Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ половых хромосом конопли посевной (Cannabis sativa L.) и родственных видов рода Humulus

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ половых хромосом конопли посевной (Cannabis sativa L.) и родственных видов рода Humulus"

УДК 575.18: 582.635.38

На правах рукописи

РАЗУМОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛОВЫХ ХРОМОСОМ КОНОПЛИ ПОСЕВНОЙ (CANNABISSATIVA L.) И РОДСТВЕННЫХ ВИДОВ РОДА HUMULUS

Специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 НОЯ 2015

Москва 2015

005564324

005564324

Работа выполнена в Центре молекулярной биотехнология Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А.Тимирязева»

Научный руководитель: Михаил Георгиевич Дивашук,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Центра молекулярной биотехнологии ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет -МСХА имени К.А.Тимирязева»

Официальные оппоненты: Бадаева Екатерина Дмитриевна,

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генетических основ идентификации растений, отдел генетики растений, ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Ежова Татьяна Анатольевна,

доктор биологических наук, профессор, профессор на кафедре геиетики биологического факультета, ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Ведущая организация: ФГБНУ «Федеральный исследовательский

центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»

Защита состоится « 16 » декабря 2015 г. в 16-30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 на базе ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева» по адресу: 127550, Москва, ул. Прянишникова, д. 19, тел./факс +7(499) 976-17-14, e-mail: J|siQvet@timaca4ffl

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и на сайте h Up: //www .iimacad.ru/

Автореферат разослан » октября 2015 г.

Ученый секретарь ^^—• х?

диссертационного совета Л.С. Большакова

Общая характеристика работы

Актуальность. Подавляющее большинство видов покрытосеменных растений имеют обоеполые цветки, то есть являются гермафродитами. Однако около 6% покрытосеменных представлены двудомными формами, возникшими неоднократно в процессе эволюции (Dellaporta, 1993; Ming, et al.. 2011; Vyskot and Hobza, 2015). При этом гетероморфные половые хромосомы обнаружены только у 20 видов из 6 неродственных родов (Ming et al., 2011; Renner, 2014).Возникновени'е двудомности само по себе представляет значительный интерес исследователей, поскольку не может быть объяснено только препятствием к аутбридингу, так как для предотвращения самоопыления большинству покрытосеменных растений достаточно различных механизмов самонесовместимости (Charlesworth and Charlesworth, 1978; Charlesvvorth, 1985). Многие двудомные виды обладают экономической значимостью (папайя, актинидия, облепиха, щавель, спаржа, шпинат, хмель и др.).

Виды семейства Cannabaceae обладают разными системами половых хромосом (XX/XY у хмеля обыкновенного и конопли посевной, XX/XY1Y2 у хмеля японского), поэтому представляют собой интересную и удобную модель для изучения эволюции половых хромосом цветковых растений.

Несмотря на богатую историю возделывания, с генетической точки зрения вид Cannabis sativa по-прежнему остается слабо изученным, и на данный момент нет четкого понимания особенностей определения пола. Возникновение моноцийных форм, образование спектра половых типов, отсутствие однозначного представления о вкладе Y-хромосомы в процессы половой детерминации делают исследования хромосом конопли весьма актуальными. Последний детальный кариотип создан японскими учеными в 1998 году (Sakamoto et al., 1998) с применением методов классической цитогенетики. Кариотипов, основанных на современных методах молекулярной цитогенетики, нет. При этом наличие чернового варианта сиквенса генома (Van Bakel et al., 2011) в совокупности с новейшими биоинформатическими подходами открывает широкие возможности для молекулярной цитогенетики. Половые хромосомы хмеля обыкновенного и хмеля японского изучены несколько лучше, есть достоверные кариотипы, созданные с использованием современных методов флуоресцентной in situ гибридизации, идентифицированы и охарактеризованы половые хромосомы (Oivashuk et al., 2011; Alexandrov et al., 2012). Однако сравнительная характеристика половых хромосом видов данного семейства до настоящего времени не проводилась.

Цель работы. Цель данной работы изучить молекулярно-цнтогенетические особенности организации генома Cannabis sativa L., выявить половые хромосомы и провести их сравнительный анализ с половыми хромосомами родственных видов рода Humulus

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести биоииформационный анализ генома конопли посевной (Cannabis sativa L.), выявить высоко копийные тандемноорганизованные последовательности ДНК и провести их клонирование.

2. Методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) локализовать выявленные тандемные повторы, 45 S и 5S рДНК и теломерный повтор на митотических и мейотических хромосомах растений Cannabis sativa. Выявить молекулярно-цитогенетические маркеры для эффективной идентификации половых хромосом (XY).

3. Провести кариотипирование однодомных и двудомных сортов конопли посевной и изучить полиморфизм их кариотипов.

4. Провести молекулярный и молекулярно-цитогенетический анализ однодомных сортов конопли посевной и установить состав половых хромосом.

5. Создать кариотип однодомных и двудомных (мужских и женских) растений Cannabis sativa L.

6. Провести геномную гибридизацию in situ с собственной меченой ДНК (self-GISH) на митотических хромосомах трех видов семейства Cannabaceae (С. sativa, Н. hipulus, Н. japonicus).

7. Провести кросс-GISH эксперименты по гибридизации ДНК родственных видов на митотических хромосомах изучаемых видов. На основе полученных цитогенетических данных установить расположение псевдоаутосомпого региона на Y хромосоме С. sativa, а также оценить его размеры у трех изучаемых видов.

8. Сделать вывод о возможных путях эволюции половых хромосом в семействе Cannabaceae.

Научная новизна. Впервые цитогенетически идентифицирована Y-хромосома у мужских растений Cannabis sativa L. Показано отсутствие Y-хромосомы у однодомных форм. Впервые проведена геномная гибридизация in situ на трех видах семейства Cannabaceae, выявлена преимущественная локализация сигнала на Y-хромосомах. Идентифицирован псевдоаутосомный регион. Составлены идио граммы и кариотипы мужских, женских и однодомных растений конопли. Впервые показана локализация 5S рДНК, 45 S рДНК и теломерного повтора арабидопсис-типа на хромосомах Cannabis sativa L. Выявлен, клонирован и секвенирован хромосом-специфичный прицентромерный повтор Cs-237. Идентифицированы 5 из 10 хромосом гаплоидного набора Cannabis sativa.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты, полученные в данной работе, имеют важное теоретическое значение для фундаментальных исследований по изучению эволюции и возникновения пола в семействе Cannabaceae и у покрытосеменных растений в целом. Важное значение имеют

данные о структурной организации генома конопли посевной, полученные с использованием методов молекулярной цитогенетики. С практической точки зрения, результаты исследований могут быть использованы в селекции и семеноводстве конопли посевной. Даны рекомендации по использованию молекулярного маркера пола MADC2 в семеноводстве при оценке засорения двудомными формами партий семян однодомной конопли. Молекулярно-цитогенетические маркеры позволяют идентифицировать отдельные хромосомы, что важно при молекулярно-генетическом и физическом картировании генома и создании маркеров для использования в селекционной работе.

Методология и методы диссертационного исследовании. Диссертация выполнена с использованием современных, хорошо зарекомендовавших себя методов молекулярной цитогенетики и биоинформатики, па современном оборудовании. Полностью методология и методы исследования отражены в разделе «Материалы и методы».

Положения, выносимые на защиту:

1. Кариотип мужских и женских растений С. sativa, составленный с использованием современных методов молекулярной цитогенетики.

2. Выявленный тандемный повтор Cs-1 (Cs-375) является надежным молекулярно-цитогенетическим маркером Y-хромосомы мужских растений и четвертой пары аутосом С. sativa.

3. Y-хромосома - самая большая по относительному размеру в кариотипе С. sativa, гетерохроматиновая.

4. Псевдоаутосомный регион расположен на коротком плече Y-хромосомы С. sativa.

5. Выявленный тандемный повтор Cs-237 является видоспецифичным, прицентромерным цитогенетическим маркером на хромосому 9 (несущую 45S рДНК) и хромосому 3 Cannabis sativa.

6. В кариотипе Cannabis sativa по 1 сайту гибридизации 45S рДНК (хромосома 9) и 5S рДНК (хромосома 8).

7. Теломерный повтор Cannabis sativa - Arabidopsis-ита и локализуется на всех хромосомах.

8. Растения изученных восьми однодомных сортов конопли отечественной селекции не содержат в кариотипе Y-хромосому.

9. Молекулярный маркер MADC2 (Mandolino et al., 1999) может применяться в селекции и семеноводстве однодомных сортов для их оценки на засорение мужскими генотипами.

10. Геномная гибридизация in situ с использованием в качестве пробы собственной ДНК изучаемых видов (self-GISH) выявляет Y-хромосомы у Humulus htpulus, Humulus japonicus, Cannabis sativa.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты представлены в 16 печатных работах. Из них 4 статьи, опубликованных в журналах

из списка, рекомендуемого ВАК. Основные положения были представлены на различных международных и российских конференциях и симпозиумах, в том числе: на научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии». - Ростов-на Дону, 25-29 марта 2013, XIII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - Москва, 10 апреля 2013 г., 7-ом совещании «Кариология, кариосистематика и молекулярная систематика растений» и симпозиуме, посвященном 135-летию со дня рождения Г.А.Левитского. -28-30 октября 2013 г., г. Санкт-Петербург, I Международной научно-практической конференции Лекарственные растения: биоразнообразие, технологии, применение. - Гродно: ГГАУ,2014. Plant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic era. - 23-24 September 2014 University of Silesia in Katowice, Poland, VI съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированные генетические симпозиумы г. Ростов-на-Дону, 15-20 июня 2014 г, 3-ей Всероссийской научно-практической конференции по геномному секвенированию (NGS-2015, Москва, 2015): а также на ежегодных конференциях аспирантов, молодых ученых и преподавателей РГАУ-МСХА.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие на всех этапах работы. Поиск, клонирование и локализация субтеломерного повтора -совместно с Александровым О.С. под руководством Дивашука М.Г., выделение и анализ хромосом-специфичного повтора Cs-237 - совместно с Александровым О.С., остальные разделы диссертации - полностью самостоятельно. Автор лично проводил обработку, анализ и интерпретацию всех полученных результатов, а также подготовку публикаций и рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 4 в рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста и включают 42 рисунка. 6 таблиц. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Глава 1. Из истории вопроса», «Глава 2. Материалы и методы», «Глава 3. Результаты», «Глава 4. Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы включает 224 источника, из них 197 иностранных.

Содержание диссертации.

ГЛАВА 1. ИЗ ИСТОРИИ ВОПРОСА.

В главе приведен аналитический обзор литературы по изучаемой проблеме. Рассмотрены типы половых систем растений, особенности организации растительных геномов, дана общая характеристика повторяющимся последовательностям ДНК в растительных геномах, их возможная роль, места локализации и участие в формировании половых хромосом растений. Представлены ботаническое описание, таксономическое положение, хозяйственное

значение, а также генетические особенности и определение пола у конопли посевной и родственных видов рода Humulus.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ.

Материалом в данной работе послужили 12 безпаркотических сортов однодомной и двудомной конопли, любезно предоставленные лабораторией селекции и семеноводства конопли Краснодарского Научно-исследовательского института сельского хозяйства имени П.П. Лукьяненко и ГНУ «Чувашский научно-исследовательский институт сельского хозяйства», а также дикорастущие формы хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) местных популяций (г. Москва) и растения хмеля японского (Humulus japonicus Siebold et Zuccarini) сорта Самурай (фирма «Гавршп»), Для изучения мейоза использовались молодые мужские цветки конопли сорта Зеница, любезно предоставленные C.B. Долговым (филиал института биоорганической химии имени академиков M. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН).

Поиск и выделение тандемных повторов. Поиск повторяющихся тандемноорганизованных последовательностей проводили в программе Tandem repeat finder (Benson, 1999). После этого, выявленные программой скэффодды, содержащие тандемноорганизованные последовательности, просматривались и вручную отбирались наиболее перспективные по длине повторы. Далее они проверялись на копийность в геноме в программе BLAST (ht^i№l_ast.ncbi.nlm.nih.cov./Blast.cgi?CMP=\Veb&PAGH TYPE-BlaslHome). Параллельно геном и найденные повторы анализировались в программе RepeatExplorer (Novák et al., 2013) (http:/Avww.repeatexplorer.org/). Праймеры на выбранные повторы подбирали в программе Primer 3.

Клонирование и секвепированнс. Клонирование фрагментов ДНК осуществлялось с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, U.S.A.) в соответствии с инструкцией производителя. Плазмидную ДНК выделяли, используя готовый набор реактивов «The GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas. Canada) согласно прилагаемой инструкции Секвенирование нуклеотидных вставок проводили на ABI3130XL (Applied Biosystems, Inc., USA).

Приготовление препаратов. Цитологические препараты митоза и мейоза готовили методом "Steam drop"' (Kirov et al., 2014) с незначительными модификациями. Семена проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге или в одноразовых пластиковых боксах на вермикулите, при температуре 25°С, до достижения корнем длины 1-2 см., после чего каждому семени присваивали свой индивидуальный номер, корешок отделяли и использовали для приготовления цитологических препаратов, а из оставшегося семени выделяли ДНК, и с помощью молекулярных маркеров, определяли пол растения. Предфиксационную обработку корней проводили в 2 мМ водном растворе 8-гидроксихинолина, в течение четырех часов при температуре 20°С.

Выделение ДНК и определение пола. Для определения пола проростков использовали SCAR-маркеры MADC2, (Mandolino et al, 1999), SCAR 119 и SCAR323 (Torjek et al. (2002)). ДНК выделяли СТАВ-методом. Праймеры сиитезировали в ЗАО Синтол (Москва). ПЦР проводили на амплификаторе Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, США), в реакционной смеси объемом 25 мкл. Условия ПЦР оптимизировали отдельно для каждой пары ираймеров. Визуализацию результатов проводили с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием, с последующей документацией в системе гель-документирования Gel Doc XR Plus (BioRad).

Геномная (GISH) и флуоресцентная (FISH) in situ гибридизация. In situ гибридизация проводилась как описано Karlov et al. (2003), модифицированной для препаратов, приготовленных методом Steam drop.

Кариотипирование. Измерение длин хромосом и построение кариотипов производили с использованием программного обеспечения NickMesuare.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

Анализ генома на наличие высококопинных тандемных повторов.

Геном конопли посевной был проанализирован на наличие высококопийных тандемноорганизованных повторов с использованием программного обеспечения Tándem repeat finder (Benson, 1999) и RepeatExplorer. (Novák Р. et al., 2013) (bttp://w\%Y.ncbi.nlm.nih.gov/igenome/?term=<,annabis%20genonie). Всего нами выделено и проанализировано 10 тандемноорганизованных повторов. На них были подобраны праймеры, продукт амплификации помечен флуоресцентными нуклеотидами и использован в качестве пробы для FISH. Однако локализацию на хромосомах показало только 2 повтора — Cs-1 (Cs-375) и Cs-237.

Выделенный повтор Cs-1 (в базе NCBI JX402748.2) располагался в контиге AGQN01004814, с мономером в 375 п.н., АТ - богатый (64%), Kpnl- типа. По оценке программы RepeatExplorer, в геноме повтор занимает 1,4%, а риды, включающие в себя данную последовательность, кластеризуются в виде плотного кольца, что также подтверждает его тандемную организацию (Рисунок 1).

н

Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймеров на субтеломерный повтор Сэ-1 (Сэ-375) 1,2 - повторность, М - маркер молекулярного веса (а) и графическое представление кластера с субтеломерным повтором Се-! (С8-375) в двухмерном пространстве, полученное в программе Кереа1Ехр1огег (б).

При флуоресцентной гибридизации in situ меченая проба Cs-1 (Cs-375) показала локализацию на хромосомах в субтеломерном регионе (Рисунок 2) Анализ метафазных пластинок растений обоих полов, выявил 1 пару хромосом, несущую сигнал только в субтеломерной области короткого плеча (в кариотипе - четвертая пара). Также отсутствовал сигнал в районе сателлита спутничной хромосомы. Кроме того, у мужских растений выявлялась 1 крупная, непарная хромосома, с сигналом только на коротком плече. Длинное плечо этой хромосомы при окрашивании DAPI имеет яркое свечение, характерное для гетерохроматина, а сама она является самой крупной в кариотипе, что не позволяет спутать ее с четвертой парой хромосом. На метафазных пластинках женских растений этой хромосомы не было, что дает нам основания делать вывод о том, что данная хромосома является специфичной для растений мужского пола Y-хромосомой, а выявленный нами повтор Cs-1 (Cs-375) - цитогенетическим маркером на половую хромосому. X-хромосомы данным маркером выявить не удалось. Для более детального изучения 1 организации половых хромосом, мы провели гибридизацию субтеломерного | повтора на хромосомы мужского растения в стадии диакинеза метафазы 1 мейоза. FISH с меченными зондами повтора Cs-1 выявила 10 бивалентов, распределение сигналов изучаемого повтора не отличалось от описанных в митозе. Половые хромосомы на стадии диакинеза образуют открытый бивалент, соединяясь в области короткого плеча (Рисунок 2а), поэтому мы можем сделать вывод о расположении псевдоаутосомного региона Y-хромосомы в дистальной части эухроматинового (короткого) плеча.

Рисунок 2. FISH локализация повтора Cs-1 (Cs-375) на хромосомах метафазы I мейоза (а), митотических хромосомах мужских (б) и женских (в) растений Cannabis sativa сорта «Зеница». Проба - биотин (красный), контр-окрашивание DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole).

Следующим повтором, показавшим локализацию на хромосомах, был тандемный повтор Cs-237. Анализ последовательностей ДНК, содержащих данный повтор при помощи сервера RepeatExplorer и электрофорез с подобранными праймерами подтвердили его тандемную организацию. ПЦР-продукт с праймеров, меченный биотином или дигоксегинином, гибридизовался на ДНК спутничных хромосом в области вторичной перетяжки и в перицентромерном регионе одной из пар аутосом. Для того чтобы удостовериться, что гибридизация проходила именно с найденным повтором, продукт амплификации был клонирован и секвенирован. Повторная гибридизация пробы, сделанной с клона, подтвердила локализацию данного повтора на одной паре хромосом в перицентромерном регионе и на

Рисунок 3. FISH на митотические хромосомы С. sativa с мечеными зондами повтора Cs-237 (красный). Проба - биотин (красный), контр-окрашивание DAPI

Флуоресцентная гибридизация in situ повторов 45S рДНК и 5S ДНК на хромосомы конопли посевной показало по 1 сайту локализации на хромосоме 9 и 8, соответственно, как в женских, так и в мужских растениях (Рисунок 4, 5).

Рисунок 4. FISH с меченным сигналом 45S рДНК на метафазные хромосомы мужских и женских растений конопли посевной. Проба - дигоксигенин (зеленый), контр-окрашивание DAPI

Мужское растение__Женское растение

Рисунок 5. FISH на метафазных хромосомах женских и мужских растений конопли посевной сорта «Зеница» с использованием меченных сигналов 5S рДНК. Проба - дигоксигенин (зеленый), контр-окрашивание DAPI

Кроме того, мы провели совместную флуоресцентную гибридизацию in situ повтора Cs-237 и 5S рДНК, а также 5S рДНК и субтеломерного повтора. Это позволило нам убедиться, что Cs-237 и 5S рДНК локализуются на разных хромосомах, а значит, могут служить независимыми цитогенетическими маркерами. Аналогично, пара хромосом, несущих субтеломерный сигнал Cs-1 только на одном плече, не является хромосомой Cs-237 и 5S рДНК. Кроме того, мы впервые физически картировали на хромосомах Cannabis sativa теломерный повтор Arabidopsis-типа. Проведенные FISH и выявленные с их помощью цитогенетические маркеры позволили составить и проанализировать кариотип мужских и женских растений конопли посевной, а также создать на его основе идиограмму (Рисунок 5).

а

12 3456 7 8 9 (sat) X Y

6 i« X X i • . - • - »* .* t

1 2 3 4 5 6 7 8 9 (sat) X X

lllllilii||

123456789 XY

Рисунок 5. Кариотипы мужского (а) и женского (б) растений и идиограмма мужских растений. На идиограмме синий цвет - Cs-237, красный - теломерный повтор, зеленый -субтеломерный повтор, желтый - 5S рДНК, фиолетовый - 45S рДНК, темно-серый -гетерохроматиновый участок Y-хромосомы.

Определение хромосомного состава однодомных форм Несмотря на то, что в норме конопля посевная - двудомное растение, в промышленности оказались более востребованы однодомные сорта, что объясняется разновременным созреванием женских и мужских растений и связанными с этим трудностями в агротехнике, в частности, необходимостью ручных прополок. Мы провели флуоресцентную in situ гибридизацию субтеломерного повтора Cs-1 на хромосомах конопли восьми однодомных сортов отечественной селекции, для сравнения использовали два двудомных сорта. Кариотипы двудомных сортов соответствовали кариотипу сорта «Зеница» и имели формулу 2n=l8+XY/XX у мужских и женских растений соответственно. Y хромосомы у однодомных сортов выявлено не было. По некоторым аутосомам наблюдалась вариабельность по наличию/отсутствию и положению сигнала субтеломерного повтора. Всего нами было выделено 10 цитотипов (Таблица 1), при этом внутри однодомных сортов Кубанка, Риге, Диана и Ингреда было выделено 3 цитотипа, а у двудомного сорта Игоркин - 4 (2 у мужских растений, 2 у женских).

Таблица 1. Цитотипы двудомных и однодомных сортов конопли, выявленные FISH с использованием в качестве пробы субтеломерного тандемного повтора Cs-1._

Сорт Пол Цитотип Половые хромосомы Мужской ПЦР бенд Хромосома 2 Хромосома 9 (ядрышко- организующая)

И горюш Мужское 1 XY + 11 »

Женское 2 3 4 XY XX XX + U 11 12 И » Ü

Зеница Мужск. 5 XY + И Ii

Женское 6 XX 11 IS

Мария, Цивильскип скороспелый Однодомн. 6 XX 1S Ii

Гентус Однодомн. 3 XX - ж II

Диана, Риге, Кубанка Однодомн. Однодомн. 7 8 XX XX н к Ii Ii

Однодомн. 3 XX 11 Ii

Марго Однодомн. 3 XX л II

Однодомн. 4 XX и Ii

Однодомн. 9 XX 11 Ii

Ингреда Однодомн. 3 XX И II

Однодомн. 7 XX и Ii

Однодомн. 10 XX II il

Кроме того, растения всех сортов были проверены молекулярными маркерами определения пола MADC2 (Mandolino et al., 1999) и SCAR 323 (Torjék et al., 2002). После проверки все однодомные сорта показали амплификацию по женскому типу. Это послужило поводом предположить возможность использования маркеров пола для анализа партий однодомных семян на засорение мужскими генотипами. При сравнении результатов анализа партий семян однодомных сортов, с известным соотношением полов, с результатами, полученными молекулярным маркированием, была показана эффективность использования молекулярных маркеров для выявления мужских образцов, и высказано предположение о возможности замены грунтового контроля ДНК-маркированием. При этом более удобным нам представляется использование маркера MADC2 в следствие его кодоминантности.

Выявление Y-хромосомы двудомных видов Cannabaceae с использованием геномной in situ гибридизации. Для выявления аккумуляции

повторяющихся элементов на Y-хромосомах, мы провели геномную гибридизацию in situ на митотические хромосомы мужских растений трех родственных видов семейства Cannabaceae (Я. lupulus, Н. japonicus, С. sativa). В качестве пробы использовали меченую дигоксигинином собственную ДНК мужских или женских растений, в качестве блока - ДНК женских растений, в различных соотношениях. GISH с собственной ДНК (Self-GISH) на всех трех видах показала дифференциацию

б в

V \

\ Y2

w * V

ч* 5 И™ { j 5 i»m. Y' ¿Mäf

Рисунок 6. GISH собственной меченой ДНК на хромосомы мужского растения хмеля обыкновенного (а), хмеля японского (б) и конопли посевной (в).

Наиболее четко Y-хромосомы определялись у хмеля японского, при этом различий в интенсивности сигнала между Y1 и Y2 выявлено не было. Эксперимент по изменению соотношения проба : блок показал, что с увеличением концентрации блока, степень дифференциации половых хромосом уменьшается. Наилучшие результаты показала гибридизация с отсутствием блока Использование в качестве пробы меченой ДНК женского растения продемонстрировало аналогичные результаты, как с блоком мужской ДНК, так и без него. Сигнал GISH распространялся на всю длину Y-хромосом у трех видов, за исключением псевдоаутосомного региона (ПАР). Расположение ПАР на конкретных плечах хромосом совпадало с ранее выявленным при FISH- локализации субтеломерного повтора на мейотические биваленты у всех трех видов. Y-хромосомы хмеля японского также хорошо были видны в интерфазных ядрах, в больших гетерохроматиновых областях, что указывает на их компактизацию в ходе клеточного цикла. У конопли и хмеля обыкновенного в интерфазных ядрах такой картины не наблюдалось. Кросс-гибридизация, в которой ДНК-зонды одного вида гибридизовали на хромосомы других видов, показала слабые сигналы только на спутничных хромосомах в регионе 45 S рДНК.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

В ходе наших экспериментов по локализации видоспецифичного субтеломерного повтора на хромосомах конопли посевной, а также с учетом данных, ранее полученных на хмеле обыкновенном (Divashuk et al., 2011) и хмеле японском (Alexandrov et al., 2012) нам удалось получить косвенные доказательства предполагаемых хромосомных перестроек в половых хромосомах этих трех видов.

Создана сравнительная модель половых хромосом семейства Cannabaceae (рисунок 7).

Рисунок 7. Обобщенная структурно-функциональная модель половых хромосом растений семейства Cannabaceae

А - Cannabis sativa, Б - Humulus lupulus (с использованием данных, полученных Дивашуком М.Г. с соавт. (Divashuk et al., 2011) В - H.japonicus (с использованием данных, полученных Александровым с соавт. (Alexandrov et al., 2012). Цветом обозначено: темно-синий - GISH-позитивная область Y-хромосомы, красный - теломерный сигнал арабидопсис-типа, зеленый -субтеломерный сигнал, квадратной скобкой отмечен псевдоаутосомный регион

Данные по ориентации псевдоаутосомных регионов показывают значимость субтеломерных повторов в генезисе половых хромосом. Сравнение локализации блоков рибосомальной 45 S и 5S рДНК в кариотипе обоих видов хмелей и конопли показали различия как в количестве сайтов, так и в их расположении на хромосомах. Результаты, полученные при геномной in situ гибридизации с использованием в качестве зонда собственной ДНК (self-GISH), позволили четко визуализировать Y-хромосомы Cannabis sativa, Н. lupulus и Я. japonicus, что демонстрирует накопление повторяющихся последовательностей в нерекомбинирующих областях Y-хромосом у всех изученных видов. При этом мы можем сделать вывод, что данные группы повторяющихся элементов не являются специфическими для Y-хромосомы, а достаточно широко представлены в геномах обоих полов и должны присутствовать на Х-хромосомах и аутосомах, но со значительно меньшим числом копий. Полученные данные по кросс-локализации self-GISH, распределению сигналов рДНК, размерам геномов и расположению субтеломерных сигналов позволяют сделать вывод о достаточно длительном периоде независимой эволюции половых хромосом в этих трех родственных видах. Сам по себе вопрос о времени происхождения пола и половых хромосом как в семействе Cannabaceae, так и в целом у покрытосеменных остается дискуссионным (Chibalina & Filatov 2011, Filatov, 2015). Основываясь на наших данных и ранних работах других авторов, половые хромосомы изученных на данный момент видов Cannabaceae находятся на поздних стадиях эволюции (в модели Минга (Ming et al., 2011) на четвертой (Cannabis sativa), пятой (Humulus lupulus) и шестой (Humulus japonicus)) Учитывая это, а также возраст расхождения родов Humulus и Cannabis

(около 25 млн. лет назад), половая система Cannabaceae, возможно, является одной из старейших среди изученных половых систем покрытосеменных. Однако, чтобы ответить на вопрос о точном времени возникновения половых хромосом и направления эволюции - происхождение двудомных форм от гермафродитного предка, или же возникновения однодомных видов от первоначально двудомных, как это произошло у рода Vitis и, возможно, наблюдается в роде Cannabis, необходимо расширить список изучаемых видов.

Заключение. Несмотря на теоретическую значимость и возможность прикладного применения в сельском хозяйстве, вопросы детерминации пола у растений остаются не решенными в настоящее время. На многих видах не известны конкретные гены, отвечающие за формирование мужских и женских цветков, не известен механизм определения пола, не ясно, как растения, имеющие в своем кариотипе гетероморфные половые хромосомы, решают проблему компенсации дозы генов. Семейство Cannabaceae является в своем роде уникальным, поскольку его изученные представители обладают различными системами половых хромосом, а сами хромосомы, по-видимому, являются одними из старейших в эволюционном плане. Наличие секвенированных геномов, сельскохозяйственная значимость, в совокупности с полученными в этой работе знаниями о молекулярно-цитогенетической характеристике видов Cannabis sativa, Humulus lupulus и

H. japonicus делают семейство Cannabaceae перспективным модельным объектом для изучения эволюции половых хромосом у покрытосеменных, а синтез молекулярной цитогенетики и геномики, возможно, позволит пролить свет на механизмы детерминации пола растений.

Выводы:

I. Выявлены и клонированы новые тандемно организованные высококопийные видоспецифичные последовательности ДНК конопли посевной: Cs-375 и Cs-237.

2. Методом флуоресцентной гибридизации in situ у конопли посевной выявлена хромосомная локализация повторов Cs-375, Cs-237, 5S рДНК, 45S рДНК и теломерного повтора арабидопсис-типа.

3. FISH с тандемным повтором Cs-237 на митотических и мейотических пахитенных хромосомах показала центромерную локализацию повтора на хромосоме 3 и хромосоме 9 (спутничная), а также сайты ко-локализации с 45S рДНК на хромосоме 9.

4. Идентифицирована хромосома Y в кариотипе мужских растений Cannabis sativa. Показано, что субтеломерный повтор (Cs-375) является эффективным цитогенетическим маркером для ее определения.

5. Выявлены молекулярно-цитогенетические маркеры для 5 из 10 хромосом гаплоидного набора Cannabis sativa. Создан кариотип мужского и женского растений Cannabis sativa.

6. С использованием данных о распределения сигнала self-GISH на Y-хромосоме и анализа бивалентов XY в мейозе установлено, что псевдоаутосомный регион расположен в терминальной области короткого плеча Cannabis sativa.

7. Молекулярный и молекулярно-цитогенетический анализ однодомных сортов конопли посевной показал отсутствие хромосомы Y в их кариотипах, что свидетельствует об XX конституции половых хромосом.

8. Показана высокая эффективность использования ДНК маркера пола MADC2 в семеноводстве однодомных сортов конопли посевной для выявления примесей мужских форм растений и оценки качества семян.

9. Методом геномной гибридизации in situ (Self-GISH) показана возможность визуализации Y-хромосом конопли посевной, и ее ближайших сородичей: хмеля обыкновенного и хмеля японского. Псевдоаутосомные регионы расположены в терминальных областях Y-хромосом у всех трех изучаемых видов и занимают незначительную часть (10-30%) от размера хромосомы.

10. Использование геномной ДНК трех изучаемых видов для кросс-GISH не выявило сигналов на хромосомах, за исключением сайтов эволюционно высоко консервативных 45S рДНК.

11. Полученные данные по распределению сигнала Self-GISH и гетерохроматина на Y-хромосомах трех видов, размерах псевдоаутосомных регионов и результаты кросс-GISH, позволяют сделать вывод о нахождении Y-хромосом Cannabis sativa и видов рода Humulus на поздних этапах эволюции, и указывают на высокую степень дивергенции повторяющейся фракции ДНК их геномов.

Список публикаций по теме диссертации. Статьи в реферируемых журналах:

1. Divashuk, MG Molecular Cytogenetic Characterization of the Dioecious Cannabis sativa with an XY Chromosome Sex Determination System. / MG Divashuk, OS Alexandrov, OV Razumova, IV Kirov, GI Karlov И PLoS ONE, 2014. - 9(1): e85118. doi:10.1371/joumal.pone.0085118

2. Разумова, O.B. Использование полоспецифичных ДНК-маркеров для оценки качества семян однодомных сортов конопли посевной / О.В Разумова, О.С. Александров, Т.И.Сухораца, М.Г. Дивашук, C.B. Долгов, Г.И. Карлов. // Известия ТСХА, 2014,-№ 4,-С. 28-35

3. Yakovin, N Use of laser microdissection for the construction of Humulus japonicus Siebold et Zuccarini, 1846 (Cannabaceae) sex chromosome-specific DNA library and cytogenetics analysis./ N Yakovin, M Divashuk, О Razumova, A Siloviev, G Karlov // Comparative Cytogenetics, 2014 8(4): 323-336. doi: 10.3897/CompCytogen.v8i4.8473

4. Razumova, O.V. Molecular cytogenetic analysis of monoecious hemp (Cannabis sativa L.) cultivars reveals its karyotype variations and sex chromosomes constitution

/Olga V. Razumova, Oleg S. Alexandrov, Mikhail G. Divashuk, Tatiana I. Sukhorada, Gennady I. Karlov//Pro topi asma, 2015 doi 10.1007/s00709-015-0851-0

Тезисы и материалы конференций:

5. Александров, О.С. Сравнительная молекулярно-генетическая характеристика растений семейства Cannabaceae / О.С. Александров, О.В. Разумова, Н.А. Яковин. М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов. // Тезисы докладов научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии». - Ростов-на Дону, 25-29 марта 2013. - 5с,

6. Разумова О.В Использование молекулярно-цитогенетических маркеров для кариотипирования хромосом Cannabis saliva L /О.В. Разумова, О.С. Александров, М.Г. Дивашук, И.В. Киров, Г.И. Карлов// тезисы XIII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - Москва, 10 апреля 2013 г. - с. 46

7. Александров, О.С. Цитогенетический и молекулярный анализ сателлитного повтора ДНК Cs-237 в геномах растений семейства Cannabaceae //Александров О.С., Киров И.В., Разумова О.В., Дивашук М.Г., Карлов Г.И. // Лекарственные растения: биоразнообразие, технологи, применение: сборник научных статей по материалам I Международной научно-практической конференции. — Гродно: ГГАУ.2014. - 276 с.

8. Alexandrov, O.S. Molecular cytogenetic studying of the novel hemp tandem repeat CS-237 that is linked with IGS 18S-26S rDNA/ Oleg Alexandrov, Olga Ra/.umova, Ilva Kirov, Mikhail Divashuk, Gennady Karlov // Plant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic era. - 23-24 September 2014 University of Silesia in Katowice Poland — p. 31

9. Razumova, O.V. GISH painting of the Y chromosomes in dioecious Cannabaceae species /Olga Razumova, Mikhail Divashuk, Oleg Alexandrov, Gennady Karlov. /'/Plant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic era. - 23-24 September 2014 University of Silesia in Katowice Poland. - p.86

10. Разумова, O.B., Александров O.C., Дивашук М.Г., Карлов Г.И. Молекулярно-филогенетический анализ семейства. Cannabaceae с использованием генов rbcL// Материалы VI конференции по кариологии, кариосистематике и молекулярной филогении и II школы-симпозиума молодых ученых, памяти Г.АЛсвитского «Хромосомы и эволюция» . -28-30 октября 2013 г., г. Санкт-Петербург с. 91

11. Karlov, G.I. Molecular cytogenetics (GISH, FISH) of dioecious sea-buckthorn (Hippophae rhamnoides) with XY Chromosome Sex Determination System /Gennady Karlov, Olga Razumova, Oleg Alexandrov, Galina Andreeva, Grigorv Boyko, Mikhail Divashuk/ZPlant molecular cytogenetics in genomic and postgenomic era. -23-24 September 2014 University of Silesia in Katowice Poland. - p.58

12. Карлов Г.И., Молеку лярная цитогенетика в интеграции геномных данных/ Г.И. Карлов, М.Г. Дивашук, О.С. Александрой, О.В. Разумова, Кхуат Тхл Май JI // VI съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и

ассоциированные генетические симпозиумы г. Ростов-на-Дону, 15-20 июня 2014г-с. 130

13. Карлов Г.И. Александров О.С., Дивашук М.Г., Разумова О.В. Двудомные виды семейства Cannabaeeae как модель для изучения половых хромосом растений // Материалы VI конференции по кариологии, кариосистематике и молекулярной филогении и II школы-симпозиума молодых ученых, памяти Г.А.Левитского «Хромосомы и эволюция» . - 28-30 октября 2013 г., г. Санкт-Петербург с. 59

14. Razumova О. Molecular cytogenetic characterization of the dioecious Cannabis saliva with an XY chromosome sex détermination system/ Сборник статей Научная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 170-летию со дня рождения К.А. Тимирязева. Москва, 2013 с. 111 -112

15. Разумова, О.В. Хромосомный состав однодомных форм конопли (Cannabis saliva L.) отечественной селекции. /О.В. Разумова, О.С. Александров, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов. // Сборник материалов конференции молодых учёных и специалистов, посвященной созданию объединенного аграрного вуза в Москве, г. Москва, 3-4 нюня 2014 г., ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А*. Тимирязева, М„ РГАУ-МСХА, 2015 - с. 45-47

16. Киров И.В. Применение NGS данных для разработки молекулярно-цитогенетических маркеров хромосом растений, на примере Allium fistulosum и Cannabis sativa! Киров И.В., Александров О.С., Разумова О.В., Дивашук М.Г., Хрусталем Л.И., Карлов Г.И.// 3-я Всероссийская научно-практическая конференция по геномному секвенированию (NGS-2015), Москва —2015.-с. 14.

Благодарности

Автор выражает огромную признательность своему научному руководителю, Дивашуку Михаилу Георгиевичу. Благодарю всех сотрудников Центра молекулярной биотехнологии, в особенности к.б.н., с.н.с. Олега Сергеевича Александрова за помощь в проведении экспериментов, консультации и научные дискуссии, и к.б.н., с.н.с. Крупина Павла Юрьевича за техническую помощь в оформлении доклада. Выражаю огромную благодарность ученому секретарю диссертационного совета, к.б.н., доценту кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства Большаковой Людмиле Семеновне. Благодарю своих друзей и коллег — к.б.н. Киселеву A.B. и Золотаренко А.Д. за всестороннюю, в первую очередь моральную, поддержку. Автор хотел бы поблагодарить лабораторию селекции и семеноводства конопли Краснодарского Научно-исследовательского института сельского хозяйства имени П.П.Лукьяненко и лично д. с-х. н. Т.И. Сухораду и ГНУ Чувашский научно-исследовательский институт сельского хозяйства и лично Романову И.В., а также д.б.н., Долгова С.В (Филиал института Биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А.

Овчинникова РАН), за предоставленный материал. Большое спасибо к.б.н., доценту кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА Михаилу Юрьевичу Чередниченко за помощь в переводе статей с немецкого языка.

Отдельно хотелось бы поблагодарить своих друзей и близких, а также свою семью — мужа, сына и собаку, за терпение, моральную и материальную поддержку.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 15.10.2015 г. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ 573.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44 тел.: (499) 977-00-12, 977-40-64