Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ. МУТАЦИИ В КОТОРЫХ ПРИВОДЯТ К ПОВЫШЕНИЮ СИМБИОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ. МУТАЦИИ В КОТОРЫХ ПРИВОДЯТ К ПОВЫШЕНИЮ СИМБИОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ"

/} - ЗАоСо

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ РАСХН

На правах рукописи.

САГУЛЕНКО Евгений Александрович

УДК: 579.25:631.461.5

КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ, МУТАЦИИ В КОТОРЫХ ПРИВОДЯТ К ПОВЫШЕНИЮ СИМБИОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЮигоМшп гпеШоН

Специальности: 03.00.15 - Генетика

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Б. В. Симаров,

кандидат биологических наук Л. А. Шарыпова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С. Б. Каменева,

кандидат биологических наук Л. Н. Миронова.

Ведущее учреждение: кафедра микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится " £0 " 1ааа года в Ю ^асов

на заседании диссертационного сотета К 020.26.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " ЛГ " чяэй года.

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат биологических наук А.Н.Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Становление б о бс во-ризобиалького симбиоза -сложный многостадийный процесс, который контролируется-генетическими системами как макро-, так - и микросимбионта. -Известно, что ризобии в значительной степени отличаются друг от друга'по своим симбиотическим свойствам и, в частности, по симбиотической эффективности. В настоящее время' под симбиотической эффективностью клубеньковых бактерий понимают их способность :'увели*йгаать зеленую массу растений и накопление в них азота по сравнению с неи-нокулированными растениями (Симаров и др.. 1990). Получение высокоэффективных штаммов ризобий представляет собой большой'.'инте-рес как с научной, так-и с практической точки зрения. Во многих лабораториях проводится работа по выделению и предпринимаются попытки по конструированию таких-штаммов с использованием генно-инженерных методов (Plazinski.1981;: Blrkeníiead et al., 1988; Sharypova et.al., 1992; Sharypovaetal.. 1994: Romero et al.;.

Овин из подходов к изучению симбиотической эффективности заключается в том, чтобы с помощью мутагенеза получить высокоэффективные штаммы, а уже затем исследовать гены, вовлеченные в процесс "тонкой настройки" симбиотического аппарата, в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов ВНИИСХМ в течение ряда лет приводится изучение генетического контроля симбиотической эффективности клубеньковых бактерий ЮИгоМшя теШои. в лаборатории имеется коллекция мутантов с повышенной симбиотической эффективностью (Ш+ч -мутантов), полученных с использованием транспозонового мутагенеза. Эти мутанты обладают способностью увеличивать массу-инокулированных ими растений на 20-3035 по сравнению с родительскими штаммами СХМ1-105 и СХМ1-188 (Шарыпова и др.. 1994).

.Цель» настоящей работы являлось выявление генетических детерминант, вовлеченных в контроль симбиотической эффективности у ЕГГ^-мутантов К.теШои.

Нам практически ничего не было известно о последовательностях ДНК, в которые произошла инсерция транспозона у ЕГГ++-мутан-тов. Такие последовательности ДНК, условно были названы генами "эффективности'' или еГГ-генами. Поэтому было необходимо провес-

1995).

ти анализ последовательностей ДНК, смежных с транспозоном, то есть секвенирование. этих последовательностей. "от транспозона". Такой анализ позволяет локализовать сайты инсерции транспозона и, при сравнении просеквенированных последовательностей с последовательностями ДНК из.генетического банка данных, выявить гены, имеющие гомологию с изучаемыми последовательностями^ ДНК.. Для. определения структуры еГГ-генов первоначально следовало отобрать мутантные штаммы, пригодные для молекулярного клонирования у них еГГ-генов, и проклопировать эти гены. Таким образом, в соответствие с целью исследования, нами были поставлены следующие задачи;

1) проанализировать семь ЕГГ++-мутантов-штамма СХМ1-188 Й.тен-1ои на наличие в их геноме последовательности транспозона и последовательности векторной плазмиды для того, чтобы отобрать мутанты. у которых произошла истинная шсерция:транспозона. и которые можно использовать для молекулярного клонирования фрагментов ДНК. смежных с транспозоном Тп5;

2) проклонировать из тотальной ДНК ЕГГ++-мутантов последовательности ДНК, смежные с транспозоном Тп5. и разработать способ клонирования немутантных генов "эффективности" (копий генов дикого типа);

3) определить первичную нуклеотидную последовательность Фрагментов ДНК, смежных с транспозоном, и-сравнить просеквенированные последовательности с последовательностями ДНК из банка.генов.•

Научная новизна работы. Показано, что мутации,, вызывающие повышение эффективности симбиоза,у клубеньковых бактерий Изгонит теШои с люцерной Me^licago■saЪlva, обусловлены: инсерцией транспозона в последовательность гена рМЬА(р!1аА),, кодирующему фермент кетотиолазу. вовлеченную в биосинтез и деградацию поли-бета-оксимасляной кислоты; в последовательность ДНК, гомологичную гену Гаав, кодирующему фермент З-гидроксиацил-КоА дегидро-геназу,. вовлеченную в бета-окисление жирных кислот; в последовательность ДНК, гомологичную гену оррС, кодирующему один из белков олигопептидной пермеазы, осуществляющей.транспорт олигопеп-тидов'в клетку.

. Практическая ценность. Выявлены и^проклонированы гены Б.те-

lllotl, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности. Проклонированные•гены могут быть использованы для .изучения их функций и регуляции и, в дальнейшем, для конструирования высокоактивных штаммов ризобий с применением генно-инке-нерных методов,

Лтфобоция работы. Результата работы докладывались на научных семинарах лаборатории генетики и селекции ВНИИСХМ, общеинститутских семинарах ВНИИСХМ. на X Мевдународном конгрессе по биологической фиксации азота (С.-Петербург, 1995).

Публикации. По теме диссертации-опубликовано 3 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 30 рисунков. Список литературы насчитывает 212 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал к методы исследования

Материал. Объектом исследования служили высокоэффективные мутант штамма СХМ1-188 Rhizoblum melilotl - Т152. Т716, Т841, Т835, Т810. Т728.Т748 и Т837 (Шарыпова, 1987). В работе использованы штаммы СХМ1 и CXMl-l88 клубеньковых бактерий люцерны Rhi-zoMum melilotl (Зарецкая, 1976; Федоров. Симаров.. 1987). штаммы Ш5<£ {Grant. 1990). XLl-blue (BullocK et al.. 1987) и S17-1 (Simon. 1988) Escherichia coll, плазмидьг pUCl9 (Norrancler. 1983). PSUP2021 H-pSUP5011 (Simon, 1983). pBR325(BOllvar, 1978) и pKlSmob (Shafer et al.. 1994).

Методы. Выделение тотальной ДНК проводили методом Meade (Meade. 1982). Выделение плазмидной ДНК проводили по методу щелочного лизиса (Birnbolm. Doly, 1979; Ish-Horowlcz. Burke. 1981) из-1,5 и 200 мл культуры Е.coll. Для выделения фрагментов ЛНК из геля использовали метод электрофореза на ДЕАЕ-целлюлоэу (Маниатис и др., 1982).

Приготовление компетентных клеток- Е.coll и трасформацию плазмвдной ДНК осуществляли методом:высокоэффективной- трансформации (Inoue et al.. 1990).

, Для клонирования Тп5-мутантных копий ризобиальных генов был применен метол» описанный в работе Скотта о соавт. (Scott et al.. 1982)..В качестве векторной плазмиды использовали pUC19, Рестри-цированную тотальную ДНК и вектор лигировали -в сотношении 1:1. Концентрация ДНК в 20 мкл лигиругощей смеси составляла 6 - 8 мкг. 200 мкл компетентных клеток DHSrt Е.colt трансформировали лигаз-ной смесью, содержащей 100 - 200 нг ДНК. После трансформации клетки рассевали на чашки со средой LB, содержащие антибиотик канашцин (50 мг/л).

Для конструирования плазмидного банка генов 30 - 50 мкг тотальной. ЯНК штамма СХН1-188 обрабатывали ферментом рестрикции и наносили полностью в одну широкую лунку агарозного геля. После идентификации в геле интересующего нас Фрагмента тотальной ДНК, вырезали кусочек агарозы, содержащий этот фрагмент, и извлекали его с помощью электроэлюирования в диализные трубки (McDonnell etal., 1977). Выделенные фрагменты ДНК лигировали в вектор рис19. После трансформации клеток DHScCE.coli отбирали белые клоны на среде. LB с XGal и IPTG, несущие рекомбинантные плазмиды. Скрининг плазмидного банкагенов проводили с. помощью дот-гибридизации по Саузерну с мечеными-дигоксигенином фрагментами ДНК.

Для клонирования генов ."дикого" типа с помощью вектора рК18-mob из фрагментов ДНК, смежных,1 с транспозоном; субклонировали в pKlSmob последовательности ДНК, отстоящие от сайта интеграции транспозона на 1,5 - 4 т.п.н., в которые предполагалось интегрировать этот вектор. Полученные рекомбинантные плазмиды вводили посредством конъюгации в клетки R.melllotl, используя в качестве донора штамм S17-1 E.coll. Так как pK18mob не способен реплицироваться а клетках ризобий, .. сохранение плазмиды могло происходить лишь за счет ее интеграции в геном по участку, гомологии-После отбора канамицинуотойчивых клонов рекомбинантов (интегран-тое pKlSmob в геном R.melllotl) из них выделяли тотальную ДНК и обрабатывали ферментами рестрикции EcoRI или BamHl. Затем фрагменты ДНК лигировали "на себя" и вводили в.клетки штамма DH5oC Е. coll с помощью трансформации. Из:полученных рекомбинантных плазмид фрагменты ДНК, содержаще гены "дикого" типа, субклонировали в вектор pUC19.

Перенос ДНК из агарозного геля на нейлоновый фильтр (Ну-born. Amerstiam) проводили по стандартной методике ■(Маниатис И' др.. 1982) с использованием вакуумного прибора Фирмы Pharmacia. (Pharmacia UCB. VakuGene XL). Блот-гибришзащт с DIG-меченым. зондом и детекцию проводили по методике, описанной в методическом руководстве (Boehrlnger Mannheim. 1989).

Для проведения конъюгации культуры штаммов донора и реципиента выращивали до поздней лог-фазы в жидкой' среде TY, смешивали в соотношении 1:6 и осаждали центрифугированием.. Коныогацион-нуга смесь переносили,на агаризованную среду TY и культивировали в течение 18 часов при 28*с; Выросшие на чашках бактерии суспендировали в 5 мл дистиллированной вода и высевали;по-0,1 мл суспензии на.чашки с селективной средой для отбора гетерогенот.

Секвенирование ДНК проводили по Сэнджеру, используя методику. предлагаемую фирмой Amersham, на аппаратуре для Cycle-Sequen-clng. Электрофорез проводили в 6% полиакриламшиом геле при напряжении 6G0V.

Сравнение прооеквенированных последовательностей ДНК с последовательностями ДНК из генетического банка данных CGeneBanW проводили с использованием компьютерной сервисной сети BLAST.

РЕЗУЛЬТАТЫ И'ОБСУЖДЕНИЕ Отбор Eff **-mi№m№9.- пригодных для молекулярного - клонирования ненов "эффективносш".

Использованные в нашей работе мутанты штамма СХМ1-188 R.rae-Uloti, обладающие повышенной симбиотической эффективностью, были получены с помощью плазмид-исамоубийця pSUP202l и psup50li. содержашх. соответственно, Тп5 и Tn5-mob,. Однако при транспозо-новом мутагенезе с использованием этих плазмид часто происходит интеграция вектора вместе с транспозоном в геном ттамма-решпи-ента. При получении Eff*+ -мутантов от 6 до 29Я клонов одновременно с устойчивостью к. канамицину (маркер транспозона Тп5) несли плазмидный маркер хлорамфениколустойчивости (Шарыпова. 1987). Учитывая такую высокую частоту интеграции векторной плазмиды при встройке транспозона в*геном ризобий, мы предположили.. что отсутствие у мутантов этого маркера, не является:строгим доказательством отсутствия в их геноме интегрированной векторной плазмиды, так как могла произойти утрата маркера, например, в ре-

зультате делеции отдельных.Фрагментов ЯНК плазмиды или точковых мутаций в гене хлорамфениколустойчивости. Для-проверки этого предположения му провели блот-гибридизаиии тотальной (геномной), ДНК мутантных штаммов, гидролизованной ферментами рестрикции Есой! и ВатЛХ, сплазмидой рВЯ325, на основе которой сконструированы векторы семейства-рЭЦР. В результате проведенного анализа-было обнаружено, что у тотальной ДНК штаммов Т728; Т748 и Т837 гибридизуется один Есо£1-фрагмент ДНК, в то время как у ДНК штаммов Т716, Т841. Т810 И Т835 ответов на данный зонд не было обнаружено. Отсутствие зсн гибридизации у тотальной ДНК четырех штаммов является доказательством того, что в их геном не произошло интеграции вектора. Наличие же одного ответа у. остальных четырех штаммов могло означать, что произошла интеграция не всего вектора в геном, а только какой-то его части, поскольку векторная плазмида содержит сайт, для ЕсоШ. На рисунке 1 представлена.ги-

12 3'4-56?в9

т.п.н. 21.2,

6.6, 4.4,

2.3 -2.0

V. Ш , . ( <_г

—* Ш

—, V

Рис. 1. Гибридизация гидролизованных рестриктазой ВашН1 тоталь-.• ных ЛНК ЕГГ+*-мутантов с плазнидой рВЙ325. Обозначения:

1. ДНК.фага %-Н1пс11П.. 2. рБиРбОИ-Рз«. 3-9. Тотальные ДНК ЕГ^-мутантов: , 3. Т728, 4. Т716, 5; Т748. 6. Т841, 7. Т835. 8. Т810, 9. Т837.

бридизация тотальной ДНК мутантных штаммов, обработанной ВаггШ, с плазмидсй pBR325. Транспозон Тп5 содержит уникальный сайт для фермента рестрикции BamHI,. расположенный на расстоянии 2,8 и 3.0 т.п.н. от концов транспозона. В плазмидах pSUP также имеется сайт для BamHI. При расщеплении тотальной ДНК мутантных штаммов, у которых плазмидная последовательность фланкирует оба "плеча" транспозона, должно гибридизоваться три фрагмента ДНК. У ДНК всех трех мутантов выявлено по три зоны гибридизации, одна из которых на всех дорожках была на уровне 10 - 11 т.п.н., вторая соответствовала Фрагменту ДНК размером 3,2 т.п.н. Размер третьего фрагмента ДНК составил 5.5 т.п.н. (Т728), 15 -17 т.п.н. (Т748) • и 5.0 т.п.н. (Т837). На основании результатов данной гибридизации мы сделали вывод, что два фрагмента ДНК представляют собой последовательность векторной.плазмиды с одним из плечей транспозона, а третий фрагмент ДНК является векторной последовательностью. Таким образом, мы показали, что три штамма -Т728. Т746 и Т837 несут в геноме последовательность вектора, фланкирующую оба "плеча" транспозона. Так как эти штаммы оказались непригодными для клонирования у них eff-генов, мы не использовали их в дальнейшей работе.

Кроме того, известны случаи включения в геном более одной копии транспозона (Rolfe et ai.. 1983; Regensburger et al., 1986; Шарыпова, 1987). Поэтому для молекулярного клонирования мутантных eff-генов было необходимо подтвердить наличие одной копии транспозона в геноме Eff"^-мутантов. Мы провели гибридизацию по Саузерну тотальной ДНК мутантных штаммов, гидролизованной Eco-RI,' с зондом, содержащим Н1МШ-фрагмент Тп5 размером 3,4 т.п.н. (рис. 2). Так как сайтов для фермента EcoRI в транспозоне Тп5 не существует, при единичной инсерции транспозона должен гибридизоваться только один Фрагмент ДНК. с помощью этой гибридизации мы показали, что у штаммов" Т716. Т841. Т835, Т810 произошла единичная истинная инсерютя'Тп5 в геном. Они и были отобраны для дальнейшей работы по клонированию eff-генов.

Клонирование Тп5-№ркированньа и нежушшньвс копка генов, "эффективности'.

Из- отобранных в результате предварительного анализа Eff*+ -мутантов Т716, Î841, Т835, Т810 штамма СХМ1-188, обладающих по-

23,1. 9,4 V- U

6,6 - w

4,4 -: —

2,3

2,0

Рис. 2., Гибридизация гидролизованных рестриктазой EcoRI тотальных ДНК Efl"*+ -мутантов с 3,4 т.п.н. Hindin-Фрагментом ЛНК транспозона Тп5. Обозначения:

1. ЛНК фага Я-HinöIII, 2. pSUP5011-PstI. 3 - 6.. Тотальные ДНК ЕГГ+ч-мутантов: 3. Т716. 4. Т841, 5. TS35,. 6. Т810.

вишенной симбиотической эффективностью, а также высокоэффективного штамма Т152, который уже был проверен на наличие в геноме последовательности транспозона Тп5 и последовательности векторной плазмиды (Юргель, 1996), мы проклонировали из тотальной ДНК этих штаммов по EcoRl-сайтам фрагменты ДНК, смежные с Тп5. в вектор pUCl9. Гибридизационный анализ рекомбинантных плазмид с тотальной ДНК штамма СХМ1-188 показал, что проклонированные Фрагменты ДНК содержат, последовательности ризобиалъной ДНК, Фланкирующие транспозон. После этого были построены рестрикционные карты рекомбинантных плазмид (рис. 3). Плазмиды были гидролизо-ваны рестриктазами EcoRI. BamHI.. Hindlll,. Pstl.H Sali по отдельности и парами:во всех возможных сочетаниях. Размер прокло-нированных Фрагментов ризобиальной ДНК представлен в таблице х.

eflfl52 I-

еГГ841 E p T s H B

III-1-h

effS35 ETS

i 4oo ooo 1400 aooo J^QQ H

eff716

effölO

1 50

В P

750

H

1350 E S

2000 3300 . В P

750

1100

—1-1—

3600 .4000

P H

—I—h—

2100 2300

9000 P E

4-!

6200 6700

S E

7390 7500 8180 В

6000

-isoo

7400

Рис.. 3. Рестрикционные карты клонированных Фрагментов ДНК у Eff*:+-мутантов. г Обозначения: Тп5

Сайты рестрикции: е.- EcoRI, В.- BaxHI. Н - Hindlll, • Р - Estl. S - Sali.

Таблица 1. Размер клонированных фрагментов ДНК у ЕГ^-мутантов штамма СХМ1-188 R. meliloti.

ЕГГ+Ч> .Размер Размер.клони- Размер клонирован-

Плазмида мутант плазмшщ рованного ного фрагмента ри-

(т. п.н.). фрагмента ДНК зобиальной ДНК

(Т.П.Н.) (Т.П.Н. )

pSK2 .T716 10.60 ■ ■ 8.05 0.20

pSK4: T841 12.30 8.70 г. 90

pSK5 T835 10.85 8.15 2.35

pSK6 - T810. 21.70 19.00 13.20

pSKS'. T152. 12.00 9.30 1.60

Используя Тп5-мутантные последовательности ДНК, мы проклони-роваликопии еГГ-генов дикого типа. С помощью дот-гибридизации

Фрагментов ДНК. содержащих Тп5-мутантные последовательности еГГ-генов, с банком генов, сконструированным нами на основе плазмиды рЧС19. был выявлен клон, гибридизовавшийся с меткой. Для того, чтобы подтвердить тот факт, что проклонированный ЕсоИ-фрагмент ДНК размером 1.5 т.п.н. содержит немутантную последовательность еГП52, мы провели блот-гибридизацию этой плазмиды, гидролизо-ванной ферментом £соН1, с меченым дигоксигенином фрагментом ДНК плазмиды р£К8, содержащим мутантную последовательность еГГ152. в результате данной гибридизации было показано, что проклонирован-ный Фрагмент ДНК включает в себя последовательность ДНК еШ52 дикого типа. Помимо этого, -клонирование немутантных последовательностей еГГ-генов мы проводили с использованием вектора рК18-люЬ. Основываясь на данных по рестрикционному картированию фрагментов ДНК, смежных с Тп5. мы подбирали ферменты рестрикции, которые позволили бы вырезать из тотальной ДНК гетерогенот (интег-рантов рК18шоЬ в геном штамма СХМ1-188) вектор вместе с фрагментом ризобиальной ДНК. содержащим немутантную последовательность гена. Далее Фрагменты ДНК, содержащие немутантные последовательности еГГ-генов, были субклонированы а вектор р11С19. С использованием вектора рК18тоЬ мы проклонировали немутантные копии генов еГИ1б, еГГ810,- еГГ841 и еГГ835. Размер субклонированных в векторе рис 19 фрагментов ДНК составил: еГП16 - 6.2 т.п.н. (За11-Р5И). еГГ841 - 1.5 т.п.н. (ШпйШ-ЕсоШ). еГГ835 - 3.2 Т.п.н. (Н1паШ-ВатН1), еГГ810 - 4,3 Т.п.н. (Н1пс1Ш-ВатН1). С помощью блот-гибридизаций мы подтвердили наличие в проклонированных фрагментах ДНК последовательностей еГГ-генов "дикого" типа (рис. 4). Подготовка фрагментов ДНК, смежных с транспозонам, к секвенкро-вана».

Подготовка фрагментов ДНК к секвенированию от праймера, гомологичного концевой последовательности транспозона заключалась в субклонировании фрагментов ДНК, включающих правое или левое плечо транспозона и смежную с ним последовательность ризобиальной ДНК. В соответствие с данными, полученными при рестршщион-ном картировании плазмид. содержащих клонированные. ЕсоШ-фраг-менты ДНК, мы субклонировали последовательности ризобиальной ДНК

^pUC19"

1 234567B9

1 23456789

r.:.^ ; • .у

f

ТПН

' 23.1

~ Z. 9.4

w — 6,S

— 4,4

— 2,3

— 2,0

Рис. 4.. Электрофорез и блот-гибридизаикя по Саузерну рексмбинан-тных плазмид, рестрицированных по сайтам клонирования Фрагментов ризобиальной ДНК.

Обозначения: 1. 2. 3, 4 - Тп5-мутантные копии eff-генов. 5. 6, 7. 8 - копии генов "эффективности" дикого типа, 9 - ДНК фага VHlrdlll. 1 и 5 - effBlO. 2 и 6 - еИ841. 3 и 7 - effS35. 4 и 8 - eff-716. В качестве зонда использована смесь меченых дигоксигенином фрагментов Тп5-му-тантных копий генов еГГ716, eff835. еГГЗЮ и eff841.

в вектор pUC19. Результаты,этсй работы представлены в табл. 2. Размер проклонированного EcoRI-фрагмента ризобиальной ДНК еГГ7!б (табл. -1) оказался недостаточным для выявления гомологии с последовательностями ДНК из генбанка данных. Поэтому из тотальной. ДНК штамма Т716 мы проклонировали ВагаН!-фрагмент ДНК, - включающий в себя Km -"плечо" Тп5 и прилежащий к нему генокный фрагмент ДНК размером 6.0 т.п.н. (рис, 3, табл. 2),

Таким образом, нами были сконструированы рекомбинантные плазмиды, включающие в себя фрагменты ризобиальной ДНК, фланкирующие плечо транспозона. эти плазмиды можно было использовать для секвестрования последовательностей ризобиальной ДНК, с применением лраймера. гомологичного концевсй последовательности Тп5.

Таблица 2. Рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты ДНК eff-генов, смежные с одним из IS-элементов транспозона Тп5.

Плазмида Транспозант, из которого клонирован' Фрагмент днк. Размер клонированного Фрагмента ДНК (т. п.н. К/ Размер-.клоки- ■ рованного;.'фрагмента* ризобиальноЯ ДНК (Т.П.Н.) Сайты клонирования

PSK21 Т716 3.0 ; o.i BamHI-EcoRl

pSK22 Т716 2.9 . о. Г BamHI-EcoRI

pSK23. Т716 9.0 "Y" .6.0 BamHI

pSK41 Т841 3.4 - 0.4. BamHI ■

pSK51 Т835 4.55 >„'. 1.55 .. BaraHIrEcoRI

pSK52 Т835 3.6 0. 8 BamHI-EcoRI

pSK6i Т810 7.4 4.8 Sail

pSK81 Т152 3.3 0.3 BamHI-EcoRI

pSK82 Т152 4.1 1.3 BamHI-EcoRI

Секвенщювание послед овательностей ЛНК. сл&кныг с гаранспозошм Гп5. и сравнение прос еквенирозаккис послевовательностеа ДНК с последовательностями ДНК из генетического банка Ванта.

Мы секвенировали. фрагменты ризобиальной ШК. смежные с транспозоном Тп5, от концевой последовательности IS50, используя праймер TN0UT. в результате была определена первичная нукле-отидная последовательность Фрагментов ДНК, размером от 180 п.н. до*546 п.н. {табл. 3). После получения:данных о первичных последовательностях ДНК. смежных с транспозоном; мы провели сравнение, этих последовательностей с последовательностями ДНК из генбанка данных (GeneBank) (табл. 3; рис. 5). Процент гомологии определяли по количеству идентичных аминокислот.и по количеству'иден-тичных Аминокислот плюс количество сходных по физико-химическим свойствам аминокислот (в тексте такой процент гомологии указан в скобках). В таблице показан процент гомологии по аминокислотным-последовательностям, предоставленный генбанком, и процент гомологии; определенный нами как отношение общего.количества просек-;

Таблица 3. Последовательности ДНК из генбанка данных, гомологичные генам "эффективности " ЯтеШой

ГЕНЫ, ИМЕЮЩИЕ НАИБОЛЬШИЙ ПРОЦЕНТ ГОМОЛОГИИ С ГЕНАМИ ЭФФЕКТИВНОСТИ

ШТАММЫ, ИЗ КОТОРЫХ КЛОНИРОВАНЫ ФРАГМЕНТЫ ДНК (ЛОКАЛИЗАЦИЯ Тп5) КОЛИЧЕСТВО ПРОСЕКВЕНИ-РОВАННЫХ НУКЛЕОТИ-ДОВ (ГШ) Ген Белое Организм П[Н)1К11Г гомологии {данные геибаика) Процент ГОМОЛОГИИ (ЯП ОШН1ИИОО к общему ' кол> теслу просеке« гиром т [ых К)ХЛС . он)

Идентичные аминокислоты Идентичны« и сходные аминокислоты Идентичные 1М1ИЮК11С-яоты Илектнчньк н модные (МИНОКНС- лоты

Т716 (М1) 507 ыв 3-гндрокси-ацил-КоА-дегидрогеназа Воз 1аиги5 65 76 46 63

*Т152(кр) 117 179 рМ)А (рЬаА> Бета-кеттнолмэа К.теЫои 94 69 100 73 94 69 »00 73

ТО5(М2) ' 546 ■47» ' ОррЭ Олиго/тептия-ная лермеаза Е.еоК 54 69 66 42 40 58 53

ТК41 (М2) 180 Нет гомологии - - - -

Т810(М2) НО Нет . гомологии - - - - -

* - секвенироваиие проведено Л.А-Шарыповой.

рис. 5.. Сравнение аминокислотных последовательностей eff-генов с последовательностями из генетического банка данных. Обозначения: : - идентичные, + - похожие аминокислоты..

eff7î6 (pSK23):

З-гидроксиатл-СоА дегидрогежза. (ген fadB Bos tawrus). eff716: 7 vncagtapgek 17 . 19 lgrsgphaldsfartvavnligt 41

****** * * * * * Л * ^ i * * * л •

Гаав : 89 vncàgiàvask 99 . 103 lRksqahtiedfqrvlnvniigt 125 еГГ716: 42 fnmlг1aaevmsqgepdadgergvlvntaslaafdgq1gq 81

l t+Ï t Ï * 1 I »4* + * *

fadB : 126 fnv1rivagemgqnepdqggqrgviintàsvààfegqvgq 165 eff716: 106 g 1 гvvtlapgiratpmagmpqd vqdalaasvp fpprlgraeey 149

****^,****»ц.< » p * ++ « • ^ » * » * * « * *»

fadB : 170 girvmtiapgirgtpllttlpdkvrnfiasqvpfpsrigdpaey 203 eff716: 150 aalvktllcentmlngevlrl 169

fadB 204 ahlvqailensfIngevIrl 233

efT835 ■ (pSKSi) :

АТФ-сгязтахщЮ. белок OppD, вовлеченный e олигопепшаный транспорт (зен oppD Escherichia coli).

eff835: 6 pdUladepUaldvtlqaqlldllkslqrrfginaivlUMlgl 50

l!!»*»*ZIII!'* * * ; ++ * ; * *

oppD : 175 peinääepttaidvsvqaqiiqiireiqgelnmgmlfi'timisi 219 eff835: 51 vkyfadrvavmrrgevveqgmtad1ferpkelyytrml1eaepsg 96

* J; * ; * + ; j j • j *

oppD : 220 vrklahrvavmqngrcveqnyaatlfaspttipyytqklinsepsg 264 eff835: 130 vdgvnIrlrqgqt1glvgesgsgkst1gral1kllpssgyyrГgs 174

* ^^ . * * * ^^ • < « 4 ^ * * *

oppD : 302 vknlsftiragetlglvgesgsgkaUglaiirilnsqgslifdg 346

eff835: 175 tdlsgfdr. 182 +

oppD :* 347 qplqnlnr 354 effS35 (pSKSZ) :

eff&35: 154 lkvdfstpdgtveavkgldld vvpge tlavvgesgsgksqtmœg 109

« ц»* *•**«*' * « * ^^ ^ * « * « ^.è *«>»**«***

oppD : 35 irvt'fs'tpdgdvtavndlrifslragetiglvgesgsgksqtafa 78 eff835: lio imgllakngtvpgfgxyrgqelvglapkalnkvrgskltmifqepmt 64

+ j j j * I IÎ +3 + • ; + * ++ * î Î ! +"

oppD : 79 lmgi.iâangrlggsatfngrellnipeheinklraeqlsmifqdpmt 125 eff835: 62 ldplytlgrqlaeplvhhrggs 41

oppD : 127 Inpymrvgeqlmev1mlhknms 148 , eff835:. 31 llelrrlaepgrrl dsypiiel s 10

+ ++ J I'** •

oppD : 149 midavkmpearkrmkmyphe Г s 170

венированных нуклеотидов (в аминокислотах) к общему количеству идентичных и сходных аминокислот, далее в тексте будет указываться вычисленный нами процент гомологии. В тех случаях, когда сек-венировались последовательности ДНК одного eff-гена. смежные с правым yt левым плечами транспозона, мы использовали среднюю от данных, сиквенса по двум плечам.

Было выявлено, что две последовательности (eff810 и eff84l) не. имеют гомологии.с какими-либо ранее просеквенированными последовательностями ДНК, то есть они представляют собой ранее неизвестные гены, контролирующие симбиотическую эффективность у клубеньковых бактерий-KhizoMum mellloti.

Последовательность еШ52 гомологична (идентичность - 90Ж) последовательности гена phbA (phaA) штамма Кш41 R.mellloti, кодирующего фермент кетотиолазу, вовлеченную в синтез и деградацию поли-бета-оксимасляной кислоты (ПОМ). Инсерция транспозона произошла в открытую рамку считывания на расстоянии приблизительно 90 п.н.. от точки инициации транскрипции.

Последовательность eff71ô гомологична последовательности ДНК. кодирующей 3-гидроксиацил-СоА дегидрогеназу у зукариотичес-ких видов Bos taurus, Homo sapiens. Mus musculus,. Caenorhabdltis elegans. Наибольшее сходство наблюдалось с последовательностью этого гена у Bos taurus - 46% (63%). Инсерция транспозона произошла в открытую рамку считывания. В сравниваемой последовательности гена Bos taurus сайт инсерции транспозона.находится приблизительно в районе двести сорокового нуклеотида от точки инициации транскрипции,-

Последовательность eff835 гомологична последовательности гена oppD, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт олигопептидов а клетку (один из компонентов олигопептидной пермеазы) у многих видов бактерий. Наибольший процент гомологии был выявлен мевду;последовательностью eff835 и последовательностью гена oppD Escherichia coll. Инсерция транспозона произошла в открытую рамку считывания., Б сравниваемой последовательности гена oppD Е.coll сайт инсерции находится приблизительно в районе пятьсот двадцатого нуклеотида от точки инициации транскрипции.

Таким : образом. . в данной работе мы показали, что повышение симбиотической эффективности у мутантов Т716, Т835 и Т152 штамма

CXM1-188R. melllotl связано с мутациями в генах, продукты которых вовлечены в различные пути энергетического метаболизма бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Среди семи Тп5-мутантов штамма СХМ1-188 Rhlzobium melllotl -Т748, Т837. Т728; Т716, Т810. Т835 И Т841. Обладавших повышенной симбиотической эффективностью (ЕГГ^-мутанты), отобрано четыре мутанта».. являющихся истинными транспозантами, для клонирования последовательностей ДНК. смежных с транспозоном Тп5, и секвени-рования этих последовательностей ДНК.

2. Проклонированы в векторе pUClS последовательности ДНК, смежные с транспозоном. у мутантов Т152, Т716, Т810, Т835 И Т841.

3. Построены рестршшионные карты рекомбинантных плазмид, содержащих мутантные копии егг-геноз, и определен размер проклони-рованых фрагментов ДНК (от 200 п.н. до 13.2 т.п.н.).

4. С помощью вектора рК18шоЬ проклонированы немутантные последовательности eff7l6, efiSlO, eff841 и eff835. Клонирование последовательности effl52 дикого типа осуществлено с помощью сконструированного нами на основе вектора pUClQ плазмидного банка генов.

5. Вдавлены два гена (еН810 и еИ841). не.имеющие гомологии с какими-либо ранее просеквенированными последовательностями ДНК. Таким образом, обнаружены неизвестные ранее гены, влияющие на симбиотическую эффективность клубеньковых бактерий Rhizoblum melllotl.

6. Показано, что три еГГ-гена R.-melllöti имеют гомологию с известными ранее генами. Последовательность еГГ152 гомологична последовательности гена phbA (phaA) В, melllotl вовлеченного в биосинтез и деградацию поли-бета-оксимасляной кислоты' (9056 гомологии по идентичным аминокислотам и. 9255 по идентичным и сходным аминокислотам). Последовательность efH16 гомологична последовательности. гена fadB Воз taurus, вовлеченного в. бета-окисление жирных кислот (46% и 6356 гомологии). Последовательность eff835 показала наибольший процент гомологии (415S и 5556) с последовательностью гена oppD Е. coll, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт в клетку олигопептидов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы;

1. Sharypova L.А., Onlshchuk О.Р., Sagulenko Е.А., Evdonin A.L., Chlzhevskaya Е.Р. Melanin production by Rftlzoblum melllotl strains Isolated from Central Asia; proc. 10-th Intern. Congr. on Nitrogen Fixation, Saint-Petersburg, Russia, Kay 28 - June 3, 1995. p. 416.

2. сагуленко E. A., Шарыпова Л.A., Кроль E.А., Симаров Б.В. Клонирование генов "эффективности" Rhlzoblurn melllotl с использованием вектора pK18mob. Генетика. 1998. Т.34. N7, С.903-907.

3. Чижевская Е.П., Кроль Е.А., Онишук О.П.. Сагуленко Е.А., Фо-мина-Ещенко Ю.Г., Скмаров Б.В., Шарыпова Л.А. Физическое и генетическое картирование мутации симбиотической эффективности на мегаплазмиде-2 штамма СХМ1 R.melllotl. Генетика. 1998. Т.34, N9. С.1220-1227.

АО СКВ "Индикатор". Зак. Тир .IS »кэ. Тел.252-46-6£.