Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и физическое картирование субтеломерных областей хромосом человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и физическое картирование субтеломерных областей хромосом человека"

и Б оа

^ д ЬПР №35 На правах рукописи

НЕГОРЕВ ДМИТРИЙ ГЕННАДЬЕВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ И ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ СУБТЕЛОМЕРНЫХ ОБЛАСТЕЙ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - молекулярная биология

.....АВТОРЕФЕРАТ 1

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН (Москва) н в Институте Внстора (Филадельфия).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук Данилевская О. И.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, проф. Толсторуков И. И. кандидат биологических наук Эльдаров М. Л.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Кардиологический научный центр РАМН.

/р а-учи;

Здщита состоится . 1995 года в _ часов па заседании

Диссертационного совета Д 098. 12. 01. при Государственном научио-исслсдопательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

(Москва, 113545, 1-ый Дорожный проезд, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан ЧГ-сС^ЩЧ 1995 г.

/7-0*

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Щербакова И. И.

t t

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Разработка технологии рекомбинантной ДНК явилась основой крупных успехов молекулярной биологии при изучении структуры и функции генов, а также решения практических задач биотехнологии. Применение этой технологии ic анализу генома высших организмов и, в частности, для физического картирования; до недавнего времени осложнялось тем, что предел чувствительности щ*гогенетических методов состаалял несколько миллионов нукпеотидов, а методы молекулярного клонирования позволяли оперировать с фрагментами до 50 т.п.н. Эту брешь удалось закрыть при разработке новых методов манипулирования крупными фрагментами ДНК; эпейрофореза в пульсирующем попе (пульс-форез), клонирования ДНК в искусственных хромосомах дрожжей (YAC); реакции специфического расщепления ДНК, опосредованная RecA белком (PCP).

Применение YAC'ob как векторов позволяет клонировать последовательности ДНК генома эухариот величиной до 1000 т.п.н. Фрагменты такого размера необходимы для исследования структуры и функции районов локализации жизнзнно важных геноэ. С помощью YAC'ob удается изолировать также трудно клонируемые в бактериях фрагменты генома, обогащенные • повторами. Кроме того, гак показал опыт работы по созданию физических карт хромосом человека в рамкзх программы "Геном человека", наличие YAC'ob значительно ускоряет и облегчает процесс построения таких карт, особенно на первом этапе сбора контигов. Поэтому метод YAC весьма перспективен для изоляции больших, непрерывных сегментов зукариотичесхого. генома. Последнее обстоятельство особенно важно при исследовании организации районов локализации повторяющихся элементов, в частности, в теломерах. При работе с. крупными геномами высших эукариот уже недостаточно тех возможностей, которые предоставляются наберем обычных эндснукпеаз. требуется большая специфичность. Этого можно достичь с помощью комбинирования PCP и пульс-фореза.

Концы зугариэтических хромосом - теломеры - выполняют особые функции, необходимые поддержания структурной целостности хромосом и полной репликации их генетического материала. Теломеры представлены повторяющимися последовательностями различного типа. К простым концевым

I 1

повторам хромосом человека (TTAGGG)n примыкают протяженные субтеломерные повторы [Blackburn & Szoostak. 1984]. которые могут быть отнесены к классу среднепоагоряющихся последовательностей. Функция большинства из них неизвестна. Такие ассоциированные с теломерами последовательности выявлены у многих эукариотических организмов: у дрожжей, ржи, хирономуса, аскариды, мыши и человека [Chan & Туе, 1983; Bsdbruk et al., 1980;Saiga &£dsíram, 1985; Cooketal.. 1985].

Структура субтеломерных областей хромосом человека" слабо изучена, в основном, из-за отсутствия в современных геномных библиотеках физических концов хромосом.

Цель и задачи нзстсяцдей работы. В лаборатории проф. Ритмана (США) была сконструирована геномная библиотека хромосом чзлозека в составе полу-YAC'ob, обогащенная последовательностями ДНК человека с (TTAGGG)n повторами [Riethman et al., 1983], характерными для теломер человека. Пслу-УАС'и представляет искусственную хромосому дрожжей, у которой отсутствует теломерная последовательность на одном из концов. В. процессе анализа отдельных клонов данной- библиотеки оказалось, что часть из них содержит фрагменты из внутренних областей хромосом с (TTAGGG)n повторами. В связи с зтдал цепью- диссертационной работы было подтвердить происхождение клонированной ДНК из теломерной области. Для этого следовало решить следующие задачи;

- подтвердить происхождение ДНК данных попу-УАС'ов из области хромосомы, соответствующей ее физическому концу,

- устанозить идентичность структуры фрагмектов, клонированных в пслу-YAC'ax, crpsfioype субтепомерной области хромосом человека,

- построить физические карты клонированных фрагментов,

• - изучить строение дакных фрагментов на уровне нукпеатидной последовательности,

- осуществить поиск полиморфизма теломер человека.

Нзг'чная новизна и практическая ценность работы.

В результате проделанной работы были получены дрожжевые трансформанты, содержащие полу-УАС'и с клонированными е них фрагментами

ДНК генома человека из сегмента 1q44. Показано, что они содержат ДНК, являющуюся физическим концом длинного плеча хромосомы 1.

Построена физическая карта фрагмента ДНК прителомерной области длинного плеча хромосомы 1 человека протяженностью 260 т.п.н. по сайтам редкощепящих рестрикгаз. ^

. В составе плазмидноги вектора клонирован фрагмент ДНК, включающий CpG-островок. расположенный на растоянии 50 т.п.н. от физического конца большого плеча хромосомы 1. Определена нуклеотидная последовательность 6 участков, расположенных на различном удалении от физичесазго конца длинного плеча хромосомы 1, общей протяженностью 14 т.п.н.

Достоверная физическая карта субтеломерного района протяженностью 60 . т.п.н., построенная по сайтам среднещепящих рестриктгз. а также вновь полученные уникальные и низксягопийные зонды могут быть использованы для выявлении тонких структурных изменений субтеломерной области длиного плеча хромосомы 1 человека при исследовании различных генетических аномалий, связанных с субтеломерной областью хромосом человека, которые не могут быть обнаружены цитогенетическими методами.

Методом флуоресцентной in situ гибридизации показано предпочтительное распределение низкокопийных проб рНС1403 (размером 1,2 т.п.н.) и рНС1405 (размером 3,0 т.п.н.) в субтеломерных областях хромосом, причем для каждой пробы характерен свой набор т^юмер, где она может быть лсяализована. '

Дополнительно получены дрожжевые трансформанты, содержащие полу-YAC'h с фрагментами ДНК, принадлежащими хромосомам 2, 8.8, 12, 13, 14 и 18. Исследован полиморфизм теломер 1q, 2q, 6q, 8р, 8q, 12q, 13q, 14q, 18p и 18q гехэма человека методом специфического расщепления ДНХ, опосредованного RecA белком. Показано, что в выборке из 11 неродственны* индивидуумов, на уровне разрешения данного метода, у 1q, 8q, 12q, 13q, 18p и 18q полиморфизма нет, ay 2q, 6q, £p и 14q плеч хромосом он наблюдается и составляет от 100 т.п.н. до 300 т.п.н.

Апробация работ ы. Результаты работы были представлены на конференциях в Сой Spring Harbor Laboratory по геному челсзека в 1S93 и 1994 N годах и семинарах лаборатории молекулярной генетики дрожжей ИМГ РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и находиться в печати 4 Статьи и 3 тезисных сообщения.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на ... страницах машинописного текста, включая ... рисунков, ... таблиц, и список литерагурц, содержащий ... ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Клонирование и физическое картирование субтелоыерной области хро моемы 1 человека.

В настоящее время структура субтеломерных областей хромосом человека слабо изучена. Отсутствие в современных геномных библиотеках физических концов хромосом является следствием технологии клонирования фрагментов геномной ДНК в любом векторе. В лаборатории прсф, Ритмана (США) былч сконструирована геномная библиотека хромосом человека в состазе полу-УАС'ов, обогащенная последовательностями ДНК с (ГТАССС)п повторами, характерными для тёломер человека [йе^глап et а!.. 1939]. Полу-УАС'и представляет собой искусственную хромосому дрожжей, у которой отсутствует теломерная последовательность на одном из концов. Такие молекулы автономно поддерживаются в дрожжах, если в составе клонированного фрагмента содержится последовательность, способная функционировать как толомера в дрожжевых клетках. На этом принципе основана стратегия клонирования терминальных фрагментов генома человека в, составе погту-УАС'оз. Вторым основанием для отбора интересующих клоноз являлась положительная гибридизация с (7ТАССС)п повторами. Однако, а процесса анализа отдельных клонов данной библиотеки оказалось, что по данной схеме могут быть отобраны фрагменты из внутренних областей хромосом, содержащие (ТТАвЗв)п повторы. В связи с этим возникла задача подтвердить происхождение клонированной ДНК из теломерной области.

А

■ т ■■■■

^ГгЛ -Л- / , Ш- '

ГлЧ.г:^ ША^ Ьг

2123

С

2192

Рис. 1. Определенна локализации клонированных фрагментов.

Местоположение фрагментов, клонированных в полу-YAC'ax, на метафазкых хромосомах человека посредством флюоресцентной гибридизации in situ биотинилированных продуктов Alu-ПЦР (А) - yRM2123 и (С) - yRM2192. На сг.айде А - хромосомы здорового индивидуума. На слайде С - хромосомы клеточной линии меланомы: три нормальные копии хромосомы 1 отмечены маленькими стрелками, а 1р" производная - большой стрелкой.

1.1. Отбор лалу-YAC'oe с последовательностью, которая соответствует 1q44 покусу, ' Предварительные эксперименты по флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с метафазными хромосомами человека ДНК фаэмиды sCos14, пояученой з' лаборатории проф. Олсона (США), показали, что эта ДНК происходит из 1q44 области хромосомы человека. В опытах по молекулярной гибридизации эта ДНК дапа сильный положительный сигнал с ДНК из клонов yRM2004 (размер полу-YAC'a 65 т.п.н.) wyRM2123 (размер 270 т.п.н.}. Третий независимо изолированный клон, yRM2192 (размер 125 т.п.н.), содержал последовательность, гомологичную ДНК из yRM2123. что было выявлено методом полимеразнсй цепной реакции. Отсюда возник вопрос, являются ли эти три независимо изолированных полу-YAC'a аутентичными, и соответствует ли клонированная в них ДНК физическому концу хромосомы 1 человека.

ДНК из кпоноз yRM2123 и yRM2132 была локализована на человеческих хромосомах с помощью метода FISH биотинипированных продуктов Alu-ПЦР анализа, где в качестве матрицы использовали ДНК из соответствующих клонов (рис.1). На рис.1 А показаны результаты такого эксперимента для yRM2123 с метафазными хромосомами из клеток здорового человека. На рис. 1С для yRM2192 с метафазными хромосомами из- клеточной линии мелономы, содержащей три нормальные копии хромосомы 1 и одну копию с делетированным мапым плечом. Пробы из yRM2123 и yRM21S2 всегда давали самый сильный FISH сигнал с наиболее дистальным q концом хромосома 1. На концах других XDOMOGOM наблюоали только слабые сигналы. По-випемому они появлялись благодаря присутствию теломерных и субтеломерных повторов в ДНК зтих полу-YAC'ob.

Метод FISH не позволяет'в эксперименте с ДНК, содержащей пооторы, однозначно определить ее локелизацию на хромосоме. ПЦР анализ дает более определенный результат.

1.2. Хромосоиный анализ продуктов ПЦР.

Нукпеотидная последовательность фрагментов ДНК yRM2QQ4, yRM2123 и yRM2192, примыкающая к вектору (sV-l). была использована для ПЦР анализа на панели из 24 гибридных клеточных линии "грызун-человек* (N1GM.S #2).

б

ММоНаНи1 234 56789 101112 131415 16 17 18М Ьр и 19202122 X V

920-

В ■

ММоНлНи! 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11121314 15 161718 М Ьв М19202122ХУМ

Рис. 2. Хромосомная локализация продуктов ПЦР.

Опкюрограммы гслей после электрофоретического разделения продуктов ПЦР длл геномных псслэдовательностей 2123Л/-1 (А) и 1406а (В). Номера дорожех соответствуют той хромосоме человека, которая присутствует в данной гибоидной линии; М - «эркер размера фрагментов фХ174; Ни - геномная человеческая ДНК линии ССМ-1; На - геномная ДНК хомячка; Мо- геномная ДНК мыши Слева указан ожидаемый размер продукта ПЦР в п.н.

м

ПЦР анализ для 2123 (продует длиной 920 п.н.) четко показал, что. эта область уИМ2123 происходит из хромосомы 1 (рис. 2 А). В противоположность этому ПЦР анализ для зУ-1.2004 (продует длиной 251 п.н.) дал неоднозначный результат. Из-за амплификации последовательности из генома мыши, но не хомяка, однозначно интерпретировать можно только результаты ПЦР клеточных линий "хомяк-человек*. В итоге, можно утверждать, что данная область уЯМ2004 присутствует э человеческих хромосомах 1. 8, 9, 10. 11. 22, X и У (рис.2 В). Последовательность 2192 также присутствовала во многих хромосомах человека.

-Т.о. было похазано, что рекомбинантные клоны содержат ДНК из субтеломерной области хромосомы 1. На следующем этапе работы следовало показать наличие в составе клонированной ДНК терминального фрагмента теломеры. Это дало бы право утверждать, что исследуемые клоны содержат в своем составе телоыеры.

1.3. Чувствительность фрагментов геномной ДНК, соответсвующих дистальному концурекомбинантных пслу-УАСое, к экзонуклеаэе Ва131.

Проба рНС1208 была получена как 300 п.н. ЕсоИ - НтОШ фрагмент одного из рекомбинантных- полу-ИХД уКМ275, который гибридизовался, в основном, с фрагментами геноиа человека, чувствительными к обработке зхзонукпеазой Ва131 (данные неопублиязваны). ДНК из клеточной линии "мышь-чапоеек" (1-пео8) [Уашаба е! а!, 1990] с единственной хромосомой 1 из генома человека была обработана Ва131, затем гидролизована ВатН! и гибридизована на фильтре с пробой рНС1208. Результаты показывают, что данная мультиголийная проба действительно вхойэт в состав терминального фрагмента теломеры хромосомы 1 человека (рис. 3).

Эта проба также гийридиэовалгоь с терминальным фрагмеетом, чувствительным к воздействию асга.укпеазы Ва!31, как уР.М2123, так и уРМ2С04. Тем самым показано, что эти июнь.' содержат ДНК из теломерной области хромосомы 1. Однако, оставалась возможность, что в составе этих УАСоэ находятся фрагменты, гомояогачные пробе рНС1203, но ставшие терминаг.оньил'л в ' < процесса клонирования в дрожжах. Поэтому было необходимо обнаружить уникальные пробы вблизи от теломеры хромосомы 1. В связи с этим были

А

В

Рис. 3. Чувствительность геномной ДНК гибридной линии' "мышь-чел овец" 1 -пео8 к экзонуклеазв Ва/31..

(А) - результаты гибридизации с низкогопийной пробой рНС1208, (В) -результаты гибридизации со среднекопийной пробой рНС1407. Дорожка 1 содержит ДНК клеточной линии CGM-1,. гидролизованной эндонуклеазой BamHIl дсрсжхи 2, 3, 4. 5, 6, 7. 8 и 3 содержат ДНК гибридной плетенной линии "мышь-человек" .1-пео8. обработанную экзонуклеазой Bai31 в течение 0,30. 60, 90. 120, 180 и 240 минут соответственно, а затем педрелизованкую эндонуклеазой ßamffi. Дорожка 10 содержит геномную ДНК мыши. После алепрофоретического разделения образцы были перенесены на мембрану и гибридиэсезны. М - маркер молекулярного веса в т.п.н.

клонированы фрагменты из исследуемых полу-УАСов на различном удалении от теломерного конца, а также построены физические карты данных полу-УАСов.

1.4. Характеристика проб ДНК из полу-УАС'ов, специфичных для 7 с?. Одна уникальная проба была получена из области ДНК полу-УАС уРШ2123, расположенной по соседству с вектором. Исходя из размера УАС'а, проба должна находиться на растоянии 260 т.п.н. от физического конца хромосомы 1. Этот зонд, обозначенный как 2123АМ, гибридизовался с фрагментами одинакового размера, полученными после гидролиза ДНК как из нормальной клеточной линии человека, так и из гибридной линии "мышь-человек, содержащей хромосому 1 в качестве единственной хромосомы человека (рис. 4 А). Единственной однокопийной пробой в составе ДНК из уШД2004, оказался Б^НИ фрагмент в 300 п.н., расположенный в. вС-богатой области ДНК этого клона. Эта проба (рНС1406а) так же пререкрестно гибридиэовалась с некоторыми, фрагментами мышиной ДНК (рис. 4 Б).

В дополнение к уникальным зондам были изолированы пробы из ДНК уЯМ2004, наиболее близко расположенные к теломере хромосомы 1. Пробы РНС1404, рНС1405, рНС1407, рНС1408 гибридизовапись с относительно большим количеством фрагментов геномной ДНК.- Нукпеотидная последовательность пробы рНС1404 содержит область гомологичную длинному концевому повтору (ЬТЯ) эндогенного ретровируса человека. Нукпеотидная последовательность пробы рНС1407 имеет область с 84% гомологии кодирующей последовательности рибосомального гена крысы 1123а. Эта область содержит открытую рамку трансляции, сдвинутую благодаря делеции 4 нуклеотидов, а также поли(А) последовательность. Все это характерно для псевдогена. Кроме того, эта проба содержит участок в • 140 п.н. с 66% индентичностью нукпеотидной последовательности, которая была раньше определена как субтеломерный повтор. .

Проба рНС 1403 представлена в геноме 20-30 копиями (рис. 5 А). Другая низкпкопийная проба, рНС1208, узнает специфический фрагмент в составе хромосомы 1 человека в плбридкых клетках (рис. 5 В). Эти последовательности присутствуют толыю в одной копии в ДНК уНМ2004 и уЯМ2123, но отсутствуют в ДНК уЯМ2192. Анализ нухлеотидной последовательности не выявил никаких значительных гомологии в составе проб рНС1403 и рНС1405.

Ю

Рис. 4. Характеризация уникальных проб для хромосомы 1 человека. Результаты гибридизации проб (А) - 2123Л/-1, (В) - 1406а. Дорожки 1, 2 и 3 содержат ДНК клеточной линии человека СЗМ-1; дорожки 4, 5 и 6 содержат ДНК гибридной клеточкой линии "мышь-человек" 1-пео8 с уникальной хромосомой 1 человека; дорожги 7. 8 и 9 содержат геномную ДНК мыши. ДНК на дорожках 1, 4 и 7 была гидролизована эндонукпеазой ВатН1; ДНК на дорожках 2, 5 и 8 -зндонукпеазой ЕсоК!; ДНК на дорожках 3, 6 и 9 - эндонукпеазой Н/лсШ1. После электрофоретического разделения образци были перенесены на мембрану и гибридизованы. М - маркер молекулярного веса в т.п.н.

1208

Рис. 5. Харзкгернзациа ктхоколийных проб. (А) Дорожки 1,2*3 содержат ДНК клеточной линий человека ССМ-1; дорожки 4,5 иб^содержатДКХвтонауИЛ2004. ДНК кадорсмжах 1 и4 бьига гцдрогетаэвана эндснуклеазой Есок}\ ДНК на дзрзжкЕХ 2 и.5 -зндокухлзазой Шх!1П; ДНК на дорожках 3 м С - знвонухпеазэй ВашН!. После электрофоретическога разделения образцы были ларекесены «а мембрану и гибридизоааиы с пробой рНС1403. (8) Геномная ДНК чапсзака {дорокха 1). ДИК гибридной линии "домяк-чепоае^ с хромосомами 1 и X человека {дорзжга 2). ДНКгибридной линии "хоияк-чгшаек" с хромосомами Xчеловека (дорсзаа 3), ДНК клана уЯМ2004 (дорсжка 4). ДНК ююяа уКМ2123 {дорсоаа 5) былишдролизовзны звдэнухп-эазой Н1п с31, роэдзп&ы элестрафсретичваси, перенесены на >.«ем5раку и гебридиэозаны с пробой рНС1208. М - маркер мапекугаодго веса в тл.н.

1403

Методом FISH было исследовано распределение проб рНС1403 и рНС1405 по метафазным хромосомам человека. Проба рНС1405 (4,0 т.п.н.) гибридизуется с теломераыи следующих хромосом человека: с длинным плечом - 1 (самый сильный сигнал). 3.4, 5. 9.10.13,15. 16,17,19, 22; а с коротким плечом - 2, 4, 5, S, 7, 8, 11. 13. 14, 15, 16, 19. 21, 22, Y. Проба рНС1403 (1,2 Т.п.н.) давала только слабые сигналы, по-видимому, из-за своего малого размера. Их удалось идентифицировать только при использовании для, гибридизации смеси обеих проб. В этом случае появились дополнительные сигналы у хромосом: - 2, 6, 7, -8, 11, 12, 14, 18, 20, 21 и Y (длинное плечо); и очень слабый - у короткого плеча хромосомы 1. -

1.5. Физические карты yRM2004, yRM2123 и sCos14.

Последовательности из векторов, низкокопийные пробы, присутствующие только в одной копии в составе ДНК рекомбинантных полу-УАСов, а также уникальные пробы были использованы для построения рестрикционных карт yRM2004 и yRM2123 методом концевого меченкя частично парализованной ДНК редгацепящими рестрихтазами SssHll, С/аI, Nofl, Sacll и Sfi] (рис. 6 А). Каргты высокого разрешения были построены для sCos14 и yRM2004 по сайтам ' рестрикгаз ЙашН! и ScoRI (рис. 6 В). Казщая прхэба, происходящая Vis sCos14, гибридизовалась с индентичным фрагментом yRM2004 и yRM2123. Эти эксперимента показали, что последовательность yRM2004 соответствует дистальным 55т.п.н. последовательности yRM2123.

На основе этих гарт, были идентифицированы один реальный и несколько потенциальных CpG островков. Островок, который расположен на растоянии около 50 т.п.н. от конца рекомбинантного пслу-YAC'a, гибридизующегося с (TTAGGG)n пробой,- содержит большое количество сайтов редкощепящих рестриэтаз, а также уникальную пробу, гибридизующуюся с последовательностями генома мыши. При анализа этой области с помощью PCR наблюдалась амплификация ДНК кзх из генома человека, тех и из гешна мыши (данные к о показаны). Это указывало на консервативность данной ДНК в обеих организмах. Поэтому мы были заинтересованы определить нуклеотидную последовательность этой области. /■ •

ь

50 кь

I-1

I I

J-II I I |

I_Щ пи IIIIII 11111 н

I-1—]-1м I

_} 5»СП

—| N0(1

-1-1-и_, си,

-I—НИ I III I I н м,,

ф------

УЙП2123

^Д- - ^ уЙП2004 200-4/V-!

|С Й N

тт

8 С К

Е .

ьт _1

ТЛИ1 V

«В НН Й н

&15т5Г ЕВ1Е

>14 ЙМ N I | Е

Г--И 1 ^

ТГ1

* 427 ' '708 1408

Е Е-

йIП Ш

: ^ «» •• нн

Рис. 6. Физическая карпа прителомерной облает 1<}44 хромосомы 1 человека.

(А) - компиляция карт >ЯМ2123 и уЯМ2004 по сайтам редкощепящих эндонукпеаэ; прерывистая линия показывает некартированную область уКМ2192. (В) - карты уКМ2004 и гСозМ, построенное по сайтам среднещепящих эндонуклеаз. Места расщепления теми эндонукпеазами, положение которых картировано для всех сайтов, показаны выше линии. Ниже линии показаны места расщепления теми эндонукпеазами, положение которых картировано только для некоторых сайтов. Представлена так же локализация проб, использованных для построения карт. В - ВатН1, Вэ - акНП. С - С/а1, Е - Еад1, Н - Н/лсЯ|1, Р? - ЕсоГО, ИУ - ЕсоНЧ, N - Л'о/1, Ба - БасИ, БГ - в//'!, Бт -Зта1. Слева приведено положение вектора. Масштаб указан над картами.

2192/У-1

1.6. Анализ нукпеотиднои последовательности Срв островка уНМ2004.

Была определена нуклеотидная последовательность длиной 5225 п.н. от

сайта ЕсоИ, который использовали при клонировании в полу-УАСе yRM2004. Поиск в различных базах данных нуклеотидных последовательностей выявил область между нукпеотидами' 2412 и 3405, которая имеет высокую степень гомологам с нухлеотидной последовательностью области ЬТИ ретровирусных • элементов человека HERV. Область между нукпеотидами 2200 и 2350 содержит множество позиций, в которых ДНК-полимеразы, использовавшиеся 'при секвенироеании данного района, часто останавливались. Это предполагает присутствие в этой области необычных стабильных вторичных структур (рис. 7 А). вС-богатая область заключена между нукпеотидами 1950 ч и 2280, ее ОС-содержание равно 72%. Сна включает также уникальную пробу - БкНН фрагмент, имеющий гомологию с неким участком из геномом мыши. В этой области обнаружен кластер из 6 потенциальных участков узнавания транскрипционного фактора вр1 (рис. 7 В).

Секвенированная последовательность содержит множество потенциальных открытых рамок считывания, длина которых не превышает 100 а.о. Их анализ не выявил значительных гомопогий с существующими базами данных, что, однако, не исключает присутствия гена в исследуемой последовательности, но требует более тонкого анализа,

1.7. Физическая связь между пробои зУ-/ 2123 и теломерныи концом хромосомы 1 человека. ' Итак, обнаружить уникальныв"пробы вблизи теломеры не удалось. Наиболее прямой путь для демонстрации тога, что уРМ2123 содержит фрагмент ДНК, коллинеарный геномной ДНК, - слецифичесхи расщепить геномную ДНК в месте, соответствующем Бя^ сайту, использованному при клонировании в полу-УАС'е. Затем следует определить протяженность высвобождаемого фрагмента. Расщепление должно привести к появлению специфического фрагмента только в том случае, если данный фрагмент является тепомерным по отношению к выбранному сайту. Если же клонированный в полу-УАС'е фрагмент ДНК имеет ту же структуру, что и геномный участок, то и расстояние от физического конца кз.< природной, так и искусственной хромосомы до конфетного сайта ЕсоИ должно

А

О ' 2 J <1 5

—I-1-1_!_ _ I_L

[ЛИ

aaj=.<~:—in

■ ПН »» с швв!

111 I "_k\s\mss\wl

Ptai Р5ка

PHCI496

B Cl.l

1100 Mflllicc»iiitMiC6eriictcR«iMBKitci6TiM(iiicc[;btt(icRTti5«MccRClH:ccmnflRslc:c:eTcriCKCtGSHbc

15Ш »umncciiuMUtiicUMciBsmiinuiUMi:cnum>c№imcua«SMCtcuccriic«:twcimi>rEtcncii 8«aHI Secll SMI

leg I Met I

1700 HTUAIl6CCCUCC&WCTGCBSCKKCCCTC1UIGCCUCETlCCCCCCKCGRrECCCCIICC£tHflCCCII«CCCCRCSCTCCUIITCCECCCPMlCM

p.ll

1000 lECICCUTlCSCCCTCCCniClCCCTCtlCSUTRGCetRSCTItCfiCClCftClCTKTCCCCClCCIISCCIICCGCTlCCCTTCACIflCIUCAClCGTT

Bi»K11

two 56KTTGaiSTT6tgmiCICMCCSCC6CgTCttaMft6TTi:GICC1Cttcm6r6fsrrrfiftrt;r.1CECrTEKrEi:CHrrBSCBrBC6WBfHfiTCG

Sill E<g!

ИМ ЕЯТТГСЕЯЕЕЕГГЬГЯЯЕЕСбГЕГТГГТТГТСГЕЕТТЕЕйЕТЕГЕИГГ-ГСЕЕРЕГЕСГГЕЕГТГ^ЯЕГ EriliBEECfiERf.rEGGETSGGTEC-GE*rrWGGCP

Sal 5a) .

2100 ЕССТГССЕГТРМПДЕЕбйТЕ^ЯТТГЯЕЕРГЕЕСЕТВЕВЯСЕЕВГГЯЕЕССИЁСГРТГЕПГГ^^ЕТЕГ.Г.ГГ.ГЕЯГГЯНГЕЯЕЕГСССГбСССТ EfiCSCT

__OsiHII _

220O ECtEt:CEEEBfTEfGRBTGCCBCCTrKfWfHCEEGrEEfiETGCrTglGUrri;ffErErfc.-IcEEEEfECEKEllHlMCIECblCtEmCbGa*

2300 cauTCRESlITCISAEEElCTTTETTlSCCCITCIlTCTCIlTIECllUlEUClEMEKCEAEGERCGEIlCTlCCEIHICCCRCHmAEACCRnC

EteW

2100 TEa«TEncCE1E«tf661EStCTECCCTICCWWtIETEEEHTIIICtICTCIICCTEEEaGEW*EHCTEM

Рис. 7. Анализ GC-богатой последовательности.

(А) Карта секвенированкой области, окружающей CpG-островок. Стрелки под картой показывают направление и длину каждого секвенирукхцего пробега. Черный прямоугольник указывает область между нуклеотидами 2200 и 2350, где наблюдались паузы в элонгации праймерое. Белый прямоугольник представляет область с гомологией LTR элементу HERV. В - ВзгоШ. Bs - ßssHIl, С - C/al, D -Oral. Е - Еад\, Н - H/ndlll. Fi - EcoRl, RV - EcoRV. N - Nofl^ Ns - Nsi\. P - Psfl. Pv -Pvul\, S - Sa/Gl, Sa - Sadl. Sf - Sfiü, Sm -Sma\. X -Xöal.(B) Нуклеотидкая последовательность GC-богатой области .("оказана как заштрихованный прямоугольник на А). Подчеркнута последовательность с гомологией ДНК мыши. Указаны сайты узнавания транскрипционным фактором Sp1. Нумерация дана от нуклеотида G в EcoR1 сайте .использованном для клонирования.

быть идентичным с точностью до возможных изменений, связанных с клонированием ДНК в дрожжах. Метод специфического расщепления ДНК. опосредованного ЯесА белком, позволяет провести такой эксперимент.

Данный метод заключается в том, что в известной области, где предполагается произвести расщепление, выбирают последовательность, фланкирующую ЕсоМ сайт, длиной в 50-60 нукпеотидсв и синтезируют по ней олигонуклеотид. Этот олигонукпеотид инкубируют с ИесА белком в присутствии слабогидролиэуемого аналога АТФ- у -Б. Затем данный комплекс гибридизуют с интактной ДНК хромосом человека в составе агарозных блочкоа. Р.есА белок, благодаря своей способности образовывать гетеродуплексы между гомологичными последовательностями сдноцепочечной и двуцепочечной ДНК, образует стабильней тройкой комплекс. Если обработать геномную ДНК ЕсоЯ!-метилазой, то все ЕссРЛ сайты, кроме защищенного тройным комплексом, будут метилированы и, следовательно, не подвергнутся воздействию ЕсоР! экдонуклеазы.

На рисункз 8 показаны результаты такого эксперимента с ДНК из лимфоцитов человека. ЕЗ качестве 60-мерного олигонуклеотида использовали последовательность, фланкирующую ЕсоЯ1 сайт, по которому клонировали ДНК в попу-УАС'е у«М2123. При этом 50 нукпеотидов являются специфичными для ДНК "человека, а 10 - для вектора. После проведения описанной процедуры ДНК из агарозных блочков разделяли с помощью электрофореза в пульсирующем поле и переносили на нейлоновую мембрану для последующей гибридизации с уникальной пробой 2123Л/-1. Как видно на рис. 8, на соответствующих дорожках выявляется только фрагмент размером около 270 т.п.н., что несколько больше размера ДНК, клонированной в уЯМ2123 (260'т.п.н.). Аналогичный результат был получен после отмывки блота в жестких условиях и гибридизации с пробой рНС1406а. Это подтверждает колинеарность клонированных в уЯМ2123 уникальной последовательности 2123ЛМ и терминального фрагмента теломеры длинного плеча хромосомы 1.

1 23 4 5 6 7 8 9 10 Í1 12 M

- kb

-400 - 300 -200

-100

Рис. 8. Специфическое выщепление, опосредованное RecA белком, теломерного фрагмента q плеча хромосомы 1.

Высокомолекулярная ДНК из лейкоцитов человека в агорозных -блочках была специфически расщеплена в месте, соответствующем сайту EcoRI, использованному при клонировании в yRM2123. Копличество слигонукпеотида варьировалась: дорожка 4-50 нг; дорожка 5 - 100 нг; дорожка S - 200 нг; дорожка 7 - 300 нг, дорожка 8 - 400 нг, и дорожка 9 - 500 нг. Дорожки 1 и 12 содержат нативную ДНК клона yRM2123; дорожка 2 содержит контрольную ДНК человека, v гидролизованную зндонукпеазой С/аI; дорсжка 3 содержит контрольную ДНК человека, инкубированную во всех буферах, использованных в эксперименте; дорожка 10 содержит контрольную ДНК человека, гидролизованную эндонуклеаэой EcoRI; дорожка 11 содержит контрольную ДНК человека, гидролизованную зндонукпеазой EcoR\ после обработки EcoRI-метилазсй. Образцы были разделены пульс-форезом, перенесены на нейлоновую мембрану с помощью капиллярного блота и гибридизованы с уникальными пробами 2123/V-I (А) и рНС1406а (В). Ы - маркер молекулярного веса в т.п.н

Глава 2. Анализ полиморфизма теломер 1q, 2q, 6q, Зр, 8q, 12q, 13q, 14q, 18p и 18q хромосом человеха.

Полиморфизм различных областей хромосом широко изучается, однако данные такого рода отсутствуют для теломерных областей. В лаборатории проф. Ритмана (США) были изолированы дрожжевые клоны, содержащие рекомбинантные полу-УАС'и с фрагментами ДНК из хромосом человека 2, 6, 8, 12, 13, 14 и 18, что было подтверждено с помощью методов FISH гибридизации и ПЦР анализа (таблица 1). Для каждого из исследуемых случаев были изолированы уникальные пробы. Методом специфического расщепления _ мы показали, что все отобранные УАС'и являются теломерно-концевыми для соответствующих хромосом. Таблица 1.

Характеристика полу-УАС'ов по размеру и локализации на хромосоме.

имя палу-УАС'а размер, т.п.н. штамм уникальная проба локус на хромосоме

yRM 2123 270 AB138Q 2123/V-I 1q44

yRM 2112 • 240 AB1380 2112/V-I 2q37

yRM 2158. 280 AB1380 2158/V-I . 6q27

yRM 2053 170 AB1380 2053/V-I 8q24

yRM 2205 300 CGY2516 2205/V-! 8p23

yRM 2196 190 CGY2516 2196/V-I 12q24

yRM 2002 100 AB1380 2002/V-! 13q34

yRM 2006 200 AB1380 2006/V-I 14q32

yRM 2102 220 AB1380 2102/V-I 18p11

yRM 2050 290 A81380 2050/V-I - 18q23

Высокомолекулярная ДНК из лимфоцитов периферийной крови от 11 неродственных индивидуумов была выделена в . агарозных блочках. Специфическое расщепление проводили аналогично тому, как описано выше для уМЛ2123, только каждый олигонукпеотид добавляли в реакционную смесь при одной и той же оптимальной концентрации для- всех образцоз. Характерные примеры для нескольких геномных теломер показаны,на рис. Э, 10, и 11.

I, 11

Рис. 3. Анализ полиморфизма теломерного фрагмента плеча хромосомы человека методом специфического расщепления.

При анализе ДНК от 11 неродственных индивидуумов (дорожки 3-13) использовали 200 нг олигонукпеотида, который был применен в эксперименте на рис. 8. Дорожка 1 содержит ДНК для контроля "буфера и манипуляций"; дорожка 2 содержит ДНК, гидролизованную эндонукпеазой ВгаНН; дорожка 14 - контроль "метилирование"; дорожка 15 содержит ДНК, гидролизованную эндонукпеазой ЕсоК; дорста 16 содержит натизную ДНК клона уКМ2123. После пульс-фореза образцы были перенесены на мембрану и гибридизозаны с уникальной пробой 2123ЛЧ. М - маркер молекулярного веса в т.п.н.

Для каждого клона может быть определен один или несколько фрагментов ожидаемого размера. В восьми из десяти случаев размер рекомбинантного полу-УАС'а совпадает с размером одного из детектируемых фрагментов. Небольшие различия в миграции геномных фрагментов относительно соответствующего полу-YAC'a, как в случае 1q теломеры (рис. 9), являются, по-видемому, следствием концентрационного эффекта, характерного для пульс-фореза [Riethman ¿t al., 1994]. Однако, в случае 8р теломеры (рис. 10) для рекомбинантного полу-YAC (yRM2205) различие сказалось существенным. Это предполагает, что ДНК в ■/RM2205 была либо делетирована, либо амплифицирована [Macina et al, in press].

Ситуация с 14q теломерой оказалась более сложной. Было показано, что yRM20QS содержит 5' конец им(йуноглобулиноваго локуса VH [Cook et а!., 1994]. В зтой области генома наблюдается большой полиморфизм у разных индивидуумов, а также происходят соматические перестройки, сопровождающиеся делениями ДНК размерами в сотни т.п.н. [Tonegawa, 19ЭЗ]. Поэтому присутствие множества фрагментов разной величины в данном случае требует аккуратной интерпретации. Фрагмент величиной в 200 т.п.н. совпадает с размером yRM2006 (рис. 11) и, вероятно, соответствует клонированной в данном рекомбинантном полу-YAC'e геномной ДНК того индивидума (№11), чья ДНК была использована при конструировании теломеркой библиотеки. Более крупные фрагменты происходят, по-видимому, из" других аллелей! ДНК из дистальной области: yRM2006 встречается в V н локуее, по-меньшей мере, один раз, и можно предположить, что фрагменты реакции специфического расщепления были получены в результате расцепления геномной ДНК более чем в одном месте. Исследование данного вопроса требует дополнительных экспериментов.

12345678 ВэМеЕУ

600500-

12345678 ВэМеЕУ

400300200- ' ?

Л-Ь

100-

НС1312

■ фк % 1

\ .: I

& Ё- /V ;>

-V

2205 V-!

Рис. 10. Анализ полиморфизма теломерного фрагмента плеча Ер хромосомы человека методом специфического расщепления.

При анализе ДНК от 8 неродственных индивидуумов (дорожки 1 - 8) использовали 200 нг олигонуотеотида, специфичного для плеча 8р хромосомы человека. Дорожка Вэ содержит ДНК, г,1дролизозанную зндонуклеазой ВггНИ; дорожка Ме -контроль "метилирование"; дорожка Е содержит ДНК. гидролизованмую зндонуклеазой ЕсоИ; дорожка У содержит ДНК клона уНМ2205. После лульс-фореза образцы были перенесены на мембрану и гибридизованы с уникальными пробами 2205ЛМ (А) и НС1312 (В). Слеза показано положение маркера молекулярного веса в т.л.н.

о

М У С Вз 1 2 34 5 в 7 а 91011 Ме £ М 550- т.- ;*

450350- - < ' ¿?А*

250- « - в }

150-2- и $

аз

Рис. 11. Анализ полиморфизма теломерного фрагмента плеча 14ч хромосомы человека методом специфического расщепления.

При анализе ДНК от 11 неродственных индивидуумов (дорожки 1 - 11) использовали 200 нг олигонуклеотида, специфичного для плеча 14р хромосомы человека. Обозначения те же, как на рис. 10. Дорожка С содержит ДНК для контроля "буфера и манипуляций". Дорожха У содержит натиануга ДНК кпонэ уЯМ2006. После пульс-фореза образци были перенесены на мембрану и гибридизованы с унихальной пробой 2005А/-!.

выводы

1. Получены дрожжевые трансформаиты, содержащие полу-УАСи с клонированными в них фрагментами ДНК генома человека из сегмента 1q44. Показано, что полу-УАСи содержат ДНК, которая является физическим концом длинного плеча хромосомы 1 человека.

2. Построена физическая карта фрагмента ДНК прителомерной области длинного плеча хромосомы 1 протяженностью 260 т.п.н. по редкощепящим рестрикгазам. Определена нуклеотидная последовательность 6 участков общей протяженностью 14 т.п.н. на различном удалении от физического конца длинного плеча хромосомы 1.

3. Клонирован фрагмент ДНК, включающий СрС-островок, расположенный на расстоянии 50 т.п.н. от физического конца большого плеча хромосомы 1. В субтеломерном районе картированы сайты среднещепящих рестрикгаз. Получены уникальные и низкокопийные зонды. Карты и зонды могут 5ьгть использованы для выявления тонких структурных изменений в згой области при исследовании различных генетических аномалий.

4. Методом FISH гибридизации показано предпочтительное распределение ниэкокопийных проб рНС1403 и рНС1405 в прителомерных областях разных хромосом. Для каждой пробы характерен свой набор теломер, где она может быть

локализована. • - »• ■ • ' " • - • .

' •_

5. Получены дрсокжеаые трансформанты, содержащие полу-УАС'и с фрагментами ДНК, принадлежащими хромосомам 2, 6, 8, 12, 13, 14 и 18. Исследован полиморфизм теломер 1q, 6q, 8р, 8q, 12q, 13q, 14q, 18p и 1&q хромосом человека методом специфического расщепления ДНК, опосредованного RecA белком. Показано, что в выборке из 11 неродственных индивидуумов полиморфизм наблюдается у 6q, 8р и 14q хромосом и составляет от 100 т.п.н. до 300 т.п.н.

Слисок работ, опубликованных по тема дисс&ртацми.

1. Negorev, D.C., Macina, R.A., Spais, С., Ruthig, LA., Ни, X.-L, and Riethman H.C. (1994). Physical analysis of the tenninal 270 kb of DNA from human chromosome 1q. Genomics 22: 569-578.

2.Macina, R.A., Negorev, D.G^ Spais, C., Ruthig, LA., Ни, K-L, and Riethman H.C. (1994). Sequence organization of the humanchromoosme 2q telomere. Hum. Mol. Genet, 3: 1847-1853.

3. Macina, R.A., Negorev, D.G., Wu, T.-T.,., Spais, С., Ни, K-L, Buckigham, J., Grsdy, D.L, Moyzis, R.K., and Riethman H.C. (1994). Physical mapping of cloned DNA sequences within 100 kb of the human 13q telomere. Genomics (в печати).

4. Macina, R.A., Mont, К., Ни, X.-L, Negorev, D.G., Spais, C., Ruthig, LA., and Riethman H.C. (19SE). Molecular cloning and analysis of chromosome-length polymorphism of human 6q, Bq, 8p. 12q, 14q, 18p, and 18q telomeres. Genomics (направлена в печать).