Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование генетических детерминант, локализованных на плазмиде pFra Yersinta pestis, и определение протективности кодируемых ими продуктов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование генетических детерминант, локализованных на плазмиде pFra Yersinta pestis, и определение протективности кодируемых ими продуктов"

рг Б

На правах рукописи

п I ?!ГП о'

ЯШЕЧКИН ВРИИ ИВАНОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ, ЛОКАЛИЗОВАННЫХ НА ИЛАЗМИДЕ рГга УетвШа ревИз, И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОСТИ КОДИРУЕМЫХ ИМИ ПРОДУКТОВ

03. 00. 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов..1995

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации.

Научние руководители:

диктор биологических наук, профессор Ю. А. Попов доктор медицинских наук. ст. научн.сотр. И. Г. Дроздов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор A.B. Липницкий кандидат медицинских наук. ст.научн.сотр. о.п. Плотников

Ведущая организация: Иркутский научно-исследовательский

противочумный институт

Защита состоится "_"_ 1995 г. в_ часов на

заседании Диссертационного Совета Д 074.32.01. при Российском Научно-исследовательском Противочумном институте "Микроб" Гос-комсанэпиднадзора Российской Федерации (410071, г, Саратов, ул. Университетская, 46). ,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Р'осНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан "_" _ 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор

Г. А. Корнее:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время проводятся интенсивные исследования с целью разработки принципиально новых диагностических и профилактических препаратов для бактериальных инфекций, основанные на технике молекулярного клонирования различных генетических детерминант. Подобные исследования начаты и на чумном микробе: получены генно-инженерным путем штаммы Б. colt - продуценты известиях Факторов вирулентности и иммуногенности этого микроорганизма (Гончаров Е.К., 1987; So-delndeO., et ab. 1988, 198a; Price S.В., etal.. 1989; Skur-nlk M.& Wolf-Watz H.. 1989; Гончаров а:ю. с соавт.. 1989. 1993; Barve S.S.. etal. 1990; Llndler L. E.. etal.. 1990; Berprn Т.. etal., 1391; Булгакова, i. Г., 1991; Филиппов A.A. с соавт. , 1991: Маракулин И.В., с соавт. 1991; Кириллина 0. А.. 1SS2 и другие). Продолжаются исследования по определению роли этих антигенов в формировании невосприимчивости к повторному заражению лабораторных животных возбудителем чумы (Наумов A.B. с соавт., 1992). Полученные штаммы-продуценты антигенов чумного м-кроба приближают нас к создали» эффективной химической вакцины, но решение этого вопроса требует еще значительных усилий. Это обусловлено практически полной неизученностью подавляющего большинства антигенов.-а их насчитывается у чумного микроба до 100 (Вейнблат В.И.. 1974). До сих пор не разрешен вопрос: воздействие какого дополнительного фактора необходимо, чтобы мощный ревакиииирующий эф$ект антигена фракция I (Белов Л.Г.. Дальвадянц с.М., 1939) стал вакцинирующим. Для ответа на этот вопрос необходим поиск новых генетических детерминат и

тестирование иммунологической активности кодируемых ими продуктов.

Многие из известных иммуногенных детерминант чумного микроба локализованы на плазмидах. в том числе и на самом большом внехромосомном решгаконе - 100 kb ллазмиде pFra. Установлено, что на этой плаэмиде находятся гены, определяющие синтез "мышиного токсина" и антигена Фракция I. К настоящему времени эти гены достаточно хорошо изучены (Galyov Е.Е.. et al. 199Q, 1991; Черепанов П. А. с'соавт., 1991; Karlyshev А. V.. etal., 1992). Остальная же часть плазмиды pFra, • составляющая более 90^ генетической информации этого репликона. обладающего большой кодирующей емкостью, представляет собой сплошное "белое пятно". В большинстве исследований, предметом изучения служат плазмиды pFra гз родственных океанических штаммов: Y. pest is EV (Гончаров А.Ю. с соавт.. 19В9; Galyov Е. Е. etal.. 1990, 1991: Черепанов П. А. с соавт.. 1991). и Y. pestts-А1122 (Шишкина 0. Г.. 1990, Кириллина 0.А.. 1992). Выбор штамма У. pestts EV понятен. • так как он широко применяется как противочумная вакцина. Естественным было бы продолжить в сравнительном плане исследование структурно-функциональной организации репликона pFra штамма другого происхождения , использующегося в качестве эталона вирулентности, - континентального штамма Y. pestts 231.

Все вышеизложенное определяет актуальность настоящего исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - молекулярное клонирование локализованных на плазмиде pFra У. pestts 231 генов и определение протективной активности детерминируемых ими продуктов.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Построить рестрикционную карту ДНК плазмиды pFra штамма У. pes из 231 с использованием эндонуклеаз рестрикции Вага-HI. Hiiidlll. Smal. Xbal. Xhol. EcoRI.

2. Провести сравнительный анализ рестрикционных карт плазмид pFra штаммов У. pestis 231, У. pestis А1122. У. pestis EV76.

3. Получить библиотеку генов плазмиды pFra штамма V. pestis 231 в плазмидных векторах.

4. Локализовать клонированные гены на рестрикционных картах плазмид pFra штаммов У. pestis 231 и Y. pestis AI 122.

5. Охарактеризовать продукты клонированных генов б составе реципнентньк штаммов чумного микроба и кишечной палочки по молекулярной массе, антигенной активности и протективностн для белых мышей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

1. Впервые построена рестрикционная 'карта ДНК плазыиды pFra штамма У. pestts 231 для эндонуклеаз BamHI, HindiII, Smal. Xbal, Xftol, FeoRI и, частично,' для эндонуклеазн SalGI. Уточнена рестрикционная карта ДНК плазмиды pFra штамма У. pes- . tis AI 122 для эндонуклеаз ВсшЩ. fltndJII, Smal, Xbal; дополнена сайтами для эндонуклеаз Xhol. EcoRI и. частично, для SalGI.

2. Проведен сравнительный анализ рестрикционных карт плазмид pFra штаммов Y. pestis 231, У. pestis 358/12, У. pestis AI122. Y. pestls EV, показавший консервативность молекулярной структуры плазмид pFra этих штаммов. Отличия структуры репликрнов pFra< океанических штаммов от структуры этих плазмид

континентальных

штаммов заключаются в инверсии двух областей

плапмидной ЛИК и делении фрагмента ЛНК размером около 3 kb.

з, Впервые клонированы до настоящего времени неизвестные гены г/р.заидц ррга. определена их локализация на рестрикцион-ных картах плазмид pFra штаммов Y. pestis 231 и У. pestts Al 122. Гены кодируют не менее 10 белков, молекулярной массой от 11.3 до 105,6 kDa., В реципиентном штамме У. pestts (pCad*. pPst*. pFra") эти белки характеризуются низкой антигенной активностью и не обладайт протективность» для белых мшей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ:

1. Депонированы в Государственной коллекции бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний 1-11 групп патогенности (РооНКПЧИ ";.лкроб". г. Саратов) семь генетически маркированных штаммов кишечной палочки, содеряащих рекомбинантные пдазмидн -с клонированными ранее неизвестными генами плазмиды pFra штамма У. pestts 231.

2. Методические рекомендации " Использование коммерческого препарата иммуноглобулинов диагностических чумных антикап-сульных моноклональных люминесцирующих сухих для проведения иммунодот-анализа" одобрены Ученым Советом и утверждены'директором РосНИПЧИ "йикроб"_ (Протокол»N5. от 19 апреля 1994 г.).

3. Метод определения элзктрофоретической подвижности микробных клеток в свободном потоке жидкости рекомендован в качестве способа скрининга библиотек генов. Данный способ применяется при выполнении экспериментов по -плановым НИР для анализа библиотек генов хромосомы чумного микроба научными подразделениями РосНИПЧИ "Микроб".

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Плазмида pFra штаммов Y. pestts А1122, У. pestis EV. Y. pestis 231 и Y. pestts 358/12 консервативна по своей молекулярной организации. Молекулярная структура репликона pFra океанических игакмоз Y. pestis Al 122 и У. pestis EV отличается от структуры ДНК. которую имеют репликоны pFra континентальных цтамиов Y. pestis 231 и Y. pestis 358/12, инверсная двух областей и меньшем на 3 КЬ размером.

2. Обнаружены новые гены плазмиды pFra штамма У. pestts 2Я1. которые детерминируют'синтез не менее 10 белков тлену-лярноР массой от 11,3 до 105,6 Ш.

3. Метод .определения электрофсретйческой подвижности клеток в свободном потоке жидкости кожет быть использован как способ отбора из геномных библиотек рекомбинантных клонов, продуцирующих биополимеры, которые влияют на заряд клеточной поверхности реципиента.

•АПРОБЛШЯ РАБОТЫ: Материалы диссертации доложены на Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" в Волгограде в 1992 году; Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика ООИ" в институте "Микроб" в 1993 году; на итоговой апрельской научной конференции в 1994 году и на межлабораторных научных конференциях института "Микроб". •

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано три печатных работы..

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения и восьми глав, включающих обзор литературы, описание материалйв и методов, результатов собственных экспериментов, а также зак-

.точения и выводов. Работа изложена на 142 страницах машинописи, иллюстрирована 23 рисунками и 10 таблицами. Список литературы содержит 131 цитируемую работу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы 12 штаммов чумного микроба и 13 штаммов кишечной палочки.

В работе были применены следующие методы.

1. Молекулярно-генетические,методы: 'плазмидный скрининг (KadoC., Llus.T., 1981); выделение плззмидных ДНК (Godson G.N.. Vapnekü., 1973; Blrnbolm Н.С., Doly J., 1979; Week D.f. et al. 1986, в.модификации Федотова Э.А. с соавт. 1990); рест-рикционный анализ плазмидных ДНК; электроэлюция фрагментов ДНК из агарозного геля (Kainz P. and Kainz V.. 1939. d кодификации Лежнева А.И., 1991): трансформация (Cohen S.N.,-et al. 1973). клонирование (Маниатис Т. с соавт.. 1984); электрофорез и пульс-электрофорез; радиоизотопное мечение ДНК-зондов. ДНК-ДНК гибридизация по Саузерну Шаниатас Т. с соавт..' 1984), полимера зная цепная реакция (Вартапетян А.Б., 1991).

2. Иммунологические, иммунохимические и биохимические методы: реакции пассивной гемагглютинашш (РПГА), нейтрализации антител (РНАт) проводили в. соответствии с "Руководством по профилактике чумы" под ред., Наумова A.B. и др., 1992; электро-форетический анализ белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS (U.K. Laemmll. 1970); определение концентрации белка в образцах (О.Н. Lowry et al. 1951); получение антисывороток морских свинок (Видяева H.A.. 1992); иммуноблоттинг (Towbin Н.

et al. 1979); экспрессия клонированных генов в сисгзмчх сопряженной транскрипции-трансляции - в миникдетках, полученных из штамма coli Х.925, и максиклетках. полученных из штамма Е. coli UHI, (Хеймс Б., Хиггиис С., 1987); определение протекткв-ности по показателю 1thDS0 (Ашмарин И.П. и Воробьев A.A. 1959) и мышино-протективному индексу по Майеру (Филиппов А,Ф. с со-авт., 1973), для заражения использовался полноценный штамм Y. pestls 231.

Предложены новые методические приемы и способы;

1) "быстрая трансформация" чумного микроба; 2) способ нерадиоактивного мечения ДНК; 3) скрининг библиотек генов, основанный на методе определения электрофоретической подвижности микробных клеток в свободном потоке жидкости, 4) применение коммерческого препарата иммуноглобулинов диагностических чумных антикапсульных моноклональных -люминесцируващ сухих для проведения иммунодот-анализа.

' 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как и.любое генетическое исследование подобного плана, данная работа была начата с получения библиотеку фрагментов ДНК плаэмиды pFra штамма У. pestts 231 (pFra231). На этом этапе мы столкнулись с неожиданными трудностями, связанными с нестабильностью рекомбинантных молекул ДНК, которые ранее не были описаны, несмотря на то, что получением библиотек генов этого репликона. Овтом числе и на плазмидных векторах, занима-* лись многие исследователи'(Galyov'E. Е.. et al. 1990; Черепанов, fit А.- с соавт.:.-4991;. Шишкина.О. Г.", ; 1991; Кириллина O.A., 1992; Гончаров А.Ю. с.соавт.. ,1992)....Многократные.попытки клониро-

вать в векторах, имеюцих ColEI решшкон, фрагменты плазмиды

pFra231 более 9 kb не дали положительного результата. Вставоч-

*

ные фрагменты ДНК. которые, "зашивались" в векторные молекулы, вероятно, при первых жз генерациях трансформантов делегировали либо полностью, либо частично. В дальнейшем, хотя и удалось клонировать в этих векторах Фрагменты ДНК меньшего размера, но. как выяснилось в ходе экспериментов по определенно злект-рофоретической подвижности клеток, эти вставочные фрагменты также, возможно, подверглись рексмбинаиионным перестройкам, так как большинство из них не содержали функционально активных генов, способных выявляться этим методой.

Стабил: но наследуемую библиотеку фрагментов плазмиды pFra231 удалось получить в векторной молекуле. ДК которой не 'имеет гомологии с ColEI решшконсм - в плазмиде pACVCl84- Ре-комбинантные плазмиды этой серии названы pYS и содержат вставки SalGI фрагментов ДНК репликона pFra231,

Для скрининга полученной библиотеки был выбран метод, который ранее для этих целей никем не использовался - метод определения электрофоретической подвижности микробных клеток в свободном потоке, жидкости. Этим .методом из 34 рекомбилантных клонов Е. oolt, содержащих плазмиды со вставочными фрагментами ДНК более 1,5 kb. были отобраны восемь, подвижность клеток которых отличалась от контрольного штамма. В дальнейшей работе был использован еще один клон, клетки которого не . отличались по подвижности от контрольного.штамма,; но он имел плазмиду с самым большим из клонированных - SalGI фрагментом ДНК pFra231 размером 9,1 kb. Все эти клоны содержали рекоыСинантные плаз-милы серии pYS.

- и -

В научной литературе имеется множество разрозненных сведений, касающихся структурно-функциональной организации плаз-мид pFra разных штаммов чумного микроба. В частности, установлен Факт разнообразия плазмид pFra по размеру (Flllppov А. А. et al., 1900; Иванова B.C. с соавт. 1990); наблюдается высокая частота интеграции этой плазмиды с хромосомой (Protsenko О.а. et al.. 1991); имеется данные о наличии на рёпликонп pFra копий, по крайней мере, двух 15-элементов'( Portnoy D.A., Falkow S.. 1981; Филиппов А.А. с соавт., 1990; Bobrov A.G. et al., 1991) и нескольких повторявшихся последовательностей (Galyov Е.Е., et al., 1993; Кириллина О. А., 1992). наличие которых предполагает возможность "включения-выключения" и регулирования активности различных генов этой плазмиды (Заренков К.И., Дегтярев Б. М,. 1984; В. В. Кугырев с соавт., 1985; Karlyshev А. V., et , al./ 1992). Все эти Факта нуждаются в осмыслении. Почвой для этого мокет быть сравнительное молекулярно-генети-чйгкоз. исследование плазмид pFra из штаммов разного происхождения. Первый шаг в этом направлении сделан в данной работе.

С использованием методов рестрикционного и гибридизацион-ного анализов была построена физическая карта плазмиды pFra231 по шести."крупнощепящим" рестриктазам и локализованы некоторые сайты для зндонуклеазы SatGI (рис. 1). Физическая карта плазмиды pFraAl 122. построенная Кириллиной 0. А. (1992), была уточнена и дополнена сайтами узнавания рестриктаз Xhol. EcoRI, и отдельными сайтами для зндонуклеазы satGI (рис. 2). Проведен сравнительный анализ структуры ДНК плазмид pFra.океанических штаммов Y. pestts EV. У. pestis EV76 (Гончаров А.Ю. с соавт;.

<s SS^1 ю»®^ ja

l&lf.SSl'O £

Seil 7И0 IUI 1воо

JI25»

,esiö « i *eÄ'«T ь

•'■'ii

Рис. 1. Рестрикционная карта плазмиды pFra штамма У. pes-tis 231. Величины размера плазмидной ДНК и координат сайтов рестрикции указаны в масштабе 1:10, Показана локализация мест разрывов, обозначенных а,- ь, с и d. Стрелками указано направление генов fra и tox, и относительная ориентация клонированных SalGl Фрагментов <ys).

1989, 1992) У. резня А1122, и континентальных У. реэИз 231 и У. регШ 358/12.

Установлено, что коноплазмидные штаммы У. резне Е'/7б. V. реэНе ЕЧ,. У. резИз А1122, . У. резис 231. У. резав 358/12 содержат плазмиды рРга. молекулярная структура которых консервативна, то есть, состоит из одних и тех же (по расположению сайтов гидролиза эндонуклеаз рестрикция и результатам гибриди-

ШОУ

mi z **

. \ V .111 i 1 . s J

pFra Al122

10000 Sa 1 Gí

pm ja

у|й

fc»JU 2500

o.d

(2850)

Рис. 2. Рестрюсционная карта ппазмиды pFra штамма У. vestís АИ22. Ветчины размера ялэзнндноя ДНК и координат сайтов рестрикции указаны'в масштабе 1:10. Показана локализация мест разрывов, обозначенных а, Ь,.с и d. Стрелками указано направление генов fra и tox, и относительная ориентация клонированных SalGl фрагментов (ys).

заций) последовательностей ДНК. Тем не менее, ллазмиды рРга этих океанических и континентальных штаммов имеют существенные отличия, заключающиеся в инверсии двух областей ллазмид-ной ДНК одних штаммов относительно их расположения в плазми-дах других штаммов и меньшем на 3 кЬ размером ллазмид океанических штаммов.

По рестрикционной картине участков ДНК, в которых произошли разрывы было предположено, что указанные выше инверсии связаны с двумя ранее описанными IS-элементами: IS100 и IS285 (РогШОУ D.А., FalkowS., 1981: Flllppov A.A. et al., 1994). Результаты экспериментов по ДНК-ДНК гибридизации показали, что участки плазмид pFraAll22 и pFra23l. в которых происходят разрывы цепи ДНК. не имеют между собой гомологии нуклеотидных последйвательностей. Поэтому, в указанных местах может нахохлится не более, чем по оЯной копии этих мигрирующих элементов.

В опытах по изучению структурной организации плазмид pFra с применением ДНК-ДНК гибридизации были использованы в качестве зондов, клонированные SalGI фрагменты ДНК плазмиды pFra23l. В результате, эти фрагменты были локализованы на Физических картах плазмид pFra23i. и pFraAU22.

Для анализа библиотеки генов метод отбора рекомбикантних клонов по отличив подвижности их клеток при элгктрофорезе в свободном потоке жидкости был применен впервые. Поэтому, результаты скрининга библиотеки генов этим методом еще не могли служить безусловным доказательством того, что тот или иной клонированный фрагмент ДНК содержит гены, кодирующие биополимеры. с которыми и связан отличающий рекомбинантные клоны заряд клеточной поверхности. Это положение стало доказанным после получения экспрессии.генов, расположенных на клонированных фрагментах плазмиды pFra23l, в системах мини и м'аксиклеток; каждый из рекомбинантных клонов.' отобранных по ЭФП. .содержит' гены плазмиды pFra.. Было 'обнаружено, что клонированные гены детерминируют синтез не менее 10 белков в диапазоне .молекулярных масс от 11.3 до 105,6 KDa (табл. 1).

Таблица 1

Результаты экспрессии в системах сопряженной транскр..пции-трансляции рексмбинантных плазмид серии pYS

Название плазмид Размер вставки (kb) ЭФП 1 м. к.г (o.e.3) Молекулярная масса полипептидов (kDa)

pH 8,6 pH 9.4

pYS 2 2,5 -5 41.2 20.6

pYS 3 3,6 +2 -0,5 16.5

pYS 6 4.3 - -1.5 23,5 40,5

pYS 7 1.4 - +1 17.0 11.3

pYS 10 3,8 - +1 21.6

pYS 17 3.6 +1,5 - 16.5

pYS 22 4.3:1,0; 0.4 +4 +0,5 30,0 40,5

pYS 26 3,8 - '+2 62.4

pYS 29 9.1 . 0 0 105.6 28.1

ЭФП ' - электрофоретическая подвижность м.к. * - микробная клетка

o.e. 3 - относительные единицы - разница между номерами фракций с максимальной оптической плотностью клеток контрольного и тестируемого штаммов -

Антигенная активность была проверена с коммерческими иммуноглобулинами (сыворотками) и с помощью полученных антисыво-■ роток морских свинок,.. Результаты'этих экспериментов показали, что ' продукты клонированных генов в Составе реципиентных штам-

мов У. реэШ ЕV, не содержащих плазмиду рРга, являются слабыми антигенами. Концентрация клеток штаммов с плазмидами серии рУБ, дающая в РПГА положительную реакции. отличалась максимум в четыре раза от таковой контрольного штамма, не. имеющего эти шшмиды. В иммуноблотах дополнительные зоны были выявлены только в четырех клонах с плазмидами рУ32, р753, рУЗб. рУБЮ. Результаты иммуноблотов лишь в случае с клоном несушим плазмиду р^б соответствовали данным, полученным в системах сопряженной транскрипции-трансляции - в обоих случаях выявлялись белки молекулярными массами 23,5 и 40,5 кОа.

Экспериментальная проверка протективности рекомбинантных штаммов чумыго микроба, содержащих клонированные гены плазш-ды рРга, по двум показателям [1т040 и мышино-протектисный индекс (МПИ) по Майеру (1965)1, привела-к результатам, коррелирующим с полученными при тестировании антигенной активности этих штаммов (табл. 2). Разделенные случайным образом на две группы. они обладали даже меньшей протективной активностью, чем' контрольный штамм с векторной ллазнидой-- У. , .ревМз ЕУ {рСаб.. рРэг, рАСУС184). Использование дополнительного показателя про-тективного эффекта - МГИ, дало возможность провести математический анализ зависимости изменения протективной защиты от величины иммунизирующей дозы, который, в свою очередь, позволил сделать следующее предположение.- '

Группа рекомбинантов. состоящая из штаммов У,.. резиэ,ЕУ■ (рСай. рРзг). несущих по одной.из плазмид р¥Б2, рУЗЗ. . рУ86. рУБЮ, обладала выраженной зависимостью нарастания протектив-ного эффекта от увеличения иммунизирующей дозы (рис,, 3). Как • показало экстраполирование* приближенной функции, отражающей г

Таблица 2

Средние и пограничные значения показателя Irr,Ds0 для разных штаммов У. pestis (КОЕ)

ImDso вакцин.1 EV 8 pAFlO-23 EV PACYC184 EV , pYS" 3 EV pYS" *

Средн. 1833 2426 18496 21751 21853

Мах ' 5796 7586 232847 - -

М1П 580 76-7 4646 - -

вакцин.1 - вакцинный штамм У. рсзыв ЕУ (рСасЗ, рРзЬ, рЕга) маточная культура линии НИИЭГ.

ЕУ 2 - реципиентнкй штамм У. реэШ ЕУ (рСай. рРзЬ). рУЗ' 3 - рекомбинантные' плазмиды первой группы: рУ32, рУБЗ, рУЭб. рУЗЮ.

рУЗ" 4-- рекомбинантныа плазмидь второй группы: рУ317, руэгг. ру$2б. ркгэ.

данную зависимость, при иммунизирующей дозе Ю10 КОЕ эта группа штаммов может обеспечить высокий протективный эффект (МПИ-5). Современная генно-инженерная технология позволяет создавать штаммы-продуценты с высоким уровнем экспрессии клонированных в них генов. На их основе вполне реально достижение уровня синтеза антигена, соответствующего указанной выше дозе использованных штаммов, при значительно меньшей, примерно на два порядка, иммунизирующей дозе микробных клеток. Что касается второй группы, состоящей из клонов с плазмидами рУБП, рУБ22. рУ526, рУБ29, и контрольного штамма с вектором, то они не обеспечат такого эффекта ни при какой сколько-нибудь реальной дозе.

Кроме этого следует отметить, что первая группа рекомби-нантных штаммов по двум начальным дозам, а вторая - по всем дозам показали более низкий протективный эффект (по МПИ), чём контрольный штамм с вектором. Это свидетельствует о том, что в

Рис. 3. Аппроксимированные графики зависимости МПИ от иммунизирующей дозы (КОЕ) исследуемых штаммов.

обоих группах, возможно (указанное различие статистически не достоверно), имеется штамм(ы) с клонированными генами, продукты которых оказывают иммунодепрессирующее действие. Следовательно, при исключении этих клонов, протективный эффект первой группы рекомбинантов должен еще возрасти. Таким образом, теоретически возмошо ' получение необходимой дозы гена для того, чтобы достигнуть заметного уровня защиты.

В экспериментах по исследованию антигенности и протектив-ности были получены данные о роли caflR-гена в регуляции экспрессии капсульного антигена, подтвердившие мнение А.V. Kar-lyshev et al. (1992) об этом гене, как о гене-активаторе транскрипции. Мы использовали в качестве одного из тестируемых штаммов штамм Y. pestis EV с плазмидой pAFlO-23 (Кириллина

O.A.. 1992). содержащей /га-оперон без са/JR-rena. Уровень продукция капсульного антигена по результатам реакций РПГА и РНАт бу такой же. как и у штамма У. pestts ЕV, имеющего только нлагмид/ pFra. Это наблюдалось несмотря на то. что плазмида pAF10-23 мультикопийна и, следовательно, количество фракции I должно было бы превышать таковое у штамма У. pestts EV (pFra). По данным Кириллиной O.A. (1992). уровень экспрессии капсульного антигена в штаммах с плазмидой pAF10-23 действительно выше, чем в штаммах чумного микроба с плазмидой pFra, но основное его количество находится не на поверхности, а внутри клеток. При определении протективности штамм У. pestts EV с плазмидой pAF10-23 создал почти такой же уровень защиты, как и вакцинный штамм. Это свидетельствует о том. чтс протективная защита,'в основном, обеспечивается тем количеством капсульного антигена, которое представлено на клеточной поверхности.

Сравнение концентраций клеток, дающих 'положительную реакцию в РПГА и РНАт. штаммов чумного микроба,-' содержащих только гслазмиду pFra, позволило сделать предположение, касающееся регуляции экспрессии Гга-оперона. Было замечено, что концентрация клеток ьтамма У. pest is 231 (pFra)> обеспечивающая положительную реакцию, < на порядок превышает эту величину у штаммов У. pestts АИ22 (pFra) и У. pestts EV (pFra). Результаты про-зеденных исследований по сравнению физических карт плазмид pFra. свидетельствуют о том. что структура Гга-оперона, состоящего из четырех генов (Galyov Е.Е.. et al. 1990; Karlyshev LV. - et al., -1992), -у этих штаммов одинакова, 'но последовательности ДНК;расположенные,за caf'lR-геном у них разные, так ■cäK'именно в этом месте происходит разрыв с'инверсией фрагмен-

та ДНК. Следовательно, за саШ геном на плазмиде рГга231 либо находится какая-то последовательность ДНК. оказывающая позитивное воздействий на экспрессию капсюльного антигена, либо в этом месте отсутствует последовательное:ь. влияющая негативно, и которая, соответственно, находится за са/Ш геном на плазми-дах рРгаАИ22 и рГ'гаЕ^'.

Таким образом, в результате проделанной работы были получены новые данные о структурно-функциональной организации плазмид рРга штаммов разного происхождения Методами гибриди-зационного и рестрикционного анализов выявлены особенности молекулярной организации плазмид рРга штаммов У. резав 231. У. резш 358/л2, У. резШ А1122, У. ре$Ш ЕУ. Впервые показано, что, помимо хорошо известных, плазм1,1дсй рГга детерминируется еще не менее 10 белков, которые в были охарактеризованы по молекулярным массам, антигенной " протективной активностям.

Полученные в результате этой работы сведения имеют, прежде всего, фундаментальное значение. Они позволяет.проводить более целенаправленные исследования структуры ДНК плазмид рРга любых штаммов чумного микроба, в частности, рестрикционного картирования этих плазмид. Клонирование ранее неизвестных генов репликона рГга231. открывает возможности изучения их генетической организации, а так ке конструирования Н1Ташоз (супер) продуцентов кодируемых ими продуктов.

ВЫВОДЫ

1. Молекулярная структура плазмид pFra штаммов Y. pest 1а EV. Y. pestts А1122. Г. pestts 231, У. pestls 358/12 консервативна. Структура ДНК плазмид pFra океанических штаммов Y. pestts А1122 .И Y. pestls EV имеет отличия от структуры ДНК репли-конов pFra континентальных штаммов У. pestts 231 и У. pestls 358/12. заключающиеся в инверсии двух областей и меньшем на 3 kt> размером молекулы ДНК. Области ЛНК плазмид pFra23l и pFraAi122. в которых произошли разрывы цепи ДНК. сопряженные с * инверсией и делецией, не имеют между собой гомологии нуклео-тидннх последовательностей.

«

2. Плазмила рАСУС184 (репликон р15А) является более предпочтительным носителем для клонирования фрагментов плазмиды pFra штамма Y. ' pest is 231 по сравнению с векторами на основе ColEI репликона (pbR322. pUC18).

3. Пэлучена библиотека генов плазмиды pFra У. pestls 231. состоящая из фрагментов ДНК размерами от 1.4 до 9.1 kb. представительностью около 50%.

4. Показана возможность использования метода определения электрсфоретической подвижности микробных клеток в свободном потоке жидкости для скрининга библиотек генов.

5. Плазмидой pFra. помимо хорошо известных продуктов -Фракции I и "мышиного" токсина, кодируется не менее 10 белков, молекулярной массой от 11,3 до 105,6 kDa.

6. Клеточные белки, детерминированные клонированными генами плазмиды pFra23l, в рекомбинантных штаммах Y. pestts EV (pFra") обладают слабой антигенной активностью. В моноплазмид-

ном штамме У. pestts 231 (pFra) экспрессия этих генов не выявляется методом нммуноблотинга.

7. Продукты клонированных генов ранее неизученной области илазмлдн pFra231. экспрёссчрукмциеся в реципиентном штамме У. pestts EV (pCad*. pPst". pFra"). не обладают протективной активностью для белых мышей.

'СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TF.ME ДИССЕРТАЦИИ

1. Стукова Н. 10.. Дроздов И. Г.. Попов Ю.А., Шведун Г Л!.. Самойлова С. В., Яшечкин Ю. И., Кириллина O.A.. Булгакова Е. Г., Ледванов М.Ю. Факторы патогенности чумного микроба, их генетическая детерминированность и влияние на функциональное состой-ние макрофагов// Сб. тез. Рос. научн. конф. "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций"- Волгоград. - 1992. - С. 22.

2. Яшечкин Ю.И., Кириллина O.A., Попов D.H..- Дроздов И. Г. Физическое картирование 65 МД плаэмиды V. pestts 231// Сб. Проб, особо опасн. инф. - Саратов. - 1993.- N. 1-2. - С. 149-153.

3. Стукова Н. Ю., Дроздов И. Г.. Попов Ю. А., Шведун Г. П.. Самойлова C.B., Яшечкин Ю.И.. Кириллина O.A.. Булгакова Е.Г.. Лазовский Ю. В.. Фирсова В. В., Ледванов М.Ю. Генетически детерминированные факторы иммуногенности и вирулентности Y. pestis и их влияние на функционально« состояние макрофагов// Сб. тез. Рос. научн. конф. "Иммунол. и слециф. проф. ООН"- Саратов.-1993,- С. 70-71.

Mm- "J"» t*><