Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры гетерохроматин-теломерных повторов Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры гетерохроматин-теломерных повторов Drosophila melanogaster"

Московский государственный университет нм. М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 575.577

КУРЕНОВЛ Елена Всеволодовна

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ГЕТЕРОХРОМАТИН-ТЕЛОМЕРНЫХ ПОВТОРОВ 1)гозорЫ1а ше1апо£а5(ег

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена в Институте юлекулярной генетика АН СССР Научный руководитель: кандидат биологических наук

0. Е Данилевская Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор кафедры генетики ЛГУ JL а Еайданов

Бедутая организация; Институт »молекулярной биологии АН СССР

Завдта состоится а<уплгк11ЯЯ1г. в УУ час на заседании Спениаливированного ученого совета Д. 053.05.70 при ibcKDSCKDii государственном университете ш ЕЕ Дэшвоеова.

С диссертацией потно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_1991г.

кандидат биологических наук, доцент

кафедры генетики МГУ

А.И.ЕШ

Ученые секретарь Совета кандидат химических наук

/

В. Е Кагряманов

Актуальность темы. Концы эукариотических хромосом - тело-меры - необходимы для поддержания целостности хромосом и полной репликации их генетического материала. Структура теломер хорошо изучена у низших зукариот. Как правило, к простым концевым повторам Т/А(1-8)6(1-8), обеспечивающим полную репликацию концов хромосом при действии фермента теломеразы, примыкают протяженные субтеломерные повторы (Blackburn,1989). Структура теломер очень консервативна, и такая же организация теломерных районов показана для хромосом человека и многих позвоночных (Richards arid Ausubel, 1988; Me у ne et al. , 1089). Организация теломерных районов хромосом дрозофилы представляет особый интерес, так как на концах хромосом не выявлены простые GT-богатые повторы. Возможно, теломера дрозофилы представлена только теломер-ассоциированными последовательностями, и репликация концов осуществляется иным способом. У дрозофилы открыто семейство повторяющихся последовательностей Не-Т, кластеры которого обнаружены в теломерах, прицентромерном ге-терохроматине и У хромосоме (Young et al., 1983, Traverse and Pardue, 1989). Важнейшая роль Не-Т семейства в функционировании теломер показана Бейсманом, который установил, что "залечивание" концов поврежденных хромосом происходит в результате присоединения к сво^ -тым концам определенных последовательностей из Не-Т семейс'и>а (Biessrann et al. ,1990). Пээтому молекулярный анализ членов больного семейства гетерохроматических повторов - Не-Т семейства, можно рассматривать как первый шаг к выяснению структурных особенностей последовательностей на концах хромосом дрозофилы и их взаимосвязи с копиями, расположенными в прицентромерном гетерохроматине и У хромосоме.

Задачи исследования. Целью настоящей работы явилось клонирование и характеристика фрагментов, гибридизующихся с тело-мерами политенных хромосом D. melanogaster, определение и анализ их нуклеотидных последовательностей и характеристика часто соседствующего с ними семейства мобильных элементов hoppel.

Научная новизна результатов исследования. Клонировано и секвенировано несколько фрагментов генома D. melanoeaster,

содержащих последовательности иа гетерохроматин-теломерного семейства Анализ нуклеотидных последовательностей показал мозаичную организацию членов этого семейства по крайней мере из семи типов коротких последовательностей. В нуклеотидных последовательностях двух клонов обнаружены НеТ-А боксы, вызывающе "залечивание" делетированных концов хромосом. Во фрагменте Drr665, происходящем из У хромосомы, обнаружена гомология с геном Stellate, регулирующим сперматогенез у дрозофилы. Выявлено новое семейство МЭ hoppel с короткими инвертированными повторами, имеющее предпочтительную локализацию в гетерохроматине, особенно в последовательностях Не-Т семейства. Определена нук-леотидная последовательность нескольких членов семейства hoppel.

Практическая ценность. Клонированные последовательности могут быть использованы в качестве зондов при исследовании теломер, прицентромерного гетерохроматина и У хромосомы, а также в работах по физическому картироЕаню генома дрозофилы.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 16-й конференции ФЕБО (Москва, 1984), IV симпозиуме СССР-Италия, (Киев,1984), VI симпозиуме СССР-ФРГ (Ленинград, 1985), VI симпозиуме СССР-Италия (Ленинград,1988), V съезде БОГиС (Москва, 1987), Ш Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск,1990).

Объем диссертации. Материал диссертации изложен на _

страницах машинописного текста, содержит _ рисунка и _ таблицы. Список цитированной литературы состоит из _ работ.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Создание клоногеки и первичный анализ клонов проводился совместно с И. А. Еасс. Результаты по гибридизации in situ получены совместно с Е. А. Лейбовичем.

Материалы и метода

Линии дрозофилы. Drosophila melanogaster Oregon RC, gtwe CantonS, 0. simulans.

Пдаамиды и микроорганизмы. Для клонирования были использованы

векторы pBR322, pUC19, pTZ19, YIp5. Использовались бактериальные штаммы НВ101, JK©3. TGI и линия дрожжей-сахаромицетов DBY747.

Определение последовательности нуклеотидов проводили по методу Maxam and Gilbert (1930) ■ и Sanger (1977). Все работы с ДНК ( получение рекомбинантных плавмид, трансформация клеток Е.coll, введение радиоактивной метки в ДНК и очистку меченых фрагментов электрофорезом в агарозе) проводили как описано в руководстве Маниатиса и др. (1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА I Характеристика повторов гетерохроматин-тедомерного (Нэ-Т) семейства генома дрсвофилы.

1.1 Клонирование и характеристика фрагментов, принадлежащих гетерохроматин-тедомерному семейству.

Первый фрагмент DmB65 (2,4тпн), гибридизувдийся с тело-мерными районами политенных хромосом, был найден среди последовательностей ДНК дрозофилы, обеспечивающих автономную репликацию плазмид в дрожжах (ARS-активность) (Danilevskaya et al., 1984). Гибридизация in situ выявляет гомологию этого фрагмента с теломерами, слабую с хромоцентром и внутренним сайтом 12DE на X хромосоме (рис.1). С целью поиска дополнительных последовательностей, гомологичных концам хромосом, была создана кло-нотека ДНК D. melanogaster линии Oregon RC в векторе pBR322. Анализ более 100 клонов методом гибридизации in situ выявил 3 клона, гибридизующиеся с теломерами (рис.1) - Dm456S, Dm4579 и Dm4269. Опыты по перекрестной гибридизации выявили гомологию между Dnß65 и отобранными клонами (рис.1). Причем уровень гомологии с Dm665 сильно варьировал, что проявлялось в различной интенсивности блоттинг-гибридиаации. Можно предположить, что все клонированные фрагменты содержат последовательности одного И того же семейства повторов, но отдельные копии повторов ха-

Ш lu «Uu I Ыч

+ + 12Е *

В Bi в

Da665 рТД I КТЛДЯПЯЯ 'Se-Ей"

_L^™ • ••=•••• 1 + + t +

bfippil

p_L__Д

ffmi^al';- <■!:■ [ ,1 .....J + + + +

CüjiA

IfcnlMIlP к^Ешшё - + - -

—ЩШП-

Ц я»

Рис. 1 Рестриктные карты и основные.характеристики фрагментов Не-Т семейства. Р - Pst], В - BamHI, Е - EcoRI, H - Hindi]]. Bg - Belli. Частой штриховкой обозначен район сильной гомологии с Dw665, редкой - слабой гомологии. Мобильные элементы отмечены под соответствующим фрагментом линией с названием Ю. Справа отмечена способность фрагментов поддерживать автономную репликацию дрожжевых интегративных плазмид (ARS), и локализация фрагментов на политенных хромосомах дрозофилы (in situ). Т - гибридизация с теломерами, Вн - внутренними сайтими, Хц -хромоцентром.

растеризуются дивергенцией последовательностей.

M. L. Pardue с соавторами (Young et al. , 1983,Traverse and Pardue, 1988) описала Не-Т семейство из генома дрозофилы, локализованное в лрицентромерных и -теломерных районах хромосом и У хромосоме (Traverse and Pardue, 1389). Данилевская О. Я пока- 1 зала перекрестную гибридизацию между Dnß65 и плаамидой pDRM25, с HindlII фрагментом из АТ-А фага, содержащего Не-Т ДНК (Уоипг at al., 1983). Следовательно, Dir£65 и гомологичные ему после-

довательности принадлежат Не-Т семейству.

1. 2 Определение ARS активности в клонированных фрагментах и локализация ARS последовательностей.

Так как все клонированные нами фрагменты ДНК дрозофилы имеет районы гомологии с Drrß65, который обладает ARS активностью, то фрагменты также были проверены на ARS активность по метод/ Davis et al. (1979). В опытах по трансформации дрожжей интегративными плазмидами, содержащими как целью клонированные фрагменты (табл. 1), так и их субфрагменты, было показано, что ARS активностью обладает фрагменты Dm42B0 и Dm4579 (рис. 1).

Таблица 1. Эффективность трансформации дрожжевых клеток 0BY747 плазмидами, содержащими различные фрагменты ДНК D. melanogaster

плазмида вектор размер вставки (тпн) эффективность трансформа. ции 1мкг ДНК/10* клеток

POD65 _

YRpl2 arsl 4-6x10® -

рббб pOD65 2.4 4-5x10*

р4269(1) рЕК95 2.9 1-2x10®

р42Б9(г) рЕК95 2.9 1-2x101

р4579(1) PÛD65 1-2x10*

р4579(г) PÛD55 4.1 1-2x10*

Р элементе 1)- 4. 75 1-2x10* .

Р элемент(г)- 4.75 1-2x10*

Буквы "Iй и "г" обозначает различную ориентацию фрагмента в векторе.

Детальный анализ показал, что фрагмент Dm4269 содержит последовательность со свойствами ARS во фрагменте размером БОО п. н., справа от EcoRI сайта, вне района гомологии с последовательностью Dn665 и МЭ copia Анализ нукдеотидной последовательности части этого района не выявил канонических ARS после-

доватйяьаоотев, по показал обогащэнность этого района Aï параш (7БХ).

В случав Ш4579 ARS активностей обладает участок НЭ hoppal (рис. 1). Важнш для репликации гибридной плазкиды оказался район справа и слева от Hindi 11 сайта При анализе иук-леотиднай последовательности 0nvîS79 обобщенная 11-нукпэотиднаа последовательность, характерная ала дроотэвызс ARS, была найдена в последовательности мобильного элемента hoppel, слева от Hindi И сайта. Крош того, содержание AÎ пар в районе, окруяа-sэдем ARS, составило 802. Эти данные яодтверздает сделанные ранее вшоды о дпух-трех-кокпонаитнои строении AIS, где крош 11 - членной последовательности предполагается сущэствоваш:е эи-хаисериьн районов.

В опытах по трансформации дройаэвшс клэток интегративиши шшзшдаш в качестве контроля были использованы Ю дрозофилы двух сеьййств: ратротранспозоны - ыдг1, copia и Dm4l2 и классический транспоаон - Р элешит. Только Р вламеит поддергивает репливдшо шшед в дрогэсut (таОл.1). В его нуклэотид-поа последовательности были найдены несколько консенсусов ярокзэюа AKL Сравиаийэ результатов опытов по трансформации дрожэа различными фрагшнтаки плааииды j$í25.1 ((У Hare & Rubin,1983) с локализацией канонических 11-членных последовательностей & первичной структура Р элешита также показало связь usssy ASS активность» и наличкам 11-членного консенсуса, а таккэ двухкомпонеитное строение ARS.

Р элемент и hopp&l отпосячса к одному классу тракспозоиов с короткими Ш во флангах, для которых не исключается возможность рёпликативяого механизма транспозиции. Возшжно, AIS активность этих элементов отражает наличие в них функциональных оридяшоз репликации.

1.3 Анализ вукдеотидных последовательностей различных копий Не-Т семейства

Одной из задач исследования являлось определение первичной структуры.' клонированных копий Не-Т семейства и выявление

обшвг заковомэряостей в организации послагшЕауельяосгой вгого сешбства. Егп этого бил полностью секвенирозан йрагшнт DtrS65 Й частично фрагкэкта'0й4579, Dm4269 a DM53S. Кроыэ ТОГО бши сэквашгровшш копии №665 кэ таяве>а»го кластера в У хрошсоаэ (гкбрщшыа фаг Î2) и копии, сосвЕстаушщвэ с Ш hoppel кз fera

(оба фага описаны в кшщ. диссвртаакп В, Д.ШОшюва). I.ai. Анализ яукшдаишой поолеяовагалыюсш ttaSSS.

Зрагиент DnSSB бш аачнтая го даун wams а ©го послэдоаа-тельпость представлена ка ркс.2. Ллпва HindlII фрагшнта 2443тпи. Последовательность нэ содэрЕНТ ввачзггвдыгых открыть» рашк счэтшания, протязштшх п|шз и инввруировашш повторов. Срааиешэ послэдоваэельности с даань&а Qsr&snk вшвшэ небольшой райоя в 94 пуклэотпда (410-501), tmwmü 83% сходства е шбшакт алешнтом D. ralanogaster copia ды 4728-481 Б), а такю догопыго протшгзгшнЛ участок гокохогкя (нукяеотнды 012-1250) о гексм D. rslanogaster Stellate (Ste)(Livek 1900). В этот m ушотек попадал район гоюдагш со срэдпеповгоряюшййсз послэдоватшшгостьа ta НЬЯ сашйства, фяаакарушюЯ готерохроматичэскнэ копня Ш МШ (Shovelyov et al. 1989). Авторами бый> показано, что НШ послэдоватэльность является копией гена St», .юкавйзованпой в У хрояссомэ СМ. Д. I&Batmpèea, личкоэ сорбЕэш»).

Гекн Ste - это сеиэйство таядеьшо организованных последовательностей, расположенное в районе 12F1-2 sa Х-хрокосонэ п ответственное за сперматогенез у самцов. Транскрипция этих генов контролируется локусом Su(Ste), расположенном в С-сегмзита аа длинном плече У-хромосомы (Hardy et al. 1981, Livak 1990). По данным Данилевской О. К именно в С-сегиент У хромосомы картированы тандемяыэ кластеры семейства Dm565, и сам фрагшнт Dm665 клонировав из этого района. Однако, размер единицы тан-демного повтора, выявляешь на Dnß65 в У хромосоме - 2.4 тпн -иеньше единицы тандемного повтора иэ локуса Su(Ste) -2.8 тпн. На данных Ltvak (1990) следует, что существует еп© район гомологии со Stellate, располовенный рядом с уже описанным локусом Sü(Ste), и возможно, фрагшнт Dra665 является единицей этого

TAG TTTTTTQTAG TTATAATCGG TAATGTTGGC AATTTTAATT TQCQTTTQOQ CT CCTGTTTTCQ OTTOCSITCß ATTGGCTGTG STCAAGGAGG TAAGTGCßTT

tGCTNTAAATA ATAGTNTTGG TCXftAGTTAB TATTTTTTTC GTACTAGGTT TTTGACAGTA rACATGQACTQ STAACATTAT CATATTGCST GQTTTQTTTA CATTTTACAA TTQAAATTAT TATGCAAAAA CATTGAACTÛ 6AAGÇCTCAG GAQCGATCQC AGGTAGGTßT TAGTTGTTTG TGGCTGTTGC GGCCGCTGGA TGCGCGCCGT TGQSACQTGA CGTTQCAQGT AATTTGTÎTG 6QATAQTAGT ATCCCQCGCC GCTCTCAATT TQGTGGTAAT CTTTCCACTA TTAGTGGTAT TTCTTTGCAA TTGTTTAATG AQTTCGTTCA AATTGCAGGG ACACTTCCTT GGTCGTCAGG AAGAAGAATT 6TGAAGGGTC CCGCACAGCC GTCATTACAT TTTTTTGAGC TGCTG6CAAT ATTTGGTGTT QAAATCTGCC CCOTTGTQGC AGAGGAGTCG TCAATGGAAA TAÇCTGGTCG TTCACCGAQA GTTGCCAGCA GAGßCGCATC TTGIGGCCAT TGCATCGGGA TTGCCAQTTT GGAGCCGCCG GATAGGATTT GTTGCCGAGT ACCGCCGCAA CGATTGGGGC CATGGAAATT AATGTAAAAT TATAATTAAS TAAGTATTAC ATTTGTTATT CGTCTTTATG CGTGCfcfTÄÄ ПкТТТТТТС fAGTTACATTA GGTG3AASCT AATTTGGGG3 TAAGTATTTT ATTTATTTTT

Д

ATGATTGCAT TGATTT^TGT TTTTGGGGTA CATTTTGTAA GAGTTAATTC GGAGÜCCCGC

AGCTGAAGTG CCGCGGTTTT GAAGTCGTCG GTTGuCAATT AGATAAGTAT TATGTTTAAA TATATATTTC ACAGTATTAG CTTGTGTTGT GTCTTTCA3T ATTTGCAQTC TTGGAAGAAG GAATTGCGTG CGTGTCGTCA GCAG3AT63A GTCGCATATT ASCAÎCTGCT AGTTTGCCTG TCTGGTTTGC TATTTTATGT GTGTTCTTGG TTAACTTTGT ATCACATTCT TATTAAGTTT

CCTTTCTTTA CAGGTTAGCG GAAATTCGTT GAAAjWACGA TACCGAG3AA AAATATATAT

TTTGGGGACG GATTTTGCAG CTTTTTAATG TGGCATCAGC TCCGCGCTAß TGATCCTTAT AAAGGCAGTG GCATCAGGAG ATGGAGATGG CATCATßAGg^

6C 12

ATTTGATTGT TATATTTATT TJATATTTATT TACAACTTGC TGATATACTA ACTAAGCCGT 16

TACCATCTQC AAGATTCATT ACATTGAGAA GTGGQCTTGG ACTCTCAGAA TGAATTAAAA 24

CAATATATGC TTAGATTGAA ATGAAGAAAC AGACTGAACT GGQGGTCGTG ATATAAAGTA 3C

TCATTAAATT AAATTTAATT AAßTTTATTG ATAATTTT6A GGTTCTACAA AGTTGAATAA 38

TATTGATTTT AGTTAAAATT GTTTGCAAAC TGAATTTATG TAAATAATAT GTTCAATTGA 42

TCTGPTTGGQ TTTTACTGGG TTTCCCACCT GGTTTCCCAC /¡CCTCGCAGC GÀATGCTGGÀ' 48

M^VVVkVW o-^vwvwwt.

TCAAAATTAT TCCCCABAAß QACATGCAAQ TAATAAAAGT ACAQCAATGT AACTTTTGAQ 54

CTGOCOTATT GGÄMGTATG TACCCATGTA TACTCGGCTT ACATATACTC CTGCATAGCA 60

GAGAGGAGCG fr--Stellate-l »ke-sequencg^---—---........-..................126

13

13

14

lö 151 16! 161 17181 18< 19Í 19f 2Ck 21C 21£

22£ 234 24C 244

Рис. 2 Последовательность фрагмента Dm665. Район гомологии с геном Stellate только отмечен. Район гомологии с ИЗ copia подчеркнут волнистой чертой. AR3 последовательность подчеркнута. г послелователь-сть, образующая прямой повтор во фрагменте uav$5?9 подчеркнута редкой. ПоследоватЕльность, дуплицирсванная в LV4579 в сайте,ин-грации мЭ гюрре14Г>79 ваята а рамку. Точка интеграции happe 1178 с-чена вертикальной стрелкой, Елоки гомологии с последовательнрс-и îfe-T семейства ГА-D) обведены (соответствуют схеме на рис.3).

ность, стрелко: те

OTW

тяии

минорного (по отношению к Su(Ste)) тандемного повтора.

Возможно, район гомологии, со Stellate, имеющийся в №665, тоге играет роль в регуляции транскрипции Stellate. Во более вероятным кажется предположение о связывании с таидемно организованными последовательностями Не-Т семейства белков, участвующих в поддержании структуры хромосом, как это предполагается для гетерохроматических районов с генами фертильности из У хромосомы 0. hydei (Hennig et al. ,1989) 1.3.2. Сравнение последовательностей Ршбб5 и Ят-А.

Клон Jt-A, открытый M. L Pardue ( 1983), является первым исследованным представителем Не-Т семейства. В 1990 г. опубликована его нуклеотидная последовательность (Valgeirsdottir et al. ,1990). Последовательность 0л6б5 оказалась гомологична последовательности из фага 2Т-А в основном в районе 1280-2443 пн. Можно выделить пять фрагментов гомологии A-D на последовательности DffiS55, размером от 130 до 650 пи, причем их взаимное расположение и ориентация в последовательности ¿Т-А иное. Нук-деотидные последовательности всех последующих Не-Т фрагментов сравнивались с Dnfi65 и ÎT-A. Общая схема гомология представлена на рис. а

1.3.2 Анализ нуклеотидиых последовательностей Не-Т фрагментов из разных областей генома.

Частично отсеквенированы и проанализированы еще пять фрагментов, содержащих последовательности Не-Т семейства. Среди фагов, отобранных по гибридизации с Dm665, фаг ¿2 интересен наличием тандемного повтора иэ пяти BglII фрагментов размером 2. 4тпн, содержащее Hindi 11 сайт и соответствугаих по размеру и сайтам рестрикции Dm665. Оказалось, что единица тандемного повтора, ограниченная сайтами Bglll, соответствует последовательности фрагмента Dm565, где за точку начала и конца условно приняты сайты Bel II. расположенные в последовательности, гомологичной гену Stellate. Т.о. отсеквенированные участки - это Ste-подобные последовательности. В проанализированной области степень отличий от DmB65 не превышала 7Z. По-видимому, фрагмент, клонированный в фаге 32, происходит из С района длинного

ОшбК lil I feât* г В ■ jCKD[fl

XT-к I амии?- д--.•:••••:•■ m ill

&н m

Рш458В I шт 1 <Ш1ШВ1

СтШ № •••••• rift сори I

¿M

ыт l-B. ICH» "" I i

рРШ7.4 E^WI III !■:•■■■ "

. ÏH ......... fflftw

Рис.3 Схема организации Не-Т последовательностей. Буквами A-G отмечены блоки гомологичных последовательностей, стрелками указана их ориентация относительно последовательности Ошббб. Елок F содержит НеТ-А бокс, стрелкой под фрагментом указано предполагаемое направление транскрипции. Прерывистой чертой выделены нёсеквенированные участки. Показан район гомологии с геном Stellate, 1£3 copia. ИЗ hoppel выделен штриховкой, отмечены Ш Стрелка указывает взаимную ориентацию копий МЭ.

плеча У хромосомы, где последовательность Dm865 образует кластер тандемных повторов.

Картина рестрикции и гибридизации рекомбинантного фага А17 также позволяет предположить, что в фаге клонирован тан-демный повтор, содержащий последовательность Не-Т семейства со встроенным в нее МЭ hoppel (рис.3). Еыл частично секвенирован субклон фага - pFMl7.4. Анализ фланга hcppelî78 выявил район гомологии с последовательностью Dm665, где рядом расположен участок из конца (2213-2442, фрагменты D и Е) и иа начала этой последовательности ( I - îil. фрагмент А). Второй район гомсло-

гии с последовательности) Олббб расположен на расстоянии 120 пн от EcoRl сайта и соответствует фрагменту В Отббб (иуклеоти-ды 1266-1444). Отличия по последовательностям варьируют в пределах 15Х. Так как 0п6б5 представляет собой единицу тандемного повтора, ограниченную фрагментами А я 0, то можно предположить, во-первых, что в фаге ll7 клонирована последовательность, где в подобную единицу произошло встраивание МЭ hoppel; . во-вторых, эта единица была амплиФицироваиа и копии повтора .расположены в прямой ориентации, что подтверждается и данными о прямой ориентации двух копий 16 hoppel (раздел 2.3).

Сравнение последовательности Dm4269 с последовательностью Dn6BS покаеало, что район гомология ограничен нухлеоти-дами 4-774 и 1284- 2019 в соответствующих последовательностях. Этот район последовательности 0x665 соответствует фрагментам В и С (рис.3), количество нуклеотидных замен 14 я 20Х соответственно.

На рис. 3 также представлены результаты анализа последовательности, фланкирующей МЗ hoppel4579 (глава 2) и фрагмента Dm4568 (Danilevskaya et al., в печати). Во всех фрагментах встречаются последовательности, гомологичные 3' району Опббб (куклеотиды 1280-2443). Степень дивергенции всех проанализированных последовательностей варьирует от 15 до 20 Z, что подтверждает вывод о дивергенции членов этого семейства, сделанный • по результатам перекрестной гибридизации ккжов.

На основании анализа сделано предположение, что последовательности, представленные в 3' районе клона 0тбб5, являются основными структурными элементами гетерохроматин-тело мерного семейства. Структурная единица Яе-Т семейства организована мозаично. В её составе можно выделить по крайней мере семь блоков (A-G), которые встречаются в различных сочетаниях и взаимных ориентадаях. Наиболее постоянным компонентом Не-Т последовательностей является, вероятно, В последовательность, а предпочтительными сочетаниями фрагментов являются F+B я В+С (рис.3).

3.3. Лэкализация во фрагментах' НеТ-А бокса, принимающего участие в "залечивании" хромосомных разрывов. НеТ-А бокс - мотив из 140 пн - был найден Ве^тапп еЬ ай. (1990). при нуклеотидном анализе "залеченных" концов X хромосом дрозофил. Такие концы возникают в линиях мух с концевыми делениями X хромосомы (КГ хромосомы) (Мазоп, 1984) при переносе на иих последовательностей Не-Т- семейства. Механизм этого переноса неясен, однако Еейсман предполагает, что залечивание концов может быть следствием ретропозиции мобильного элемента,

0Ш4269 ОТССААСТСССАААСТСАССАСАТОСААТОТТАААСТСТААААСТСАААТ

рРМ17.4 ......ТС............С--С-Т.....АС-С—А----Т------

ТА1 .*.... ОС. А.......... СА.........А. Т.... АТ... Т......

0)1)4269 ТАТТаТАССТАТАТАТТАС*ААААТТСТААТСАААООСААААТАААТТСТ рРШ7. 4 А-.........С-----6—ТТСТА-........................

тм а................а ас. с. с.......с......т.......а.

Dm4269 GQATGCGQAACAGAATTCACTCIOra^C^AOCTC^QBAQCAAAQIAS

рРМ17.4 ..................GT—Т........................**

TAI .................Т. ТА..... Т.....................Т*

Dm4269 AAGTT (А) 14 А)STOC

рРМ17.4 ***** (А) 10

TAI ***** (А) 7 *»*****»**1>**(ХЯТГУ1СГАПОАААСГГ(А)Э

Dm4269

ОАТАОСТССАОСАаСАААШТ( А) 15ТСШГАаЯССМХМЗСАААвП( А)3

Рис.4. Сравнение последовательностей, гомологичных НеТ-А боксу. Штрихом и точкой (Beissmann et al. ,1990) обозначены совпадающие нуклеотиды. Для выравнивания последовательностей относительно друг друга в них внесены делешш, обозначенные"*". Жирным шрифтом выделена последовательность, являвшаяся частью НеТ-А бокса н повторенная в последовательностях Dim2ö9 N TAI несколько раз.

и

частью которого является НеТ-а бокс. Наличие в НзТ-а боксе полиса) участка, характерного для ретропозонов (Rogers 1985),. позволяет предположить участие РНК в переносе посдедователъ-тельностей Не-Т семейства.

Поиск НеТ-А бокса в нуклеотидных последовательностях выявил этот мотив в двух фрагментах - Dml269 и р?М17.4. На рис. 3 НеТА бокс обозначен буквой F, стрелкой указано предполагаемое направление транскрипции элемента На рис. 4 представлен сравнительный анализ НеТ-А мотива из разных фрагментов Не-Т последовательностей.

По нашим и литературным данным ВеТ-А бокс найден в семи фрагментах Не-Т последовательностей, и это позволяет предположить, что НеТ-А бокс является достаточно постоянным структурным компонентом копий Не-Т семейства.

ГЛАВА 2. Характеристика семейства мобильных элементов hoppel. соседствующего с Не-Т последовательностями.

Клоны 0ш4269 и Dm4579 содержат мобильные элементы, о чем свидетельствует большое число внутренних сайтов гибридизации, варьирующее от линии к линии. Фрагмент Dm42S9 содержит известный мобильный элемент copia, что доказано перекрестной гибридизацией фрагмента с copia и совпадением сайтов гибридизации этих МЭ на политенных хромосомах линий Oregon RC и gtw®.

Фрагмент Dm4579 содержит мобильный элемент, фланкированный короткими инвертированными повторами. Семейство этих элементов, названное нами hoppel, часто ассоциировано с Не-Т повторами. При анализе геномных библиотек было показано (Бебихов Д. Е , канд. диссертация), что этот МЭ встречается в 75Х Не-Т клонов. Подробному изучению этого семейства посвящена вторая глава диссертации.

2.1 Локализация мобильного элемента во фрагменте Dm4579. определение его нуклеотидной последовательности и идентификация ARS.

Для локализации IG фрагмент 0.*п4579 был сyt5клонирован.

Анализ данных гибридизации субфрагментов с политеикыыи хромосомами показал, что большая часть ДО расположена в центральной фрагменте EareHl-EcoRI, так как с шш выявляется гибридивацкя с внутренними сайтами и хромоцентром. Область, соответствунавя 193, была секвенврована (рис.5). В нуклеотщщой иосладователь-востн был найден участок, ограниченный инвертированными повторами и имеющий 91% гомологии с элементом ОлйЗбО (Холодилов в др. 1888). Элемент hoppel4579 имеет инвертированные повторы (ИГО по 37 нуклеотидов. Коша hoppel4679 отличается от hoppallSBO делвциейв 112 нуквеотндов, - небольшими вставками в дэлешошя.

Наличие коротких инвертированных повторов позволяет формально отвеете семейство Ш hoppel к классу классических траисвозоыов, объединаадему семействаЬоЬо, HB и Р злемэитоа.

Фрагмент 0вА579 поддерянвает автономную решшкациа шшамзд в клетках дровюй (тебл.1). В последовательности hoppel4Б79 на расстоянии 60 нуюоотидов слова от Hindi IX сайта обиаругш "ишсексус" /Т/А ÍTT&TPuTTT А/Т/ характерный для ARS.

2.2 Полиморфизм копий ИЭ семейства hopoel в генош дрозо-■ бит

Цра сравнении нуклеотидных последовательностей двух элэ-ментов hoppel4578 и hoppöli360 ш обнаружила, что они отличается друг от друга делецияш, вставка^-и и единичными заменами нуклеотидов. Полиморфизм центральной части ДО hoppel был определен методом Сауэерн-гибрадиэацни. ДНК, выделенная из мух линий Oregon RC и et**, а также из слюнных «елеэ личинок линии Oregon RC, бьиа рестрицирована одновременно фериси»^; .".;r.d III и SauSA, которые вырезают внутреннюю область 18. В качестве вонда для блоттинг-гибридизации использовали плазмиду, содержащую центральный фрагмент hóppe14579. В геноме мух двух линий присутствует одинаковый набор, по крайней мере, 6 вариантов элемента, с размером центральной части 450 лн, 500 mi, 600 пн, еоопн, 900 пн, 1000ПН. Полосы 450 лн и 500 пн соответствует центральному Sau3A-HindIII фрагменту элементов

hoppel4579 и hoppellSSO. Ib интенсивности гибридиаации коаво сделать вывод, что копив Ю со структурой .центраяьной части как у hoppell360, очень редка в геноме и совсем не представлены в ДНК из политенных хромосом, «го можно обменить происхождение« этих копив из Y хромосомы (Lifachytz and Hare ven, 1982). Структура Tima hoppel4579 (цэптрадьная часть 600 пи) я еда один вариант с размером центральной части 600 па наиболее распространены в геноме. Гибридизация с фрагментами геномной ДНК большего размера свидетельствует о существовании копий о иной структурой центрального фрагьггнта. Таким образом, для МЭ семейства hoppal выявляется полиморфизм копив по длине цент--радьного фрагиепта, который шяэт Еозниать как га счет поли-иорфазш по сайтаа рестрикции, так и ва счет, вставок и деле-ций. Наличие дедеционных производных таккэ является характерной чертой классических траяспоеоноз дрозофила

2.3 Особенности распределения Ш семейства hoppel в геноме дрозофилы.

lía данных по гибридизация ПШБ79 с полятеннша хрошеоиа-ш следует, что элемент обладает особым характером распределения а геноме. Для него характерна шщшя гибридизация с хромо-центроы и серией внутренних сайтов по 4-ой хромосоме. Таю» Ю гкСридизуетса с телокэриыш областями подятэюшх хромссои. Ко-.знчество внутренних сайтов гибридизации варьирует от 10 в линии Oregon RC до 29 в линии Cranston. Причем увеличение числа апутренних сайтов гибридизации происходит, а основной, при сохранении старых мест локализации.

В ДНК одного из рекомбинантных фагов - 3l7, было детально наследовано расположение копий МЗ hoppel. Фаг содеряит две копии МЭ семейства hoppel на расстоянии 1.8 тпв друг от друга, обе они интегрированы в блок» повторов Пе-Т семейства (рис.3). ВДаамида рР1Д7.4, содержалая Hindi 11 фрагмент размером 3.2 тпн, была секвенирована от HindIII сайтов (рис.б). Сравнение с последовательностью Ю hoppel однозначно устанавливает прямую ориентацию обеих копий элемента по отношению друг к другу. Од-

на из копий обозначена hoppell74, другая - hoppell78. Таким образом, в гетерохроматических областях хромосом дрозофилы наблюдается кластерное расположение копий семейства hoppel.

Сравнение последовательностей четырех копий hoppel в пределах 300 нукдеотидов показывает, что гомология отдельных копий варьирует от 80 до 9 ОХ.

2.4 Определение сайтов интеграции hoppel в Не-Т последовательностях.

Как отмечалось выше, при анализе геномных библиотек было показано, что ИЗ hoppel часто оказывается в окружении Бе-Т последовательностей. При анализе нуклеотидных последовательностей фрагмента Dm4579 и фага il7 оказалось, что последовательности Не-Т семейства являются сайтами интеграции ДО. Последовательность, окружающая 10 hoppel4579, (положения 24-269 и 1399-1727 рис. 5) на 85-902 гомологична В, С и D блокам Не-Т. При анализе 3' фланга hoppell78 найдены блоки D, Е и А Ве-Т семейства.

Наш показано, что копии U3 hoppel могут располагаться мастерами на небольшом расстоянии друг от друга. Ыожно предполагать, что для копий IB hoppel характерна интеграция в другие повторяющиеся последовательности, составляющие гетерохроматические области генома дрозофилы, и дальнейшая амплификация и эволюция как составной части гетерохроматина Сушируя все данные, можно отметить,что хотя семейство hoppel по структурной организации' сходно с семействами Р и hobo, видимо его роль в геноме иная и, скорее всего, оно является структурным комло-иеЫйи ro»>FOJCp01STIiHiL

Рис. 5 Нуклеотидные последовательности копий Ю семейства hoppel: 3 - hoppel4579, 2 - ПорреИЗбО, 3 - hoppell74, 4 - hoppell78. Нукле-отиды, совпадающие у разных копий ЫЭ отмечены , делегированные нукдеотиды - 'V, Концевые инвертированные повторы 1В подчеркнул стрелкой. В. рамку заключены нуклеотиды, дуллидировалиые в сайт« интеграции hoppel. Теугольником отмечено место инсерции 112 нукдеотидов в копии hoppel1260. Волнистой линией выделен ARS-консенсус.

\ зоо

1 TAGAATAACA AQATGCGTAA CGCCATACGA TTTTTTGGCA САСЛАТТТТТ TGGCCGTQQC

2 - - a----;-t- ----a—----------------**** *c-t—-—

1 TCTAOAGAUT ШТСАШСТ CTCTCGAATT TTTGTTAGAS AGCGAGAGCB AA0AQCGCTA

2 --------с........coa-- --------------------- --------ge gg--------

l CAœOAACAU еТеугП'САА CGCA^AAAGT CTGATAGCAG ACAACTOTAT STGTGCACAC £ GTATOCTCAT (.ГATI ui'AAA TTTQACAAAA TATGCCCTTC AOCTCAGAAS TTCTTAGACT £ ÎTAAATCTAT ATTATTTTTG ATCAATTGSC ACCATQCGAA AAAÏTCTÎGT TTTGCATTGC 593 £ CTTAACaíTA TTATTATT'J^AAAATAIMÍI AQAAATASC^ AAATCTATST ACATATTATC

1 AOAAAATAAA TTTCAAAAAT ííX'TTTATAT TAGAATATTT GTCATTAGAQ TATTCAICTT

2------------a------- -a--a----* *------------------------GATC-*

3 ---------------- *--------*--------------'

1 GCGGOíiTGTG AAAAATTAAT AAGGCAATGG TTGTTGAGTG CTTGTG*TCC GCAcff&TG

2 .....F------------a----t-------aa----------------с---------

3 ------------- ---------- ---------a---------- ----g--- ----*

jjt ATGACCAAAQ CAAAGAAAC* TAGAATAATT CTACSGTCTT TGATATTAOT

I TTTGCAATAA ACAGTTATCA T|TT£AATTA TTTAGTATAT TTATTAA|TC ATTTGACTTA 896

1 ATATGATGTA ACATTAACAT T&AAGTGTT TCAAAAAAAA AATATTTAG* CTATTAAAAA

g -----o------------g- —**--------------* -----с-* -et------g

3----1----------------------------------* ****—c-t —t—-—-

1 ATTGTCA6AT GAQAGACAAA TTAGAATTAA ACATAAATAT АЛААШШАА ACGGTAGCTA

ATTC**GAGÇ AACAATTTTA ACAAGCAAAI TGCAAAAAGC TTTAAAATTA TAATAGTCAG

----tt---1 ------ ------'---**********

s > ----- ---------------------

1 GGCGCGAATT TTT**AAAAT TTTTTTTT** ^AATT^ÂfВ1 IÍATTGCATS 6AAATTS3CA

2 *y<*r*«t----—t*t—a a—a----** **-t-------------ç.ac--------a4----a-----—*a-----— и-----je cc-E-------------ta-----------

Jj AAAACTACCC TAAtATGTAC CATGTAAATT CGTTTCTTCG ATCAGAATTg ATTTCGGCCC 118?

1 GAAAATCGTG TT*CTAGCAC AACAÇGCACA CTIATACGC^^ÖTCGTCTC TTGTXTTTAC

2---------- —t—с—----£------a--------g--ct-g— с—gcccc-t.

4----------—л-------------------------a_-------------------gr

TCACACAAGC AAGCAAATTA TATTTTTAGG TTTCTTACGC TCTCAGCGGG AGTGAGCG**

c--t--t— l—lg-~gc C--C--C— -c--c--t-g с-------с- **------ag

-----------------------------a---------- ----------------s.Mí

*-*CAAAGAGA GATAATTTTG GCCGÎCACGA AAAAAGTGGC TGCATAGTGC CAAACCAATG ta--------- -c--*.-------------1----------- --------------------

*A-------- ---------------*- ---------- --------a------1—-

Д TATGGCCGTT ACGCATCTTG TTAITCTAGG СТСТТТСВДД/

X-----------i---------------—t--------cVf

выводы

1. Клонировано три фрагмента геномной ДНК Drosophila melanogaster, гибридизующихся in situ с теломерами политенных хромосом, принадлежащих семейству гетерохроматин-теломерных повторов Не-Т. Определена нуклеотидная последовательность этих фрагментов. Дополнотельно секвенированы etsß три фрагмента Не-Т семейства иэ разных областей генома.

2. Анализ нуклеотидных последовательностей шести Не-Т фрагментов показал мозаичную организацию членов этого семейства. Выявлено по крайней мере семь типов (A-G) коротких последовательностей, составляющих в различных комбинациях Не-Т повторы. Постоянным компонентом Не-Т семейства является последовательность В, обнаруженная во всех проанализированных копиях.

3. Последовательности Не-Т, происходящие из У хромосомы (Dnfi65 и ^2), имеют гомологию с геном Stellate, участвующим в регуляции сперматогенеза у самцов дрозофилы. Степень дивергенции в пределах тандемного кластера,иэ У хромосомы не превышает 7%. Копии Не-Т, происходящие из разных частей генома, отличаются друг от друга в пределах 20%.

4. В двух копиях Не-Т семейства выявлен консервативный участок, идентичный НеТ-А боксу, который, согласно гипотезе Бейсмана, участвует в "залечивании" поврежденных концов хромосом.

5. Последовательности Не-Т семейства часто ассоциированы с различными типами мобильных элементов. В составе Не-Т клонов обнаружены ретротранепоаон copia и семейство транспогонов, названное нами iioppel. Подробно охарактеризовано семейство hoppel, для которого характерна предпочтительная локализация в гетерохроматине. Для двух копий hoppel показана интеграция в Не-Т последовательности. >

в. Последовательности КЭ hoppel и Р элемента обладают способностью поддерживать репликацию дрожжевых интегративных плаамид в клетках дрожжей (ARS). Элементы относятся к одному

классу транспозояов с короткими ИП во флангах, для которых не исключается возможность репликативного механизма транспозиции. Возможно ARS активность этих элементов отражает наличие в них функциональных ориджинов репликации.

Список работ, опубликованых по теме диссертации.

1. Danilevskaya 0. N., Kurenova Е. V., Leibovitch В. А. , Shevelyov

A. Ya. , Bass I. А. , Khesin R. В. Telomeres and P-element of Drosophila melanogaster contain sequences that replicate autonomously in Saccharomyces cerevisias. Mol. Gen. Genet. 1984. 197:342-344

2. Данилевская О. E , Куренова E. В., Каверина E. H Лэкализация

в Р-элементе Drosophila melanogaster последовательностей, обеспечивающих автономную репликацию плазмид в дрожках. Мол. генет. .микробиол. и вирусол. 1988. 4:41-44

3. Лейбович Б. А. „• Куренова Е. а , Данилевская О. Е Вариабель-

ность теломерных и ряда внутренних районов хромосом дрозофилы по интенсивности гибридизации in situ с мечеными зонда»,¡и. Цитология и генетика, 1990, 24, N1, 23-28.

4. Данилевская О. R , Куренова Е. Е , Лейбович Б. А., Басс И. А.,

Павлова М.Е Семейство повторяющихся последовательностей генома дрозофилы, имевшее теломерную локализацию: свойства и полиморфизм. Генетика, 1990, 26, N3, 474-484

5. Куренова Е, Е , Лэйбович Е А., Басс И. А., Бебихов Д. Е , Пав-

лова М. К , Данилевская О. Е hoppel - семейство мобильных элементов Drosophila melanogaster, фланкированное короткими инвертированными повторами и имеющее предпочтительную локализацию в гетерохроматиновых областях генома. Генетика, 1990, 26, N10,1701-1712.

6. Danilevskaya O.N., Kurenova £. V., Pavlova M.N.. Bebichov D.

V. .Link A. ,Koga A. ,and Hartl D. L. He-T family DNA sequeces in the Y chromosome of Drosophila melanogaster share homology with the. X-linked Stellate genes. Chromosoma, 1990, 100,118-121.