Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетическое изучение половых хромосом у видов Humulus Lupulus и Humulus Japonicus

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-цитогенетическое изучение половых хромосом у видов Humulus Lupulus и Humulus Japonicus"

0046 9294

АЛЕКСАНДРОВ Олег Сергеевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПОЛОВЫХ ХРОМОСОМ У ВИДОВ

нимиьиБ ьириьт и нимиьиБ JAPO^'Icus.

Специальность: 03.02.07 - генетика, 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 О ЯНВ 2011

Москва 2010

004619294

Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К. А. Тимирязева

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Г.И. Карлов Кандидат биологических наук М.Г. Дивашук

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Т.А. Ежова Кандидат биологических наук В.В. Соболев

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита состоится «23» декабря 2010 г. в/3" часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 49.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Учёный секретарь Диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение генетических систем детерминации пола у живых организмов пользуется широким интересом как область научного познания (Charlesworth et al., 2005; Ezaz et al., 2006; Smith & Voss, 2007; Jamilena et al., 2008). Часто в качестве объектов таких исследований используют животных, однако, многие факты эволюции систем половых хромосом были установлены благодаря изучению раздельнополых растений.

Одними из популярных растительных объектов с половыми хромосомами являются представители рода Humulus - хмель обыкновенный, используемый человеком в пивоваренной, лекарственной, косметической промышленности, и декоративный хмель японский. Согласно схеме, предложенной Ming et al. (2007), половые хромосомы видов рода Humulus находятся на поздней стадии эволюции половых систем и являются хорошими моделями для изучения этой стадии. Применение современных информативных методов молекулярной биотехнологии и цитогенетики на слабо исследованных в данном плане геномах растений рода Humulus способно внести значительный вклад в теоретическое понимание феномена пола у растений.

Кроме большого теоретического интереса работа по выявлению молекулярных и цитогенетических особенностей хромосом хмеля, как, в частности, маркирование половых хромосом, является актуальной и для селекционной практики. Типовое кариотипирование нормальных растений хмеля с использованием цитогенетических маркеров на половые хромосомы даёт возможность осуществления контроля хромосомного состава полиплоидов и анеуплоидов, а также растений с нарушениями нормального проявления пола. К тому же в связи с трудностью определения пола на ранних стадиях развития растений широкое распространение получило применение полоспецифичных молекулярных маркеров, разработка которых напрямую связана с изучением полоспецифичных регионов половых хромосом. В случае с представителями рода Humulus, особенно с хмелем японским, данное направление разработано слабо.

Характеристика геномов видов хмеля, основанная на молекулярно-цитогенетических аспектах пола, а также создание эффективных полоспецифичных цитогенетических и молекулярных маркеров позволит существенно расширить представление биологической науки об эволюции половых хромосом.

Цель н задачи работы. Провести молекулярно-цитогенетическое изучение половых хромосом у видов Humulus lupulus и Humulus japonicus.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать высококопийные повторяющиеся последовательности геномов хмеля обыкновенного и хмеля японского;

2. Изучить клонированные последовательности с помощью методов биоинформатики;

3. Изучить организацию выделенных последовательностей в геномах хмеля обыкновенного и хмеля японского;

4. Изучить локализацию найденных последовательностей на хромосомах соответствующих видов хмеля;

5. Провести кариотипирование и идентификацию половых хромосом. Выявить локализацию псевдоаутосомного региона на половых хромосомах.

6. Выявить нуклеотидные последовательности, специфичные для Y хромосом изучаемых видов хмеля.

Научная новизна. Результаты по молекулярно-цитогенетическому маркированию половых хромосом Н. lupulus и Н. japonicus с помощью высококопийных последовательностей, специфических для соответствующих геномов, являются оригинальными и обладают научной новизной. Впервые выделены маркерные последовательности хмеля, с помощью которых возможна дифференциация половых хромосом. Впервые показано присутствие субтеломерных повторов в прицентромерном районе короткого плеча X хромосомы хмеля обыкновенного. Впервые использовано маркирование на основе повторяющихся последовательностей при изучении хромосом хмеля в мейозе. Впервые разработан эффективный цитогенетический маркер для чёткого отличия половых хромосом хмеля японского друг от друга.

Разработан эффективный полоспецифичный ISSR-маркер для хмеля японского и расширен сиквенс Y-хромосомспецифичной области хмеля обыкновенного AJ831218.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент отечественного и мирового сельского хозяйства», Москва (2007), Съезде генетиков и селекционеров, посвящённом 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2009), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в развитие инноваций аграрной науки», Москва (2009), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию Академии имени К.А.Тимирязева, Москва (2010), Международной научной конференции «Современная биотехнология сельскохозяйственных растений и биобезопасность», Одесса (2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на

_ страницах машинописного текста и включают_рисунок. Диссертация

состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и

«Список литературы». Список цитируемой литературы включает _

наименований, из них_иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовали следующий растительный материал: мужские и женские растения хмеля обыкновенного местных популяций (г. Москва) и культурных сортов, предоставленных ВНИПТИХ (г. Цивильск, Чувашия); мужские и женские растения хмеля японского сорта Самурай и сорта фирмы Флос.

Выделение ДНК. Выделение ДНК производили из молодых листьев растений согласно методике Bernatsky, Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.

Рестрикицоннын_анализ. Выделение высококогашных

последовательностей генома осуществляли путём проведения рестрикционного анализа тотальной ДНК с рядом эндонуклеаз рестрикции: Alul, Dral, EcoRJ, Hin6I, HincII, HindIII, Kpnl, NotI, PstI, Xmil, Bel, Haelll, Vha464I, BamHI, Ncol, Taql. Условия реакции соответствовали требованиям для оптимальной работы каждой из рестриктаз. Электрофоретическое разделение продуктов осуществляли в 0,7%-ном агарозном геле при напряжении 3 В/см в течение 5 ч.

ПЦР-анализ. Изучение высококопийных последовательнотей осуществляли с использованием оригинальных разработанных праймеров. Разработку полоспецифичного ДНК-маркера для хмеля японского проводили путём эмпирического подбора RAPD- и ISSR-праймеров с использованием в качестве матрицы для ПЦР смеси ДНК отдельно мужских и женских образцов с последующим индивидуальным анализом мужских и женских растений в случае выявления полиморфизма.

AL-PCR. Расширение Y-хромосомспецифичного участка хмеля обыкновенного проводили с использованием техники ПЦР с лигированным адаптером или AL-PCR (adaptor ligation PCR), согласно предложенному алгоритму (Zhang et al., 2001).

Клонирование фрагментов ДНК. Клонирование продуктов рестрикции и ПЦР осуществляли с помощью векторной системы pUC19 и набора pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, U.S.A.) в соответствии с инструкцией фирмы производителя.

Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программного обеспечения

GenDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver. 2.6.002. Copyright © by K. Nicholas); Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.O.; Lasergene ver.7.1, Comprehensive Software for DNA & Protein Sequence Analysis. Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытой базе генетических данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Локализацию высококопийных рестрикционных фрагментов на хромосомах осуществляли согласно методике проведения FISH, оптимизированной для хмеля, по Karlov et al. (2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Изучение сателлитной ДНК растений рода Humulus.

1.1 Выделение высококопийных последовательностей у растений рода Humulus. Одним из распространённых направлений геномных исследований на начальных этапах является изучение повторяющей ДНК. Среди способов выделения специфических единиц повторов часто применяется расщепление тотальной ДНК с помощью ферментов рестрикции.

Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения продуктов рестрикции тотальной ДНК: А) - хмеля обыкновенного (М - мужское растение, Ж - женское растение, 1 - AluI, 2 - Dral, 3 - EcoR, 4 - НЫ61, 5 - Hincll, 6 - Hindlll, 7 - Kpnl 8 - Notl, 9 - Pstl, 10 -Xmil), Б) - хмеля японского (1 - Hindll, 2 - Xbal, 3 - Psil, 4 - Kpnl, 5 - Fael, 6 - Sse9 1,7 -Fbll). Стрелками указаны бэнды ^«/-фрагментов.

В анализе ДНК хмеля обыкновенного использовались эндонуклеазы рестрикции AluI, Dral, EcoRI, Hinól, Hincll, Hindlll, Kpnl, Notl, PstI, Xmil, Bel, HaelII, Vha464I, BamHI, Ncol, Taql. В анализе ДНК хмеля японского - Hindll, Xbal, Psil, Kpnl, Fael, Sse91, Fbll. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции в агарозном геле показало наличие бэндов в случае расщепления рестриктазами EcoRI, Kpnl, НаеШ и Taql, но наиболее отчётливые бэнды,

соответствующие размеру около 380 п.о., наблюдались в варианте с Крп! (рис.1).

Вырезанные из геля Ари/-фрагменты обоих видов хмеля были клонированы в векторе pUC19 и секвенированы, что позволило уточнить их размеры (/^«/-фрагмент Н. lupulus GU831574 - 384 п.о., Н. japonicus GU831573 - 380 п.о.) и провести сравнительный анализ их внутренней структуры.

Как показало выравнивание с помощью программы GenDoc, для исследуемых сиквенсов характерно наличие нескольких общих блоков различной протяжённости, среди которых преобладают АТ-богатые участки (105 - 110; 152 - 157; 166 - 170; 287 - 302). Наиболее протяжёнными общими блоками являются участки 244 - 256 (13 п.о.), 287 - 302 (16 п.о.) и 389 - 6 (12 п.о.). В качестве существенной особенности также стоит отметить присутствие 6-нуклеотидной делеции (135 - 141) у Кри/-фрагмента хмеля японского (рис.2). Сопоставление сиквенсов изучаемых /^«/-фрагментов с помощью BLAST показало Max score = 55.4 при идентичности наиболее схожего участка 73%.

A AT GCTCGAA А А ТТ GA АААТ G А ТТТС GAAAGG

Рис. 2. Сравнение сиквенсов А/да/-фрагментов Н. lupulus и Н. japonicus с помощью программы GenDoc.

Проведённый BLAST-анализ с помощью www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST не выявил достаточно высокого уровня гомологии GU831573 и GU831574 с известными последовательностями других организмов. Было отмечено лишь некоторое сходство небольших участков GU831574 с фрагментом локуса СТ009625.1 Aegilops taushii (Total score = 48,2) и GU831573 с локусом АС214096.1 Populus trichocarpa (Total score = 50,0).

1.2. Дизайн праймеров на основе выделенных выеококолийных последовательностей. Изучение инвертированных повторов. Секвенирование выделенных ^«/-фрагментов GU831573 и GU831574 позволило разработать 3 пары праймеров для выделения пула им подобных /^«/-последовательностей.

Продукты ПЦР с каждой пары праймеров показали при электрофоретическом разделении лестницеообразные структуры (рис.3). Это

косвенно свидетельствует о том, что амплифицируемые Крп1-последовательности представляют собой тандемно повторяющиеся единицы.

Рис. 3. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов: праймер ХО-1 (дорожки 1 -6); праймер ХО-2 (дорожки 7 - 12); праймер XII (дорожки 13 - 18); М - маркер молекулярного веса 100 Ьр.

С целью выявления особенностей организации данных Kpnl-повторов в геноме проводили ПЦР только с одним (каждым из трёх пар) праймером. В данном случае удачная амплификация является признаком присутствия инвертированных участков. Для большинства праймеров были получены паттерны бэндов из совокупности фрагментов широко варьирующей длины, что показывает разнообразие вариантов организации инвертированных локусов.

Пул ПЦР-продуктов с каждой пары праймеров и с одиночных праймеров подвергался лигированшо с вектором pGE.M®-T Easy Vector Systems (Promega, U.S.A.) и клонированию. Анализ сиквенсов клонированных фрагментов позволил установить, что последовательности А^ри/-повторов, выделенных для каждого вида хмеля с помощью ПЦР, имеют между собой лишь небольшие нуклеотидные различия. ПЦР-продукты, полученные с единичных праймеров, представляли собой уникальные участки генома с инвертированными последовательностями.

Межповторный Межповторный Порядковые фрагмент 53 п.о фрагмент 38 и.о.

Единицы прямого повтора

Часть единицы обратного повтора

Часть единицы обратного повтора

Рис. 4. Схема нуклеотидной организации вставки клона ХМ-7-18. Было установлено, что инверсионные события в сателлитной ДНК двух видов хмеля, некоторые результаты которых были проанализированы

благодаря ГПДР с единичными праймерами, сопровождались и другими мутационными явлениями, такими, как делеции и инсерции (рис.4).

1.3. Изучение локализации найденных высоко копийных I последовательностей с помощью FISH. Для определения локализации найденных Kpnl-повторов на хромосомах проводили флюоресцентную in situ I гибридизацию на препаратах митотических хромосом мужского и женского растений хмеля обыкновенного и хмеля японского с зондами 1 последовательностей ДНК GU831574 и GU831573. Детекция сигналов показала, что данные /¡^«/-последовательности представляют собой субтеломерные повторы (рис.5).

Рис.5. Метафазная пластинка митотических хромосом мужского и женского растений хмеля обыкновенного с FISH-сигналом высококопийной последовательности GU831574.

При более подробном изучении метафазных пластинок хмеля обыкновенного были обнаружены хромосомы с сигналом Kpnl-повтора в I прицентромерной области короткого плеча вместо субтеломерного района. Мужские пластинки несли одну такую хромосому, а женские - две. Этот факт свидетельствует о том, что данная хромосома является X хромосомой. К тому же мужские пластинки несли ещё и одну непарную хромосому, самую короткую по абсолютному размеру и не имеющую сигнала на одном из концов j (Y хромосома).

Анализ мейоза хмеля обыкновенного с помощью FISH подтвердил выводы о расположении сигналов Kpnl-повтора GU831574 на половых хромосомах (рис.6).

При рассмотрении открытого бивалента половых хромосом наблюдался сигнал GU831574 в прицентромерной области короткого плеча более длинной хромосомы (X хромосома), подобно митотическим хромосомам, определённым ранее как X хромосомы. Концевая хиазма в половом биваленте, как и ожидалось, образуется между длинными плечами X и Y хромосом, о чём

9

свидетельствует сигнал субтеломерного повотора между ними и отсутствие такового сигнала на противоположном конце У хромосомы.

Рис. 6. FISH с сигналами высококопийной последовательности GU831574 (зелёный) и 45S рДНК (красный) на мейотических хромосомах хмеля обыкновенного на стадии диакинеза (слева). Открытый половой бивалент с сигналами высококопийной последовательности GU831574 (справа).

На рисунке 6 помимо сигналов субтеломерного повтора (зелёный) также хорошо заметна локализация 45S рДНК в дистальной области хромосомы 6. Эта хромосома несёт яркий сигнал 4SS рДНК, что легко отличает её от других хромосом на стадии диакинеза, а также характеризуется преждевременным исчезновением хиазм у плечей с 45 S рДНК и визуализируется как открытый бивалент, напоминающий букву «Y».

Анализ метафазных пластинок хмеля японского выявил различное распределение сигналов Kpnl-повтора GU831573 на половых хромосомах, подобно сигналам GU831574 у хмеля обыкновенного (рис.7).

Согласно данным Soo-Young Kim et al. (2008), половые хромосомы хмеля японского - X, Y| и У2 - являются самыми длинными в наборе и трудноотличимы друг от друга в митозе. Изучение метафазных пластинок мужских растений, содержащих все три половые хромосомы, показало, что одна из них имеет сигналы на обоих концах, другая - только на конце одного из плеч, а третья - вовсе не имеет сигналов. Поскольку женские пластинки несли две длинных хромосомы с сигналом только на одном плече, был сделан вывод о том, что это X хромосомы. Следовательно, оставшиеся хромосомы - с двумя сигналами и без сигналов - являются хромосомами Yi и Y2. Показанное распределение сигналов Крп1-повтора GU831573 на половых хромосомах хмеля японского теоретически подтверждает выводы о том, что средняя хромосома в половом триваленте - это X хромосома.

Хиазма ■Ш Прицентромерный '—^ зИр сигнал -

4» •

■. X ' 4 «

* X ^

' \. , " ■, ■ V V, v o, 2 ь Yj « ♦ »* * »

* \ fef >

* 4 V- * * *

*

Рис.7. Метафазные пластинки митотических хромосом мужского (слева) и женского растений (справа) хмеля японского с FISH-сигналами высококопийной последовательности GU831573.

FISH, проведённая с зондом Kpnl- повтора хмеля обыкновенного GU831574 на препаратах митотических хромосом хмеля японского, не выявила отчётливых сигналов, что свидетельствует о видоспецифичности Kpnl-повторов изучаемых видов хмеля несмотря на существование общих консервативных блоков. Это дает основание говорить о том, что выделенные Kpnl-повторы являются эффективными цитогенетическими маркерами на хромосомы соответствующих видов хмеля, с помощью которых возможна идентификация половых хромосом.

1.4. Кариотипирование. На основании анализа метафазных пластинок было произведено кариотипирование хмеля обыкновенного (рис.8) и хмеля японского (рис.9) с флюоресцентными сигналами соответствующих Kpnl-повторов.

Изучение кариотипов хмеля обыкновенного показало, что первые три пары хромосом как женского, так и мужского растений легко отличаются по абсолютному размеру от остальных и являются метацентрическими. Сигналы высококопийной последовательности, локализованые в субтеломерных районах обоих плеч этих хромосом, примерно одинаковы по интенсивности, за исключением сигнала на коротком плече хромосомы 2. Хромосомы 4, 5, 7 и 9 тоже являются метацентрическими и несут практически не отличающиеся по интенсивности сигналы, отличаясь друг от друга только абсолютным размером. Хромосомы 6 и 8 - субметацентрические, причём хромосома 6 имеет сигнал субтеломерного повтора только на длинном плече. Именно у этой хромосомы было выявлено наличие более тёмных бэндов в субтеломерном регионе короткого плеча при контрокрашивании пропидий-йодидом в процессе FISH. Это связано с локализации в данном регионе повторов 45S рДНК (Karlov et al., 2003).

Рис. В. Кариотипы мужского (вверху) и женского (внизу) растений хмеля обыкновенного.

X хромосома является, как и большинство аутосом, метацентрической, но чётко отличается от них наличием сигнала не в субтеломерном районе короткого плеча, а прицентромерной области. Такое расположение сигналов совпадает с расположением DAPI-бэндов, показанным Karlov et al. (2003). Y хромосома - самая маленькая по абсолютному размеру хромосома мужского кариотипа хмеля. Она несёт только один сигнал в дистальной части длинного плеча, что является чётким цитогенетическим маркером, облегчающим её выявление на препаратах.

Анализ кариотипов хмеля японского показал, что кариотип мужских растений данного вида состоит из 17 хромосом и включает 5 метацентрических (пара 3 и хромосомы X, Y\, Y2), 3 пары субметацентрических (пары 1, 2 и 4) и 3 пары акроцентрических хромосом (пары 5, 6 и 7). Выявленная структура кариотипа вполне согласовывается с данными, полученными при кариотипировании хромосом хмеля японского с зондами повторов 5S и 45S (Soo-Young Kim et al., 2008).

Локализация гибридизационной пробы Крп1-повгора GU831573 на большинстве хромосом была представлена субтеломерным расположением сигналов в дистальных районах обоих плеч, кроме пар хромосом 6, 7, а также X и Y2. Хромосомы 7 и Y2 вовсе не несут сигналов данной пробы. X хромосома несёт один сигнал в дистальном районе длинного плеча, а у хромосомы 6, по наличию сигнала в дистальном районе короткого плеча наблюдается полиморфизм. Вероятно, данный полиморфизм связан с произошедшей когда-то негомологичной рекомбинацией, подобно случаю, описанному Kihara (1929), когда наблюдалось образование цепочки из 3 половых хромосом и пары аутосом.

Половые хромосомы четко отличаются друг от друга по распределению сигналов Kpnl-повтора GU831573. X хромосома несёт сигнал данного повтора

только на длинном плече, У; - на обоих плечах, а У2. - совсем не несёт сигнала, как и было предварительно отмечено при анализе метафазных пластинок.

и..ч и *

1 2 3 4 5 6 7

а)

X V, V

(1-1-1 11.1? 11,12 (|.?5

1} и а ц «м

] 2 3 4 5 6 7

ши»

б)

>3

х х

В)

0,22 0,23 (,,9

да

г)

0,34 „„ 0,42

0,22 0,23 0 19

1 2 3 4 5 6 7 X У,У2

1 234567 XX

рис. 9. Кариотипы и идиограммы мужского (а, в) и женского (б, г) растений хмеля японского с р18н-сигналами повтора вшз 1573. Сверху указаны центромерные индексы.

2. Анализ последовательностей ДНК хмеля обыкновенного и хмеля японского, связанных с полом.

2.1. Расширение полоспецифичной области у хмеля обыкновенного.

Поиск полоспецифичных участков генома хмеля обыкновенного стал весьма актуальной задачей в связи потребностью селекционной практики в молекулярных маркерах, связанных с полом для быстрого скрининга растений на ранних стадиях развития. Эффективные полоспецифичные молекулярные маркеры для определённых групп сортов были созданы РоПеу й а1. (1997), ?аХгзк е1 а1. (2002), БапПоуа & Каг1оу (2006). Однако полоспецифичные регионы представляют также интерес для изучения теоретических основ проявления пола. Секвенирование большого количества полоспецифичных участков необходимо для выявления консервативных последовательностей, связанных с полом и установления принципов организации связанной с полом ДНК.

Эффективное решение вопроса по выявлению новых полоспецифичных регионов на хмеле обыкновенном было осуществлено с помощью метода ПЦР с

лигированным адаптером или AL-PCR (adaptor ligation PCR) при использовании в качестве якорной последовательности фрагмента AJ831218 -одного из У-хромосомспецифичных маркерных локусов. После расщепления тотальной ДНК с помощью рестриктазы BstFnl было произведено лигирование рестрикционных фрагментов с адаптером, согласно Zheng et al. (2001), и проведена ПНР по типовой схеме (рис.10).

область с неизвестном последовательностью нуклеотидов

САЙТ РЕСТРИКЦИИ

ОБЛАСТЬ С ИЗВЕСТНОМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ НУКЛЕОТИДОВ

область с неизвестной последовательностью нуклеотидов

АР2

АР2

АДАПТОР

LB2

Рис. 10. Схема проведения AL-PCR. А - амплификация неизвестной последовательности между правой фланкирующей областью известного сиквеиса и адаптером поэтапно с внешних (RB1 и API) и внутренних (RB2 и АР2) праймеров. В -амплификация неизвестной последовательности между левой фланкирующей областью известного сиквенса и адаптором поэтапно с внешних (LB1 и API) и внутренних (LB2. и АР12) праймеров (по Zhang et al., 2001).

Полученные в результате AL-PCR продукты были клонированы и секвенированы. Контроль достоверности того, что полученные сиквенсы включают фланкирующие последовательности локуса AJ831218, осуществлялся с помощью сравнения в программе GenDoc. После обрезания соответствующих фланкирующих AJ831218 последовательностей было

установлено, что сиквенс данного локуса был расширен на 264 п.о. в сторону 5'-конца и на 102 п.о. - в сторону 3'-конца.

ВЬАВТ-анализ с помощью www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST показал гомологию области 5'-конца расширенного сиквенса к микросателлитному локусу хмеля обыкновенного АУ588386 и к участку полоспецифичной последовательности хмеля японского ЕШ82086, что свидетельствует о существовании консервативных блоков в полоспецифичных последовательностях хмеля обыкновенного и хмеля японского.

2.2. Разработка полоспецифичных молекулярных маркеров на хмеле японском. Крайне слабая изученность генома хмеля японского в молекулярном плане создаёт значительные трудности при изучении механизмов детерминации пола. Так как характеристика связанных с полом участков для слабо изученных геномов с половыми хромосомами является одной из приоритетных задач, были проведёны ЯАРО- и 18811-анализ параллельно в мужской и женской части популяции хмеля японского. На первом этапе в качестве ДНК-матрицы для ПЦР использовалась смесь ДНК всех мужских растений и смесь ДНК всех женских растений популяции. ЯАРВ- и 188К-праймеры, по которым был выявлен полиморфизм, использовали в дальнейшем для анализа индивидуальных растений, чтобы подтвердить связь полиморфных элементов электрофоретического профиля с полом.

М М М М М М Ж Ж Ж Ж М Ж М М М Ж М М М М

щ Щ ф *» «" I* в w» -

„.--.о« «j^.ttTi» - ~ _ _ ^

Рис. 11. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов с ISSR-праймера К-16 у мужских (М) и женских (Ж) образцов хмеля японского. Стрелкой указан бэнд полоспецифичных фрагментов.

Таким образом, из 52 изучаемых молекулярных маркеров было отобрано 7 маркеров, по которым был выявлен полиморфизм. Анализ индвидуальных растений подтвердил высокую эффективность в качестве полоспецифичного только одного ISSR-маркера - К-16. Он показывал стабильную амплификацию бэнда около 300 п.о. у всех мужских образцов по отдельности и отсутствие данного бэнда у всех женских образцов (рис.11).

выводы.

1. Клонированы новые высококопийные повторяющиеся последовательности: Kpnl-повторы хмеля обыкновенного GU831574 длиной 384 п.о. и хмеля японского GU831573 длиной 380 п.о. BLAST-анализ показал, что они не имеют значительного сходства с известными сиквенсами других организмов, однако при сравнении их между собой выявляется несколько небольших консервативных блоков, что косвенно свидетельствует об их общем происхождении.

2. С помощью флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) показана субтеломерная локализация выделенных Kpnl- повторов на хромосомах соответствующих видов хмеля. Крис-кросс гибридизация не выявила подобных сигналов, то подтверждает видоспецифичность данных Крп1-поелоров.

3. Результаты ПЦР-анализа и секвенирования свидетельствуют о тандемной организации выделенных Дри/-фрагментов в блоках сателлитной ДНК (сатДНК) у изучаемых видов хмеля. Однако встречаются и участки сатДНК, включающие инвертированные единицы А"ри/-повторов или части таких единиц и имеющие вставки длиной 38-53 п.о., что указывает на эволюционную пластичность изучаемых повторов.

4. Показана специфическая локализация /¿/«/-повторов на половых хромосомах, что позволяет использовать их как эффективные цитогенетические маркеры при идентификации половых хромосом. X хромосома хмеля обыкновенного имеет характерный прицетромерный сигнал Kpnl-повтора на коротком плече, a Y хромосома имеет сигнал только на конце длинного плеча. X хромосома хмеля японского имеет сигнал А/зи/-повтора только на одном из плеч, Y, - на обоих плечах, a Y2 - не имеет сигналов. Данные факты свидетельствуют об активном участии сатДНК субтеломер в эволюции половых хромосом.

5. С помощью цитогенетичесхого маркирования на основе Kpnl-повтора GU831574 показана ориентация плеч половых хромосом хмеля обыкновенного в биваленте на стадии диакинеза и определено, что псевдоаутосомный регион расположен в терминальной области длинных плеч X и Y хромосом и включает мощный субтеломерный блок GU831574.

6. С помощью AL-PCR (adaptor ligation PCR) расширен сиквенс Y-хромосомспецифического локуса AJ831218 хмеля обыкновенного на 264 п.о. в сторону 5'-конца и на 102 п.о. - в сторону З'-конца. BLAST-анализ показал гомологию области 5'-конца расширенного сиквенса к микросателлитному локусу хмеля обыкновенного AY588386 и к участку полоспецифичной последовательности хмеля японского EU8 82086, что свидетельствует о

существовании консервативных блоков в полоспецифичных последовательностях хмеля обыкновенного и хмеля японского.

7. Скрининг молекулярных маркеров (25 IS SR- и 27 RAPD-маркеров) позволил выявить полоспецифичный ISSR-маркер (К-16) на хмеле японском (длина маркерного бэнда у мужских образцов составила 300 п.о.). Полученные данные подтверждают высокую эффективность применения ISSR для поиска полоспецифичных участков, формирование которых связано с накоплением и распределением повторяющейся ДНК.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Дивашук М.Г., Александров О.С., Карлов Г.И. Клонирование и анализ субтеломерного повтора ДНК хмеля (Humulus lupulus). II Материалы международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент отечественного и мирового сельского хозяйства», 27-28 ноября 2007. М.: ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева.- 2007, С. 163 - 164.

2. Дивашук М.Г., Александров О.С., Карлов Г.И., Клонирование субтеломерной повторяющейся ДНК и её использование для идентификации половых хромосом хмеля обыкновенного и хмеля японского. // Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва. - 2009 -Часть I, С. 219.

3. Александров О.С., Дивашук М.Г. Карлов Г.И. Изучение субтеломерных повторов растений рода Humulus. // Международная научная конференция молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в развитие инноваций аграрной науки». Сборник статей. РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 23-24 апреля 2009 - С. 5-8.

4. Александров О.С. Цитогенетическое маркирование половых хромосом хмеля японского (Humulus japonicus Sieboid & Zucc). II Международная научная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 145-летию Академии имени К.А.Тимирязева, 1-2 июня 2010 -Т.1.-С.З-5.

5. Александров О.С., Дивашук М.Г., Фесенко И.А., Карлов Г.И. Клонирование прилегающих регионов Y-хромосомспецифичной последовательности ДНК хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.). // Известия ТСХА, вып.З, 2010 - С. 5-11.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84'/16 Усл. печ. л. 0,93 Тираж 100 экз. Заказ 620

Издательство РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Александров, Олег Сергеевич

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Системы половых хромосом у растений.

1.1.1. Гомоморфные системы половых хромосом.

1.1.2. Гетероморфные системы половых хромосом.

1.1.2.1. Гетероморфные системы с активной У хромосомой.

1.1.2.2". Гетероморфные системы с Х/А-балансовой детерминацией пола

1.2. Растения рода Натгйт и их системы половых хромосом.

1.2.1. Классификация и ботаническое описание растений рода Нытики.

1.2.2. Изучение половых хромосом растений рода Нити1ш.

1.3. Повторяющиеся последовательности генома и их использование для изучения половых хромосом.

1.3.1. Краткое описание локализации и роли повторяющихся последовательностей в геноме.

1.3.2. Использование повторяющихся последовательностей для изучения хромосом.

1.4. Полоспецифичная ДНК двудомных растений и молекулярное маркирование пола.

1.4.1. КАРО-маркеры в идентификации пола.

1.4.2.188К-маркеры в идентификации пола.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительный материал.

2.2. Выделение ДНК из растительного материала.

2.3. Рестрикицонный анализ.

2.4. ПЦР-анализ.

2.5. АЬ-ПЦР.

2.6. Клонирование фрагментов ДНК.

2.7. Анализ нуклеотидных последовательностей.

2.8. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH).

2.9. Безденатурационная FISH для выявления теломер.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1. Изучение полоспецифичной ДНК хмеля обыкновенного и хмеля японского.

3.1.1. Поиск новых полоспецифичных участков генома у хмеля японского.

3.1.2. Поиск новых полоспецифичных участков генома у хмеля обыкновенного.

3.2. Изучение сателлитной ДНК растений рода Hamulus.

3.2.1 Выделение высококопийных последовательностей у растений рода Humulus.

3.2.2. Подбор праймеров на выделенные высокопийные поледовательности. Изучение инвертированных повторов.

3.2.3. Изучение локализации найденных высококопийных последовательностей с помощью FISH.

3.2.3.1. FISH на митотических хромосомах хмеля обыкновенного.

3.2.3.2. FISH на мейотических хромосомах хмеля обыкновенного.

3.2.3.3. Формирование половых хромосом хмеля обыкновенного в свете результатов локализации повтора GU831574.

3.2.3.4. Обобщённая структурно-функциональная модель половых хромосом хмеля обыкновенного.

3.2.3.5. FISH на митотических хромосомах хмеля японского.

3.2.3.6. Формирование половых хромосом хмеля японского в свете результатов локализации повтора GU831573.

3.2.3.7. Обобщённая структурно-функциональная модель половых хромосом хмеля японского.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-цитогенетическое изучение половых хромосом у видов Humulus Lupulus и Humulus Japonicus"

Изучение молекулярно-биологических основ полового диморфизма живых организмов пользуется широким интересом как область научного познания. Часто объектами такого изучения становятся животные, поскольку большинство из них составляют раздельнополые особи, обладающие системой половых хромосом. В отличие от них значительная часть растительных организмов представлена гермафродитами и не имеет половых хромосом. Однако существует около 4% двудомных растений с различными системами половых хромосом. Многие из этих растений широко распространены и имеют важное хозяйственное значение для человека (хмель, конопля, облепиха, щавель, тополь, актинидия, шпинат, спаржа, гинкго и др.).

Вопросы изучения пола у растений напрямую связаны с выявлением специфических особенностей половых хромосом как морфологических носителей генетических факторов проявления пола. Первые попытки исследований половых хромосом растений были предприняты в начале XX века рядом известных учёных того времени (Winge, 1923;Kihara & Ono, 1923; Hirata, 1924; Winge, 1929; Flory, 1931). В значительной доле случаев изучаемые двудомные растения обладали системой половых хромосом, морфологически отличающихся от аутосом (хмель, конопля, щавель, дрёма белая и др). Однако были и исключения, как, например, шпинат, спаржа и папайя, половые хромосомы которых долгое время не удавалось выявить из-за отсутствия морфологических отличий от аутосом. Для этих растений очень остро стоял вопрос о специфическом маркировании половых хромосом, который в частности для шпината был в последствии успешно решён с помощью методов молекулярной цитогенетики (Lan et al., 2006).

Половые хромосомы хмеля обыкновенного были впервые обнаружены и описаны Winge О., (1923). Он выделил у мужских растений хмеля две половые хромосомы, X и Y, которые морфологически отличаются друг от друга и образуют в диакинезе открытый бивалент. Кроме того, Y хромосома легко различима в кариотипе, поскольку обладает наименьшим абсолютным размером (Shepard et al., 2000; Karlov et al., 2003; Grabowska-Joachimiak, 2006).

Хмель японский, в отличие от обыкновенного, имеет не две, а три половых хромосомы, подобно щавелю (Parker & Clark, 1991). Половые хромосомы хмеля японского - самые большие в кариотипе и обозначаются X, Yi и Y2. В двадцатые годы XX века данная система половых хромосом активно изучалась Кихарой (Kihara & Опо, 1923; Kihara, 1928). Им же впервые были высказаны предположения, что число хромосом, связанных с наследованием пола, не три, а пять (Kihara, 1929).

Несмотря на очевидные морфологические особенности половых хромосом растений рода Humulus, позволяющие без особого труда отличать половые хромосомы от аутосом, важность их молекулярно-цитогенетического маркирования не меньше, чем в случае с маркированием гомоморфных систем половых хромосом шпината, спаржи и папайи. Такие задачи, как чёткое установление ориентации половых хромосом при спаривании в профазе мейоза, кариотипирование спонтанно появляющихся однодомных растений, выявление процессов формирования отличий половых хромосом от аутосом и другие сложно решить без применения надёжных молекулярно-цитогенетических маркеров.

В качестве маркерных последовательностей для изучения хромосом часто применяются высокоповторяющиеся последовательности генома (Sakamoto et al., 1995; Buzek et al., 1997; Scutt et al., 1997; Matsunaga et al., 1999; Shibata et al., 2000; Koo et al., 2004). При их тандемном расположении легко получить качественные сигналы в ходе флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) с соответствующим зондом. Благодаря применению повторов в качестве проб для FISH, были выявлены факты, имеющие большое значение для изучения растений с половыми хромосомами. Например, маркирование плеч половых хромосом у Бйепа 1ай/о11а позволило пересмотреть классическую схему ориентации X и У хромосом в мейозе и установить действительное расположение псевдоатосомного региона на конце короткого плеча X и на конце длинного плеча У хромосомы (\Vestergaard 1940, Lengerova е! а1., 2003). Косвенно об этом свидетельствует и одинаковое соотношение сигналов двух крупных подсемейств сатДНК на этих концах плечей (Кагата е1 а1., 2006). К тому же глубокое изучение субтеломерных повторов у дрёмы белой позволило установить факт ещё неоконченной гомогенизации сателлитной ДНК (сатДНК) в геноме, что более характерное для животных организмов, нежели для растительных.

По праву дрёма белая является одним из самых проработанных растительных модельных объектов с половыми хромосомами. Однако, её У хромосома является активной, то есть несёт некоторые транскрибируемые гены, что выделяет дрёму из ряда растений, обладающих системой половых хромосом. У многих растений, в том числе и у хмеля, У хромосомы является неактивными. Вопрос изученности таких половых хромосом в молекулярно-цитогенетическом плане остаётся на данный момент ещё слабо проработанным, что делает изучение системы ХХ/ХУ хмеля обыкновенного и мультихромосомной ситемы ХХ/ХУ^г хмеля японского в качестве модельных систем, находящихся на поздних этапах эволюции половых хромосом, весьма актуальным.

Цель работы:

Провести молекулярно-цитогенетическое изучение половых хромосом у видов Нити1т Ырикю и Нити1и$ ¡аротст.

Задачи:

1. Выявить нуклеотидные последовательности, специфичные для У хромосом изучаемых видов хмеля.

2. Клонировать высококопийные повторяющиеся последовательности геномов хмеля обыкновенного и хмеля японского;

3. Изучить клонированные последовательности с помощью методов биоинформатики;

4. Изучить организацию выделенных последовательностей в геномах хмеля обыкновенного и хмеля японского;

5. Изучить локализацию найденных последовательностей на хромосомах соответствующих видов хмеля;

6. Провести кариотипирование и идентификацию половых хромосом. Выявить локализацию псевдоаутосомных регионов на половых хромосомах.

Научная новизна:

Результаты по молекулярно-цитогенетическому маркированию половых хромосом Н. 1ири1и8 и Н. ¡аротсиз с помощью высококопийных последовательностей, специфических для соответствующих геномов, являются оригинальными и обладают научной новизной. Впервые выделены маркерные последовательности хмеля, с помощью которых возможна дифференциация половых хромосом. Впервые показано присутствие субтеломерных повторов в прицентромерном районе короткого плеча X хромосомы хмеля обыкновенного. Впервые использовано маркирование на основе повторяющихся последовательностей при изучении хромосом хмеля в мейозе. Впервые разработан эффективный цитогенетический маркер для чёткого отличия половых хромосом хмеля японского друг от друга.

Разработан эффективный полоспецифичный КБИ-маркер для хмеля японского и расширен сиквенс У-хромосомспецифичной области хмеля обыкновенного А.Г831218.

Практическая значимость:

В данной работе показана практическая возможность применения молекулярно-цитогенетического маркирования на основе высококопийных повотрояющихся последовательностей генома для изучения половых хромосом важной сельскохозяйственной культуры - хмеля обыкновенного — и декоративного вида - хмеля японского. Результаты исследований могут найти применение в селекционной практике при цитогенетическом контроле отбираемого материала и имеют значительный интерес для фундаментального изучения пола у растений.

Найденный на хмеле японском полоспецифичный ^БЯ-маркер может использоваться как для научной работы с данным видом (разделение популяции по полу на ранних стадиях развития растений), так и в селекционной практике.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова -фундамент отечественного и мирового сельского хозяйства», Москва (2007), Съезде генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2009), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в развитие инноваций аграрной науки», Москва (2009), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию Академии имени К.А.Тимирязева, Москва (2010), Международной научной конференции «Современная биотехнология сельскохозяйственных растений и биобезопасность», Одесса (2010).

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Александров, Олег Сергеевич

ВЫВОДЫ.

1. Клонированы новые высококопийные повторяющиеся последовательности: /<р«/-повторы хмеля обыкновенного GU831574 длиной 384 п.о. и хмеля японского GU831573 длиной 380 п.о. BLAST-анализ показал, что они не имеют значительного сходства с известными сиквенсами других организмов, однако при сравнении их между собой выявляется несколько небольших консервативных блоков, что косвенно свидетельствует об их общем происхождении.

2. С помощью флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) показана субтеломерная локализация выделенных /^«/-повторов на хромосомах соответствующих видов хмеля. Крис-кросс гибридизация не выявила подобных сигналов, то подтверждает видоспецифичность данных Kpnl- повторов.

3. Результаты ПЦР-анализа и секвенирования свидетельствуют о тандемной организации выделенных ^»«/-фрагментов в блоках сателлитной ДНК (сатДНК) у изучаемых видов хмеля. Однако встречаются и участки сатДНК, включающие инвертированные единицы А^шУ-повторов или части таких единиц и имеющие вставки длиной 38-53 п.о., что указывает на эволюционную пластичность изучаемых повторов.

4. Показана специфическая локализация /^«/-повторов на половых хромосомах, что позволяет использовать их как эффективные цитогенетические маркеры при идентификации половых хромосом. X хромосома хмеля обыкновенного имеет характерный прицетромерный сигнал Kpnl-повтора на коротком плече, a Y хромосома имеет сигнал только на конце длинного плеча. X хромосома хмеля японского имеет сигнал Kpnl-повтора только на одном из плеч, Yi — на обоих плечах, a Y2 - не имеет сигналов. Данные факты свидетельствуют об активном участии сатДНК субтеломер в эволюции половых хромосом.

5. С помощью цитогенетического маркирования на основе Kpnl-повтора GU831574 показана ориентация плеч половых хромосом хмеля обыкновенного в биваленте на стадии диакинеза и определено, что псевдоаутосомный регион расположен в терминальной области длинных плеч X и Y хромосом и включает мощный субтеломерный блок GU831574.

6. С помощью AL-PCR (adaptor ligation PCR) расширен сиквенс Y-хромосомспецифического локуса AJ831218 хмеля обыкновенного на 264 п.о. в сторону 5'-конца и на 102 п.о. - в сторону 3'-конца. BLAST-анализ показал гомологию области 5'-конца расширенного сиквенса к микросателлитному локусу хмеля обыкновенного AY588386 и к участку полоспецифичной последовательности хмеля японского EU882086, что свидетельствует о существовании консервативных блоков в полоспецифичных последовательностях хмеля обыкновенного и хмеля японского.

7. Скрининг молекулярных маркеров (25 ISSR- и 27 RAPD-маркеров) позволил выявить полоспецифичный ISSR-маркер (К-16) на хмеле японском (длина маркерного бэнда у мужских образцов составила 300 п.о.). Полученные данные подтверждают высокую эффективность применения ISSR для поиска полоспецифичных участков, формирование которых связано с накоплением и распределением повторяющейся ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании полученных опытных данных был показан значительный вклад накопления и распределения повторяющейся ДНК в формирование половых хромосом хмеля обыкновенного и хмеля японского. Благодаря специфической локализации повторов на половых хромосомах изучаемых видов хмеля показана возможность использования некоторых А^У-повторов в качестве цитогенетических маркеров для идентификации половых хромосом. Секвенирование данных Крп1-повторов позволило синтезировать оригинальные праймеры, с помощью которых возможно выделение пула подобных Крп1-повторов и изучение инвертированных участков сателлитной ДНК. Данные результаты могут стать основанием для дальнейших работ по установлению организации сателлитной ДНК в геномах хмеля японского и обыкновенного, а также по углублению понимания механизмов формирования половых хромосом, связанных с распределением сателлитной ДНК.

Кроме того, в данной работе показана возможность изучения полоспецифичных локусов с помощью межмикросателлитных молекулярных маркеров (188Я). Расширение найденных с помощью данных маркеров специфичных фрагментов половых хромосом может стать основанием для характеристики более крупных полоспецифичных районов и выявления консервативных последовательностей ДНК, связанных с детерминацией пола.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Александров, Олег Сергеевич, Москва

1. Вершинин А.В. Центромеры и теломеры хромосом // Природа. -2007.-№ 9.-с. 21-27.

2. Зузук Б.М., Куцик Р.В. Хмель вьющийся (син. хмель обыкновенный). Humulus lupulus L. (Аналитический обзор) // Провизор —2004.-с. 13-14.

3. Соболев В.В., Соболева А.Г., Андреева Г.Н., Карлов Г.И., Оценка межвидового и межсортового полиморфизма малины и маркирование признака ремонтантности с использованием ISSR-ПЦР анализа. // Известия ТСХА. 2009. - №. 2 - с. 103-109.

4. Фесенко Игорь Александрович. Организация теломерной ДНК Allium fistulosum L. : Дис. . канд. биол. наук : 03.00.23, 03.00.15 Москва. —2005.- 109 с.

5. Хемлебен В. Сателлитные ДНК / В. Хемлебен, Т.Г. Беридзе, Л.Бахман, Я. Коварик, Р. Торрес. // Успехи биологической химии. 2003. - т. 43-с. 267-306.

6. Хрусталёва Л.И. Молекулярная цитогенетика в селекции растений. //Известия ТСХА. -2007. вып. 1-е. 45-55.

7. Ainsworth C., J. Parker and Buchanan-Wollaston V. Sex determination in plants. // Curr. Top. Dev. Biol. 1998 - V. 38 - pp. 167-223.

8. Ainsworth C. Boys and girls come out to play: the molecular biology of dioecious plants. // Annals of BotanyT 2000. - V. 86 - pp. 211-222.

9. Alstrom-Rapaport C., Lascoux M., Wang Y.C., Roberts G., Tuskan G.A. Identification of a RAPD marker linked to sex determination in the basket willow, Salix viminalis L. // J. Hered. 1998. - V. 89 - pp. 44-49.

10. Anamthawat-Jonsson K., Heslop-Harrison J.S. Isolation and characterization of genome-specific DNA sequences in Triticeae species. // Mol. Gen. Genet. 1993.-V. 240-pp. 151-158.

11. Appels R., Gerlach W.L., Dennis E.S., Swift H. and Peacock W.J. Molecular and chromosomal organization of DNA sequences coding for the ribosomal RNAs in cereals. // Chromosoma. 1980 - V. 78 - pp. 293-311.

12. Atanassov I., Delichere C., Filatov D.A., Charlesworth D., Negrutiu I., Moneger F. Analysis and evolution of two functional Y-linked loci in a plant sex chromosome system. // Molecular Biology and Evolution. 2001. - V. 18 - pp. 2162-2168.

13. Bachtrog D. Protein evolution and codon usage bias on the neo-sex chromosomes of Drosophila miranda. // Genetics. 2003. — V. 165 - pp. 1221— 1232.

14. Banerjee N.S., Manoj P., Das M.R. Male sex associated RAPD markers in Piper longum L. // Current Science. 1999. - V. 77 - pp. 693-695.

15. Barry J.D., Ginger M.L., Burton P., McCulloch R. Why are parasite contingency genes often associated with telomeres? // Int. J. Parasitol. — 2003. V. 33 - pp. 29-45.

16. Baur J.A., Zou Y., Shay J.W., Wright W.E. Telomere position effect in human cells. // Science. 2001. - V. 292 - pp. 2075-2077.

17. Bernatsky R., Tanksley S.D., Toward a saturated linkage map of tomato based on isozymes and random cDNA sequences // Genetics. — 1986. — V. 120-pp. 1095-1103.

18. Blackburn K.B. Sex chromosomes in plants. // Nature. 1923. - V. 112-pp. 687-688.

19. Bode J., Kohwi Y., Dickinson L., Joh T., Klehr D., Mielke C., Kohwi-Shigematsu T. Biological significance of unwinding capability of nuclear matrix-associating DNAs. // Science. 1992. -V. 255(5041) - pp. 195-197.

20. Borst P., Rudenko G., Taylor M.C., Blundell P.A., Van Leeuwen F. et al. Antigenic variation in trypanosomes. // Arch. Med. Res. — 1996. — V. 27 — pp. 379-388.

21. Bridges C.B. Triploid Intersexes in Drosophila melanogaster. II Science. 1921.-V. 54-pp. 252-254.

22. Bull J.J. Evolution of Sex Determining Mechanisms. // Benjamin-Cummings, Menlo Park, CA 1983.

23. Buzek J., Koutnikova H., Houben A., Riha K., Janousek B., Siroky J., Grant S., Yyskot B. Isolation and characterization of X chromosome-derived DNA sequences from a dioecious plant Melandrium album. II Chromosome Res. 1997. -V. 5(1)-pp. 57-65.

24. Cafasso D., Cozzolino S., Chinali G., De Luca P. An unusual satellite DNA from Zamia paucijuga (Cvcadales) characterised by two different organisations of the repetitive unit in the plant genome. // Gene. 2003. - V. 311 -pp. 69-77.

25. Carlos S., Carbonelli, Alejo M., Ronderosia ommexechoides: a New Species of Brazilian Dichroplini (Orthoptera: Acrididae, Melanoplinae). // Neotropical Entomology 2006. - V. 35(5) - pp. 632-637.

26. Charlesworth B., Sniegowski P., Stephan W. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. // Nature. 1994. - V. 371 - pp. 215220.

27. Charlesworth B. The evolution of chromosomal sex determination and dosage compensation. // Current Biology. 1996. — V.6 — pp. 149-162.

28. Charlesworth B. & Charlesworth D. The degeneration of Y chromosomes. // Philosophical Transactions of the Royal Society of London, B, Biological Sciences. -2000. -V. 355 pp. 1563-1572.

29. Charlesworth D., Charlesworth B., Marais G. Steps in the evolution of heteromorphic sex chromosomes. // Heredity 2005. — V. 95 - pp. 118-128.

30. Chaves-Bedoya G., Nunenz V. A SCAR marker for the sex types determination in Colombian genotypes of Carica papaya. II Euphytica. — 2007. — V. 153-pp. 215-220.

31. Chen G., Wang Y., Zhao C., Korpelainen H., Li C. Genetic diversity of Hippophae rhamnoides populations at varying altitudes in the wolong natural reserve of China as revealed by ISSR. // Silvae Genet. 2008. - V. 57 - pp. 29-36.

32. Chiu C.-T. Study on sex inheritance and horticultural characteristics of hermaphrodite papaya. // MS thesis, National Pingtung University of Science and Technology, Pingtung, Republic of China. 2000.

33. Corriols L., Doré C., Cassini R., Asparagus breeding: national French work. // Asparagus Res. Newsletter. 1983. - V. 1 - pp. 12.

34. Corriols L. Are asparagus all-male hybrids attractive? // Asparagus Res. Newsletter. 1984. - V. 2 - pp. 16-19.

35. Cuadrado A., Golczyk H., Jouve N. A novel, simple and rappid nondenaturing FISH technique for the detection of plant telomeres. Potential used and possible target structures detected. // Chromosom. Res. — 2009. 17- pp. 755762.

36. Danilova T.V., Karlov G.I., Application of inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism for detection of sex-specific molecular markers in hop (Hamulus lupulus L.) // Euphytica. 2006 - V. 151 - pp. 15-21.

37. Darlington C.D. Recent Advances in Cytology. // London: Churchill. 1932.

38. Delichere C., Veuskens J., Hernould M., Barbacar N., Mouras A., Negrutiu I., Moneger F. SIY1, the first active gene cloned from a plant Y chromosome, encodes a WD-repeat protein. // EMBO Journal. — 1999. V. 18-pp. 4169-4179.

39. De Melo N.F., Guerra M. Variability of the 5 S and 45 S rDNA sites in Passiflora L. species with distinct base chromosome numbers. // Ann. Bot. — 2003. -V. 92-pp. 309-316.

40. Diaz M.O., Saez F.A. DNA synthesis in the neo-X neo-Y sex determination system of Dichroplus bergi (Orthoptera-Acrididae). // Chromosoma (Berl.). 1968. - V. 24 - pp. 10-16.

41. Dickinson L.A., Joh T., Kohwi Y., Kohwi-Shigematsu T. A tissue-specific MAR/SAR DNA-binding protein with unusual binding site recognition. // Cell. 1992 - V. 70(4) - pp. 631-645.

42. Doré C, Androgenése in vitro par culture d'anthères d'Asparagus officinalis. Il État actuel des recherches. l'Asperge, Versailles. 1973. - pp. 155— 162.

43. Ehsanpour A.A., Tavasoli M., Arab L. Sex determination of Pistacia vera L. using ISSR markers. Il Malaysian Applied Biology. 2008. - V. 37(2) -pp. 25-28.

44. Elder J.F. & Turner B.J. Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes. // Quart. Rev. Biol. 1995. - V. 70 - pp. 297-320.

45. Falavigna A. Pure lines of A. officinalis obtained by in vitro anther culture in Italy. // Proc. 5th Int. Asparagus Symp., Geisenheim. 1979. - pp. 91— 99.

46. Falavigna A., Casali P.E., Taccomi M.G. Potential of in vitro anther culture technique for asparagus. // Acta Hortic. 1990. - V. 271 - pp. 39-46.

47. Falavigna A., Casali P.E., Taccomi M.G. Advances in asparagus breeding following in vitro anther culture. // Acta Hortic. 1996. - V. 415 - pp. 137-142.

48. Fang D.Q., Krueger R.R., Roose M.L. Phylogenese relationships among selected citrus germplasin accessions revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. // J. Am. Soc. Hort. Sei. 1998. - V. 123(4) - pp. 612-617.

49. Fann J.Y., Kovarik A., Hemleben V., Tsirekidze N.I., Beridze T.G. // Theor. Appl. Genetics. -2001.-V. 103 pp. 1068-1073.

50. Farbos 1., Veuskens J., Vyskot B., Oliveira M., Hinnisdaels S., Aghmir A., Mouras A., Negrutiu I. Sexual dimorphism in white campion: deletion on the Y chromosome results in a floral asexual phenotype. // Genetics. — 1999. — V. 151 pp. 1187-1196.

51. Filatov D.A. Substitution rates in a new Silene latifolia sexlinked gene, SlssX/Y. II Molecular Biology and Evolution. 2005a. - V. 22 - pp. 402408.

52. Filatov D.A. Evolutionary history of Silene latifolia sex chromosomes revealed by genetic mapping of four genes. // Genetics. 2005b. - V. 170 - pp. 975-979.

53. Flory W.S. Genetic and cytological investigations on Asparagus officinalis L. II Genet. Princeton. 1932. - V. 17 - pp. 432-467.

54. Frankel R. & GALUN E. Pollination mechanisms, reproduction and plant breeding. // Springer-Verlag, Berlin, Germany. 1977. - pp. 141-157.

55. Gangopadhyay G., Roy S.K., Ghose K., Poddar R., Bandyopadhyay T., Basu D., Mukherjee K.K. Sex detection of Carica papaya and Cycas circinalis in pre-flowering stage by ISSR and RAPD. // Curr. Sci. 2007. - V. 92 - pp. 524526.

56. Gao W.J., Sun F.C., Yin W.Zh., J1 Y.K., Deng Ch.L., Lu L.D., Clone and Development of ISSR and SCAR Markers Linked to Male Humulus scandens L. // Journal of Molecular Cell Biology. 2009. - Zl.

57. Garcia-Cao M., O'Sullivan R., Peters A.H., Jenuwein T., Blasco M. A., Epigenetic regulation of telomere length in mammalian cells by the Suv39hl and Suv39h2 histone methyltransferases. II Nat. Genet. 2004. - V. 36 - pp. 94— 99.

58. Gasser S.M., Laemmli U.K. The organisation of chromatin loops: characterization of a scaffold attachment site. // EMBO J. 1986. - V. 5(3) - pp. 511-518.

59. Gebler P., Wolko L., Miko K. Identification of molecular markers for selection of supermale (YY) asparagus plants. // Journal of Applied Genetic. -2007.-V. 48(2)-pp. 129-131.

60. Gill G.P., Harvey C.F., Gardner R.C., Fraser L.G. Development of sex-linked PCR markers for gender identification in Actinidia. // Theor. Appl. Genet. 1998. - V. 97 - pp. 439-445.

61. Gottching D. E., Aparicio O. M., Billington B. L., Zakian V. A. Position effect at Saccharomyces cerevisiae telomeres: reversible repression ofpol //transcription. // Cell. 1990. - V. 63 - p. 751.

62. Grabowska-Joachimiak A., Sliwinska E., Pigula M., Skomra U., Joachimiak A.J. Genome size in Humulus lupulus L. and H. japonicus Siebold & Zucc. (Cannabaceae). // Acta Societatis Botanicorum Poloniae. — 2006. — V. 75 -pp. 207-214.

63. Grabowska-Joachimiak A., Mosiolek M., Lech A., Gyralski G. C-Banding/DAPI and in situ Hybridization Reflect Karyotype Structure and Sex Chromosome Differentiation in Humulus japonicus Siebold & Zucc. // Cytogenet. Genome Res. DOI: 10.1159/000321584.

64. Grant S., Houben A., Vyskot B., Siroky J., Pan W.H., Macas J. et al. Genetics of sex determination in flowering plants. // Devel. Genet. 1994. - V. 15 -pp. 214-230.

65. Gupta M., Chyi Y-S., Romero-Sever son J., Owen J.L. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. // Theoretical and Applied Genetics 1994. - V. 89 - pp. 998-1006.

66. Guttman D.S. & Charsworth D. An X-linked gene with a degenerate Y-linked homologue in a dioecious plant. // Nature. 1998. - V. 393 - pp. 263266.

67. Haupt G. Beitrage zur Zytologie der Gattung Marchantía (L.). //1. Z. indukt. Abst. Vererbungslehre. 1932. - V. 62 - pp. 367-428.

68. Heikkinen E., Launonen V., Muller E., Bachmann L. The pvB370 BamHI satellite DNA family of the Drosophila virilis group and its evolutionary relation to mobile dispersed genetic pDv elements. // J. Mol. Evol. 1995. - V. 41 -pp. 604-614.

69. Heslop-Harrison J.S., Comparative genome organization in plants: from sequence and markers to chromatin and chromosomes // Plant Cell. 2000. -V. 12-pp. 617-635.

70. Hirata K. Sex reversal in hemp. // Journal of the Society of Agriculture and Forestry. 1924. - V. 16 - pp. 145-168.

71. Hofmeyr J.D.J. Genetical studies of Carica papaya L. // South Africa Department of Agricultural Science Bulletin. 1938. — V. 187 - p. 64.

72. Hofmeyr J.D.J. Sex reversal in Carica papaya L. // South Africa Journal of Science. 1939. - V. 26 - pp. 286-287.

73. Hofmeyr J.D.J. Some genetic and breeding aspects of Carica papaya. II Agronomía Tropical. 1967. - V. 17 - pp. 345-351.

74. Hormaza J.I., Dollo L., Polito V.S. Identification of a RAPD marker linked to sex determination in Pistacia vera using bulked segregant analysis. II Theor. Appl. Genet. 1994. - V. 89(1) - pp. 9-13.

75. Horovitz S. & Jimenez H. Cruzamientos interespecificos e intergenericos en caricaceas y sus implicaciones fitotecnicas. // Agronomía Tropical. 1967. - V. 17 - pp. 323-343.

76. Hough J.S., Briggs D.E., Stevens R., Young T.W. In Malting and Brewing Science. II Chapman and Hall, London. — 1982. — V. 2.

77. Howell E.C., Armstrong S.J., Filatov D.A. Evolution of Neo-Sex Chromosomes in Silene diclinis. II Genetics. 2009. - V. 182(4) - pp. 1109-1115.

78. Irifune K., Hirai K., Zheng J., Tanaka R., Morikawa H. Nucleotide sequences of a highly repeated DNA sequences and its chromosomal localization in Allium fistulosum. II Theor. Appl. Genet. 1995. - V. 90 - p. 312.

79. Irzikovska L., Wolko B., Swicicki W.K. The genetic linkage map of pea (Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers. // II Pisum Genetics. 2001. - V. 33.N.1. - p. 13.

80. Jaarola M.,. Martin R.H., Ashley T. Direct evidence for suppression of recombination within two pericentric inversions in humans: a new sperm-FISH technique. // American Journal of Human Genetics. 1998. - V. 63 - pp. 218-224.

81. Jablonka E. & Lamb M.J. The evolution of heteromorphic sex chromosomes. // Biological Review of the Cambridge Philosophical Society. — 1990 V. 65-pp. 249-276.

82. Jacobsen P. The sex chromosomes in Humulus. II Hereditas. 1957. -V.43- pp. 357-370.

83. Jakse J., Stajner N., Kozjak P., Cerenak A., Javornik B.: Trinucleotide microsatellite repeat is tightly linked to male sex in hop {Humulus lupulus L.). //Mol. Breeding. 2008. - V. 21 - pp. 139-148.

84. Jamsari A., Nitz I., Reamon-Buttner S.M., Jung C. BAC-derived diagnostic markers for sex determination in asparagus. // Theoretical Applied Genetics. 2004. - V. 108 - pp. 1140-1146.

85. Jiang L., You R.L., Li M.X., Shi C. Identification of a sex associated RAPD marker in Ginkgo biloba II Acta Botanica Sinica. 2003. - V. 45 - pp. 742-747.

86. Jiang J.B. & Gill B.S. Non-isotopic in situ hybridization and plant genome mapping: the first 10 years. // Genome. — 1994. — V. 37 pp. 717-725.

87. ICafkas S., Ozkan H., Ak B.E., Acar I., Atli H.S., Koyuncu S. Detecting DNA polymorphism and genetic diversity in a wide pistachiogermplasm: comparison of AFLP, ISSR, and RAPD markers. // J. Am. Soc. Hortic. Sei. -2006. V. 131 - pp. 522-529.

88. Karlov G.I., Danilova T.V., Horlemann C., Weber G., Molecular cytogenetic in hop (Humulus lupulus L.) and identification of sex chromosomes by DAPI-banding. // Euphytica. 2003. - V. 132 - pp. 185-190.

89. Kazama Y., Sugiyama R., Matsunaga S., Shibata F., Uchida Y., Hizume M., et al. Organization of the Kpnl family of chromosomal distal-end satellite DNA in Silene latifolia. II J. Plant Res. 2003. - V. 116 - pp. 317-326.

90. Kazama Y., Sugiyama R., Suto Y., Uchida W., Kawano S. The clustering of four subfamilies of satellite DNA at individual chromosome ends in Silene latifolia // Genome. 2006. - V. 49 - pp. 520-530.

91. Kejnovsky E., Hobza R., Cermak T., Kubat Z., Vyskot B., The role of repetitive DNA in structure and evolution of sex chromosomes in plants. // Heredity.-2009.-V. 102-pp. 533-541.

92. King K., Jobst J., Hemleben V. Differential homogenization and amplification of two satellite DNAs in the genus Cucurbita (Cucurbitaceae). II J. Mol. Evol. 1995 - V. 41(6) - pp. 996-1005.

93. Kihara H. & ONO T. Cytological studies on Rumex L. // Botanical Magazine. 1923. - V. 37 - pp. 84-90.

94. Kihara H. On the chromosomes of Humulus japonicus. II The Bot. Magazine. 1928. -V. 496 - pp. 237-238.

95. Koo D.H., Hur Y.K., Bang J.W. Variability of rDNA loci in dioecious Rumex acetosa L. detected by fluorescence in situ hybridization. // Korean J. Genetics. 2004. 26 - pp. 9-13.

96. Koukalova B., Reich J., Matyasek R., Kuhrova V., Bezdek M. A BamHI family of highly repeated DNA sequences of Nicotiana tabacurn. II Theor. appl. Genet. 1989. - V. 78 - pp. 77-80.

97. Kumar L.S.S., Abraham A., Srinivasan V.K. The cytology of Carica papaya Linn. I I Indian Journal of Agricultural Sciences. 1945. - V. 15 - pp. 242253.

98. Laemmli U.K., Käs E., Poljak L., Adachi Y. Scaffold-associated regions: cis-acting determinants of. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1992. - V. 2(2) -pp. 275-285.

99. Lahn B.T. & Page D.C. Four evolutionary strata on the human X chromosome. // Science. 1999. - V. 286 - pp. 964-967.

100. Lan T., Liu B., Dong F., Chen R., Li X., CHEN Ch. Multicolor FISH analysis of rDNA and telomere on spinach // Front. Agric. China. 2008. - V. 2(3) -pp. 314-316.

101. Lardon A., Aghmir A., Georgiev S., Moneger F., Negrutiu I. The Y chromosome of white campion: sexual dimorphism and beyond. In C. C. Ainsworth ed., Sex determination in plants. // BIOS Scientific Publishers, Oxford. UK. 1999. - pp. 89-99.

102. Lengerova M., Moore R.C., Grant S.R., Vyskot B. Sex chromosomes of Silene latifolia revisited and revised // Genetics. 2003. - V. 165 - pp. 935— 938.

103. Lengerova M., Vyskot B. Sex chromatin and nucleolar analyses in Rumex acetosa L. // Protoplasma. 2001. - V. 217 - pp. 147-153.

104. Lindsay, Ruth H., The chromosomes of some dioecious angiosperms. // Amer. J. Bot.-1930.-V. 17-pp. 152-174.

105. Lorbeer G. Die Zytologie der Lebermoose mit besonderer Berucksichtingung allgemeiner. // Chromosomenfragen. Jahrb. Wiss. Bot. 1934. -V. 80-pp. 567-817.

106. Loptien H. Identification of the sex chromosome pair in asparagus {Asparagus officinalis L.). // Zeitschrift fur Pflanzenzuchtung. — 1979. V. 82 — pp. 162-173.

107. Louis E.J., Vershinin A.V. Chromosome ends: different sequences may provide conserved functions. // BioEssays 2005. - V. 27(7) - pp. 685-697.

108. Lundblad V. & Blackburn E.H. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues esz*i-senescence. // Cell. —1993. V. 73 - pp. 347— 360.

109. Ma H., Moore P.H., Liu Z., Kim M.S., Yu Q., Fitch M.M., Sekioka T., Paterson A.H., Ming R. High-density linkage mapping revealed suppression of recombination at the sex determination locus in papaya. // Genetics. — 2004. — V. 166 -pp. 419-436.

110. Mantovani M., Abel L.D.S., Moreira-Filho O. Conserved 5S and variable 45 S rDNA chromosomal localisation revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). // Genetica. 2005. — V. 123 - pp. 211-216.

111. Markova M., Lengerova M., Zluvova J., Janousek B., Vyskot B. Karyological analysis of an interspecific hybrid between the dioecious Silene latifolia and the hermaphroditic Silene viscosa. II Genome. — 2006. V. 49 - pp. 373-379.

112. Marks M. A reconsideration of the genetic mechanism for sex determination in Asparagus officinalis. Proceedings of the EUCARPIA meeting on asparagus (Asparagus officinalis L.). // Versailles, EUCAPRIA, Wageningen, Netherlands. 1973. - pp. 123-128.

113. Matsunaga S., Kawano S., Michimoto T. Semiautomatic laser beam microdissection of the Y chromosome and analysis of Y chromosome DNA in a dioecious plant Silene latifolia. II Plant Cell physiol. — 1999. V. 40 - pp. 60-68.

114. Matsunaga S., Yagisawa F., Yamamoto M., Uchida W., Nakao S., Kawano S. LTR retrotransposons in the dioecious plant Silene latifolia. II Genome. 2002. - V.45 - pp. 745-751.

115. Miller J.T., Dong F., Jackson S.A., Song J., Jiang J. Retrotransposon-related DNA sequences in the centromeres of grass chromosomes. // Genetics. — 1998.-V. 150-pp. 1615-1623.

116. Ming R., Wang J., Moore P.H., Paterson A.H. Sex chromosomes in flowering plants. // Am. J. Bot. 2007. - V. 94 - pp. 141-150.

117. Min-Syang Chen, Tzay-Fa Sheen. Cytogenetic studies on Asparagus officinalis. // Contribution № 1030 From the Taiwan Agricultural Research Institute. 1982 - pp. 52-59.

118. Mosiolek M., Pasierbek P., Malarz J., Mos M., Joachimiak A.J: Rumex acetosa Y chromosomes: constitutive or facultative heterochromatin? // Folia Histochem. Cytobiol. 2005. - V. 43 - pp. 161-167.

119. Nagaki K., Tsujimoto H., Isono K., Sasakuma T. Molecular characterization of a tandem repeat, A/a family, and distribution among Triticeae. II Genome. 1995. - V. 38 - pp. 479-486.

120. Neve R.A. Sex chromosomes in the hop Humulus lupulus. II Nature. -1958.-V. 181-pp. 1084-1085.

121. Neve R.A. Hops. II Chapman and Hall, London. 1991.

122. Nève G., Meglécz E. Microsatellite frequencies in different taxa. // Trends. Ecol. Evol. 2000. 15 - pp. 376-377.

123. Noronha R.C.R., Nagamachi C.Y., O'Brien P.C.M., Ferguson-Smith M.A., Pieczarka J.C. Neo-XY body: an analysis of XYiY2 meiotic behavior in CaroUia (Chiroptera, Phyllostomidae) by chromosome painting. // Cytogenet Genome Res. 2009. - V. 124 - pp. 37-43.

124. Ono T. Chromosomen und Sexualität von Rumex acetosa. // Science. — 1935.-V. 10-pp. 41-210.

125. Ono T. On sex-chromosomes in wild hops. // Botanical Magazine. -1937.-V. 51 -pp. 110-115.

126. Ono T., Studies in hop. I. Chromosomes of common hop and its relatives. // Bull. Brew. Sei. 1955. - V. 2 - pp. 1-65.

127. Parker J.S. Sex chromosomes and sexual differentiation in flowering plants. // Chromosomes Today. -1990. V. 10 - pp. 187-198.

128. Parker J.S. & Clark M.S. Dosage sex-chromosome systems in plants. // Plant Science. 1991. - V. 80 - pp. 79-92.

129. Patzak J., Vrba L., Matousek J. New STS molecular markers for assessment of genetic diversity and DNA fingerprinting in hop {Humulus lupulus L.). // Genome. 2007. - V. 50 - pp. 15-25.

130. Pestsova E.G., Goncharov N.P., Salina E.A., Elimination of a Tandem Repeat of Telomeric Heterochromatin during the Evolution of Wheat. // Theor. Appl. Genet. 1998, - V. 97(8) - pp. 1380-1386.

131. Polley A., Seigner E., Ganal M.W: Identification of sex in hop {Humulus lupulus) using molecular markers. // Genome. —1997. — V. 40 — pp. 357— 361.

132. Prakash S., Van Staden J. Sex identification in Encephalartos natalensis (Dyer and Verdoorn) using RAPD markers. // Euphytica. 2006. - V. 152-pp. 197-200.

133. Qiu Y.-L., Palmer J.D. Phylogeny of early land plants: insights from genes and genomes. // Trends Plant Sei. 1999. - V. 4 — pp. 26-30.

134. Rayburn A.L., Gill B.S. Use of biotin-labeled probes to map specific DNA sequences on wheat chromosomes. // J. Hered. 1985. — V. 76 - pp. 76-81.

135. Reamon-Buttner S.M., Jung C. AFLP-derived STS markers for the identification of sex in Asparagus officinalis L. 11 Theor. Appl. Genet. 2000. - V. 100-pp. 432-438.

136. Richards E.J., Ausubel F.M. Isolation of a higher eucariotic telomere from Arabidopsis thaliane II Cell. 1988. - V. 53 - pp. 127.

137. Rollini P., Fournier R.E.K. The HNF-4/HNF-la transactivation cascade regulates gene activity and chromatin structure of the human serine protease inhibitor gene cluster at 14q32.1 // PNAS. 1999. - V. 96(18) - pp. 10308-10313.

138. Ruiz Rejón C., Jamilena M., Garrido-Ramos M.A., Parker J.S., Ruiz Rejón M. Cytogenetic and molecular analysis of the multiple sex chromosome system of Rumex acetosa. ¡I Heredity. — 1994. V. 72 - pp. 209-215.

139. Sakamoto K., Shimomura K., Komeda Y., Kamada H., Satoh S. A male-associated DNA sequence in a dioecious plant, Cannabis sativa L. // Plant Cell Physiol. 1995. - V. 36 - pp. 1549-1554.

140. Sakamoto K., Abe T., Matsuyama T., Yoshida S., Ohmido N., Fukui K., Satoh S. RAPD markers encoding retrotransposable elements are linked to the male sex in Cannabis sativa L. // Genome. 2005. - V. 48 - pp. 931-936.

141. Salina E.A., Sergeeva E.M., Adonina I.G., Shcherban A.B., Afonnikov D.A., Belcram H., Huneau C., Chalhoub B. Isolation and sequence analysis of the wheat B genome subtelomeric DNA. // BMC Genomics. 2009. -V. 10-p. 414.

142. Schaffiier J.H. Heredity and sex. // Ohio Journal of Science. 1929. -V. 29(1)-pp. 289-300.

143. Schaffiier J.H. The fluctuation curve of sex reversal in staminate hemp plants induced by photoperiodicity. // American Journal of Botany. 1931. - V. 18(6)-pp. 424-430.

144. Schmidt T., Heslop-Harrison J.S. Genomes, genes and junk: the large-scale organization of plant chromosomes. // Trends in Plant Science. — 1998. V. 3 -pp. 195-199.

145. Schwarzacher T., Leitch A.R., Bennet M.D., Hes lop-Hani son J.S. In Situ Localization of parental genomes in a wide hybrid. // Ann. Bot.-London. -1989.-V. 64-pp. 315-324.

146. Scutt C.P., Kamisugi Y., Sakai F., Gilmartin P. M. Laser isolation of plant sex chromosomes: studies on the DNA composition of the X and Y sex chromosomes of Silene latifolia. II Genome. 1997. - V. 40 - pp. 705-715.

147. Sharma K., Agrawal V., Gupta S., Kumar R., Prasad M. ISSR marker-assisted selection of male and female plants in a promising dioecious crop: jojoba (Simmondsia chinensis). II Plant Biotechnol. Rep. — 2008. — V. 2 — pp. 239—243.

148. Shephard H.L., Parker J.S., Darby P. & Ainsworth C.C. Sexual development and sex chromosomes in hop. // New Pythol. 2000. - V. 148 — pp. 397-411.

149. Shibata F., Hizume M., Kuroki Y. Chromosome painting of Y chromosomes and isolation of a Y chromosome-specific repetitive sequence in the dioecious plant Rumex acetosa. // Chromosoma. — 1999. V. 108 — pp. 266—270.

150. Shibata F., Hizume M., Kuroki Y. Molecular cytogenetic analysis of supernumerary heterochromatic segments on Rumex acetosa. II Genome. 2000. -V. 43-pp. 391-397.

151. Sieben V.J., Debes Marun C.S., Pilarski P.M., Kaigala G.V., Pilarski L.M., Backhouse C.J. FISH and chips: chromosomal analysis on microfluidic platforms. // IET Nanobiotechnology. 2007. - V. 1(3) - pp. 27-35.

152. Siebert P.D., Chenchik A., Kellogg D.E., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. // Nucleic Acids Res. -1995. -V. 23. pp. 1087-1088.

153. Sinoto Y. Chromosome studies in some dioecious plants, with special reference to allosomes. // Cytologia. 1929. - V. 1 - pp. 109-191.

154. Small E. Anumerical and nomenclatural analysis of morpho-geographic taxa of Humulus. II Systematic Botany. 1978. - V. 3 - pp. 37-76.

155. Sneep S. The significance of andromonoecy for the breeding of Asparagus officinalis L. // Euphytica. 1953. - V. 2 — pp. 89-95.

156. Sondur S.N., Manshardt R.M., Stiles J.I. A genetic linkage map of papaya based on randomly amplified polymorphic DNA markers. // Theoretical Applied Genetics. 1996. - V. 93 - pp. 547-553.

157. Soo-Young Kim, Chan-Soo Kim, Joongku Lee, Jae-Wook Bang. Karyotype Analysis and Physical Mapping Using Two rRNA Genes in Dioecious Plant, Humulus japonicus Sieboid & Zucc. // Korean J. Genetics. — 2008. — V. 30(2)-pp. 157-161.

158. Spertini D., Beliveau C., Bellemare G. Screening of transgenic plants by amplification of unknown genomic DNA flanking T-DNA. // Biotechniques. -1999.-V. 27.-pp. 308-314.

159. Storey W.B. Segregation of sex types in Solo papaya and their application to the selection of seed. // Proceedings of American Society of Horticultural Science. 1938. -V. 35 - pp. 83-85.

160. Storey W.B. Genetics of the papaya. // Journal of Heredity. 1953. -V. 44-pp. 70-78.

161. Strasburger E. Uber geschlechtsbestimmende ursachen. // Jahrb. Wiss. Bot. 1910. - V. 48 - pp. 427-520.

162. Sun S.J., Gao W., Lin S.Q., Zhu J., Xie B.G., Lin Z.B. Analysis of genetic diversity in Ganoderma population with a novel molecular marker SRAP. // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 2006. - V. 72(3) - pp. 537-543.

163. Sykorova E., Lim K.Y., Chase M.W., Knapp S., Leitch I.J., et al: The absence of Arabidopsis-type telomeres in Cestrum and closely related genera Vestia and Sessea {Solanaceae): first evidence from eudicots. // Plant. J. — 2003. — V. 34-pp. 283-291.

164. Torrey D., Peirce L. Production of haploid plantlets from anthers of asparagus. // Hort. Science. 1983. - V. 18 - p. 569.

165. Truta E., Gille E., Toth E., Maniu M. Biochemical differences in Cannabis sativa L. depending on sexual phenotype. // J. Appl. Genet. — 2002. — V. 43(4)-pp. 451-462.

166. Urasaki N., Tokumoto M., Tarora K., Ban Y., Kayano T., Tanaka H., Oku H., Chinen I., Terauchi R. A male and hermaphrodite specific RAPD marker for papaya (Caricapapaya L.). // Theor. Appl. Genet. 2002. — V. 104 - pp. 281— 285.

167. Veltsos P., Keller I., Nichols R.A. The inexorable spread of a newly arisen neo-Y chromosome. // PLoS Genetics. 2008. — V. 4 - pp. 1-9.

168. Wang S.S., Zakian V.A. Telomere-telomere recombination provides an express pathway for telomere acquisition. // Nature. — 1990. V. 345 - pp. 456— 458.

169. Warmke H.E. Sex determination and sex balance in Melandrium. II Am. J Bot. 1946. - V. 33 - pp. 648-660.

170. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18 - pp. 7213-7218.

171. Westergaard M. Studies on cytology and sex determination in polyploid forms of Melandrium album. U Dan. Bot. Ark. 1940. - V. 10 - pp. 1— 131.

172. Westergaard M. Aberrant Y chromosomes and sex expression in Melandrium album. // Hereditas. 1946. - V. 32 - pp. 419-443.

173. Westergaard M. The mechanism of sex determination in dioecious plants. // Adv. Genet. 1958. - V. 9 - pp. 217-281.

174. Wilby A.S. Population cytology of Rumex acetosa. II Ph.D Thesis, University of London. 1987.

175. Williams J.G.K., Kubelik A.R. Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. //Nucleic Acids Res. 1990.-V. 18-pp. 6531-6535.

176. Winge 0., On sex chromosomes, sex determination and preponderance of females in some dioecious plants // Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg. 1923. -V. 15 - pp. 1-26.

177. Winge O., On the nature of sex chromosome in Humulus II Hereditas. 1929. - V.12 - pp. 53-63.

178. Wu Zheng-yi & Raven P.H. et al. Flora of China (English edition) // Science Press, Beijing. 1994. - V. 4.

179. Xu W.-J., Wang B.-W., Cui K.-M. RAPD and SCAR markers linked to sex determination in Eucommia ulmoides Oliv. // Euphytica 2004. - V. 136 -pp. 233-238.

180. Yasodha R., Kathirvel M., Sumathi R., Gurumurthi K., Sunil Arachak and Nagaraju J. Genetic analyses of casuarinas using ISSR and FISSR markers. // Genetica. -2004. V. 122-pp. 161-172.

181. Ye D., Installe P., Ciupercescu D., Veukens J., Wu Y., Salesses G., Jacobs M., Negrutiu I. Sex determination in the dioecious Melandrium. I. First lessons from androgenic haploids. // Sexual Plant Reproduction. -1990. — V. 3 — pp. 179-186.

182. Zhang Y.H., Distilio V.S., Rehman F., Avery A., Mulcahy D.L., Kesseli R. Y chromosome specific markers and the evolution of dioecy in the genus Silene. Il Génome. 1998. V. 41 - pp. 141-147.

183. Zhang P., Li W., Fellers F.P., Gill B.S. BAC-FISH in wheat identifies chromosome landmarks consisting of different types of transposable elements. // Chromosoma. 2004. - V. 112(6) - pp. 288-299.

184. Zhou Q., Huang L., Wang J., Nie W., Wang J., Zhao X., Liu Y., Yang F., Wang W. Neo-sex chromosomes in the black muntjac recapitulate incipient evolution of mammalian sex chromosomes. // Genome Biol. 2008. - V. 9 - p. 98.

185. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genomic fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. // Genomics- 1994.-V. 20-pp. 176-183.

186. Zoshchuk S.A., Zoshchuk N.V., Amosova A.V., Dedkova O.S., Badaeva E.D. Intraspecific Divergence in Wheats of the Emmer Group Using In Situ Hybridization with the Spelt-1 Family of Tandem Repeats. // Genetika. -2009. -V. 45(11)-pp. 1556-1564.