Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности генов, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности генов, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ РАСХН

На правах рукописи

САГУЛЕНКО Евгений Александрович

УДК: 579.25:631.461.5

КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ, МУТАЦИИ В КОТОРЫХ ПРИВОДЯТ К ПОВЫШЕНИЮ СИМБИОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ШгоМит теШоИ

Специальности: 03.00.15 - Генетика

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Б. В. Симаров,

кандидат биологических наук Л.А.Шарыпова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С. В. Каменева,

кандидат биологических наук Л.Н.Миронова.

Ведущее учреждение: кафедра микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится 11 о№" 1998 года в ~часов

на заседании диссертационного совета К 020.26.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: Санкт-Петербург. Пушкин, шоссе Бодбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "„ // " сйи^ЛМЛ1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат биологических наук А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Становление 'бобово-ризобиального симбиоза -сложный многостадийный процесс, который контролируется генетическими системами как макро-, так и микросимбионта. Известно, что ризобии в значительной степени отличаются друг от друга по своим симбиотическим свойствам и, в частности, по симбиотической эффективности. В настоящее время под симбиотической эффективностью клубеньковых бактерий понимают их способность увеличивать зеленую массу растений и накопление в них азота по сравнению с неи-нокулированными растениями (Симаров и др., 1990). Получение высокоэффективных штаммов ризобий представляет собой большой интерес как с научной, так и с практической точки зрения. Во многих лабораториях проводится работа по выделению и предпринимаются попытки по конструированию таких штаммов с использованием генно-инженерных методов (Plazinski., 1981; Birkenhead et al., 1988; Sliarypova et.al., 1992; Sharypova et al., 1994; Romero et al., 1995).

Один из подходов к изучению симбиотической эффективности заключается в том, чтобы с помощью мутагенеза получить высокоэффективные штаммы, а уже затем исследовать гены, вовлеченные в процесс "тонкой настройки" симбиотического аппарата. В лаборатории генетики и селекции микроорганизмов ВНИИСХМ в течение ряда лет пр.оводится изучение генетического контроля симбиотической эффективности клубеньковых бактерий Miizobium mellloti. В лаборатории имеется коллекция мутантов с повышенной симбиотической эффективностью (Eff++ -мутантов), полученных с использованием транспозонового мутагенеза. Эти мутанты обладают способностью увеличивать массу инокулированных ими растений на 20-30% по сравнению с родительскими штаммами СХМ1-105 и СХМ1-188 : (Шарыпова и др., 1994).

Целью настоящей работы являлось выявление генетических детерминант, вовлеченных в контроль симбиотической эффективности у Еff++-мутантов R.mellloti.

Нам практически ничего не было известно о последовательностях ДНК, в которые произошла инсерция транспозона у Eff^-мутантов. Такие последовательности ДНК, условно были названы генами "эффективности" или eff-генами. Поэтому было необходимо провес-

ти анализ последовательностей ДНК, смежных с транспозоном, то есть секвенирование этих последовательностей "от транспозона". Такой анализ позволяет локализовать сайты инсерции транспозона и, при сравнении просеквенированных последовательностей с последовательностями ДНК из генетического банка данных, выявить гены, имеющие гомологию с изучаемыми последовательностями ДНК. Для определения структуры eff-генов первоначально следовало отобрать мутантные штаммы, пригодные для молекулярного клонирования у них eff-генов, и проклонировать эти гены. Таким образом, в соответствие с целью исследования, нами были поставлены следующие задачи:

1) проанализировать семь Eff-мутантов штамма СХМ1-188 R.raeli-loti на наличие в их геноме последовательности транспозона и последовательности векторной плазмиды для того, чтобы отобрать мутанты, у которых произошла истинная инсерция транспозона и которые можно использовать для молекулярного клонирования фрагментов ДНК, смежных с транспозоном Тп5;

2) проклонировать из тотальной ДНК Eff^-мутантов последовательности ДНК. смежные с транспозоном Тп5, и разработать способ клонирования немутантных генов "эффективности" (копий генов дикого типа);

3) определить первичную нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК, смежных с транспозоном. и сравнить просеквенированные последовательности с последовательностями ДНК из банка генов.

Научная новизна работы. Показано, что мутации, вызывающие повышение эффективности симбиоза у клубеньковых бактерий Rhizo-blum melilotl с люцерной Medicago sativa, обусловлены: инсерцией транспозона в последовательность гена phbA(phaA), кодирующему фермент кетотиолазу, вовлеченную в биосинтез и деградацию поли-бета-оксимасляной кислоты; в последовательность ДНК, гомологичную гену fadB, кодирующему фермент 3-гидроксиацил-КоА дегидро-геназу, вовлеченную в бета-окисление жирных кислот; в последовательность ДНК, гомологичную гену oppD, кодирующему один из белков олигопептидной пермеазы, осуществляющей транспорт олигопеп-тидов в клетку.

Практическая ценность. Выявлены и проклонированы гены R.те-

liloti, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности. Проклонированные гены могут быть использованы для изучения их функций и регуляции и, в дальнейшем, для конструирования высокоактивных штаммов ризобий с применением генно-инженерных методов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах лаборатории генетики и селекции ВНИИСХМ, общеинститутских семинарах ВНИИСХМ, на X Международном конгрессе по биологической фиксации азота (С. -Петербург, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 30 рисунков. Список литературы насчитывает 212 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Материал. Объектом исследования служили высокоэффективные мутанта штамма СХМ1-188 Rhizobium melilotl - Т152, Т716, Т841, Т835, Т810, Т728, Т748 и Т837 (Шарыпова, 1987). В работе использованы штаммы СХМ1 и СХМ1-188 клубеньковых бактерий люцерны Rhizobium melllotl (Зарецкая, 1976; Федоров, Скмаров., 1987), штаммы DH5oC(Grant. 1990), XLl-blue (Bullock et al., 1987) и S17-1 (Simon, 1988) Escherichia coll, плазмиды pUC19 (Worrander. 1983), PSUP2021 и PSUP5011 (Simon, 1983), pBR325 (Bolivar, 1978) и pK18mob (Shafer et al., 1994).

Методы. Выделение тотальной ДНК проводили методом Meade (Meade, 1982). Выделение плазмидной ДНК проводили по методу щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979; Ish-Horowicz, Burke,.1981) из 1,5 и 200 мл культуры Е.coli. Для выделения фрагментов ДНК из геля использовали метод электрофореза на ДЕАЕ-целлюлозу ' (Маниатис и др., 1982).

Приготовление компетентных клеток Е.coli и трасформацию плазмидной ДНК осуществляли методом высокоэффективной трансформации (Inoue et al., 1990).

Для клонирования Тп5-мутантных копий ризобиальных генов был применен метод, описанный в работе Скотта с соавт. (Scott et al.. 1982). В качестве векторной плазмады использовали pUC19. Рестри-цированную тотальную ДНК и вектор лигировали в сотношении 1:1. Концентрация ДНК в 20 мкл лигирующей смеси составляла 6-8 мкг. 200 мкл компетентных клеток DH5c(. Е. coli трансформировали лигаз-ной смесью/ содержащей 100 - 200 нг ДНК. После трансформации клетки рассевали на чашки со средой LB. содержащие антибиотик канамицин (50 мг/л).

Для конструирования плазмидного банка генов 30 - 50 мкг тотальной. ДНК штамма СХМ1-188 обрабатывали ферментом рестрикции и наносили полностью в одну широкую лунку агарозного геля. После идентификации в геле интересующего нас фрагмента тотальной ДНК, вырезали кусочек агарозы, содержащий этот фрагмент, и извлекали его с помощью электроэлюирования в диализные трубки (McDonnell et al., 1977). Выделенные фрагменты ДНК лигировали в вектор pUC19. После трансформации клеток DH5o( Е. coll отбирали белые клоны на среде LB с XGal и IPTG, несущие рекомбинантные плазмиды. Скрининг плазмидного банка генов проводили с помощью дот-гибридизации по Саузерну с мечеными дигоксигенином фрагментами ДНК.

Для клонирования генов "дикого" типа с помощью вектора рК18-mob из фрагментов ДНК, смежных с транспозоном, субклонировали в pK18mot> последовательности ДНК, отстоящие от сайта интеграции транспозона на 1,5 - 4 т.п.н., в которые предполагалось интегрировать этот вектор. Полученные рекомбинантные плазмиды вводили посредством конъюгации в клетки R.meliloti. используя в качестве донора штамм S17-1 E.coli. Так как pKl8mob не способен реплицироваться в клетках ризобий, сохранение плазмиды могло происходить лишь за счет ее интеграции в геном по участку гомологии. После отбора канамицинустойчивых клонов рекомбинантов (интегран-тов рК18шоЬ в геном R.meliloti) из них выделяли тотальную ДНК и обрабатывали ферментами рестрикции EcoRl или BamHI. Затем фрагменты ДНК лигировали "на себя" и вводили в клетки штамма DH5cC Е.coli с помощью трансформации. Из полученных рекомбинантных плазмид фрагменты ДНК, содержащие гены "дикого" типа, субклонировали в вектор pUC19.

Перенос ДНК из агарозного геля на нейлоновый фильтр (Ну-born, Amersham) проводили по стандартной методике (Маниатис и др.. 1952) с использованием вакуумного прибора фирмы Pharmacia (Pharmacia LKB, VakuGene XL). Блот-гибридизацию с DIG-меченым зондом и детекцию проводили по методике, описанной в методическом руководстве (Boehrlnger Mannheim, 1989).

Для проведения конъюгации культуры штаммов донора и реципиента выращивали до поздней лог-фазы в жидкой среде TY, смешивали в соотношении 1:5 и осаждали центрифугированием. Конъюгацион-ную смесь переносили на агаризованную среду TY и культивировали в течение 18 часов при 28°С. Выросшие на чашках бактерии суспендировали в 5 мл дистиллированной воды и высевали по 0,1 мл суспензии на чашки с селективной средой для отбора гетерогенот.

Секвенирование ДНК проводили по Сэнджеру, используя методику, предлагаемую фирмой Amersham, на аппаратуре для Cycle-Sequencing. Электрофорез проводили в 6% полиакриламидном геле при напряжении 600V.

Сравнение просеквенированных последовательностей ДНК с последовательностями ДНК из генетического банка данных (GeneBank) проводили с использованием компьютерной сервисной сети BLAST.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Отбор Eff+^-мутантов, пригодных для молекулярного клонирования генов "эффективности".

Использованные в нашей работе мутанты штамма CXMl-188 R.me-liloti, обладающие повышенной симбиотической эффективностью, были получены с помощью плазмид-"самоубийц" pSUP2021 и pSUPSOll. содержащих, соответственно, Тп5 и Tn5-mob. Однако при транспозо-новом мутагенезе с использованием этих плазмид часто происходит интеграция вектора вместе с транспозоном в геном штамма-реципиента. При получении Eff4"4, -мутантов от 6 до 29% клонов одновременно с устойчивостью к канамицину (маркер транспозона Тп5) несли плазмидный маркер хлорамфениколустойчивости (Шарыпова, 1987). Учитывая такую высокую частоту интеграции векторной плазмиды при встройке транспозона в геном ризобий, мы предположили, что отсутствие у мутантов этого маркера не является строгим доказательством отсутствия в их геноме интегрированной векторной плазмиды, так как могла произойти утрата маркера, например, в ре-

зультате делении отдельных фрагментов ДНК плазмиды или точковых мутаций в гене хлорамфениколустойчивости. Для проверки этого предположения мы провели блот-гибридизации тотальной (геномной) ДНК мутантных штаммов, гидролизованной ферментами рестрикции ЕсоИ и ВашН1, с плазмидой рВЕ325, на основе которой сконструированы векторы семейства рБиР. В результате проведенного анализа было обнаружено, что у тотальной ДНК штаммов Т728, Т748 и Т837 гибркди-зуется один ЕсоЫ-фрагмент ДНК, в то время как у ДНК штаммов Т716, Т841, Т810 и Т835 ответов на данный зонд не было обнаружено. Отсутствие зон гибридизации у тотальной ДНК четырех штаммов является доказательством того, что в их геном не произошло интеграции вектора. Наличие же одного ответа у остальных четырех штаммов могло означать, что произошла интеграция не всего вектора в геном, а только какой-то его части, поскольку векторная плазмида содержит сайт для ЕсоИ!. На рисунке 1 представлена ги-

123456789

т.п.н. 21.2 9,4

6.6 4.4

2,3 2.0-

"Т

ш

Рис. 1. Гибридизация гидролизованных рестриктазой ВагпН1 тоталь-■ ных ДНК ЕГ ^-мутантов с плазмидой рВК325. Обозначения:

1. ДНК фага %-Н1п<Ш1, 2. рЗиР5011-Рзи. 3-9. Тотальные ДНК ЕГ^-мутантов: 3. Т728, 4. Т716, 5. Т748. 6. Т841. 7. Т835. 8. Т810, 9. Т837.

бридизация тотальной ДНК мутантных штаммов, обработанной BamHI, с плазмидой pBR325. Транспозон Тп5 содержит уникальный сайт для фермента рестрикции BamHI, расположенный на расстоянии 2,8 и 3,0 т.п.н. от концов транспозона. В плазмидах pSUP также имеется сайт для BamHI. При расщеплении тотальной ДНК мутантных штаммов, у которых плазмидная последовательность фланкирует оба "плеча" транспозона, должно гибридизоваться три фрагмента ДНК. У ДНК всех трех мутантов выявлено по три зоны гибридизации, одна из которых на всех дорожках была на уровне 10 - 11 т.п.н., вторая соответствовала фрагменту ДНК размером 3,2 т.п.н. Размер третьего фрагмента ДНК составил 5.5 т.п.н. (Т728), 15 - 17 т.п.н. (Т748) . и 5,0т.п.н. (Т837). На основании результатов данной гибридизации мы сделали вывод, что два фрагмента ДНК представляют собой последовательность векторной плазмиды с одним из пле-чей транспозона. а третий фрагмент ДНК является векторной последовательностью. Таким образом, мы показали, что три штамма -Т728, Т748 и Т837 несут в геноме последовательность вектора, фланкирующую оба "плеча" транспозона. Так как эти штаммы оказались непригодными для клонирования у них eff-генов, мы не использовали их в дальнейшей работе.

Кроме того, известны случаи включения в геном более одной копии транспозона (Rolfe et al.. 1983; Regensburger etal., 1986; Шарыпова, 1987). Поэтому для молекулярного клонирования мутантных eff-генов было необходимо подтвердить наличие одной копии транспозона в геноме Eff^-мутантов. Мы провели гибридизацию по Саузерну тотальной ДНК мутантных штаммов, гидролизованной Есо-RI, с зондом, содержащим HindiIi-фрагмент Тп5 размером 3,4 т.п.н. (рис. 2). Так как сайтов для фермента EcoRI в транспозоне Тп5 не существует, при единичной инсерции транспозона должен гибридизоваться только один фрагмент ДНК. С помощью этой гибридизации мы показали, что у штаммов Т716, Т841, Т835, Т810 произошла единичная истинная инсерция Тп5 в геном. Они и были отобраны для дальнейшей работы по клонированию eff-генов.

Клонирование Тп5-маркированних и немутантнъи копий генов "эффективности".

Из- отобранных в результате предварительного анализа Eff++ -мутантов Т716, Т841. Т835, Т810 штамма СХМ1-188, обладающих по-

1 2 3 4 5 6

23,1 , 9,4 , 6,6 4,4

2,3 2,0

W

— ч/

Рис. 2.. Гибридизация гидролизованных рестриктазой ЕсоК1 тотальных ДНК ЕГ£"++ -мутантов с 3,4 т. п.н. Н1пйШ-фрагментом ДНК транспозона Тп5. Обозначения:

1. ДНК фага Х-НШсИП, 2. рЗиР5011-Рза. 3-6. Тотальные ДНК ЕГГ+4-мутантов: 3. Т716, 4. Т841, 5. Т835, 6. Т810.

вышенной симбиотической эффективностью, а также высокоэффективного штамма Т152, который уже был проверен на наличие в геноме последовательности транспозона Тп5 и последовательности векторной плазмиды (Юргель, 1996), мы проклонировали из тотальной ДНК этих штаммов по EcoRI-сайтам фрагменты ДНК, смежные с Тп5, в вектор pUCl9. Гибридизационный анализ рекомбинантных плазмид с тотальной ДНК штамма СХМ1-188 показал, что проклонированные Фрагменты ДНК содержат последовательности ризобиальной ДНК, фланкирующие транспозон. После этого были построены рестрикционные карты рекомбинантных плазмид (рис. 3). Плазмиды были гидролизо-ваны рестриктазами EcoRI, BämHI, HindiII, PstI и Sali по отдельности и парами во всех возможных сочетаниях. Размер прокло-нированных фрагментов ризобиальной ДНК представлен в таблице 1.

eff 152

eff841

E P

H В

eff835

eff716

еШО

1 400 ООО 1400 2000 2400

ES H

, т .

1 50

В Р

750

Н

1550 Е S

1 2000 3 Т ?

3300 3800 4000

Р Р Н

9000 Р Е

8200 S400 S700

S Е -4-1

7350

7500 0150

В

6000

i

750 1100 2100 2300

I

4Б00

9000 S

7400

Рис. 3. Рестрикционные карты клонированных фрагментов ДНК у Eff++ -мутантов.

Обозначения: !ЗбЖашвва| - Тп5

Сайты рестрикции: Е - EcoRI, В - BamHI, Н - HindiII, - Р - Pstl, S - Sali.

Таблица 1. Размер клонированных фрагментов ДНК у Eff "'""'"-мутантов штамма СХМ1-188 R. meliloti.

Eff++- Размер Размер клони- Размер клонирован-

Плазмида мутант плазмиды рованного ного фрагмента ри-

(т.п.н.) фрагмента ДНК зобиальной ДНК

(т.п.н.) (т. п.н.)

pSK2 T716 10.60 8.05 0.20

pSK4 T841 12.30 8.70 2.90

pSK5 T835 10.85 8.15 2.35

pSK6 T810 21.70 19.00 13.20

pSK8 T152 12.00 9.30 1.60

Используя Тп5-мутантные последовательности ДНК, мы проклони-ровали копии еГГ-генов дикого типа. С помощью дот-гибридизации

фрагментов ДНК. содержащих Тп5-мутантные последовательности еГГ-генов. с банком генов, сконструированным нами на основе плазмиды рис 19, был выявлен клон, гибридизовавшийся с меткой. Для того, чтобы подтвердить тот факт, что проклонированный ЕсоЫ-фрагмент ДНК размером 1,5 т.п.н. содержит немутантную последовательность еШ52, мы провели блот-гибрщдазацию этой плазмиды, гидролизо-ванной ферментом ЕсоК1, с меченым дигоксигенином фрагментом ДНК плазмиды рБК8, содержащим мутантную последовательность еШ52. В результате данной гибридизации было показано, что проклонированный фрагмент ДНК включает в себя последовательность ДНК еШ52 дикого типа. Помимо этого, клонирование немутантных последовательностей еГГ-генов мы проводили с использованием вектора рК18-шоЬ. Основываясь на данных по рестрикционному картированию фрагментов ДНК, смежных с Тп5. мы подбирали ферменты рестрикции, которые позволили бы вырезать из тотальной ДНК гетерогенот (интег-рантов рК18шоЬ в геном штамма СХМ1-188) вектор вместе с фрагментом ризобиальной ДНК, содержащим немутантную последовательность гена. Далее фрагменты ДНК, содержащие немутантные последовательности еГГ-генов, были субклонированы в вектор риС19. С использованием вектора рК18шоЬ мы проклонировали немутантные копии генов е{{716, еГГ810, ■ еГГ841 и еГГ835. Размер субклонированных в векторе р11С19 фрагментов ДНК составил: е£П16 -6,2 т.п.н. (БаП-Рзг1). еГ Г 841 - 1,5 т.п.н. (ШпсИП-ЕсоЫ), еП835 - 3,2 т. п. к. (Н1пйШ-ВашН1), еГГ810 - 4,3 т.п.н. (Н1гкПП-ВатН1). С помощью блот-гибридизаций мы подтвердили наличие в проклонированных фрагментах ДНК последовательностей еП"-геноБ "дикого" типа (рис. 4). Подготовка фрагментов ЛИК, смежных с шранспозоноуи, к секеениро-ванию.

Подготовка фрагментов ДНК к секвенированию от праймера, гомологичного концевой последовательности транспозона заключалась в субклонировании фрагментов ДНК, включающих правое или левое плечо транспозона и смежную с ним последовательность ризобиальной ДНК. В соответствие с данными, полученными при рестрикцион-ном картировании плазмид. содержащих клонированные ЕсоЫ-фраг-менты ДНК, мы субклонировали последовательности ризобиальной ДНК

123456789 123456789

Рис. 4.. Электрофорез и блог-гибридизация по Саузерну рекомбинан-тных плазмид, рестрицированных по сайтам клонирования фрагментов ризобиальной ДНК.

Обозначения: 1. 2, 3, 4 - Тп5-мутантные копии еГГ-генов. 5, 6, 7, 8 - копии генов "эффективности" дикого типа. 9 - ДНК фага Я.-Н1псШ1. 1 и 5 - еГГ810, 2 и 6 - еГГ841, 3 и 7 - еГГ835, 4 и 8 - еГГ-716. В качестве зонда использована смесь меченых дигоксигенином фрагментов Тп5-му-тантных копий генов еГГ716, еГГ835. е Г Г 810 и еГГ841.

в вектор риС19. Результаты этой работы представлены в табл. 2. Размер проклонированного ЕсоК1-фрагмента ризобиальной ДНК еШ16 (табл. 4) оказался недостаточным для выявления гомологии с последовательностями ДНК из генбанка данных. Поэтому из тотальной ДНК штамма Т716 мы проклонировали ВашН1-фрагмент ДНК. включающий в себя Кш -"плечо" Тп5 и прилежащий к нему геномный фрагмент ДНК размером 6,0 т.п.н. (рис. 3. табл. 2).

Таким образом, нами были сконструированы рекомбинантные плазмиды, включающие в себя фрагменты ризобиальной ДНК, фланкирующие плечо транспозона. Эти плазмиды можно было использовать для секвенирования последовательностей ризобиальной ДНК, с применением праймера, гомологичного концевой последовательности Тп5.

Таблица 2. Рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты ДНК eff-генов, смежные с одним из IS-элементов транспозона Тп5.

Транспозант, Размер клони- Размер клони- Сайты

из которого рованного'"'.',- рованного фраг- клони-

Плазмида клонирован' фрагмента' ДНК мента ризоби- рования

фрагмент ДНК (т.п.н.) альной ДНК (т.п.н.)

pSK21 Т716 3.0 0.1 BamHI-EcoRI

pSK22 Т716 2.9 0.1 BamHI-EcoRI

pSK23 Т716 9.0 6. 0 BamHI

pSK41 Т841 3.4 0.4 BamHI

pSK51 Т835 4.55 1.55 ■ BamHI-EcoRI

pSK52 Т835 3.6 0.8 BamHI-EcoRI

pSK61 Т810 7.4 4.8 Sail

pSK81 Т152 3.3 0.3 BamHI-EcoRI

pSK82 Т152 4.1 1.3 BamHI-EcoRI

Секвенщюеаше последовательностей ДНК, смежных с транспозоном Тп5. и сравнение просеквенированных последовательностей ДНК с последовательностями ДНК из генетического бант данных.

Мы секвенировали фрагменты ризобиальной ДНК, смежные с транспозоном Тп5, от концевой последовательности IS50, используя праймер TN0UT. В результате была определена первичная нукле-отидная последовательность фрагментов ДНК, размером от 180 п.н. до.,546 п.н. (табл. 3). После получения данных о первичных последовательностях ДНК, смежных с транспозоном, мы провели сравнение этих последовательностей с последовательностями ДНК из генбанка данных (GeneBank) (табл. 3; рис. 5). Процент гомологии определяли по количеству идентичных аминокислот и по количеству идентичных 'аминокислот плюс количество сходных по физико-химическим свойствам.аминокислот (в тексте такой процент гомологии указан в скобках). В таблице показан процент гомологии по аминокислотным последовательностям, предоставленный генбанком, и процент гомологии, определенный нами как отношение общего количества просек-

Таблица 3. Последовательности ДНК ИЗ гсибаика данных, гомологичные генам "эффективности " K.rncliloti

ГЕНЫ. ИМЕЮЩИЕ НАИБОЛЬШИЙ ПРОЦЕНТ ГОМОЛОГИИ С ГЕНАМИ ЭФФЕКТИВНОСТИ

ШТАММЫ, из КОТОРЫХ КЛОНИРОВАНЫ ФРАГМЕНТЫ ДНК (ЛОКАЛИЗАЦИЯ Тп5) КОЛИЧЕСТВО ПРОСЕКВЕНИ-РОВАННЫХ НУКЛЕОТИ-ДОВ(П.Н.) Ген Белок Организм Процент гомологии (данные генбанка) Процент гомологии(по 1 отношению к общему количеству просеквешфованных нукле - OR) 1

Идентичные аминокислоты Идентичные и сходные аминокислоты Идентичные аминокислоты Идентичные и сходные аминокислоты

Т716 (Mi) S07 fadB З-гидрокси-ацил-КоА-дегидрогеназа Bos taurus 65 76 46 63

*Т152 (хр) 117 179 phbA (phaA) Бета-Kf готнол;|ЗУ R meliloti 94 69 100 73 94 69 100 73

! TS35 (М2) 546 471 OppD Олнгопептид-ная пермеаза E.coli 54 48 69 66 42 40 58 53

T84I (М2) 180 Нет гомологии - - - - - -

T8I0 (М2) МО Нет гомологии - - - - - -

* - секвенирование проведено Л.А.Шарыповой.

Рис. 5.. Сравнение аминокислотных последовательностей eff-генов с последовательностями из генетического банка данных. Обозначения: : - идентичные, + - похожие аминокислоты.

е//716 (PSK23):

З-гидроксиацил-СоА дегидрогеназа (ген fadB Bos taurus). eff716: 7 vncagtapgek 17 . 19 Igrsgphaläsfartvavnligt 41 •.::::: : : +: : :+ : : + :::::: fadB : 89 vncaglavask 99 . 103 Ikksqahtledfqrvinvnligt 125 eff716: 42 fnmirlaaevmsqgepdadgergvlvntasiaafdgqigq 81 ::+::: : : : ::: +:+::::+::::+:::+:: :: fadB : 126 fnvirlvagemgqnepdqggqrgvilntasvaafegqvgq 165 eff7l6: 106 glrvvtiapgifdtpmmagmpqdvqdalaasvpfpprlgraeey 149 ::::+:::::+: ::++ +: :++::+:::: ::: :: fadB : 170 girvmtiapglfgtpllttlpdkvrnflasqvpfpsrlgdpaey 203 eff7l6: 150 aalvkhlcentmlngevirl 169 : ::+ : ::+:::::::: fadB :' 204 ahlvqaliensflngevirl 233

eff835 (pSK51):

АТФ-связыващий белок OppD, вовлеченный в олигопеппидный транспорт (ген oppD Escherichia coli).

eff835: 6 pdllladepttaldvtlqaqlldllkslqrTfgmalvlltMlgi 50 :++::::::::::::++::::: ::+ :: :++:::+: : oppD : 175 pellladepttaldvsvqaqllqllrelqgelnffigmlfittmlsi 219 eff835: 51 vkyfadrvavrarrgevveqgmtadlferpkelyytrmlleaepsg 96 :+ ::::::+: ::: : +: : :::+::+:::: oppD : 220 vrklahrvavraqngrcveqnyaatlfaspthpyytqkllnsepsg 264 eff835: 130 vdgvnlrlrqgqtigivgesgsgkstlgrallkllpssgyyrfgs 174 : ++ :: :+:+:+:::::::::: : :::+:+: : : oppD : 302 vknisftlragetlglvgesgsgksttglailrllnsqgsllfdg 346 eff835: 175 tdisgfdr 182 + +:

oppD 347 qplqnlnr 354 eff835 (pSK5Z):

eff835: 154 lkvdfstpdgtveavkgidldvvpgetlavvgesgsgksqtmmg 109 : +: :::::: : :: ++ + :::: +::::::::::: oppD : 35 lrvtfstpdgdvtavndlnfslragetlgivgesgsgksqtafa 78 eff835: HO imgllakngtvpgfgxyrgqelvglapkalnkvrgskitmifqepmt 64

oppD : 79 Imgllaangrlggsatfngrellnlpehelnklraeqlsmlfqdpm't 125 eff835: 62 ldplytlgrqiaeplvhhrggs 41 :+: +: :+ : ++ :+ : oppD : 127 Inpymrvgeqlmevlmlhknms 148 eff835: 31 llelrrlaepgrrldsyphels 10 +:+ ++ : +: + :::: : oppD : 149 mldavkrapearkrmkmyphefs 170

венированных нуклеотидов {в аминокислотах) к общему количеству идентичных и сходных аминокислот. Далее в тексте будет указываться вычисленный нами процент гомологии. В тех случаях, когда сек-венировались последовательности ДНК одного eff-гена, смежные с правым и левым плечами транспозсна, мы использовали среднюю от данных сиквенса по двум плечам.

Было выявлено, что две последовательности (effSlO и eff84l) не имеют гомологии с какими-либо ранее просеквенированными последовательностями ДНК, то есть они представляют собой ранее неизвестные гены, контролирующие симбиотическую эффективность у клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti.

Последовательность eff152 гомологична (идентичность - 90%) последовательности гена phbA (phaA) штамма Rm41 R.melllotl, кодирующего фермент кетотиолазу, вовлеченную в синтез и деградацию поли-бета-оксимасляной кислоты (ПОМ). Инсерция транспозона произошла в открытую рамку считывания на расстоянии приблизительно 90 п.н.. от точки инициации транскрипции.

Последовательность eff7l6 гомологична последовательности ДНК, кодирующей 3-гидроксиацил-СоА дегидрогеназу у эукариотичес-ких видов Bos taurus, Horao sapiens, Mus musculus, Caenorhaödltls elegans. Наибольшее сходство наблюдалось с последовательностью этого гена у Bos taurus - 46% (63%). Инсерция транспозона произошла в открытую рамку считывания. В сравниваемой последовательности гена Bos taurus сайт инсерции транспозона находится приблизительно в районе двести сорокового нуклеотида от точки инициации транскрипции.'

Последовательность eff835 гомологична последовательности гена oppD, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт олигопеп-тидов а клетку (один из компонентов олигопептидной пермеазы) у многих видов бактерий. Наибольший процент гомологии был выявлен между последовательностью eff835 и последовательностью гена oppD Escherichia coli. Инсерция транспозона произошла в открытую рамку считывания. В сравниваемой последовательности гена oppD Е. coli сайт инсерции находится приблизительно в районе пятьсот двадцатого нуклеотида от точки инициации транскрипции.

Таким образом, в данной работе мы показали, что повышение симбиотической эффективности у мутантов Т716, Т835 и Т152 штамма

CXMl-188 R.meliloti связано с мутациями в генах, продукты которых вовлечены в различные пути энергетического метаболизма бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Среди семи Тп5-мутантов штамма CXMl-188 Rhizobium meliloti -Т748, Т837. Т728, Т716, Т810, Т835 И Т841, обладающих повышенной симбиотической эффективностью (Ef ^-мутанты), отобрано четыре мутанта, являющихся истинными транспозантами, для клонирования последовательностей ДНК, смежных с транспозоном Тп5, и секвени-рования этих последовательностей ДНК.

2. Проклонированы в векторе pUCl9 последовательности ДНК, смежные с транспозоном, у мутантов Т152, Т716, Т810, Т835 и Т841.

3. Построены рестрикционные карты рекомбинантных плазмид, содержащих мутантные копии eff-генов, и определен размер проклони-рованых фрагментов ДНК (от 200 п.н. до 13.2 т.п.н.).

4. С помощью вектора pK18mob проклонированы немутантные последовательности eff716. eff810, eff841 и eff835. Клонирование последовательности eff152 дикого типа осуществлено с помощью сконструированного нами на основе вектора pUC19 плазмидного банка генов.

5. Выявлены два гена (eff810 и eff841), не имеющие гомологии с какими-либо ранее просеквенированными последовательностями ДНК. Таким образом, обнаружены неизвестные ранее гены, влияющие на симбиотическузо эффективность клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti.

6. Показано, что три eff-гвна R. meliloti имеют гомологию с известными ранее генами. Последовательность eff152 гомологична последовательности гена phbA (phaA) R. meliloti вовлеченного в биосинтез и деградацию поли-бета-оксимасляной кислоты (90% гомологии по идентичным аминокислотам и 92% по идентичным и сходным аминокислотам). Последовательность eff?16 гомологична последовательности гена fadB Bos taurus, вовлеченного в бета-окисление жирных кислот (46% и 63% гомологии). Последовательность eff835 показала наибольший процент гомологии (41% и 55%) с последовательностью гена oppD Е. coli, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт в клетку олигопептидов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Sharypova L.A., Onishchuk О.Р., Sagulenko Е.А., Evdonln A. L.. Chlzhevskaya E.P. Melanin production by Rhlzobium meliloti strains Isolated from Central Asia. Proc. 10-th Intern. Congr. on Nitrogen Fixation, Saint-Petersburg, Russia, May 28 - June 3, 1995, p. 416.

2. Сагуленко E.А., Шарыпова JI.А., Кроль E.A., Симаров Б.В. Клонирование генов "эффективности" Rhlzoblum meliloti с использованием вектора pK18mob. Генетика. 1998. Т.34. N7. С.903-907.

3. Чижевская Е.П., Кроль Е.А., Онищук О.П., Сагуленко Е.А., Фо-мина-Ещенко Ю.Г., Симаров Б.В., Шарыпова Л.А. Физическое и генетическое картирование мутации симбиотической эффективности на мегаплазмиде-2 штамма СХМ1 R.meliloti. Генетика. 1998. Т.34. N9. С.1220-1227.