Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологический анализ генов Sinorhizobium meliloti, вовлеченных в контроль симбиотической эффективности и модуляционной конкурентоспособности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологический анализ генов Sinorhizobium meliloti, вовлеченных в контроль симбиотической эффективности и модуляционной конкурентоспособности"

Л-ШВЪ'

На правах рукописи

ЧИЖЕВСКАЯ Елена Петровна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ БЫогЫюЫит теШоН, ВОВЛЕЧЕННЫХ В КОНТРОЛЬ

СИМБИОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ И НОДУЛЯЦИОННОЙ КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТИ

Специальность: 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации нр соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 2003

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Снмаров Борис Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Миронова Людмила Николаевна,

кандидат биологических наук Проворов Николай Александрович.

Ведущее учреждение: кафедра микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета

Зашита диссертации состоится 25 декабря 2003 г. в 11 часов на заседании специализированного Ученого совета К 006.028.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан 24 2003 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета: кандидат биологических неук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы. Бобо во-р и зоб на льны и симбиоз уже давно привлекает внимание специалистов, работающих в самых различных областях биологии. Интерес к этой биологической системе особенно резко возрос в последние голы, когда появилась возможность проводить генетический и молекулярно-биологический анализ наследственных факторов, детерминирующих признаки клубеньковых бактерий, необходимые для вступления в симбиоз. Так, за последние 15 лет у клубеньковых бактерий были выявлены и подробно изучены гены, контролирующие все качественные симбиотические признаки - вирулентность, азотфиксирующую активность и хозяйскую специфичность.

Долгое время единственным способом повышения интенсивности симбиотической азотфикеащш был подбор природных активных штаммов клубеньковых бактерий, на основе которых готовили препарат нитрагин, используемый для предпосевной обработки семян бобовых. На сегодняшний день, благодаря бурному развитию методов молекулярной генетики и генной инженерии, появилась реальная возможность направленно конструировать высоко эффективные штаммы клубеньковых бактерий. Однако производственные штаммы, обладающие высокой нитрогеназной активностью и симбиотической эффективностью, в полевых условиях часто не способны конкурировать за образование клубеньков с находящимися в почве штаммами "дикого типа". Поэтому в настоящее время наибольший научный интерес и практическую значимость представляет выявление и изучение генетических детерминант, контролирующих количественные симбиотические признаки клубеньковых бактерий - эффективность (способность увеличивать массу растений и накопление в них азота по сравнению с контролем без инокуляции) и нолуляционную конкурентоспособность (способность образовывать клубеньки на корнях растения-хозяина в присутствии других штаммов того же вида).

Цели и 1адач и исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении генетических детерминант, вовлеченных в контроль симбиотической эффективности и нодуляционной конкурентоспособности клубеньковых бактерий люцерны (ЗюпгЬкоЫит теШоп). Конкретными задачами данной работы являлись:

1. Картирование на метаплазм идах 5. теШоп семи генов, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности и одного гена, мутация в котором приводит к снижению конкурентоспособности.

2. Клонирование в мультикопниных векторах мутанткой и "дикой" копни гена стр-107, вовлеченного в контроль нодуляционной конкурентоспособности штамма СХМ1-105 5. теШоН. Определение и анализ нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК.

3. Проведение сайт-направленного мутагенеза гена стр-10~ у родительского штамма СХМ1-Ю5 и анализа конкурентоспособности у полученного мутанта. Комплементаииониый анализ гена стр-107 у мутанта Т107, обладающего сниженной конкурентоспособностью.

4. Анализ экспрессии гена стр-107 в чистой кулътуре_и в,сим§ШХ11чеш 1.\ уСловиях.

с/'Ш^

л**:'___г

Научная новизна работы. На мегаплазмндах S. тек!он картировано пять генов, мутации в которых приводят к повышению сшбиотической эффективности штаммов, и один ген, мутация в котором приводит к снижению нодуляционной конкурентоспособности. Показано, что euie два гена, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности, локализованы на мегаплаз-миде-I за пределами nod-nif региона.

Впервые проведен молекул ярмо-биологический анализ гена, мутаиия в котором приводит к снижению модуляционной конкурентоспособности штамма СХМ1-105 S. meliloti при симбиозе с Medicago saliva. Доказано, что функционирование гена стр-107 действительно влияет на способность штамма CXMI-105 конкурировать за образование клубеньков. Обнаружено, что стр-107 представляет собой самостоятельную транскрипционную единицу и кодирует заякоренный в клеточной мембране 45 кДа протеин, функция которого неизвестна. Показано, что стр-107 экс премируется у свободноживущих клеток S. meliloti, а также на самых ранних этапах становления симбиотических взаимоотношений, и не функционирует в азотфиксирующих бактероидах.

Практическая ценность. На генетические карты мегаплазмид клубеньковых бактерий люцерны нанесено шесть новых генов, принимающих участие в контроле важнейших симбиотических признаков - эффективности и нодуляционной конкурентоспособности. Построенные карты несут дополнительную информацию о структуре генома клубеньковых бактерий, а картированные мутации могут быть использованы в качестве "опорных точек" для дальнейшего построения генетических карт метаплазм ид S, meliloti.

Выявлен и проанализирован ген стр-107, вовлеченный в контроль нодуляционной конкурентоспособности штамма СХМ1-105 5, meliloti. Проведение таких исследований способствует наиболее полному выявлению молекулярно-генетических основ ранних этапов симбиотического взаимодействия и создает предпосылки для направленного конструирования хозяйственно ценных штаммов клубеньковых бактерий.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на X (С.-Петербург, Россия, 1995) и X] (Париж, Франция, 1997) Международных конгрессах по азотфиксанин, а также на Х[ Международном конгрессе по молекулярным растительно-микробным взаимодействиям (С.-Петербург, Россия, 2003). Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, описания материалов и методов, 2-х гнав экспериментальной части, каждая из которых содержит результаты и обсуждение, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 54 рисунка. Список литературы включает 476 наименовании, из них 38 - па русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Штаммы Siiiorhi-.оЫит meliloti. Основным объектом исследований являлись штаммы СХМ1-105 и СХМ1-188 (Федоров, Снмаров, 1987), а также их высоко

эффективные "Пи-мутанты - Т482, Т841. Т798. Т810, Т835 (Сцмаров п др., 1990а). ТЬ7, ТЫ9 (Юргель и др., 1996) и транс шва irr Т107, обладающий сниженной конкурентоспособностью (Onishcfiuíc et al., 1994),

Дня картирования мутаций были использованы следующие штаммы; Rml021 (Meade et al., 1982), его ТпЗ-мутанты - Rml24 (emV ::Tn5-B20) (Müller et al., )993), RMS37 {dciA ;;Tn5) (Engelke et al., 1987), Rm8002 (expA ::TnJ-Gm) (Keller et al., 1995) и делеционные мутанты RmFU7, RmF514, RmF638. km Fi 66, RmF693, RmF72ft, Rm5416, RmF728, RmG470 и RmG471 (Charles, Finan, 1991); штамм AK631 и его делеционные мутанты ZB121, ZB129, АК635 (Kondorosi et ai., 1984); штамм САЗО-2, способный к синтезу меланина.

Для размножения бактериофага использовали нелизогенный штамм L5-30 (Kowalski, 1965). При определении размера плазмид был использован штамм M VII, содержащий плазмиды известного размера (Kosier et al., 1993). В экспериментах по изучению экспрессии генов, в качестве положительного контроля, был использован штамм М4, содержащий конститутивно экс пресс пру ю щи йся ген gusA (Selbitschka et al,, 1995).

Штаммы Escherichia coli Для клонирования фрагментов ДНК был использован штамм DH5a (F, recAl, endAl, &<rA96, hsdRl7, deoR, A{tacZYA-argF)\]\69) (Grant et al., 1990), Для получения R'-плазмид использовали штамм НВ101 (гее A, hsdS, lisdM, lacY, pro, leu, thi, gal, Rf*) (Banfaivi et al., 1983). Конъюгаци-онный перенос плазмид проводили с использованием штамма S17-I, в хромосому которого интегрирована плазмида pRP4 (Тс::Л/к, Km::Tn7) (Simon et al., 1983).

Плазмиды. В качестве векторов для клонирования были использованы плазмиды pTZ 19 R {/acZ: : M13 m р, Apft) (Mead et al., 1986), pK18moÄ (mob, /tfcZ::M13mp, Ар , KmR) (Shafer, 1994) и вектор pCa m b ¡a 12 00 (lacZ: : M13 mp, CinR), способный к репликации в клетках клубеньковых бактерий (Cambia, Австралия, 1998). Мобилизацию ре пли ко но в S. meliloti проводили с использованием плазмиды RP4-4 (Km::Тп?, TcR) (Simon et al, 1983a). Для конструирования транскрипционного слияния была использована плазмида pCambial381Xa (lacZ::M9mp, gusA без промотора, KmR) (Cambia, Австралия, 1998).

Для приготовления гибридизаиионнах зондов были использованы следующие плазмиды (клонированный фрагмент генома S. meliloti ! вектор): рК$К5 (nodA BCD,/pRK290) (Kondorosi et al., 1984); pIDI (ni/KDH/pBR322) (Banfaivi et al,, 1981); pRm\V541-10 („i/AtpACYC 177-C) (Weber et al., 1985); pGMI1119 (noe/WLrtooKVpLAFR) (Ardourel et al„ 1995); pSK5 (<?#Ä35;:TnJ/pUC18), pSK6 (eff-S 10::Tn5/pUC 18), PSK4 (<#W/::TnJ/pUCt8) (Сагуленко и др., 1998); pLS7 (í//--/S2/pUClS) (Sharypova et al.. 1999); pLS9 (^-7^::Tnj/pSUP202), pSKll (red- 7 : : Tro -m o¿/pU С18), pLK6 (red-19: :Tri>mofo'pUC i S). (Чижевская и др., 1998); pLcl07 (anp-107::Tni-woè/pTZ 19R ), pLw!07-l (cwp-/07/pK18mo£>) (Chizhevskaya et al., 2003).

Методы. Выделение геномной ДНК проводили по стандартной методике (Meade et а!,, 1982), Для выделения плазмидной ДНК использовали метод щелочного лизиса. Реакции рестрикции, лнгирования, электрофорез в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля проводили по общепринятым мето-

ó

дикам (Маниатис и др., 1984), Перенос ДНК in геля на нейлоновый фильтр (Hybond-N Amersham) осуществляли по стандартной методике (Маннатис и др., 1984) с использованием вакуумного прибора VaknGene XL (Pharmacia LKB Biotehnology). Саузерк блот-гибриди шшю проводили с использованием набора для иерадиоакнвного мечення дигоксигенином (DfG) по инструкции фирмы-изготовителя (Boehringer-Maiinheim. Германия). Плазм иды бактерий анализировали методом лизиса в геле (Eckhardt, 1978) в модификации (Нупез et al., 1986).

Определение нуклеотидной последовательности ДНК осуществляли с помощью секвенатора A.L.F. DNA Sequencer с использованием набора для секве-нирования AutoRead sequencing kit (Pharmacia). Для определения нуклеотиднык последовательностей ДНК, смежных с транспозоном, был использован праймер 5'-GAGAACACAGATTTAGCCCAG-3\

Конъюгацноннме скрещивания проводили го стандартной методике. Приготовление компетентных клеток Е. coli н трансформацию плазмидами осуществляли по методу высокоэффективной трансформации (Htroaki et al, 1990),

Получение фаголизатов и трансдукцию с использованием фага (Finan et al-, 1984) проводили по лабораторной методике (Новикова и др„ 1984), Тнтр бактериофага в фаголизатах определяли методом агаровых слоев (Адаме, 1961).

Принцип картирования при обшей транедукции включает понятие котранс-дукиии, т.е. совместного переноса генетических локусов, который является критерием сцепления генов. Размер фрагмента бактериального генома, который может быть перенесен при транедукции, ограничен и не превышает емкость фаговой головки. Если при переносе селектируемого маркера донора полученные транедуктанты, в результате гомологичной рекомбинации, утрачивают неселективный маркер реципиента, то можно утверждать, что маркированные локусы котрансдуцируются и расстояние между ними не превышает размер генома трансдуцируюшего фага. Частоту котранедукцин определяют как соотношение количества котранедуктантов к общему числу транедуктантов.

Частоты котранедукцин могут быть переведены в расстояния между маркерами с помощью уравнения By (Wu, 1966): x=(l-(d/L)\ Эта формула может быть преобразована в другую: d = Ц1 - Wx), где: d - расстояние между селективным и неселективным маркерами, L - размер фрагмента трансдуцирующеИ ДНК (для (JÍM12 = 160 т.п.н.), х - частота котранедукцин. При применении трехсайтовых скрещиваний порядок расположения локусов был определен на основании критерия минимума множественных кроссинговеров, необходимых для образования данных генотипов (Захаров, Мацелюх, 1986).

Анализ конкурентоспособности штаммов meliloti проводили в условиях стерильного микровегетационного опыта (Федоров и др., 1983) при совместной ннокуляиии проростков люцерны (MeJicago saliva, сорт Вега) исследуемым мутантом и.родительским штаммом. Через 5 недель после инокуляции из образовавшихся клубеньков выделяли ргообнальные штаммы и идентифицировали их но маркерам пнтнбиогикоустоПчтюстн. Процентное отношение клубеньков, образованных каждым из штаммов, сопоставляли с процентным отношением количества клеток каждого штамма в исходном инокудюме.

Наличие или отсутствие экспрессии химерного гена cinp-¡Q~::gusA опреде-

ляли по активности ß-тто корон идазы - продукта ре портер кого гена giM.-l. При тестирования активности глюкоронилазы у свободноживуших бактерий штаммы .S. meíiioti пыращивати на твердой среде с добавлением X-Gluc (120 мг'л).

При тестирования активности глюкоронилазы d азотфиксирующих клубеньках с использованием внбротома VT tOOOS {Leica, Wezler, Германия) были получены Ю0 мкм срезы клубеньков (5 недель после инокуляции), окрашены в растворе, позволяющем визуализировать наличие глюкоронидазиой активности (Wilson, 1995), и проанализированы с использованием светового микроскопа Axiolab (Zeiss). Для тестирования активности глюкоронилазы в инфекционных нитях было проведено аналогичное окрашивание и микроскопия корневых волосков проростков люцерны через 5 дней после инокуляции.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдеита (Лакин, 1980), Компьютерную обработку нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программ GeneWorks 2.5.1 и Тор Predi!, Сравнение последовательностей с банком генов GeneBank проводили с использованием программы BLAST (www.псЫ.пíni nili.gоv).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ. I. Картирование мутаций симбиотической эффективности И н оду ля и ионной конкурентоспособности на мегаплазмндах S. теШоЧ. Ранее с использованием транспозонового мутагенеза в лаборатории генетики н селекции микроорганизмов ВНИИСХМ была получена коллекция разнообразных сим биотических мутантов S. mehSott. В частности, были отобраны мутанты, обладающие повышенной симбиотической эффективностью (EfF*-фенотин) (Симаров и др., 1990), мутанты, проявляющие одновременно измененный ре до кс-потенциал и повышенную симбиотическую эффективность (Rcd+T-фенотнп) (Юргель и др., 1996), а также мутант, характеризующийся снижением модуляционной конкурентоспособности (Cmp'-фенотнп) (Onishchuk et al., 1994), Нашей задачей являлось картирование некоторых из этих мутаций.

1, Делщиопное и генетическое картироеаниг мутаций сим6иопт ческой эффективности на мега1пазлтде-2.

Три е^мутации (у траиспозантов Т798, T8I0, TS35) и две гес/-мутацин (у траиспозантов ТЬ7 и ТЫ9) предварительно были локализованы на мегаплазмн-де-2 (М2), однако их точное расположение было неизвестно. Размер М2 S, meíiioti составляет более 1600 т.п.н. (Finan et al., 2001), поэтому на первом этапе картирования мы локализовали исследуемые eff- и мутации □ пределах строго ограниченных делецнй М2.

Для этого была проведена серия Саузерн блот-гнбрплизаций геномной ДНК десяти мутантов, содержащих различные делецни М2, с зондами на eff- и т/-ло-кусы, В каждом варианте было выявлено по одному делешюнному мутанту. ДНК которого не дает положительного ответа при гибридизации с каким-либо eff- или recZ-зондом. Это означает, что анализируемый лок>с отсутствует в геноме мутанта и находится в пределах данной делецип. (8 качестве примера на рисунке I приведен гибридпзационгшй анализ с тоггдом на локус eff-835). Проведенный пюрпдизационный анализ позволил установить, что четыре муташш

Рисунок I. Саупри блот-гнбршнпйцпомыый Янллт рсстршшровпнноП ферментом ДНК" штаммов тсП/о11 с фрагментом р8К5, содержащим локус е//-835.

12 } 4 5 4 1 [9 Ю II 11 ¡1 И 15

»1.0

Дорожки'

2) Т835,

3) СХМ1.

4) 1*1п20И.

5) ЯглР] 17

6) КтПМ

7) ЛтРбЗК

8) 1?тГбб6.

9) КтГОЧЗ.

10) 1?тР726 [ [) КтР728. !2)1*т5416 13) Р.т0470.

15) Л (//миЙ11)

(г]/-798, е//~835, гЫ-7 и гей-19) расположены в регионе М2, размер которого не превышает 400 т.п.н. Еще одна мутация е/]'-8!0 была локализована в удаленном от каких-либо генетических маркеров регионе М2 (рис. 2).

После определения местоположения е//- и red-.no кусов на М2 было осуществлено более тонкое генетическое картирование мутаций с использованием транс Аукционного анализа как в двух-, так и в трехсайтовых скрещиваниях.

На первом этапе работы было изучено сцепление е//- и гег/-мутаций между собой. Для этого был проведен ряд попарных транедукционных скрещиваний, в которых в качестве доноров выступали канам шину сто Ггч и в ые (Ктл) и гей-мутаиты. а в качестве реципиентов гептамнци »устойчивые (От&) варианты транспортов Т798, Т8Ш и Т835, которые были получены путем гомологичной замены Тп5 на его производный Тп5-От, В общей Рисунок 2. Локалтаиия <■//- и геД'Мутаций в лре-сложности было отобрано делах строго ограниченны* делеинй М2 и проанализировано 1085 ' 1

транедуктантов. Сцепление было обнаружено для четырех локусов - сЦ- 795, ге<1-7 и т/-/9.

Па следующем этапе был проведен анализ сцепления е)У- и гЫ-мутации с ранее картированными на М2 генами ехрЛ, ехоХ и скчА, В скрешиваннях в качестве доноров были использованы Кшк мутанты Т798. Т810, ТЗЗэ' Т1>7, ТЫ 9. ЛМ537(ЛеМ:;Тп5), Яш 124 (т>А'::Тп5-А?0), а в качестве реципиентов От* мутанты К т8002.

T798Gm, TS)OGm, TS35Gm. Было проведено 8 вариаитоа попарных трансд\ к-циониых скрецшзаямй, отобрано и проанализировано î К02 траисдуктанта. Как и предполагалось, для локусов ejf-798, eff-835, red-7 и red-}9 было обнаружено сцеплен не с геном ехрА. а гены етаУ и dctA остались за пределами досягаемости дли бактериофага ф М12.

Кроме этого был пров еде » анализ сцепления ejf- и ге^-мутаций, а также генов ехрА, ехоХ и dctA с геном биосинтеза меланина {тер-30) у природного изо-лята САЗО-2 S. meliioti. В проведенных скрещиваниях было отобрано 1273 грансдуктакта, которые затем были проверены на наличие несеяектнвного маркера реципиента - продукции меланина. Было выявлено сцепление гена мер-30 как с ехрА геном, так и с локусами eff-798, eff-835, red-7 и red-19.

В согласии с результатами делеционног» картирования, мутация eff-3 ! О не котрансдуцироаалась ни с одним нз использованных маркеров. Поэтому для картирования этого л о куса был применен иной подход - местоположение df-SlO было установлено относительно "конечных точек" двух соседних лелешш F638 и F693. Следует сказать, что эти делешюиные мутанты вместо удаленных фрагментов М2 содержали инс-ерции транс поз она Тп 5-233 (GmR). (Charles, Finan, 1991), Данное обстоятельство позволило восполнить недостаток генетических маркеров М2 и предостааило возможность провести картирование eff-SSO. В траисдухциониых скрещиваниях между донором - трансиозантом TS10 (Ктпй) и реципиентами - делецио иными мутантами RmF63S и RmF693 (GmR) были отобрано 470 траисдуктантов. Как и следовало ожидать, было обнаружено сцепление маркеров KmR a GmR. По частотам котрзнедукшш были определены расстояния между eff-810 и "конечными точками" делений F638 и F695.

Для однозначного картирования мутаций был проведен трехсайтовый транеду к иконный анализ трех вариантов скрещиваний. В качестве доноров были использованы KrnR транстванты T79S и ТЫ 9, а в качестве реципиентов выступали транедуктанты (Тд) из дополнительно проведенных скрещиваний Тд(Кт8002 х САЗО-2) и Тд(Т835Ст х САЗО-2), которые несли одновременно два маркера - (Jm* и способность к продукция меланина (Мер*). Всего было отобрано и проанализировало 456 траисдуктантов. Проведенный анализ позволил по частотам котранедукцни вычислить растоянш между маркерами и по критерию минимума множественных кроссинговеров, определить наиболее вероятное расположение маркеров Km", GmR и Мер".

В обшей сложности было проведено 35 вариантов скрещиваний, отобрано и проанализировано более 5000 траисдуктантов. Сведя воедино все данные по картнрованшо мутаций, нам удалось построить генетические карты сцепления для двух районов М2 S. meliloti, Первый район охватывает ошло 160 т.п.н. и включает ло кусы тер-30, red-7, eff-798, eJf-835, red-/9 и ген ехрА. Второй район охватывает около 70 т.п.н, и включает локус eff-S/0 (рис. 3).

2. Дпгцтншое и фттеекое картирование мутации сим ôuorni чес ко « ?</i-ф ските и ост и и ниду.мционной конкурентоспособности на мегап.ипмиде-}.

Две (^-мутации {у транегюзанит Т482 и Т841 ) и одна т/>-мутаиий (у транспозанта TI07) были локализованы на мегаплазмнде-! (Ml), однако ну

Ригу но к J. Генетические tea рты двух ре ню нее мггаплязмиды-З S. meliloth охваты sawшне: я) - J60 т.п.и., С) - 70 т.п.«. Расстояния на картах папы в т.п.п., в скобках указаны доверитель и bit интервалы.

rfi- ~

яер-30 t ci'-.y^ expA rtd-1?

-----LJ---„J-----J.-!_I_....

-J) in-ttl->«- it(f-m> -WiU.- Л -v

<- «fn-W/ -n- iifJMJ) -*

tidt-ff)

«(<0- W7)

U (7 l-l tí)

lfí93 eff-m ДЮ1

......X_I-L...

точное расположение было неизвестно. Размер Ml у Я meliloti составляет более 1300 т.п.я (Barnet et al., 2001), поэтому на первом этапе картирования мы определили локализацию eff- и cm;?-мутаций относительно делешш М1.

В нашем рас по ряже ни и и имелись три мутанта с делениями Ml (ZBI2I, ZBI29 и АК635), у которых одна из "конечных точек" была картирована в nod-nif регионе (рис, 4). Саузерн блот-гибридизацноиный анализ геномной ДНК де-леиионных мутантов с зондами на eff- и ояр-локусы покачал, что анализируемые мутации находятся за пределами nod-mf региона и расположены "вверх по течению" от генов nodABCD¡, в районе вторых "конечных точек" делецяй с неизвестной локализацией. При этом было обнаружено, что л о кус стр-107 имеет более близкое расположение к генам nodABCDi, чем локусы eff-482 и eff-841.

Для дальнейшей локализации eff- и стр-локусов было проведено клонирование in vivo крупных фрагментов MI (получение R'-шшмид} и их картирование с помошью Саузерн блот-гибридизаииоиного анализа. Метод клонирования фрагментов генома in vivo основан на том, что некоторые конъюгативные плазмиды, принадлежащих к IncPI группе несовместимости. способны а процессе мобилизации репликонов клетки-хозяина формировать стабильные коиктегранты с протяженными участками се генома. Образующаяся при этом гибридная плазмида (R'-гсяазмнда) переносится в рецяпнеитпый штамм, где в случае отсутствия гомологичного генетического материала, может существовать достаточно длительное время {Kiss et a!,, J980; Simon et ai., í983),

В нашей работе была использована мобилизующая плазшша RP4-4, имеющая размер 60 т.п.и., а донором выступал JnS-mob мутант Т107 (Стр). Присутствие mob- сайта и составе транс пою на обеспечивало полярный перенос фрагментов М1 от единственной точки - мутант но го локуса стр-107, В качестве реципиента был использован штамм HBI0I Е. coli. При переносе RP4-4 in транс-

пшанта TI07 а штамм HBIG1 было отобрано 7 транеконыогантов, содержащих в составе RP4-4 фрагменты М1. Анализ R'-плазм ид я геле позволил установить, что размер R'-плазмил варьирует от 70 до 2S0 т.п.н. и, соответственно, размер клонированных фрагментов М! колеблется от f 0 до 220 т.н.н. (табл. 1),

Для того, чтобы определить какие локусы М1 клонированы совместно с стр-107 был проведен Саузерн йлот-гибридизанионный анализ геномной ДНК трансконъюгантоа R'¡ - R'7 с зондам« на некоторые гены nod~nif региона (nodABCDh ni/КОИ, nifA, поеЛnodL,nodD;), а также на локусы eff-482 и eff-841.

При гибридизашюйном анализе было выявлено, что у четырех из семи полученных R'-плазм ид присутствуют все (R'3 и R'7) иди некоторые (R'5 и R'6) молекулярные маркеры «cW-rti/региона М1 (табл. 1). Отсутствие указанных маркеров у оставшихся трех R'-плазмид может быть объяснено тем, что R.M, R'2 и R 4 содержат в своем составе сравнительно небольшие фрагменты М! (от 10 до 20 т.п.н.). При гибридизации с зондами на локусы eff 4H2 к effS4!, не было выявлено положительного ошета ни для одной из R'-плазмид. Это подтвердило правильность нашего заключения о том, что локусы eff-482 и eff-841 находятся за пределами яси/-я(/региона Mt и расположены в районе вторых "конечных точек" делений, локализация которых не установлена.

Для получения R'-плазмид в качестве донора был использован Тп5-тоЬ мутант TI07 S. melUoli, что обеспечивало направленный перенос фрагментов М1 от одной точки - докуса стр- /07;:Тп5-тоЬ. Учитывая это обстоятельство, а также размер полученных R'-плазмид и наличие или отсутствие у них маркеров nod-nif региона, нам удалось провести картирование мутации стр-107. Так, гшазмида R'6 по данным гибридизациоиного анализа несла в составе клонированного фрагмента гены nodABCDi и nifKDH, ко уже не содержала следуюшего за ними локуса nifA. Следовательно, расстояние между локусами стр-107 и nifKDH составляет 60 т.п.н. (общий размер клонированного фрагмента мега плазм иды-1 у R'6). А т.к. расстояние между nodABCD, н nifKDH, составляет около 30 т.п.н., то мутация стр-107 должна находиться на расстоянии около 30 т.п.н. вверх по течению от общих wotf-генов (рис. 4).

Таблица 1. Анализ клонированных irt vivo фрагментов MI £ meitloti.

pR' PajMtp R'-плашпды Размер клонирован« oí о фрагмента М1 Присутствие (+> или отсутствие следующих дакусов:

Mrtrf ABCOt ni/КОИ nifA поеЛ,В nodL, | eff~ÍS2 Itodlh 1 eJf-S4í

R'l 80 т.п.и. 20 т.п.н. - - - - -

R'2 70 т.п.н. 10 т.п.н. - - - - - -

R'3 280 т.п.н. 220 т.п. и. + + + + - -

R'4 80 т.п.н. 20 т.п.н. - - - - -

R*5 140 т.п.н. 80 т.п.н. + + - - -

R'6 125 т.п.н. 60 т.п.н. + | - - • -

R'7 т.п.н. 220 т.п.н + + i - + -

Рисунок- 4. физической картирование локуса стр~\Ю на мегаплазмндс-! S. meliloti.

ZIÎ121

■*---------------------------:----------------►

¿в№

4------------------------„-►

АК635 _

— — — — — — — _ _ i i. - ..—-.....--■■ i...... ..i..——.— ... -■».

5 i к

V f í,K Г. It f. С К f. к к с t к ^ .,................. , , -I 1,11............,,111, .1. I ......„„i-1-i-l-v .......... fr. M¡

imp' fU? MG F A'jV l),«ffl PQ GFtifí Л, OWI ЛЯ ZU L I);

<trJ*P-( r>. ui/HWt K'fÁ nar i -i.'LV

R'Ö __________

If'5_

1ГЭ-.-------------^

K'7 „---—-----^

OSo in а'(си »я;

гепы; Ш * /Mil: □ • Ш - mf (для упрощении темы другие гены данного региона us: пок:тнВД [": - «Ib .Li« pueфик'оды UcofUi .tî.-iei"Hp(iiKiiifibit' фрагмент Ml кокшаим ¡¡уикчиром

Таким образом, используя метолы делеционного и физического картирования, нам удалось установить, что локусы eff-4H2, eff-84¡ и стр-107 штамма СХМI S. mciiloti находятся за пределами nod-tnj региона М1, при этом мутация стр-10? расположена на расстоянии 30 т.п.н. от генов nodíBCD/.

II. Молекула рно-биологическнй анализ гена, мутация в котором приводит к снижению н одул лиионной кон курен юс пособи ости.

Один из мутантов штамма СХМ 1-105 S. mcüloti (транспозаит TÍ07) характеризовался сниженной на 40% модуляционной конкурентоспособностью (Otiishchuk et al., 1994). Инсерция JnS-mob у мутанта была картирована нами на М1 в 30 т.п.н. от общих моргенов. Цель этого этапа работы состояла в выявлении, идентификации и анализе экспрессии гена стр-107, мутация в котором приводит к появлению Стр'-фенотипа.

1. Клонирование и определение нумеогнидных nocíедоаателы<остей му-ташпнойн "дикой" копии гена стр-107.

Клонирование фрагмента генома Т107, содержащего транспозон (рис. 5а), было осуществлено непосредственно из тотальной ДНК мутанта в векторе pTZ19R. Проведенный Саузерн блот-гибридизационный анализ подтвердил наличие в сконструированной плазмиде, обозначенной pLc№7, фрагмента ризоби-альной ДНК с инсерцией Тп5-тоЬ.

При ссквенировании фрагмента ДНК, смежного с транспозоном, была определена нуклеотидная последовательность, размером 505 п.н. Анализ последовательности показал, что инсерция ТпЗ-тоЬ у мутанта TI07 произошла на расстоянии 313 п.н. от начала некой открытой рамки считывания, которая была обозначена стр-107. При сравнении аминокислотной последовательности Cmpl07 с последовательностями из GeneBank наибольший процент гомологии (96% по количеству идентичных и 97% по количеству идентичных плюс сходных аминокислот) был выявлен с первичной структурой одного из белков штамма Rml021 5. melihti - протеина Sma0907, функция которого неизвестна.

Для дальнейшей характер!«ации гена стр-107 необходимо было определить его полную нуклсо-тидную последовательность. Поэтому на следующем этапе было проведено выделение в составе мультикопи Иного вектора аналогичного гена "дикого" типа. Не-мутантная копия гена стр'107 была клонирована методом "сайт-направленной" интеграции в геном родительского штамма СХМ 1-105 векторной плазм ним

Рисунок 5. Рестрикцнонная карта фрагмента генома мутанта Т107, содержащего транспозон (я); фрагмент, ре клонированный а плазмиде pLc 107-3 (б).

Обозначение сайтов рестрикции: В - ВатШ: S - Soil; Н - НшЛП.

a) pi.t ю7.|

^ У ¥ s в

pLtiin-,1 | Ц)

б) ? ¥

рК18/по£>. Для этого была предварительно сконструирована плаз ми да, содержащая в векторе рК18»ю6 область гомологии - 50 п,н. Ват\\[-^а1\ фрагмент рШ07-1, расположенный на расстоянии около №0 п.н. от гена стр-107. Сконструированная плаз мила была интегрирована по гомологичному участку в геном родительского штамма СХМ1-105, а затем "вырезана" оттуда вместе с фрагментом ДНК, содержащим локус си!/>-/07'дикого'' типа.

Гнбридизационный анализ (рис. б) подтвердил наличие в плазмиде, обозначенной как рЬш!07-1. немутанткой копни гена стр-107. С использованием пяти ферментов рестрикции

Рисунок 6. Б.тот-гибрид та «ионный анализ пла} гниды рЬс!07, ЛИК штамма СХМ1-105 и мутанта Т107 с фрагментом р1^107-1,

2 ,) • 4 5,6.

Дорожки:

1) pLcl07 (icoRI).

2) pLwlü7-l {BamW + ftrfl).

3)TL07

4)СХМ 1-105 (WtnrfHI).

5)T107 (йялгНО 6tCXMl-i05 tßamm.

»23,1

'9,4

'6,7

— 2Л

была построена рестрнк-ционная карта pLw(07-l (рис. 7а) и проведено ре клонирован не семи фрагментов ДНК, размер которых оптимален для секвеиировання

При секвенировании фрагментов pLw!07-l была определена последовательность из 1615 нуклеотпдов, которая содержала кодирующую и промоторную области гена стр-107. Компьютерный анализ показал наличие открытой рамки считывания +3, содержащей 1236 нуклеотидов, стартовый к о дон ATG, стоп ко дон TGA, предполагаемый промотор л предполагаемый сайт связывания с рибосомой (GAGAG).

При секвенировании региона, находящегося "вниз по течению" от гена стр-107, были обнаружены три отдельные открытые рамки считывания (ORF), транскрибируемые в обратном направлении (рис. 4а). Данное обстоятельство, а также наличие у стр-107 собственного промотора позволило сделать заключение, что изучаемый ген не является частью какого-либо оперома, а представляет самостоятельную транскрипционную единицу.

При трансляции нуклеотидной последовательности кодирующей области стр-107 была установлена первичная структу ра протеина Стр107, состоящего

Рисунок 7. Рестрикинонная карта клонированного фрагмента генома штамма СХМЫ05, содержащего ген стр-107 (а); фрагменты, рекламированные в плазмндах pLwIOT-S (б); pLw 107-7 (в). Обозначение сайтов рестрнкщш: В - S - Sa/U Н - Ит<Л\\\ Е -

fcoRI. Шпилька ук.ныеает местоположение ннссршш транс потоп а у мутаптного штаима.

Тя

al

б>

в)

1

pLwlOT.l

cmpIV? inn

pi.Tiiw-a

и с

pi,»l«T-T J,'

из 412-ти аминокислот с молекулярной массой около 45 кДа, Анализ аминокислотной последовательности Стр107 показал, что этот протеин является очень гидрофильным и имеет один г идрофобный участок из 20-ти аминокислот. Такая структура обычно характерна для белков, заякоренных в клеточной мембране.

Таблица 2. Протеины, им нощи« гомологию с первичной структурой Сшр)07.

Организм Протеин__% гомологии :

5тог}тоЫит теИЫ штамм [^1021 5та0907__93%(99%)

ИЬЬоЬшт еШ штамм СРЫ42_ Ур034__70% (83%)

МсзогМюЬшт 1оИ штамм МАРР303099 М1г9246__35% (55%)

При сравнение ам и но кисло гнои последовательности Стр107 с последовательностями из банка данных GeneBank были обнаружены гомологии с протеинами некоторых видов клубеньковых бактерий (таб. 2). Все указанные протеины имеют сходный размер - от 404 до 412 аминокислотных остатков, а гены, кодирующие эти белки, у ксех перечисленных ризобиальных видов расположены па их сим биотических плазмидах. Как и Стр107, все эти протеины являются очень гидрофильными н имеют только один гидрофобный сегмент (рис. 8), Первичные структуры всех этих белков были установлены при полном секвенировапии геномов указанных микроорганизмов, однако их функции до сих пор остаются неизвестными (Bameit et al,, 2001; Ramirez- Romero et al., 1997; Kaneko et al., 2000).

Рисунок 8. Сравнение аминокислотных последовательностей протеина Стр107 н гомологичных ему белков S m а0907, Yp034 и Ml г 9246.

emploi 3ît ------------------------------------------«13 s. »«Шое* (схнг-юз)

етжовот ------------------------------------------»и г. «.лloti (snisai)

ТрОЗ! 389 тШЕЯИЭ^Ш------------------------------------------40-t ft. «tli (CTH4Î3

Kl г) Hi 571 KT¡№rrS - <11 H. loti (И*ГГЭ020Я>

2. Caùm-iimipae.ieHHbiti мутагенез гена аир-107 y штамма CXMl-105 и ком-тем ентацнонныи анализ мутшюнг TI07.

Известно, что внедрение Тпэ может приводить к возникновению дополнительных генетических изменений, таких как делении, инверсии, активация собственных lS-элементов и т.п. Поэтому, для доказательства того, что Стр'-фенотип мутанта Т107 действительно вызван иисерцией транс по зона был проведен

направленный мутагенез гена стр-107 у родительского штамма CXM1-I05 и анализ конкурентоспособности полученного мутанта, а также комплементацн-онньн1 анализ (введение "дикой" копии гена стр-107 в геном мутанта Т107 и анализ его конкурентоспособности).

Мутагенез стр-107 у штамма СХМЫ05 бил проведен методом 'хайт-I га правлен нон" интеграция в геном векторной плазмнды pKlSfnoi. Для этого предварительно была сконструирована плазмида pLcl07-3, несущая в векторе рК 18mofe область гомологии -1,4 т.п.н. Hindltt фрагмент плазмнды pLc107, содержащий часть мутантного гена стр-107 и "плечо" транспозона (рис. 56). Далее плазмида pLcl07-3 была интегрирована в геном родительского штамма CXMI-I05 по гомологичному участку, что, аналогично ннсериии транспозона, привело к нарушению целостности и функции гена стр-107. Саузерн блот-гиб-рилнзационный анализ подтвердил получение ре комбината с мутаитным геном стр-107. При совместной инокуляции проростков люцерны исходным штаммом CXM1-I05 и полученным ре ком б и нантом, обозначенным как Ичи,.из, конкурентоспособность "сайт-направленного" мутанта была достоверно снижена относительно СХМ1-105 и соответствовала уровшо конкурентоспособности мутанта Т107.

Для ко мплементашш иного анализа была сконструирована плазмида pLw 107-8, которая несла в векторе pCambiaÍ200 фрагмент ДНК, содержащий полную последовательность промоторной и кодирующей области гена стр-107 "дикого" типа (рис. 76). Введении плазмнды pLwl07-8 в мутант Т107 полностью восстанавило конкурентоспособность транспорта до уровня родительского штамма (рис. 9).

Полученные результаты позволили сделать вывод, что мутант Т107 являегся истинным транспозантом и его Стр'-фенотип действительно обусловлен инсер-цией TnJ-wiofi в ген стр-107.

Рисунок 9. Анализ конкурентоспособности мутантов Т107, TkCXM.U3 и T107(pLw 107-8) лр» совместной инокуляции с родительским штаммом СХМ1-105 S. теШой.

•/. -

процентное отношение кол-ва клеток штамма в исходном и но кул юме

'ПОТ tk,,„-u, TI 07

(Г Lw 107-8)

процентное отношение кл) беньков. образованны* штаммом после инокудя-

Ш1П

3. Ahiliu3 экспрессии гена стр-107.

Гены клубеньковых бактерии принято разделять на три условные группы: I) гены, функционирование которых необходимо только для свобод нож и йущих ризобналышх клеток (для сапрофитного существования в почве или в чистых бактериальных культурах); 2) гены, которые функционируют только на стадии симбиоза с растением-хозяином; 3) гены, принимающие участие в обеих стадиях жизненного цикла клубеньковых бактерий (Проворов, Аронштам, 1991),

Для того, чтобы выяснить на каких стадиях жизненного цикла функционирует ген стр-107 была сконструирована плазмнда pLwl07-7, несущая в векторе рСатЫа[381 Xa (tocZ::M9mp, gusA без промотора) фрагмент ДНК, содержащий промоторную область и первые 135 нуклеотидов кодирующего региона стр-107 (рис. 7в). Сконструированная плазмида методом коньюгации была введена в штамм СХМ1-Ю5.

Анализ экспрессии транскрипционного слияния cmp-107::gusA ex planta и in planta (в инфекционных нитях н в клубеньках Medicaga sativa) позволил установить, что экспрессия гена стр-107 осуществляется у свободноживущих ризо-биальных клеток при росте на среде TY, а также на первых этапах становления симбнотических взаимоотношений - в клетках инфекционных нитей. При переходе же клубеньковых бактерий к состоянию азотфнксирующих бактероидов функционирование гена стр-107 прекращается.

ВЫВОДЫ.

1. С использованием Саузерн блот-гибридизационного и транедукцноиного анализа на м era плазм илс-2 Sirtorhizobium meíiíoü картировано пять генов, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности.

2. С использованием метода конъюгации и Саузерн блот-гибрндизационного анализа на мегаплазмиде-í картирован ген стр-107, мутация в котором приводит к снижению нодуляционной конкурентоспособности штамма CXM1-I05 S. melUoti. Показано, что еще два гена, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности, локализованы на мега-гошмиле-1 за пределами nod-nif региона.

3. Проведено клонирование в мультикопийных векторах pTZ19R и pKIBmoi мутантнои и "дикой" копии гена стр-107, построены рестрикционные карты полученных рекомбинантных плазм ид и определены нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов.

4. Показано, что ген стр-107 представляет собой отдельную самостоятельную транскрипционную единицу н кодирует 45-кДа протеин, заякоренный в клеточной мембране. Обнаружено, что Стр107 имеет значительную гомологию С белками Sma0907 штамма Rinl021 S meiiloti, Yp034 Rhizobium etli н Mlr9246 MewrhtzobtwH loti, функция которых неизвестна.

5. Проведен сайт-направленный мутагенез гена стр-107 у родительского штамма СХМ1-105 и комплементационный анализ мутанта Т107. с помощью которых показано, что функционирование гена стр-107 действительно влияет на способность штамма СХМ1-105 конкурировать за образование клубеньков.

6. Сконструировано транскрипционное слияние cmp-lQ7::gusH и установлено, что геп стр-107 экспрессируется у ссоболм оживу тих ризобиальных клеток п в клетках инфекционных нитей в корневых волосках Medicago sativa и не функционирует в азотфиксирующих бактероидах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Sharypova L.A., Onishcuk О.P., Saguienko Е.А., Evdonin A.L., Chiz-hevskaya E.P. Melanin produciion is controlled by the megaplasmid-2 in Rhhobtum meliloti strain CA15-1. Proc. 10-th Intern. Congr. on Nitrogen Fixation. St.-Petersburg: Russia. I995.P.416.

2. Lebsky V.K., Kurchak O.N., Onishchuk O.P., Chizhevskaya E.P., Simarov B.V. Comparative ultrastructural analysis of alialfa nodules induced by Rhizobium meliloti effective and ineffective strains. Proc. 1 Itii Intern. Congr. on Nitrogen Fixation. Paris: France. 1997. P.274.

3. Чижевская Е.П., Кроль E.A., Онищук О.П. и др. Физическое и генетическое картирование мутаций симбиотической эффективности на мегаплазмиде-2 штамма СХМ1 Rhizobium melihti. Генетика. 1998. Т. 34. N 9, С. 1220-1227

4. Чижевская Е.П. Выявление и изучение гена, мутация в котором приводит к изменению конкурентоспособности клубеньковых бактерий люцерны. Труды победителей конкурса фантов 1998 гола для студентов, аспирантов и молодых ученых Санкт-Петербурга. Направление "Биология": Сборник трудов.-СГШШИХ СПбГУ, 1998. С. 244-245.

5. Chizhevskaya Е.Р., Onishchuk О.Р., Sharypova L.A., Simarov B.V, cmpl07 - new gene involved in noduiation competitiveness of Sinorhizobhm meliloti it Proc. of I !-th Intern. Congr. on Molecular Plant-Microbe Interactions. St .-Petersburg: Russia, 18-26 July 2003. P. 51.

6. Chizhevskaya E.P., Onishchuk O.P., Sharypova L.A., Simarov B.V. Isolation and characterization of a gene involved in control of noduiation competitiveness of strain CXM1-105 Sinorhizobhtm meliloti/I Proc. of И -th Intern. Congr. on Molecular Plant-Microbe Interactions, St,-Petersburg: Russia, 18-26 July 2003 (in press).

Научное издание RIZO-печать

ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

Лицензия ПЛД № 69-253. Подписано к печати 20 ноября 2003 г. Тираж 100 экз.