

Сравнение ГС грам-отрицательных и грам-положительных бактерий позволило выявить различия в длине и в среднем количестве консервативных остатков, при этом степень геологии аминокислотной последовательности ГС R.sphaeroides и грам-положитель-

- 17 -

ных бактерий не превышало 347..

Из вышеизложенного можно заключить, что ГС 1?.5рЬаего1<Зез является типичной прокариотической глутаминсинтетазой, характерной для грам-отрицательных бактерий и обладающей рядом отличий от ГС грам-положительных бактерий.

Анализ нуклеотидной последовательности мутантной аллели д!пА83 показал, что образование стоп-кодона ТСА вместо Тгр15Э в районе "це)'.тральной петли" ГС должен привести к образованию полипептида, представляющего м-концевую часть белка ГС с молекулярным весом около 17 кОа. В то же время, плазмиды р152 и рПОЕР, способные восстанавливать мутачтный фенотип мутанта 61п83, содержат лишь 3'-концевую часть гена д1пА, с делецией первых 397 пар нуклеотидов. В экспериментах с мини-клетками было показано, что этот З'-концевой фрагмент кодирует полилеп-твд размером около 30 кЮа. Транскрипция этого фрагмента инициируется с плазмидного промотора, при трансляции в качестве стартового используется, по-видимому, один из имеющихся внутренних А76 кодо.чоз в З'-концевой части гена д-1пА, которому предшествует последовательность, сходная с поледовательносгью Шайн-Дельгарно. Анализ нуклеотидной последовательности гона £1пА Р.зрпаегхпЗез выявил наличие нескольких АТ6 кодеков, ргю-положениых ниже сайта ЕсоК1 по течению транскрипции в положениях 1491, 1578, 1590,1599, 1005, к кодирующих метиошш. Воем АТС кодонэм предшествуют последовательности, сходные с последовательностью ШлинДельгарно. Так«м образом, 3'-концевая часть гена д1пА представляет собой открытую рамку считывания, обозначенную нами 0пГ4, кодирующую укороченный белек ГС, лгаенкый К-концевой части (ркс.4). Это подтверждает наше предположение относительно участия З'-концевого фрагмента гена (?1пА, содержащегося на плазмидах р152 и рИОЕР, в комплементации мутации аг1пА83.

По данным, получении« на ;:афедре гекетис: к селекции МГУ, молекулярный вес ГС ¿13 кдеток дккого типа и клеток мутанта 01пЗЗ, содер^да шюзмиау р152 или рИОЕР, определенный ГАА-ГилектргФорегои е кед*натурируе.аих условиях, неразличим и (.оставляет около 600 кОа. Сопоставление этих данных с результатами, полученными с мини-клетками и при секвенировании ДНК,' позволяет сделать вывод о том, что полипептид размером 20 кОа является С-концевым фрагментом ГС Р.БрЬаего1йез. М- и С-фраг&ен-

ты белка ГС, суммарный вес которых сходен с весом ' протомера ГС, по-видимому, способны реассоциировать с образованием сначала протомера, затем додекамера и восстановлением активных центров. Подобный феномен характерен для межаллель ной комплементации.

ВЫВОДЫ

1. Из банка генов фототрофной пурпурной бактерии R.sphaero-Ides 2R изолирован фрагмент хромосомной ДНК, содержащий ген glnA,' кодирующий глутаминсинтетазу.

2. Молекулярный анализклонированных фрагментов выявил, что перед геном glnA расположен ген glnB. Установлено, что эти гены являются тесно сцепленными, и составляют оперон glnB-glnA.

3. В лидерном районе оперона glnBA выделены последовательности, которые могут принимать участие в регуляции транскрипции этого оперона: последовательность, сходная с промотором glnApl E.coli, которая перекрывается сайтом связывания регуля-торного белка NTRC и последовательность сайта связывания белка NIFA (UAS-последователь ность).

4. Сравнительный анализ продуктов генов glnB и glnA R.sphaeroides 2R с аналогичными белками других микроорганизмов показал, что они обладают структурной организацией, типичной для прокариотических GLNB-белков и глутаминсинтетаз,

5.При помощи секвенирования выявлено, что мутация glnA83 обусловлена заменой G~>A в положении 1462, что приводит к образованию стоп-кодона USA и преждевременной термина-ции трансляции полипептидной цепи.

6. Минимальный фрагмент ДНК, комплементирующий мутацию glnA83 обеспечивает в системе мини-клеток синтез полипептида, соответствующего продукту З'-концевого района гена glnA. Транскрипция этого З'-концевого района инициируется с векторного промотора с использованием в качестве стартового - одного из внутренних ATG-кодонов гена glnA. Таким образом, восстановление активности ГС при введении в клетки мутанта Gln83 плаз-миды рИОЕР можно объяснить за счет феномена металл ель ной комплементации.

- 19 -

Основнкэ результаты диссертации отражены в следующих ссоб-щешеи:

1. Шестопалов В.И.. Зинченко В.В."Векторы прямой селекции рекомбинантньк клоноз на основе IncQ плазмиды R89S"- сб. "Проблемы современной биологии", Труды 17 научной конференции молодых ученых биологического факультета МГУ, Москва, МГУ, 1986г., стр. 55-59.

2. Шестонавдв В. I-L, Фонштейн М.Ю. "Новый фазмидный вектор с репликоном RSF1010 и селективным маркером устойчивости к кана-йицгигу", тезисы зсеслсонф."Новые направления биотехнологии", 1987-, Пущино-ла-Скс.

3. Shestakov S., Zinchenko V., Babykin М., KoptevaA., Ка-meneva S., FrolcvaT., Shestopalov V., Bondarenko S. "Genetic studies on the regulation of nitrogen fixation in Rhodobacter sphaeroides" - in "Nitrogen fixation: 100 years after", Koln, FRG, Stuttgart. New York, Fisher-1988, pp.163-169.

Zinchenko V.V., Churin U.N., Shestopalov V.I., Shestakov S.V. "K'olecular organisation and characterisation of the glp.BA operon of the purple non-sulfur bacterium Rhodobacter sphaeroides ZR", J.Gen.Microbiol., 1993 (in press).