Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и молекулярный анализ гена, контролирующего устойчивость к гербициду лифунону у цианобактерии Synechocystis sp. 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и молекулярный анализ гена, контролирующего устойчивость к гербициду лифунону у цианобактерии Synechocystis sp. 6803"

Я5 м

МЫ* 1393 .

- - р0сс1м0к/л академия наук

ИНСТИТУТ( ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им.Н.И.ВАВИЛОВА

На правах рукописи УДК: 682.232.7: 681.132: 577.113: Б792&4

БАЩЕВИЧ ВК5СТ0Р ВЛАДИМИРОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ 1 ШЕШЯРННЯ АНАЛИЗ ГЕНА. КОНТРОЛИРУЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К ГЕРБШШЛУ ЯИФУНОЯУ У ЦИАН0БАК1£РИЙ БУНЕСНОСУЭТ1Э БР. 6803.

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

1'аОотн выполнена в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор Оиологичес-их наук, профессор, член-карр. РДЙ

С.В.Шестаков

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор Отологических каук, профессор.

доктор биологических Наук

В~&.Т8расов Л.В.Глазков

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной гекзтпки РАН

Защита состлггся

часов

на заседании специализированного Ученого совею Д002.4Э.01 при Институте общей гопотгаси им. Н.И.Вавилова РАН (11780Э, ГСП--1, Москва, В-333, ул. Губкина, 3).

С диссертацией • койно ознакомится в библиотеке Института общей генетики км. Н'.И'.Вавилова РАН.

Автореферат разослан

1С

1993 Г.

Ученый секретарь специализированного coeoTcj , кандидет биолоппе ских наук

I

Г.Н.Полуляа

Актуальность проблем. Задачи клонирования и молекулярного шализа генов, контролирующих устойчивость к гербицидам -1тибатора:.Г '©этосгаггезаТ' '"заншы'" "для"" 'ратания'"ряда" 'вктуайьннх~ роб лек, связанна:-: с:

) изучением молекулярных механизмов и мишеней действия

ер'биццдов в растительной клетке;

) выяснением физиологической роли генов резистентности и их родуктов в энергетическом метаболизме;

) расзмфрозкой структурно-функциональной организации. генов в леточном ядре и органеллах, исследованием механизмов регуляции '¿¿si*, генов;

) получсшюм НОВОГО поколения ВНС0К08(£ф9КТИ£ аьш Гврр^ЩИДОВ с збирательним действием и высокой степенью эгсрлогической эзопвсности;

) созданном трансгенных сельскохозяйственных..,., .растений, втойчивых к гербицидам. ; ' '

Возмолгости. исследования этих проблем на\ растениях граничены из-за методических трудностей, обусловленных поясностью »адпкул1яр1Ю-г«нетичеокого вназиэе »•?:-}у., объектов. 5,o6i;oh '.-.моделью для-изучения генетического контроля -<у,стойчквоста герошитдам могут сдурить п.какобо.'лтеряУь. С -одаой сторош, этосштотачесый аппарат циакоОьктерий и (Лишни действия эр<5иипдов очень сходны с таковыми у растошя. О другой стороны, хжариотнчоокий тип строения клетки, способность -к генетической мт-юфориащш. относительная' простота получения мутантов хтеоляпт клонировать к анализировать гзки; . каатролируаааю )зистентность к гербицидам.

В. настоящее время из цианобактерий клони$5оввйн и изучены «ш, ответственные за 'устойчивость к триазиновпи Гербицидам

¡olde.i, Ilaselkcrei, 1935; Gingrich et al.'» 1988); К

[трофэнолышм гербицидам - иоксинилу (Ajlani et ai;., 198°) и Шй'себу (Чеснавиченэ, 1992); к гербициду норфдурдзоиу ■( Chernov! tz , al., 1590, 1991).

ГопбТ'ПЗДп обеощячнващего типа (гадов кеп норфлуролон. :фукоч.; флурадоа и да.) вывивают 'хлороз у фогосийтезЕр*'ЗДк£ »гшсйнов. которой в оснопиом СВЛЗМ5 с иаруаенцрш оиосннтозо роткниидоз. Действие зти:. горбивддов на рвстения, зеленые доросли и циатабяктарии приводит к резкому снижении уровня еткых каротинопдон и визивает накопление их бесцветши. едшественников - фитоина и фитофлуина (ШиЧеЬз. McCuUough,

Sandmann, Boger, 1989).

!< результате клонирования и молекулярного анализа гена определяющего резистентность к норфлуразону у цианобектери ¿.viie^hococcus 7942, было установлено, что устойчивость вызван мутацией в гене pds, кодирующим фермент фитоин-десатураз :ouaraovitz et al, 1990, 1991)- Это ключевой фермент в биосинтез каротиночдов, ответственный за превращение фитоша сиачало фятофлупп, а затем в £-каротин. Устойчивость к норфлурезок обусловлена уменьшением сродстпа фермента к горбшиду. Однак норфлуразоц-резцстентные ?лутэтты, полученные Ливденом с соав';1 (Linden et al., 1990), чувствительны к другим гербицида о<Зосцве'Еша»«дого типа - дифунону, фдурздону. По-видюйому , зт гор5ицида могут дойстговать нз разные шш в клетке. Известно что под действием' днфунока спутается содержание рибосом хлс/рошистах и активность ряда хлороп.ластных к порокснсомны формантов (Feierabend, 1984). Таким образом, несмотря на то, чт обэсцввчивгодусо гербздздц применяются в . практико уае Долее Z лет, СЕеденкя о нодеку.>угряой природе Мишелей их действия з клэтк и гоноткчесжк. механизмах устойчивости к ним изучены ещ кедостаточно п лно.

Цзль работа. Данная работа посвящена клонировании молекулярному ьнализу гена, контролирующего устойчзвость гербициду дифунону у цнанобактерйи Synachociutiu 6БОЗ. Освовзд задачи исследования:

1. Получение .мутантов Synechocyetis 6803 yotofsSHBHX гербициду дифунону.

2. Еидолеше гена, контролирующего устойчивость к декаду.

3. Определенно нуклоотидкой последовательности шгакпрован ного гена.

4. Делэцкоаяое картирование и определенно кодэкулярш природы мутаций, .сбусловлкзаших устойчивость к Г5рйвдад дкфуноку.

Науст ьовиапь я тхраоктспар глупость Зпарвн

полученн путантн цианг ".актерки Syiieehocystle 68oí, обладагици перекрестной устойчивостью к гербициду днфуноку н к кле точны, тп'иоитсрам - хлерпромазину и трифтор-эразшу (антагониста: кальцкй-засис:шшс балкон). Выделен новый, ранее неизвестный г dir (с 1;,6йз), контролирующий устойчивость к .дифунону хмрпро-ыагьщ У цианобактарий. Определена нукдеотидна последовательность клонированного гена и выявлена молскулярна

природа повреждений в гене dfr у мутантных штаммов. Установлено, что устойчивость :с ингибиторам появляется в результате :saKT2EBUjffi гена dfr и, возмсино, обусловлена утратой функции продукта"данного тепа. —

Получвнннв данные ваваы для изучения физиологачзской роли гена dir и механизмов развития устойчивости, к гербицидам у

П8ЛЬСКО70ЯЯЛ0ТГ9'Я12дХ раОТОЖЙ. 1г.ЛОН1фОЬаЗПГЛ'4 reu Cur "TWIST быаь

иишьзрван в качество зонд?, для аоиска гомопогкчшг генов у sucphx рестбзяй i-чя ссздазпл vpauoromtx расгчиаа устсСчишх

к дйфуно.ii',

Йтруктурз g объел диасер?а1ся« Диссертация состоит из oösopa лхтзргхда. пссглнзннсго üc-эдш . кгеппроггхпя гъноа из цдааобая'гсрь^ ii иозвдляраш шжшвкш дп^стбля гербицидов, разделов с описанием материалов и методов .исследования, результатов и кх обсуждения, выводов ч списка цитируемой литературы. .Работа кзлокена на стр. машин'лисцого текста, содержит рисунков я . таблиц». Список литературы включает наженованиЯ.

VATEPltWH М- МЕТОЛУ

В работе использовали штамм Escherichia ' coli m. 22 {aupE, ilii, Ailae-proAEbÄhBdS (r~,ra"), [Iм pro AB, laoIq Z ДК151) ИЗ коллекции кафедры генетики а селекции Ш.'У, бактериологически чистую культуру штамма дикого типа Syneohccyetie яр. PCO 680J из коллекции Пастеровского ккституга (Париз, Франция), а также выделенные в данной работе спонтанные мутанты Synechocystic бьоэ-DF1 , ВРЗ и CFH6, устойчивые к гербициду дифунону и клеточным ингибиторам - хлорпромазину и трифтортаразину.

культуру Sync-chocystis 6803 выращивали в лшиностате при тегтературе 30°С и освещенности 2000 ж на модифицированной -реде "С". Твердая среда "С содержала 1% агара. Для выращвания E.coli использовали среду lb (Миллар, 1976).

Для отбора спонтанных мутантов, клетки цианобактерий высевали на твердую среду, инку'бировали в лшиностате до появления .слабо-зеленого газона и добавляли под агар дифунон iura хлорпромазин (до конечной концентрации 200 мкг/мл -и 15 мкг/мп соответственно).Через 14-20 дней отбирали клоня, выросшие на фоне лизировавшихся клеток, и проверяли на повышенную устойчивость к гербициду или ингибитору.

з

При трансформации цианобактерий на устойчивость к дафунону, суспензию клеток, находящуюся в логарифмической фёзе роста, наносили на китроцеллшсзше фильтры ("Millipore" НА, 0,45 мкм), помещенные на поверхности твердой среда. К суспензии добавляли ДНК в количестве 0.5-1 мкг и равномерно размешивали на фильтрах. Через 16-18 часов инкубации фильтры переносили на чашки с твердой средой, содержащие гербицид в концентрации 80 мкг/ыл. Трансформанты учитывали через 7-10 дней. Трансформации цианобактерий на устойчивость к канашцину проводили по описанной ранее методике (Williams, 1933).

Выделение хромосомндй ДНК Synechocyatis 6803 проводили по методу (Crigorieva, Shestakov, 1982), Элифова^щ ДНК из агарозного геля проводили фильтрованием через фильтровальную бумагу с помощью центрифугирования по описанной методике (Zhu et al., 1985; Дрэйпер и др.,1991). Перенос ДНК с агарозшх гелей на нейлоновые фильтры ("SartQriu3", "Nylon 66") осуществляли при помощи вакуумной установки для пэреноса ДНК.

Выделение шшзвддной ДНК из е. coli,, ее обработку рестркктазами, ДНК-лягазой и щелочной' фосфатазой, электрофоре талиский анализ, мочение препаратов ДНК методом рассеянного праймирования,. блот- гибридизацию ДЩС и гибридизацию in situ бактериальных колоний на ' нитроцвллэлозпых фильтрах проводил? по оощеприня.тым методикам (Маняаткс и др.,, 1;934)

Нуклеотвдпув последовательность ДНЗ: оирэлеляда .катода^-дидезоиситорминкрованая по Сенгеру (Sanger, 1977; Краэв,, 19S3).

Ферменты.,, использованные а ' работе, получать га НЮ "Фермент"- (Вильнюс).

Экстракцию пигментов , из ' клеток ßynechocystis- 6803 осуществлял» ло модифищгрсвашюму методу (Bligh st al..,, -¡359).. СпэктраГ поглощения пигментов гамзряяи на. отакт,рс4}эта?.;етрз "Ш tçoepea )ДК-.

BESyj^'ÏAyiJ; Ш, ОЕСЙЭДЕНЙГ!-

Х-. I&ïsîjss?.. SsnoolîcoÂS^ÎB 5803 усч'ойчксиэ к гарбкцзду

ЖШеоп? И иаркрсаазизу.

1.1. Отбор иутшл-оз.

My.Jiixa резистентнее к гербицидам используются для исследования мишене** " дзйствип s тих гербицидов на молекулярном уровне. В данной раоотр из й.тобряннкх первоначально 20 клонов

¡ynechocystis 6803 устойчивых к дифунону при дальнейшей селекции ш средах, содержащих все более высокие концентрации гербицида, «обрали два спонтанных мутанта DF1 и DF3 (0£г-мутанты), клетки юторых проявляют стабильную резистентность к 350 мкМ дифунона.

1.2 Влияние дифуйона на содержание хлорофилла а а кароишоидов в клетках птамиа дикого типе Synechocystis 6803 а Мг-мутантов4

При выращивании штамма дикого типа SynechocystiB 6803 на ¡реде, содернащей дифунон, клетки приобретают сине-зеленый iTTeHOK, тогда как клетки мутантных штаммов DF1 и DF3 - желто-¡еленпЯ, что обусловлено изменением содержания кло точных игментов. Измерение спектров поглощения хлорофилла а и .аротиновдов в экстрактах из клеток, выращенных в присутствии Ифунона показало, что в клетках штамма дикого типа почти олностью отсутствуют цветные каротиноиды и -снижено содержание лорофййда а, тогда- как в клетках мутантов наблюдаются лишь взначйЗМЬиые изменения в составе пигментов.

Аналогичные результаты были получены и при использовании ругого гербицида обесцвечивающего типа - нор&иуразона, который вляется инптбитором фитоин-десатуразы - фермента биосинтеза аротинондов.

Таким образом, действие гербицидов дифунона и нсрфлуразона а клетки мутантных штаммов DP1 и DF3 не приводит к такому начитзлькому снижению уровня хлорофилла а и каротикоидов, оторое характерно для клеток штамма дикого типа.

1.3 . Перекрестная ■ устойчивость 1)1г-цутантов к шшгбитораа цольцнй-зависталх белков - хлорпроыазшу н трафгорпергзину.

Многие гербицида имеют в клетке не одну, а несколько йпеней. Вместе о тем» многие метаболические пути и клеточные истемы являвтоя №ШШлй одновременно дай различных гербицидов и леточных ингибиторе, детому, для определения функции, которую ыполняёт мкшень 6 ШгатКе, существенную помощь мояот оказать солбдование перекрестной, устойчивости мутантных штаммов к азлгмнам-.гербицидам и ингибиторам. ..;

Как упоминалось выше, действие норфлуразона на пигментный остав клеток штамма дикого типа SynechocystiB 6803'И мутантцых таммов, устойчивы" к дифунону» аналогична, чействию дифунона. днако, нам не удалось установить йбрш'И устойчивости к орфлуразону, НО(?Кол!,ку клетки штамма дИкоЮ iülta tynoctwoyutie

ьяоэ . оказались исходно устойчивыми к достаточно высоким концентрация?.: ;;орфяуразопа.

Весьма неогзденннм оказалось, что гг^-мутанти резистентны также к клеточкам ингибиторам - хлорпроыезину и -рр^Фторперазину, которые язляотсл антагонистами кальвдулкн-подобшх и других кальций-завтсимых белков/в том числе фотосистема II (Сагреп^ег, Nakatan^, 1935).Спонтанные мутанта, полученные путем селекции ъэ устойчивость к хлорпроиэзг-шу, резистентны твкке к дкфунону II тркфторпераоину. В таблица 1 приведет: свсдэння о порогах устойчивости к дьфуноыу и аатог-дастам кальцвй- эввшаых балкоз (при выредавашш на твердой среде) у клеток штакма ддкоге типа БупесКосувНв 6803, мутантов - шч к прэ, отобраншх по признаку УСТОЙ^ШОСТН К ДИЩТНОНУ»' К ОРЯо, отсбрвгасго Гфя С6ЛЭКЦШ5 н» устойчивость к хлорнромэзкиу. •

Таб-аца 1. Порога устойчивости клоток вга ачка. дикого тжха БупееЬосув^1в 6803 и мутвннх. вгадоа тач» Г»э и сгиб г. доЭунопу в ингдблторам кальций- зависящих белков. '

I- Штага ёэнэках Пороговая концентрация 'шяжЗзтора ^ шсм

Дифуноа Хлорпроказан Трифтордеразш

Дикий шп ЕГ ВО '5 60

СП вгг 350 200

№3 ВГг 350 40 160

сы6 срг 350 45 200

Мутантныв штаммы обедают одинаковой перекрестной резистентностью к дифунону и ингибиторам кальций-зависимых Зелков, что может быть обусловлено мутациями в одном и том жм ^ене. Следует также отметить, что устойчивость к ингибиторам увеличена не более чем в 4-5 раз. Таким образом, выявление нутантов и трансформантов на твердых средах может осуществляться только в узком диапазоне концентраций ингибиторов.

2. клонирование гена, контролирувдего устойчивость к дифунону у Synechocyetis 6803.

'¿Л. Ецделяняе фрагаента хроиосоиной /ЦОС нз мутанта DF1, трансформирующего клетки штампа дикого типа по признаку

устойчивости к дафунону.

Препараты хромосомной ДНК, выделенные из мутантных штаммов )F1 и орнб, трансформировали клетки штамма дикого типа iynechocyetie 6803, обладающих природной компетентностью IGrigorieva, Shdstakov, 1982), по признаку устойчивости к дафунону с астотой Ю-6. Однако, трансформацию нз устойчивость к :лорпромазину и трифторперазину осуществить не удалось, поскольку юроги устойчивости к этим ингибиторам слишком малы для выявления 'рансфэрмантов с помощью данного метода.

При клонировании фрагментов ДНК, содержащего ген юзистентноста к дифунону, был применен метод "о огащенной голосы". Хромосомную ДНК мутантах штаммов обрабатывали вдонуклеазэми рестрикции BaniHl, - Bglll, Xbal до полного ¡асщепления. Продукты рестрикции фракцибцировали в 0.6% геле [егкоплавйой агарозы "и вырезали полоски геля, содержащие ¡рагменты ДНК- размером 9.4- 23.1', 6.6- 9.4, 4.4- 6.6, 2.0- -».4 ■ыояч пар нуклеотвдов (т.п.н.). Для трансформации цианобактерий ю признаку устойчивости к дифунону кусочки геля плавили при '0°0, охлакдали и добавляли ДНК к клеткам вместе с расплавленной 1гарозой. Способностью к трансформации с максимальной частотой »бладали BamHI ( 9.4-23.1 т.п.н.), Xbal (6.6-9.4 т.п.н.) и Bglll 12.0-4.4 т.п.н.) фрагмента ДНК как из штамма,DP1, так и CPN6. Это гадтверждает предположение' о том, что устойчивость к дифунону и лорпромазину у исследуевдх мутантов контролируется одним геном.

• Из Xfcal фрагментов ДНК мутанта DF1 размером в.6-9.4 т.п.н. !ыл сконструирован мини-банк (500. рекомвинантных клонов Е.соИ, намм NM&22) на-основе плазиидного вектсра punts. Из мини-банка 1ыла выделена шщивидуйльная пла'змиде pDPi, содержащая хь&1 фрагмент хромосомной ДНК мутанта DP1 размером 7.2 т.п.н. и

к

■члада'ощая способностью к трансформации: клеток ¡зтэкма детого nina на устойчивость к дифуьчэиу.

2.2. РзстрпюиоянкЗ л декедвовдиЗ xazsma ,ЦЖ>

вйотаюзакногэ соот-гае илаа ада j>3?1 -Для построения рострльгу-юнисй карты клог-крозьшого фрагмента, шгагадзу popí обрабатывав рамзчшм» рсетргастбзайи и анаяйзлр-oiiojji тшсдук-гн рэи'срйдшш с пииогый т-а «ь-s локтроЛдрззс. Полученная рпвтргсщиоииая карта приведена ¿¡а ¡жоЛ,

С поль» Сошэо точкой ¿юкализзцин кутацтл, сярвяцкхяярк устойчивость к дпйупону, оил пс лупен р.:д двтоцкжл«? вропекодгтнл-нлакигдч pD?i (рно.1)г которые п^взрядос* 'на способносчь трансчорзровать GjT.ochocystiB SßO'j i с /¿«.улот-усгоЗйпюогк. Ib¡t<s;,ui.üj pur¡о Ii ¡WE, которые содержат с7'>5гагт.сс:-и^, яюяыю область пэрг-кр^ва^мя и 100 ua-i., обседают caocoúüoc-itw к трансформации, тогле как шшоодп pttPi»t додоч&ода на отл 100 п.н., - тпеьсформа»С!й па вузывзег. Из этих, д-шпнх следует. что мутаияя докалазоеша па Riiidlii-Pu« (.ушхиэятв pú3Moj«»< 100 п.н. (р;;з Л ).

2.S. IO*o.Hiipo;¡:¡;í'2tí Срег-ь'-л-юв Дт«? «л чп-^ш» ¿¡п-юз-о

•neis м ад-теота СГЙЗ гоуоло^-иг.; • ^гр^хлсйг?" ша&'.'ад рПЗ*1.

Хромосомзую ДМ йтагд.га дикого тяпа ' и кутяат« ni-нб обрабатывала эвдонукловаой рестрикция Xbal до полного уиаразиаи. Продукты рестрикции разделяли с помощью 9лектрофэрС1Ш я 0.G й геле и элвироьали фракция с размером фрагментов дас «соло 7.2 Т.П.Н.. Для каждого штамма на основе плазшш ptf0¡9 конструировали плакедлыз кяни-банки по 200-300 клонов.

Для скрининге полученных мани-Сапков в качестве зонда был использован ílccRI-Potl фрагмент ДЧК размером 250 н,п, из шшзййда рПР1. В результате скрининга путем гибридизации колоний била шделони плазмида. .содержащие ХЪаГ фрагменты (7.2 т.к.и.) . хромосомной ДНК штаьма дикого Tima и мутанта срк5, гоыологкчныз Sbai ф1>агменту хромосомной ДКК мутанта D?1. Ил а амида обозначили «соответственно как р FWT " и рошб. Рестракционныэ карте клонированных фрагментов совпадают с картой фрагмента в нлазмвде pop ,и?ображениой на рцс.1.

Плазмида pCPÑo трансформировала клетки штамма дикого типа по iи -;нпку устойчивости к дифунону. С.помощью делоциошюго анализа .. mvt;i!1T.-¡ oi'Kb мутг. и я локализована на BglII-EcoRT участке ДНК , ■ 'V. Т.'М i. 1 т.H.H.

Яоьгязят х|хя.;'л;сшк:й ¡¡.Ci Илазьыда • г, ,г.б;ю';гь к

трансформации

M.J.

п Е"Г? Л IX

на устойчивость

К-ДИфУНОНУ ________

и

Б }:! j Р Л

pD?1A

В

PDF1B

H

Б Е|Р

¿ЗЕзагиисг«^

PDP1C

В

pUF1 D

obVV,

H Р

->-*- ' 1GO п.ч.

1 т.п.п.

J_L

VlfOaü-r-í й KO.TOv. ÜÍÍO/iU:* (TipfiJ''veisTíi

't.? '",ц а.;. а.:утп:2?г зп ,к<юм1рсоьнаого а cocí¿ее

ма-лида рд?1. мутацап картирована на HindiTT-PeU -фрпгмппте ДНЯ" к-.-'йро;.-: ß îGv3 a .su.

V-l.:uli, ß-jjgiil. 3-reoÄI, U-Hiaillî, 1»-Гз11, X-Xbal.

2.4.Определение и. кснпьюторний анализ нуклеотидной последовательности гена, контрояфуздего устов*вгоость к дифунону.

Из плазмидн pDFWT секвенировали HincII-Aeuii участок ДНК размером 3 т.п.н.. Для этого Xbsl фрагмент .гошзЪвды рШ»т расщепляли эндонуклеазами рестрикции на более мелкие субфгаманты и клонировали в фаговые векторы для секвенирования. Стратегия опытов по секвенированию приведена на рис.2. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что секвенированний фрагмент содерйит открытую рамку считывания из 563 кодонов (опубб?); в пределах которой локализованы мутации вл и CPN6. Кроме того, выявлена еще часть открытой рамки считывания (обозначенной на рис.2 как ORP95), прерванной сайтом рестрикции Hincli, по которому осуществлялось клонирование в фаговый вектор.

т Но s Не

В |Нс Hcl SI Не El Н Р. Т Т А

I I I___U_■ I ': till

0RP95 0RF663

1 т.п.н.

Рис.2. Стратегия опытов по секвенированию участка ДНК разгром 3.0 т.п.н. из плазмиды prowl'. Стрелками указаны направление и про т.частность секвенировашшх участков ДНК.

A-AsuII, B-BglII, E-EcoRI. H-IIlndlll, Hc-HincII. P-Petl, ¿•.-Saul, T-TaqI.

На рис.3 приведена нуклеотвдная и соответствующая ей аминокислотная последовательности онрббэ. Перед ОНРббз обнаружена —пуринбоРатая последовательность, которая южет служить сайтом связывания с рибосомой.

Проведенный компьютерный анализ нуклеотидкой последователь ности рамки ОКГббЗ с помощью пакета программ РСЫ5ЕГГЕ (версия 15 показал, что данная рамка с высокой степенью вероятности является кодирующей, олгббз может кодировать СШок с молекулярной массой 74.5 кДа.

—, Анализ профиля .гидрофобности аминокислотной последователь ности ОНР663 по алгоритмам Кыот и Дулитла (К^е, ГооИ«1е, 1982) (Йакет прогамм версия 1) покагчл наличие нескольких

гидрофобных учдстков на концах полипептида, что говорит о возможности(Связывания продукта данного гена с мембранами.

3. Определение копийкости ОКУббЗ.

Для определения числа копий ОЯРббз в геноме БупесКосувив 6803 была проведена блрт-гибридизвция' .лрбмосомной ДНК, обработанной андонуклеазами рестриктции Вв1П,-крп1, Рви и хЬа1, с Ввш-Ра« фрагментом (1.3 т.п.н.) из плазмиды рйрят. Во всех

четырех случаях была обнаружена только одна полоса гибридизации, что свидетельствует о наличии единственной копии опрббз в хромосоме БупеоЬосувив 6803.

4. Поася гомологии ОИ'663 с известашп гвпеш.

Сравнение нуклеотидной последовательности. ОИРббЗ с банком данных ОепВапк (рпи помощи пакета программ МГЛБ18, версия 3.07) не выявило существенной гомологии с известными .генами, в том числе к с гоном рйв, кохирущия фэт'оин-десатуразу (chamovit2 ег а1., 1291;,,Рескег st а1., 1992). Однако оказалось, что часть рамки ОЯР663 была -ранее секвеннроваьа в ооставе фрагмента хро;юссу,ной ДНК БупесПосувив 6803, содераащего ген рзаЛ, я опре;элопа как неиндентифацированная раака считывания (ПеШу а!., 1988).. Выявленная' нами 0Ю95 является частью этого гена рвав, кодирующего субъединицу и -фотосистемы I.

На рис.4 представлены рестрикционйые карта ХЬа1 фрагмента ДКК, ввдэло1шого при клонировании гена устойчивости к дифунону, и . ВалШ фрагмента, выделенного при клонировании гена рвал (НеШу et а!., 1938). В хъа1 фрагмент" не обнар:, ано сайта рестрикции ВагН1, по которому осуществлялось клон..сование фрагмента с геногл реал. Кроме того, сравнение евкввттроваттх участков ДНК, .имеющих область перекрытия около 2 т.п.н., выявило ряд несоответствий в

1-1.

"Ч

1 AGAACOfl'JCAOTAGGTTGGTGTAATGGAGATAGAATCATAGGAGTT'JTGGCAiOGAGATT

61 ATGGGGACCTCTGTGTCÛAÂTCûAACGGCGATTTTGCAGAOTATGCAGGGTm'CTGGflï

1 líQTSVSNPTAILQTHQGPLP

121 AAATGGTC ITOTGAC-TTOAACCÏACAJ'lAOCCGGTTGATGGCCGCGGCCACCÏTGGÎ'GGTG

21 KWWSEPNLQTRLJí AA ATLYV

181 TOCCTGïTAATGAGTGGGCTAACÏTÏTTGGGOAGTAAATACGATOCA-'iGAGGATGCCOAA

41 SLLBÎSGLTPWAVNTIQEDAQ

. 41 MGGTGGATACCCGrMTGGOCGGGATGT'GGGTTTGirGTTGGOGGCCAATGTTGCGO(?r '

61 L Y DT H F G R D V G L L L A A H V A,-.P

301 ATGATTGCGGATAAAAATC'iOAOGGAGGTGGCCCGGTTTTCOAGTCGOMTTAOGAAlAT

81 L'IADICNLTEVAREF S RFYEN

361 /^rTCTAATATCCGCTACATGATOTATGOGGACCUGTCTGGCAAGA'rOTïTïTTGGïATT

101 ï S N ï R Y Ы I Y A В P S G К I ? F G I 421 • CCCTAGTCTGAJ.GAAACGGÍTOAAAÁüTOCC'íCÁCSCl'AGAGOGGCGOA'rCGAA'ÍTAúCC

121 P Y S EET V - Q . N S LT L ER; RI EL P

481 CAGATTOATCCCOATMTTTTGACOAGOCm'rCTACGGCAAOACCACACTGOCAATGGC

14" QIDPHNPjjQPPV'RQHHTPKG

541 GATGTOACCGATGTG'mAaSCCCCTOCAAIÜACOAGGGCAAGTTCCTCaGAGTTCTGGCa

161 BVTDVPIPLQYQGKPILGYLA

601 ATTGGTATOAACGOOAACOGCGC3K3CGOTCAAC3,OT'GTAACCTAACCAGGGATGa!GAOÇ 181 IG' • .. к A V N S S К L ï R D V T

6e>1 AOÏÏGCAGTTmAa'IîcpATXMGGTGATGGTMIMCTCGaAGCTGTATTGAAïGCCCTA 201 I A V P I S I W.V К V Г L G A Y. F. H A L

721 ACTAraACCOAGCCOAÏTAAAGAÀCTGWCQ^iG^

221 T I T Q P I il S L L. L G V • К ■ К i' A A ' G N

781 ТТСААССАСАСМТСАССТТССССтаТСОаООАСААТТааоааААФТАА'гООТТААОТТО .241 FKQRITLPFGGELG ELIYKP

841 AACGAGATGGCGGAGCGGCTGGAGCGTTATGAAGCCCAAAATATTGAAGAGTTGACÏGCG 261 N E И A E R I. E ri Y S À Q' N I; E .E -L T A

901 GAGAAGGOGAAGCTAGAOACCCïl'GiraCOAOGA'rCGOCGASGGGGGOATSTTAGTGGAC 281 E К A К L D T L Y S 1! I к Б G A il L Y D

961 ACCAAl-HiiOAACi'IIïGïTGCï^^^

301 S II Ь Q I Ъ L V W P ï A R -R L P A _ V E N

'1021 AACCCAAÏ17..TTGGCGAAAATCÎ'C(ffiGGAA^ATÏÏG^^^ 321 К Г 1 I G S !I I 1 S !i L F P - E I T A Q L

1031 AOCCAÀCOCOïGÀCGGAAâ'ïCGCCuC^i^CCAAGGAAGÎ^^^ 341 T Q P L К E L Л Л . D Q G S I, L P S -p 0 '. !I Г 41 GaGCClUlGGiAGAGGA0,CAGCA47XU^^^

361 G "> Q E 13 Q 9 К 9 • Y A ? E E "P ti I S . L

1Й

''901 ^C004AOOGTTí?nnOC004CO*TíroOTCíPGAT(!irTOACf'OA(!GTGTTr-OATOAGA.ACAnG

'"S! V O У Г R Ф i ч j. ri L "j П. У L D Q И К .. ï e(i i _ U^ÂÀïrXÀCiXïGGÇAau'Ga'CAÏÛACUaiGCÂGGA' AlíAOÍAüGGAAG'IGGAATIAAÁT

•о: я } г j , г; u i i¿ i 7 с! ^ i i

У \ Y. 3 Cl V Г " '••-* Y Г " Tí ' П T Г Tj Г N 441 i К S Г i ri ï L ä is î (¡ a J ' h S £ / "й. h

i', i v V j г ¡: ¡) г ь r l v в г,

¿П4 -îr T л T О 17 T W Q li U V il I { If / w !< t.

i 5&1 TA'jCAGC£AúTTGááOSj±AGC¿\U({CGj!AG$'~ \00AACI'IVíAT(-C"í'AAüí;Aií.^AAuaA'JTA

irOi Y C¡ L I IÎ О 3 L Я S ¡f O L N А 1С D KOL

1621 L'AGS^AGAAAAAATTÏTGGAOCCGCA'fOTCOOtîTTCGCrCïGOGTAAC'PAOGAûCÏÎACTO

521 Q L 2.X I L P. ? L' L ? I- ¿ Ь . G К X C L L 1681

04-i L a V M T Я L X G ii S Г ■ К F KA G G К •

1741 AïCJVfl^TOOGiGCCTA^CCOC20CAOOGÏ/.OTAiO?î,ri,AGAnCAGACGATGGTCCTGG'j

""M T T Y Я Л Y P _r. ¡i ii ? h L .4 A Г1 Ij ? a

С ^CvWtfWC^.'ïT^TO'.S/.fT^

- ■ ï v 'i" i ' ¿ •> D " 'i i 'j ; ].! *• ,1 и a л

r.C, I Г -"J !í ?- i П V u ü '?■ J '.i T J< c" G T G L

: ^«¡т^го'даегл.'е '.АЛЛАГДТСЛ-! ""Of ci .-.лс АУслмоосдА^этдтедоа'ОАс^

I S I У К -К I : А 'Л П Q о - я Т И г, V ,Я

i > -AGCÏCGGGGÎGGG-aV,uPACÏta4T0G'râ,Xi:A!l,0'i,(«;i>Г><"i-f'UT/,ТСЛ/.i'CüAT«¿ТГО АТ(; fi.U Т. V G v G T T V. ft f o J. л У 5сг Q S Ï ¿ У

£041 GTGGTCGGCTAGGTTTCGCÎÎTCAOAA'OOCT^ r,b\ 7 Y о'

Й1 ,1 OATOAG AGAATTiAA'i'nTA.AAAÏ'T'A'LaGAO'l Gï Л CAA AAÎGAACAGGtTïAAACA AÏGOС

Рис.3. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности Тонкой линией псдч'ерь -;т вероятий сайт связнванил с рибосомой.

.'г т.и.н.

Вт 11 Р НН В Н Вт

11.1 II .г-д^г:

' 9 Т.П.И. * Т

рва!) ОКР365

Лк;.4 Рестрикционные карты хьа1 фрагмента ДНК, выделенного яри клонировании гена устойчивости к дафунону, и ВашН1 фраг1..энта, выделенного при клонировании гена рва1>. Тонкой линией подчеркнута протяженность секвенированных участков ДНК.

А-АвиЦ, B-Bgl.II. Вт-ВяшНХ, H-HindI.II, Х-ХЬа1.

нуклеотадашх последовательностях, затрагивающих неоколько кодонов онр663. Вследствие этого ВашНХ фрагмент содержит открытую рамку считывния размером в 365 кодонов (ОНР365), тогда как в обнаруженной нами окр содержите» 663 кодона.

Тем не менее, можно считать, что представленные на рис.4 фрагмены ДНК несут одинаковые локусы хромосомной ДНК ВупесЬооувив 6803. Это утверждение основано на сдедуйцих фактах:

1) ОНР663 и ген реаБ представлены в геноме БупёсЬосувив ■6803 в одной копии согласнс; результатам, прязздйшшм в данной работе (раздел 3)и в работе (Re.iiiy .et а1..,19В&>).";

2) участок ДНК,, севещфованный в дрэдой; работе,, содержит кроме ОйРббЗ часть гена рваю, о$означвнт'ого йа рис.4'квх ОНР95;

3) участок ДНК, секв«шровадш* Рейди с соавт. («Ч1Х1у в*

al., 198S)e содержит кроме гена psaD и часть CRF663. обозначенную НЕ рис.4 КОК OR?365.

Различия -mëanv- ORP663 и -ORF365 moi /т - быть— обусловлены спонтанной мутацией в штаг "é Syneehocye in 68О3, с которым работали Рейлн с соавт., ;зли î;o связана о допущенной имг неточностью при определении нуклеотидной последовательности.

В евла;- с vew. что ога»ббз не елгзт гокслогог с азвестнми генами. но нутзптнка гоют ORP653 н7)ансфор»яр">пт клетки штамма дикого 'iîir:a по признаку устойчивости к дофуь'сну. мы обозначили. 0RF663 кап ген dfr (резистентность к ди^унону).

Е* ^ЭЯРЙуГДрРИв ЧНядатЭ тоне dfr.

5 Л. Зогоетявепзвич путмпмк копий х^на ùîr.

Для ШЯЕЛЭ|Д1Я молекулярной природу мутаций у штаммов DP1 к СРН6 были секззрированы EeoHI-p3tI фрагмент (250 п.н. > из плазмядч . к Egiii-EcoRi фрагмент (1.1 т.п.н. ) из ллазмиды pCPNô. Иуялвотадвая ш следовэтельноса'ь 'фр5г:.ш та ЛШ$ аз мутант« dpi содержит делецию из_ трех нуклоит-кдоп,' ведущую к выпадению одной аминокислоты (Gin 521 ). В нуклеотидксЯ последовательности у пут am1 a ся?к5 обнаружена дупликация из 66 йуклеотидов, которая прак-дят к увеличение окРббз но 22 колена (р;-«.5.). Поскольку ssy?tws: гада ¿fr, обуславливающее пелоьрсстяуя усто5Мавйсть клзток 'öyriechocyctis 6S03 к дп:фунон\' г; тлор^жзокчу, имеет риздогиус крироду локализованы в разлташх jwacTXar__ гена, то ¡¡ото предполагать/ что устойчивость елтяя; с угра^ой фужауональЕО.» активности продукта гена dfr. Для проверки этого щю&.олоязяип öuj: г.ряьеден Ексерциокглй мутагенез if г.

3.2. ЕпгсргехйУкЭ Kj гсгевез <üV.

Для' тагсерцконного мутагенеза, im основе, вектора " puci9, сгтояструаровчли илазадиди рКВ1 а рКК2, содержащие, субфрагмекты xpo.-.iocaäHofi ДНК плазмиды pBPWT; прерванные кассетой о геном устойчивости к капамицику кз плэзмкдн ?UC4K по сайтам рестрикшж Bglîl ж- SnaBI соответственно (рис.6). Штзмвдами рКЙ1 и рКИ2 трансформировали клетки штамма дикого типа Synechocystis 6803 на ycTo&niBocTb й'квна'вшипу. Отобранные киг-трансформанты несколько раз сэреевгаля нз среде с кааа?дщиком в целях сегрегации гена dfr. Последующая проверка показала, что ecs йг-трансформанты устойчивы как"' к дкфунону так к хлорпромазину.

Блот-гкбридизйция препаратов хромосомой ДИК шсэрцшнних мутантов с использованием в качестве зондов Зрагмёнтоз ДНК из плазмидн pDFWü, содержащих ген dfr, показала,- что все копии

Kmr1

к»гг

ITC

т

htz

т

I

--GOT QTT-- Ala-Val-237- 258

Sn E HIP

111

dir

WT CAA OTA ОАО СТА QAA AAA Gin Leu Gin Leu GIu fya 519 524

UPN6 -OCT- OTT OCT-.....QOT-

—Alu- -Val Ala.....Val-

DF1 CAA OTA. СТА. QAA AAA ATT Gin Leu Leu Glu Lye lie

Дупликация

Дэдеция

Рис.б. Локализация и молекулярная природа мутаций в гене dir, обуславливающих резистентность к дафунону и хлорпромазину у мутантных штаммов DP1 и CPN6. Кгаг1 и Kmr2 - локализация инсерций, полученных при использовании плазмид рКН1 в рКИ2.

B-BglXI, E-EcoRI,•H-HindIIII P-Pstl, Bn-SnaBI, T-Taql.

Km1"

î

dfr

Kmr

Î rtfr

1 Г.П.К

Ssc.C. ::оЕотру1фййгк?.й ал^зшд д.<тя ¿вдзрдеюиното мутагенеза гена dfr. p!2tl и риг - щ;оязвсджп »11019-,, соДэраащие Hindi

v it a.;i,í¡.; -i 'jsi:- 'ru.;7 •jyt'i.çj-uvRH'x (i,i; у «

ü i\ ^Jííp^nv.'xí. ri,' ■' ' fC"'í- С ice msKVTM ро'Ж

;iO GDfiTCM BglH И ЕдгВ!

A-Ar,«II, D-BgiTI» па-nindl, Sn-QnnBTi,

хромосомы !ioj,y43inwx мутантов содержат ген dir с инсерцией. Из о того следует, что функционирование гена dir не является жизненно необходимым для SynechocyBtis 6803 и устойчивость к ингибиторам является, по-видимому, следствием блокирования функции продукта г ча dir.

На рис.Ь показана локализация Кшг-инсерций, полученных с помощью плазмид рКМ1 и рКМ2, и мутаций, выявленных у ыутантшх штаммов DF1 и CPN6. Все они приводят к одинаковому фенотипу -проявления перекрестной устойчивости к дафунону и хлорпромазину и, следовательно, находятся " в пределах одного гена dir. Дупликация и инсерция Кшг1 локализованы в предблах как. рамки 0RF663, так и рамки 0RF365 (Bglix-Hindlil участок ДНК), выявлелой Рейли с соавт. (Reilly et al., 1988), тогда как деления v инсерция Кшг2 локализованы только в пределах. 0RF563. Это говорит о том, что именно 0PJ663 соответствует целому гену dir, a 0RF365 является частью, этого гона.

6. Гибридизация гена dtr с ДНК высиах рестегшй.

Одной из задач изучения резистентности клеток цианобактерий к гербицидам является использованиз выделенных из них генов в качество 3t вдов для поиска гомологичных генов у высший растений. Компьютерный анализ нуклеотодной последовательности гена dfr не о'чарукил гомологии с известными генами растений. Поэтому была проведена блот-гибридизадая 'с препаратом тотальной ДНК гороха Pisum oativum (препарат любезно предоставлен Е.Лысенко). Перед фракционированием в. агарозном геле ДНК ' горохе обра б тцва'ли рестриктазами Вавй1 и Hir.dlll. В качестве гибридаз8идонного зонда использо'зали Bglil-Pstl фрагмент размером 1,3 т.п,н. из плазмида pDPWT. Зонд дает положительные сигналы с тотальной ДНК гороха, ;то указывает на наличие в геноме гороха гомологичных последовательностей.

Поскольку ген dir не имеет гомологии с геномом хлоропластов, полная последовательность которого уже известна и тлеется в банке чанных GenBank, то можно предполагать, что последовательности, дакхдие положительный сигнал гибридизации, локализованы в ядерной ' ДНК растений.

7. Обсупдвиае.

В данной работе установлена природа генетических повреждений у цианобактерии Synechocyatia 6803, ..риводящих к возникновению перекрестной резистентности к' гербициду обесцве'-лва него типа дафунону и антагонистам ^альци^-зависимых белков - хлорпромазину

п трифторпврг.зчну. Однако,.поскольку по выявлена гомология геня à£i' с ]'звост№ми .генами и не известна физиологическая функция, -продукта., гена oír, то остается_открытым^вопрос., о механизм.'.-усгойчавостя, которая когтшврувтся i :шюп геном, слабое влшшб дцфупоно че. пигмеятрй состав в клетках Di1"-мутантов еще •;е озздчвэт, что резистентность связана непосредственно с üz.vusiiizmi i бцоеттвгв пигментов.

кз того факта, что инактивация гена dir приводит h '«i',T':;níTBC!í:'rj, кояю предяолодать, fio она ойусдоаяойа отсутствии продукта дйьнуго гена, коч-орий, по-видийаыу, не является непосредственной мишенью действия «¡и »ón^yjUíMj. rera Cfr 3 mw»™скс»?

трайсформэщ-ти гдрбицчдо в активную форму,

îioiuïo Taira предположить, что ген d?r выполняет регуляторов роль и его инактквацяя' кокет право ста, напркмзр, к супврнродукции фэткеято-кггзте; явгякзтогосл кальцкй-завтлсй,&я белком.

Не EWítóHO,' что поЕЫионнал устойчивость к дифунону и антегонйетш кальций-заниааж белков обусловлена сяияеняем проаздзэысей; маиОрайГ и не ..споциф-т-пта для 'юйого-то определенного

Ív-irf/ií 05jWiC«s СЯрьДСЛЧПЛг <*%'ПК1(ЙГ* ГОТО àtr и r.í.irairíSKC yr,ToñiiFr¡ocT;i к ;n;lY":ici7y и

Зьзопм

1. Порчены споктащшэ мутанты .циаиобактерин Synechocyetis

cv^-tic"^ пзреггрзстсок уто^лпч-ос-ттл к ^гр^щмду -' "

... ;r!TííCK?ORD':í ХЛОрПретП-'ЛШУ 7 -í-pHí;tO¡Wp?¡áwTr/

снтагожстам яальций-зявямаш белков.

2. Клонирована .хромосомной ДНК мутаптннх- аташов,

' клеша ВТбММв .ДИКОГО ТИПв Пв yCT0Ü4H20CH, И

'ГлГупспу г i л-чгегроагаю' гс&доопявзя кодая ком етнта хр^тасоттой

/л- lii, ДЛ1СО.ГО

О койОШНО ДедвЦ'йОЧНОГ" ..'ЭТурОЕСНН R

генома xv.'Sína»: т-га:.«юв, опрвдалягйще устс^еостъ г< гербгашду » -ингибиторам.

4. В составе клонированных фрагментов шдеити$вдрован неизвестный ранее rei. dir (окРббз), определяйся: резистентность к дафунону.

б. Установлена молекулярная природа повревдений у мутантных вгаммов: мутация DF1 обусловлена делецией 3-х нуклеотидов, мутация СРЫ6 является следствием душикацкп участка из 66 нуклеотидов.

6. Инактивация гена dir с помощью кнсерционного- мутагенеза ьедет к возникновению устойчивости к гербициду 2 антагонистам кальций-зависякнх белков, что указывает на связь развития резистентности с утратой фукцни гена dir.

С исок публикаций

1. Шестаков C.B., Часнавичене Э.А., Барцевич В.В., Еланская И.В. Клонирование и молекулярный анализ генов, контролирующих резистентность к гербицидам у цианобактории Synechocystis 6803.-Те£ :сы Международного совещания по. молекулярной биологии и биотехнологии-растений, Москва, ИОГен, 1992, стр.24.

2. Шестакоз C.B., Барцевич В,В., Молекулярно-генетический анализ устойчивости к гербициду дифунону у цнанобактерии S,rriechooystiB 6S03Биол. науки, 1953, & 2

3. Барцевич В.В. , Шестаков C.B. -Клонирование и секвэнирование гена, контролирующего " устойчивость к. гербициду дифунону и клеточному ингибитору .ыорпромйзину у ЦИЕНОбГгСтдрЗИ Bynechooyetic 6803.- Молак. генетика мнкробиол. вирус.. 1S93, в. печати. •

Подписано в печать I.3.1993 г. Зак4 727 Формат 60е84/16. Тир. 100.

Москва. Типография РАСХН