Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КЛИНИКО-МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОЯСНО-КОНЕЧНОСТНЫХ МЫШЕЧНЫХ ДИСТРОФИЙ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ФЕРМЕНТОПАТИЯМИ

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "КЛИНИКО-МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОЯСНО-КОНЕЧНОСТНЫХ МЫШЕЧНЫХ ДИСТРОФИЙ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ФЕРМЕНТОПАТИЯМИ"

РЫЖКОВА ОКСАНА ПЕТРОВНА

КЛИНИКО-МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОЯСНО-КОНЕЧНОСТНЫХ МЫШЕЧНЫХ ДИСТРОФИЙ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ФЕРМЕНТОПАТИЯМИ.

03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2011

2 4 033 ^п

4856123

Работа выполнена в лаборатории ДНК- диагностики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель - кандидат медицинских наук, Щагина Ольга Анатольевна

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор, Дадали Елена Леонидовна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор, - Петрнн Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор, Иллариошкин Сергей Николаевич

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская

медицинская академия имени И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится «/"» марта 2011г. в 14 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье,!)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан « «М 2011 ]

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко P.A.

Актуальность темы

Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД) - группа клинически полиморфных и генетически гетерогенных заболеваний, характеризующихся преимущественным поражением мышц тазового и плечевого поясов. Частота всех ПКМД колеблется в различных популяциях от 5 до 70 больных на 1 млн. населения (Дадали E.JL, ЩагинаО.А, 2010). К настоящему времени описано 20 генетических вариантов ПКМД, которые подразделяются в зависимости от типа наследования на две подгруппы: ПКМД 1 типа с аутосомно - доминантным и ПКМД 2 типа - с аутосомно-рецессивным типом наследования. Большая часть выявленных случаев ПКМД (до 85%) наследуется по аутосомно-рецессивному типу (Ginjaard Н.В., 2000). К настоящему времени практически все гены, ответственные за возникновение ПКМД, идентифицированы и определены белковые продукты их экспрессии. Установлено, что большинство этих продуктов являются частью саркомеры или сарколеммы мышечного волокна и, взаимодействуя друг с другом, формируют белковую цепь, обеспечивающую процесс сокращения и расслабления мышечного волокна (Vainzof М., 2008). Наряду с этим существует ряд белков, выполняющих роль ферментов, активирующих и синхронизирующих функции структурных белков в процессе мышечного сокращения и сигнальной транедукции. На сегодня известно два основных фермента мышечного волокна: кальпаии 3 типа, мутации в котором приводят к возникновению ПКМД 2А типа, и фукутин-связанный белок, мутации в котором приводят к ПКМД21 типа (Tidball J.G. & Spencer M.J, 2000), (Esapa C.T., 2002).

Показано, что в большинстве европейских популяций наиболее распространенным генетическим вариантом ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования является 2А тип (OMIM: 253600), обусловленный мутациями в гене капьпаина 3 (CAPN3'), на долю которого приходится от 30% до 40% всех случаев этой группы заболеваний (Canki-KIain N., 2004; Cobo A.M., 2004; Duno M., 2008). Вторым по частоте генетическим вариантом является ПКМД21 типа, обусловленная мутациями в гене FKRP который составляет от 6% до 38% аутосомпо-рецессивпых ПКМД в разных популяциях. Наиболее часто этот вариант ПКМД диагностируется в

странах северной Европы (НашБсЬ К, 2005). Таким образом, по данным литературы в Европе па долю двух указанных ферментопатий приходится до 50% всех ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования.

Вследствие того, что белковые продукты генов, мутации в которых приводят к развитию аутосомно-рецессивных ПКМД, участвуют в одном патогенетическом процессе, клинические проявления всех генетических вариантов этой группы заболеваний характеризуется значительным сходством, что затрудняет их дифференциальную диагностику и снижает эффективность медико-генетического консультирования (Дадали Е.Л., 2004). Возникают трудности в установлении типа наследования заболевания в изолированных случаях, расчетах повторного риска рождения больного ребенка и планировании профилактические мероприятия в отягощенных семьях. Все это обуславливает необходимость создания алгоритма дифференциальной диагностики ПКМД с использованием молекулярно-генетических методов. Наличие такого алгоритма позволит определить очередность исследования мутаций в тех или иных генах, ответственных за развитие различных вариантов ПКМД, что существенно снизит экономические затраты при использовании дорогостоящих методов ДНК анализа. В основу такого алгоритма могут быть положены различия в частотах встречаемости отдельных генетических вариантов ПКМД и особенности их клинических проявлений. Проведение таких исследований наиболее целесообразно начинать с клинико-генетического анализа наиболее распространенных аутосомно-рецессивных вариантов ПКМД, к которым, по данным литературы, относятся две ферментопатии - ПКМД2А и 21 типов.

Однако до настоящего момента в РФ не проводилось исследований, направленных на определение вклада этих ферментопатий в общий спектр заболеваний с клинической картиной ПКМД и не анализировались особенности их клинических проявлений.

Цель исследования

Клинико-генетический анализ двух наследственных ферментопатий из группы ПКМД 2А и 21 типов и разработка алгоритмов их молекулярно-генетической диагностики на основании обследования выборки больных, проживающих на территории РФ.

Задачи исследовании

1. Определение частоты встречаемости ПКМД 2А и 21, обусловленных мутациями в генах САРИЗ, РКРР в выборке больных, проживающих на территории РФ.

2. Разработка эффективных систем регистрации мутаций в CAPNЗ, ИКИР генах и проведение анализа их спектра и частот встречаемости.

3. Анализ частот встречаемости основных клинических симптомов характерных для различных вариантов ферментопатий, обусловленных мутациями в генах САРИЗ и РКРР.

4. На основании полученных результатов и анализа литературных данных разработать алгоритм молекулярно-генетического диагностики распространенных ферментопатий из группы аутосомно-рецессивных ПКМД.

Научная новизна

Впервые в выборке больных с ПКМД, проживающих на территории РФ проведен анализ спектра и частот встречаемости мутаций в генах САРЫЗ и РКЯР, ответственных за возникновение двух ферментопатий из группы мышечных дистрофий - ПКМД 2А и 21 типов. Установлен вклад мутаций этих генов в структуру заболеваемости ПКМД с АР типом наследования. Выявлено наличие «горячих» экзонов и мажорных мутаций в гене САРЫЗ и РКЯР и разработана система их регистрации. Впервые, на основании анализа гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель, определены причины распространенности частых мутаций и проведена оценка возраста возникновения мутации с.550с!е!А, на долю которой приходится 49% всех мутаций в гене САРИЗ у российских больных с ПКМД 2А типом. На основании полученных оценок распространенности и особенности клинических проявлений двух ферментопатий из группы ПКМД, разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики распространенных ферментопатий у больных с ПКМД.

Практическая значимость

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики и протоколы ДНК-диагностики распространенных генетических вариантов аутосомно-рецессивных ферментопатий с фенотипом ПКМД. Созданы эффективные диагностические

системы для выявления наиболее часто встречающихся мутаций в генах CAPN3 и FKRP, ответственных за возникновение ПКМД 2А и 21 типов, позволяющие оптимизировать и значительно снизить затраты на проведение их молекулярно-генетической диагностики. Результаты проведенного исследования могут быть использованы в практической работе врачей-генетиков и неврологов, работающих в области наследственной патологии нервной системы, а также в курсе лекций по клинической генетике на кафедрах генетики медицинских ВУЗов.

Положения, выноснмые на защиту

1. На долю ПКМД 2А типа, обусловленой мутациями в гене CAPN3 и ПКМД 21 типа, обусловленой мутациями в гене FKRP приходится 43% и 9% всех изолированных ПКМД соответственно.

2. В выборке российских больных с ПКМД 2А типа выявлены две мажорные мутации гене в CAPN3 - c.550delA и с. 598-612dell5, которые обнаружены в 35% случаев (23% мутантных аллелей). Показано, что причиной высокой частоты мутации c.550delA является эффект основателя. Возраст мутации составляет 1700±500 лет.

3. Основной причиной возникновения ПКМД21 у больных, проживающих на территории РФ, является мутация Leu276Ile в гене FKRP.

4. Не выявлены статистически достоверные отличия по частотам основных неврологических симптомов в группах больных с мутациями генов CAPN3 и FKRP, что свидетельствует о невозможности их разграничения только на клиническом уровне.

5. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных наследственными ферментопатиями с клиникой ПКМД и эффективные системы диагностики частых мутаций в генах CAPN3 и FKRP, ответственных за их возникновение.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010, на конференции European Human Genetics Conference 2010, на конкурсе молодых ученых в МГНЦ РАМН в 2009, на конференции European Human Genetics Conference 2009.

Личный вклад автора в проведение исследовании

Автором проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, сформирована группа обследования. Автор лично принимал участие в планировании экспериментов. Автор самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из образцов крови пациентов, проводил поиск мутаций, генотипирование контрольной выборки на неописанные ранее точечные замены, анализ гаплотипов хромосом с частыми мутациями в генах CAPN3 и FKRP. Автором разработана система диагностики 2 частых мутаций гена CAPN3, разработан алгоритм молекулярно-генетического анализа больных изолированной ПКМД из РФ. Автор провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 8 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы по анализу генетического и фенотипического разнообразия распространенных ферментопатий в группе ПКМД были внедрены в практику медико-генетического консультирования при МГНЦ РАМН.

Объем н структура работы

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение собственных исследований, заключение, выводы. Указатель литературы содержит 89 источников: 1 отечественный и 88 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 20 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы исследования

Для исследования использовали образцы геномной ДНК 75 неродственных больных в возрасте от 4 до 36 лет (30 мужчин и 45 женщин), с диагнозом поясно-копечностпая мышечная дистрофия и 14 их клинически здоровых родственников, живущих в разных регионах РФ. Шесть пациентов имели подтвержденный аутосомно-рецессивпый тип наследования (семейные случаи), остальные случаи заболевания были спорадическими. Диагноз ПКМД верифицирован врачами-генетиками Медико-генетического научного центра РАМН, а так же Воронежской медико-генетической консультации.

Контрольную выборку составили 100 образцов (200 хромосом) полученных от неродственных индивидов различных регионов РФ. Кроме того, в качестве группы сравнения для расчета возраста мутации использованы образцы ДНК членов 24 ядерных семей (96 хромосом) из различных регионов РФ

Выделение геномной ДНК проводили с помощью набора DNA Prep 100 Diatom ™ из образцов периферической крови.

Исследование генов CAPN3 и FKRP проводили с помощью прямого автоматического секвенирования кодирующих областей генов, включая области экзон-иптронных соединений. Амплификацию необходимых фрагментов геномной ДНК проводили методом ПДР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия). Все фрагменты были секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator's v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Bio systems, Foster City, CA) и генетического анализатора ABI PRISM 3130x1 (Applied Biosystems), анализ результатов секвенирования проводили с помощью программы Chromas.

При выявлении у пациентов ранее неописанных нуклеотидных замен, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях, исследованы частоты их встречаемости в контрольной группе методом мультиплексной пробзависимой лигазной реакции.

При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене CAPN3 выбраны 7 микросателлитных маркеров с высокой гетерозиготностыо,

расположенных в области размером 5791 т.п.н, (3,22 сМ) вокруг гена CAPN3, 4 из которых расположены в сторону центромеры от гена и 3 - в сторону теломеры. При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене FKRP выбрано четыре микросателлитных маркера с высокой гетерозиготиостыо, расположенных в интервале 1980 т.п.н. (2,58 сМ) вокруг гена FKRP, два из которых расположены в сторону центромеры от гена и два в сторону теломеры. Так же для построения гаплотипа использованы внутригенные маркеры (FKRP 3' GT — двухнуклеотидный повтор в 3' области гена и полиморфизм с.135С>Т (к22И1\1)). Для каждого из маркеров были выбраны и синтезированы пары праймеров. Амплификацию фрагментов проводили в стандартных объеме и составе реакционной смеси. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучепии.

При сравнении частот аллелей в хромосомах с мутацией и в популяционных хромосомах использован %2 тест для двупольной таблицы, а так же точный критерий Фишера для случаев, когда критерий х2 неприменим при малом числе наблюдений.

Для оценки неравновесности по сцеплению использовали оценку 5 = (PD - PN)/(1 - PN), где 5 - мера неравновесности сцепления, PD - частота ассоциированного аллеля среди хромосом с мутацией, PN - частота этого же аллеля среди нормальных хромосом (Bengtsson В.О., 1981), с доверительным интервалом, предложенным Diaz G.A. с соавт. (2000).

Для определения возраста частой мутации гена CAPN3 c.550delA применяли один из подходов, основанных на понятии «генетических часов» (Labuda D,, 1997), и оценивающий количество поколений g (Rish N., 1995) с момента появления мутации в популяции до настоящего времени, исходя из изменения неравновесия по сцеплению полиморфных маркеров с локусом заболевания за этот период времени.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Молскулярпо-генетпческин анализ

В результате проведенного исследования выборки больных с изолированной поясно-конечностной мышечной дистрофией с отсутствием вертикального типа наследования оценена доля генетических вариантов, обусловленных мутациями генов, кодирующих ферменты, функционирующие в мышечном волокне и участвующих в процессе мышечного сокращения и сигнальной трансдукции. Показано, что на долю мутаций гена САРЫЗ, ответственного за возникновение ПКМД2А типа приходится 43,2% случаев заболевания, мутации гена ГКРР являются причиной ПКМД в 9,5%случаев.

Полученные результаты соответствуют литературным данным о частотах встречаемости данных генетическиз вариантов.

Молекулярно-гснетический анализ ПКМД2А типа

В гене САРЫЗ, мутации которого ответственны за развитие ПКМД2А типа обнаружены 24 различные мутации на 61 хромосоме у 32 больных. 19 мутаций описаны ранее, а пять идентифицированы впервые. Полученные результаты суммированы в табл. 1.

Все впервые выявленные мутации обнаружены у единичных больных. Три мутации с. 107с1еЮ, с.1002с1е1С, с.1558_1559с!е1СТ являются делениями, приводящими к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона. Одна из мутаций - с.11280>А - является нонсенс-мутацией. Неописанная ранее замена цитозина па тимин в интроне 16 (с.1915+10С>Т) является, мутацией сайта сплайсинга.

Мутации в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии идентифицированы у 29 больных, у 3 больных выявлена всего одна мутация в гетерозиготном состоянии. Однако, наличие характерной клинической картины у пациентов, позволяет сделать предположение, что причиной развития заболевания являются именно мутации в гене САРИЗ. Можно так же предположить, что вторая мутация находится в регуляторных областях гена, на данный момент не доступных

и

исследованию, или является протяженной делецией, не затрагивающей участок гена гомологичный тому, где мутация была выявлена.

Таблица 1. Спектр выявленных мутаций гена САРИЗ

№ экзона/ интрона Мутация Кол-во хромосом Ссылки

нуклеотид аминокислота

1 с. 107delG р.С1у36УаИзХ21 1 Впервые обнаружена

1 с.145С>Т p.Arg49Cys 1 Groen E.J. et al., 2007

2 c.319G>A р.01иЮ7Ьуз 1 Richard I. et al., 1999

4 c.550delA p.Thrl84ArgfsX36 30 Richard I. et a!., 1999

4 с.598 612del р. РЬе200 Leu204del 4 Todorova A. et al., 2005

5 c.649G>A р.Ои217Ьуз 3 Pollitt C. et al., 2001

7 c.l002delC р.Н1з334С1пГ5Х11 1 Впервые обнаружена

8 C.10630T р.Агв355Тгр 1 Krahn M. et al., 2006

8 с. 1079G>A р.ТгрЗбОХ 1 Krahn M. et al., 2006

8 C.1106G>A р.Тгр369Х 1 Todorova A. et al., 2005

8 c,1043delG Р.С1у348Уа1ГзХ4 1 Todorova A. et al., 2005

8 c.l 113T>A р.А$р37Ю1и 1 Richard 1. et al., 1999

9 c. 1128G>A р.Тгр376Х 1 Впервые обнаружена

10 с.1250С>Т р.ТЬг417Ме1 1 Krahn M. et al., 2006

10 c,1333G>A р.ау445А^ 1 Guglieri M. et al., 2008

И c. 1465C>T pArg489Trp 1 Urtasun M. et al., 1998

11 c,1471A>T рХу5491Х 1 Richard 1. et al., 1999

13 c. 1558 1559delCT р.Ьеи520А1а!зХ56 1 Вперпые обнаружена

14 c.l746-20C>T Сайт сплайсинга 2 Krahn M. et al., 2006

16 С.1914+ЮОТ Сайт сплайсинга 1 Впервые обнаружена

17 c.l 981 del A р.Пе661Х 1 Richard 1. et al., 1999

21 c.2207 2208delCA рЛТ1г736Аг£1да8 2 Pihiso G. et al., 2005

21 c.2243G>A р.Агд74801п 1 Richard 1 et al., 1999

22 c.2306G>A p.Arg769Gln 2 Richard I. et al., 1995

Всего 24 61

Выявлены «горячие» экзоны гена САРЫЗ, мутации в которых встречаются достоверно чаще, чем в других - I, 4, 5, 8, 10, 11, 20, 22 экзоны. В экзонах 3, 6, 12, 15, 18, 19, 20, 23, 24 мутаций не обнаружено, однако, по литературным данным, мутации в данных экзонах встречаются и, вероятнее всего, они не выявлены в связи с малым размером выборки ( рис. 1).

А 4> 0 0 А ©

х

А х

л0 О х &оА0 о

34

О©

I 2 3 4 5 6 7 8 9 !0 П 12 13 1415 16 17181920 21 22 2324

N8 Ш Ш2

I п га IV

О Мисссмс -щтэции X Ножеж-ыутации 1 Мутации сайта сплайсинга

/> депеция без сдвига . Делеция со сдвигом V рмхи считывания Ш ртхи считывания

Рис. 1. Распределение выявленных мутаций по экзонам гена САРЫЗ.

Примечание: В квадратах, условно обозначающих экзоны, цифрами обозначено количество выявленных мутаций в данном экзоне. Если одна и та же мутация встречается более 1 раза, она помечена цифрой в графическом ее изображении.

На «горячие» экзоны приходится 53 из 61 хромосом с мутацией, что составляет 86,9%. При молекулярпо-генетической диагностике данных экзонов обнаруживается хотя бы одна из «мутантных» хромосом у всех больных ПКМД2А. Информативность анализа «горячих» экзонов в данном исследовании составляет 43,2% от всей выборки. (табл.2)

Обнаружены две частые мутации, встретившиеся на 4 и более хромосомах. Одна их них, мутация с.598_612с1е1, встретилась у 4 больных с изолированной ПКМД, что составило 5,4%, на 4 хромосомах (2,7%). Среди больных ПКМД2А данная мутация обнаружена в 12,5% случаев (6,3% хромосом с мутацией). Другой частой мутацией в гене САРИЗ является мутация с.55(Ме1А, которая обнаружена у 23 из 74 больных, что составляет 31,1%, на 30 хромосомах (20,3%). Среди 32 больных с установленным диагнозом ПКМД2А мутация с.550с)е1А встретилась хотя бы в одном аллеле у 23 больных, то есть у 71.9% больных ПКМД2А, при этом в данной группе она

встретилась на 46,9% хромосом (табл.2)

Таблица 2. Результаты анализа гена САРЫЗ.

всего «горячие экзоны» гена САРЮ мутация c.550del А мутация с.598_6Ше! 2 частые мутации гена САРЫЗ

Кол-во пациентов 32 32 23 4 26

Кол-во хромосом 61 34 30 4 34

Для выявления двух частых мутаций, характерных для больных из РФ, обе или одна из которых встречается хотя бы на одной из хромосом в 81,2% случаев среди всех больных ПКМД2А (55,7% хромосом с мутациями), был разработай быстрый, дешевый и эффективный метода их диагностики, основанный на ПДАФ-анализе. (рис. 2).

гетеродуплекс

179 п.н. N 164 п.н с!е1

50 п.н. N

51 п.н. с)е1

С.598 612бе1

...............

ШМ1

c.550delA

Рис. 2. Система идентификации двух частых мутаций гена САРЫЗ, c.550delA и с.598 612de! методом ПДАФ - анализа.

В работах европейских авторов (Германии, Чехии, Хорватии, Болгарии и Италии) так же имеются описания мутации с.598 612с1е1, другими авторами данная мутация не

упоминается. Из этого можно сделать предположение, что причиной распространения данной мутации в указанном регионе является эффект основателя.

Мутация с.550с!е1А встречается среди больных во всем мире, однако, по литературным данным, она особенно часто встречается в странах Восточной Европы, таких как Болгария, Хорватия, Украина, что может говорить об эффекте основателя как о причине распространения мутации в этом регионе, а так же о довольно большом возрасте мутации.

Чтобы установить природу высокой частоты мутации с.550(1е1А у российских больных, проведен анализ частот встречаемости аллелей 7 микросаттелитных маркеров, лежащих вблизи гена САРЫЗ, на хромосомах с мутацией и без мутации. Из табл. 3 видно, что полное неравновесие по сцеплению не обнаружено ни по одному маркеру. Неравновесие по сцеплению наблюдается по шести из семи исследованных маркеров 0158994 - 0158968 - 015Б514 - 015Б779 - И158780 - 0158778.

Таблица 3. Аллельные частоты (%) микросаттелитных маркеров из области гена САРИЗ на хромосомах с мутацией с.550с1е1А и популяционной выборке жителей РФ.

Маркер 0158994 0158968 0158514 0158779 0158780 0158778 0150659

МЬ 38.370 38.433 39.998 40.201 40.977 43.834 44.161

сМ 40.25 40.25 43.47

зд. бол. зд. бол. зд бол. зд. бол. зд. бол. зд. бол. зд. бол.

Кол-во хромосом 166 23 166 23 96 23 96 23 96 23 96 23 166 23

аллель

-1 6,2 8,7

0 3,1

1 2,1 13,9 8,7 1,0 3,1 3,1 3,0

2 1,0 11,4 13,0 31,2 56,5 30,2 4,3 2,1 24,1 4,3

3 9,4 18,7 4,3 37,5 17,4 10,4 24,0 4,3 15,6 87,0 22,3 17,4

4 41,7 78,3 5,4 4,2 13,0 4,3 36,5 91,3 19,8 8,7 5,4 8,7

5 15,6 4,3 37,3 65,2 5,2 4,3 14,6 5,2 34,4 3,6 8,7

6 3,1 4,3 10,2 1,0 2,1 1,0 16,7 16,3 17,4

7 14,6 13,0 1,8 5,2 2,1 8,3 4,3 16,3 30,4

8 10,4 8,7 3,1 4,8 13,0

9 2,1 4,2 41,7 91,3 4,2 4,3

10 1,2 19,8

11 4,2 3,1 4,3

Примечание: Частоты аллелей с наибольшей неравновесностью по сцеплению выделены цветом; зд. - здоровые; бол. - больные.

Определены значения неравновесия по сцеплению 5 для каждого аллеля всех исследованных маркеров, также применен точный критерий Фишера для оценки достоверности ассоциации данного аллеля маркера с локусом ПКМД2А (табл. 4).

Таблица 4. Ассоциация и неравновесие по сцеплению аллелей маркеров с локусом ПКМД2А

Маркер Mb сМ аллель Р 8±95%ДИ

D15S994 38.370 40.25 4 0.023 0,63+/-0,30

D15S698 38.433 40.25 5 0.023 0,44+/-0,32

D15S514 39.998 2 0.023 0,37+/-0,31

D15S779 40.201 9 <0.001 0,85+/-0,20

CAPN3 40.467 m

D15S780 40.977 4 <0.001 0,87+/-0,16

D15S778 43.834 3 <0.001 0,85+/-0,17

D15S659 44.161 43.47 7 0.08 0,17+/-0,24

Примечание: р - вероятность для одностороннего варианта точного критерия Фишера; 6 -мера неравновесности сцепления аллелей полиморфных маркеров с локусом заболевания, ДИ-доверительный интервал

При построении гаплотипа основателя выбирались аллели характеризующиеся максимальной неравновесностыо сцепления с локусом заболевания по сравнению с другими аллелями маркеров должны и имеющие большее накопление в хромосомах с мутацией по сравнению с другими аллелями. Поэтому, при определении предкового аллеля учитывали наибольшее положительное значение 5 и наименьшее р среди всех аллелей данного маркера. В результате роведенного исследования, наиболее вероятным представляется следующий гаплотип основателя: D15S994 - D15S968 -D15S514 - D15S779 - D15S780 - D15S778 : 4-5-2-9-4-3 ( табл. 5).

По маркерам D15S514, D15S779, D15S780 и D15S778 гаплотип большинства хромосом с мутацией в выборке российских больных идентичен гаплотипам большинства хромосом с мутацией c.550delA, исследованными европейскими авторами. Данный факт говорит в пользу предположения, что распространение мутации происходило от общего основателя, так же это подтверждается частотой встречаемости мутации и ее концентрацией в странах Восточной Европы.

Таблица 5. Гаплотипы хромосом с мутацией с.55(Ме1А.

Маркер 0158994 0155968 0158514 0158779 САРЮ О158780 0158778 0150659

МЬ 38.370 38.433 39.998 40.201 40.467 40.977 43.834 44.161

Ж>№К 40.25 40.25 43.47

13 4 5 2 9 П1 4 3 7

63 4 5 2 9 ш 4 3 7

30 4 5 2 9 ш 4 3 7

61 4 5 2 9 111 3 3 7

77 4 5 2 9 111 4 3 2

8 4 5 2 9 ш 4 3 8

78 4 5 2 9 111 4 3 3

75 4 5 2 9 111 4 3 8

8 5 5 2 9 гп 4 3 3

44 4 2 2 9 111 4 3 4

44 4 2 2 9 111 4 3 4

42 4 1 4 9 III 4 3 7

42 4 5 4 9 111 4 3 7

13 4 5 3 9 111 4 3 8

12 7 8 3 9 111 4 3 6

6205 4 5 -1 9 III 4 3 5

23 7 3 5 9 III 4 3 6

78 4 5 3 9 П1 4 3 3

75 6 5 4 9 [11 4 3 3

63 4 5 -1 9 П1 4 7 6

30 4 1 2 9 III 3 4 5

61 4 8 3 4 III 4 4 6

34 7 2 2 11 ш 2 3 7

Примечание: Красным цветом выделена сохраненная часть гаплотипа основателя: синим цветом обозначены мутаитные аллели

При расчете возраста мутации использованы значения неравновесия по сцеплению для маркеров 0!5Б994 и 0158968 для аллелей, у которых наблюдалась достоверная ассоциация с локусом САРЫЗ и мера неравновесности сцепления аллеля данного маркера 8 с заболеванием лежала в пределах 0,20-0,80 (табл. 6).

Таблица 6. Число поколений, прошедших с момента распространения мутации.

Маркер Mb сМ аллель Р g Кол-во лет

D15S994 38.370 40.25 4 0.023 38.62 1160

D15S698 38.433 40.25 5 0.023 72.17 2160

Среднее значение 55.4+/-16.8 1660+/-500

Среднее значение числа поколений существования мутации в популяции составило 55,4 со стандартным отклонением 16,8. Средняя продолжительность одного поколения принималась равной 30 годам, соответственно время, за которое была накоплена мутация составляет около 1660 +/- 500 лет, учитывая, что средний год рождения больных 1980, период начала распространения мутации соответствует 340 году н.э., что соответствует историческим сведениям о великом переселении народов происходившем в 4 - 7 веках нашей эры на территории Европы.

Молекулярно-гепетическнн анализ ГЖМД21 типа При исследовании всей кодирующей последовательности гена FKRP, обнаружено 5 различных мутаций на 12 хромосомах, две из которых c.34IC>G и с.826С>А были описаны ранее, а три мутации - с.229С>Т, с.265С>Т, c,1078G>C идентифицированы впервые (табл. 7).

Таблица 7. Спектр выявленных мутаций гена FKRP

Мутация Кол-во хромосом Ссылки пуклеотид

пуклеотид аминокислота

с.229С>Т p.Gln77X 2 Впервые обнаружена

с.265С>Т p.Pro89Ser 1 Впервые обнаружена

c.341C>G p.Alall4G)y 2 Driss A. et al.,2003

с.826С>А p.Leu276Ile 6 Walter M.C.et al., 2004

c.l078G>C p.Asp360His 1 Впервые обнаружена

Всего 5 12

Мутации в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии идентифицированы у пяти больных, у двух больных выявлена всего одна, описанная ранее, мутация с.34100 (р.АЫ 1401у) в гетерозиготном состоянии. Однако, наличие характерной клинической картины у данных пациентов, позволяет сделать предположение, что причиной развития заболевания являются мутации именно в гене РКЯР. Можно так же предположить, что вторая мутация находится в регуляторных областях гена, на данный момент не доступных исследованию, или является протяженной делецией, не затрагивающей участок гена гомологичный тому, где мутация была выявлена.

Обнаружена частая мутация с.826С>А (р.Ьеи276Пе), встретившаяся на 6 хромосомах, то есть на 50% всех «мутантных» хромосом, обнаруженных у больных ПКМД21 типа. Чтобы установить природу высокой частоты мутации с.826С>А у российских больных проведен анализ гаплотипов всех 6 хромосом с данной мутацией, используя микросаттелитные маркеры, лежащие вблизи гена РККР. Характеристики гаплотипов хромосом с мутацией с.826С>А представлены в табл. 8.

Таблица 8. Гаплотипы хромосом с мутацией с.826С>А.

Маркер D19S219 D19S412 FKRP 3' GT C.13SOT rs2287717 Mutation SLC1A5 3271 D19S606

Mb 50.685 51.702 51.953 51.953 51.969 52.665

70.14 70.14 72.72

87 7 11 3 Т М 1 7

87 7 11 3 Т М 1 7

6928 7 11 3 Т М 1 7

6928 7 11 3 Т М 1 4

62 8 1 3 Т М 1 7

47 7 1 3 т М 1 7

Примечание: Красным цветом выделена сохраненная часть гаплотипа основателя

На всех хромосомах, несущих мутацию, обнаружен общий гаплотип по маркерам FKRP 3' GT - FKRP C.I3SOT - Mutation - SLC1A5: З-Т-М-1, где М- мутация С.8260А. На трех хромосомах, несущих мутацию, обнаружен общий гаплотип по всем маркерам. Из полученных результатов можно сделать вывод, что причиной распространенности мутации с.826С>А является эффект основателя.

Статистический анализ сходства клинической картины групп пациентов с различными типами ПКМД

Учитывая значительное сходство симптомов ПКМД 2А и 21 типов, а также в группе больных с изолированными ПКМД, у которых не выявлено мутаций в генах САЬРЗ и РКЯР было необходимо попытаться выделить ядро клинических признаков на основе проведения статистического анализа. Для решения этой задачи для каждого больного была составлена карта фенотипа, в которую входило 37 качественных клинических признаков и один количественный - уровень активности креатинфосфокиназы в плазме крови. В качестве исходных материалов для оценки клинических критериев ПКМД использовались результаты клинических исследований пациентов с тремя типами ПКМД, объединенные в группы, именуемые как: группа О (N=31) - пациенты, у которых не было найдено мутаций, группа К (N=26) - пациенты с мутациями в гене САРЫЗ, группа Ф (N=6) - пациенты с мутациями в гене РКЯР. Значения в скобках конкретизируют число пациентов в исследуемых группах.

Фенотипические различия между исследуемыми группами иллюстрирует рис. 3. В идеальном случае, когда исследуемые группы демонстрируют выраженную клиническую специфику, доверительные шары образуют в пространстве признаков не перекрывающиеся области. Чем выше степень фенотипического сходства исследуемых групп, тем более глубоким будет перекрывание доверительных шаров. Как следует из рис. 2 анализируемые группы обнаруживают достаточно глубокое перекрывание областей, характеризующих вариабельность клинического фенотипа образующих их пациентов. Это обстоятельство указывает на близость клинической манифестации исследуемых типов ПКМД. В то же время для каждого из типов ПКМД существуют фрагменты областей, неперекрываее областями, соответствующими всем другим типам ПКМД, что указывает на наличие отдельных симптомов и признаков, обладающих дифференцирующими способностями.

Рис. 3. Проекции доверительных шаров, отражающих вариабельность фенотипов пациентов различных групп

С целью выделения этих наиболее информативных симптомов и признаков был проведен анализ частот встречаемости каждого из анализируемых симптомов для каждой из исследуемых групп пациентов. Результаты приведены в табл. 11. Там же приведены результаты попарных сопоставлений частот встречаемости признаков в отдельных группах. Сопоставление частот проводилось стандартным методом сравнения выборочных долей. Результаты сопоставления представленя величинами зпачимостей (р). Сраниваемые группы статистически достоверно различаются частотой манифестиации некоторого признака, если рассчитанный уровень значимости не превышает уровня р < 0.05. Полученные результаты представлены в табл. 9.

Таблица 9. Частота встречаемости признаков среди пациентов с различными типами ПКМД

№ Наименование признака Частота ([,%) Значимость (р)

Гр.О Гр. К Гр. Ф Гр.О Гр. К Гр.О Гр. Ф Гр.К Гр.Ф

1 Возраст дебюта до 5 лет 53.57 3.23 50.00 <0.01 0.87 <0.01

2 Возраст дебюта 6-10 лет 7.14 29.03 16.67 0.04 0.46 0.54

3 Возраст дебюта 11-20 лет 32.14 58.06 0.00 0.06 0.11 0.01

4 Возраст дебюта старше 20 лет 7.14 9.68 33.33 0.71 0.08 0.13

5 "Крыловидные лопатки" 25.00 67.74 0.00 <0.01 0.18 <0.01

6 Симптом дряблых предплечий 10.71 54.84 0.00 <0.01 0.41 0.02

7 "Осиная " талия 7.14 3.23 0.00 0.49 0.50 0.66

8 Изменение походки по типу утиной 57.14 61.29 100.00 0.76 0.05 0.07

9 Степпаж 0.00 6.45 0.00 0.18 - 0.53

10 Трудности подъема по лестнице 85.71 93.55 100.00 0.31 0.33 0.54

И Приемы Говерса 89.29 93.55 100.00 0.59 0.41 0.54

12 Нарушение ходьбы на пятках 25.00 80.65 33.33 <0.01 0.69 0.02

13 Нарушение ходьбы на носках 3.57 6.45 0.00 0.62 0.64 0.53

14 Гипотрофия мышц голеней 32.14 32.26 0.00 0.98 0.11 0.11

15 Гипотрофия мышц предплечий 32.14 22.58 0.00 0.41 0.11 0.20

16 Гипотрофия мышц плечевого пояса 89.29 100.00 83.33 0.06 0.68 0.03

17 Гипотрофия мышц тазового пояса 89.29 100.00 83.33 0.06 0.68 0.03

18 Гипотрофия мышц лица 0.00 0.00 0.00 - - -

19 Отсутствие/снижение ахилловых рефлексов 75.00 83.87 100.00 0.39 0.18 0.29

20 Отсутствие/снижение коленных рефлексов 92.86 93.55 100.00 0.76 0.50 0.53

21 Отсутствие/снижение рефлекса двуглавой мышцы 67.86 83.87 83.33 0.16 0.47 0.97

22 Отсутствие/снижение рефлекса карпо-радиального 64.29 64.52 83.33 0.98 038 0.39

23 Снижение силы в дистальных отделах нижних конечностей 21.43 48.39 16.67 0.04 0.79 0.17

24 Снижение силы в дистальных отделах верхних конечностей 21.43 32.26 16.67 0.33 0.79 0.47

25 Снижение силы в проксимальных отделах нижних конечностей 75.00 100.00 83.33 <0.01 0.68 0.03

26 Снижение силы в проксимальных отделах верхних конечностей 75.00 100.00 83.33 <0.01 0.68 0.03

27 Деформация стоп 0.00 12.90 0.00 0.05 - 0.36

28 Деформация кистей 0.00 3.23 0.00 0.34 - 0.66

29 Контрактуры крупных уставов 50.00 64.52 33.33 0.28 0.45 0.16

30 Контрактуры мелких суставов 3.57 3.23 0.00 0.93 0.64 0.66

31 Поясничный гиперлордоз 28.57 45.16 16.67 0.19 0.55 0.21

32 Сколиоз 0.00 25.81 0.00 <0.01 - 0.17

33 Кардиопатия 21.43 25.81 0.00 0.68 0.22 0.17

34 Интенционный тремор кистей 3.57 0.00 0.00 0.29 0.64 -

35 Диффузная мышечная гипотония 39.29 54.84 50.00 0.24 0.63 0.83

36 Псевдогипертрофии икроножных мышц 10.71 29.03 50.00 0.08 0.03 0.32

37 Асимметрия поражения 3.57 6.45 0.00 0.62 0.64 0.53

При сравнении групп больных с ПКМД2А типа и больных, у которых не обнаружено мутаций в двух исследованных генах (группы К и О), статистически достоверно (на уровне значимости р <, 0.05) получены различия по частоте встречаемости следующих признаков: «крыловидные лопатки», симптом дряблых предплечий, нарушение ходьбы на пятках, снижение силы в дистальных отделах нижних конечностей; снижение силы в проксимальных отделах нижних конечностей; снижение силы в проксимальных отделах верхних конечностей. Доля пациентов, у которых наблюдается данный признак, в группе ПКМД2А типа достоверно превышает их долю в группе больных с неидентифицированными мутациями. Кроме того, в группе больных с ПКМД 2А типа обнаружены деформации стоп и кистей, а также сколиоз в грудо-поясничном отделе позвоночника, которые встречались в 12,9%, 3,29% и 25,81% соответственно и не были выявлены у больных с ПКМД не уточненного типа, что может свидетельствовать о большей тяжести и генерализации процесса. При сравнительном анализе возраста дебюта заболевания показано, что доля пациентов, у которых признаки заболевания отмечается до 10 летнего возраста в группе К достоверно превышает их долю в группе 0.

Анализ полученных данных для группы Ф не проводился в связи с ее малым размером.

Сравнение исследуемых групп по значениям КФК, измеряемым в количественной шкале, проводилось с использование непараметрического критерия Краскела-Уоллиса для анализа множественных различий (табл. 10)

Табл. 10. Анализ различий между исследуемыми группами пациентов по значениям КФК

Средние значения КФК Статистика Краскела-Уоллиса Уровень значимости

Группа 0 Группа К Группа Ф

2633.4±1044.2 3577.2±1067.4 5328.5±3654.6 3.77 0.15

Данные приведенные в табл. 10 указывают на то, что исследуемые группы не обнаруживают статистически достоверных (на уровне значимости р < 0.05) различий по значениям КФК. Однако полученный результат не указывает на объективное отсутствие различий между группами по значениям КФК, он в большей степени обусловлен ограниченностью объемов выборочных данных, привлекаемых для анализа.

Алгоритм диагностики фермснтопатнй у больных с клюшкой ПКМД с аутосомно-рецссспвпым типом наследования

На основании результатов клинико-молекулярно-генетического анализа проведенного в группе российских больных с ПКМД разработан алгоритм их диагностики, позволяющий оптимизировать затраты на дорогостоящие методы ДНК анализа и уменьшить продолжительность диагностического этапа медико-генетического консультирования. Учитывая отсутствие значимых клинических признаков, дифференцирующих ПКМД2А и 21 типа, в основу предложенного алгоритма положены частоты встречаемости двух проанализированных генетических вариантов, наличие мажорных мутаций и «горячих» экзонов генов САРЮ и РКНР.

В первую очередь необходимо исследовать две частые мутации в гене САРЫЗ, если мутации не обнаружены или одна из мутаций обнаружена в гетерозиготном состоянии, следует исследовать «горячие» экзоны гена САРИЗ. Если после данного исследования не будет найдено мутаций в исследуемых экзонах гена САРЫЗ, то для установления генетического варианта, следует исследовать ген и только затем

проводить секвенирование остальных экзонов гена САРЫЗ. Это обусловлено тем, что эффективность исследования мутаций в не «горячих» экзонах в группе больных ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования составляет менее 4%, тогда как эффективность диагностики мутаций в гене РКЯР составляет около 9,5%. Предложенный алгоритм молекулярно-генетической диагностики схематически представлен на рис. 4.

Не передано-мышечное

Поражение мышц поясов конечностей

ЭМГ КФК

Первично- Повышенное Норма

мышечное

Не ПКМД

2 мутации

ПКМД 2А

ПКМД

Не ПКМД

— Анализ 2 частых мутаций в гене САРШ'

| нет мутаций г -Секвенирование "горячих" экзонов гена САРШ' | нрч мутаций' Секвенирование гена РКЯР-

нем мутации • Секвенирование "не горячих" экзонов гена CAPN3-1 нет мутации Другой гил ПКМД

2 Мутации S мутация

| ПКМД 211

Рис. 4. Алгоритм исследования ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования.

ВЫВОДЫ

1. Установлен вклад мутаций генов САРЫЗ и РКИР, обуславливающих развитие фермелтопатий, в структуру изолированных ПКМД в РФ. В выборке из 74 больных мутации гена САРЫЗ явились причиной заболевания у 32 пациентов (43%). У семи пациентов (9%) выявлены мутации гена РКНР.

2. В гене САРЫЗ обнаружены «горячие» экзоны, информативность диагностики которых составляет 100%. Обнаружены две частые мутации: с.550с1е1А, с.598_612с!е1, информативность диагностики которых составляет более 81%, среди больных ПКМД2А типа. Разработаны эффективные методы диагностики «горячих» экзонов гена САРЫЗ - методом прямого автоматического секвенирования, двух частых мутаций - методом ПДАФ-анализа

3. В гене РКЯР обнаружена частая мутация с.826С>А, выявленная в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии у четырех из семи больных ПКМД21 типа на 50% хромосом с данной мутацией. Показано, что для анализа мутаций при ПКМД21 типа эффективен метод прямого автоматического секвенирования.

4. Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель с.550с!е1А гена САРЫЗ, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя. Время распространения мутации составляет 1700±500 лет. Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель с.826С>А гена РКЯР, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя.

5. Проведен сравнительный анализ частот встречаемости 37 клинических симптомов в трех группах больных с ПКМД2А, ПКМД21 типов и неустановленной формой заболевания. Показано отсутствие специфического симптомокомплекса, позволяющего проводить дифференциацию этих генетических вариантов только па клиническом уровне.

6. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных наследственными ферментопатиями с клиникой изолированной ПКМД, определяющий последовательность анализа мутаций генов САРЫЗ и ИКЯР, Предложенный алгоритм позволит значительно снизить экономические и временные затраты при проведении диагностики ПКМД в РФ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ:

1. Рыжкова О.П., Дадали E.JL, Щагина О.А., Поляков А.В., Молекулярно-генетическое исследование российских больных с наиболее частыми поясно-конечностными мышечными дистрофиями / Материалы VI-го съезда Российского общества медицинских генетиков // Медицинская генетика. - 2010. - Т., прил. к №5. -С. 155.

2. Ryzhkova О. P., Dadali Е. L., Scagina О. A., Rudenskaya G. Е., Polyakov А. V., The age of mutation c.550deIA in CAPN3 gene / European Human Genetics Conference 2010, June 12 - 15, 2010, Gothenburg, Sweden //European J. of Hum.Gen. - 2010. - V. 18, supp.l. - P.132.

3. Рыжкова О.П., Причина распространенности мутации c.550delA в РФ // Медицинская генетика.-2009.-Т. 8, № 12. - С. 36-37.

4. Ryzhkova, G. Rudenskaya, Е. Dadaly, О. Schagina, A. Polyakov; CAPN3 mutations in Russian patients with limb-girdle muscular dystrophy, type 2A // European journal of human genetics-2009 - PI6.46

5. Дадали Е.Л., Щагина O.A., Рыжкова О.П., Руденская Г.Е., Федотов В.П., Поляков А.В. Клинико-генетическая характеристика кальпаинопатий у российских больных // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике/ под ред. А.Б. Масленникова. Новосибирск: АртЛайн.-2010.-Вып. 14,- С. 83-91.

6. Дадали Е.Л., Щагина О.А., Рыжкова О.П., Руденская Г.Е. , Федотов В.П., Поляков А.В. Особенности клинических проявлений поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии типа 2А у российских больных // Журнал неврологни н психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2010.-№4. - С. 79-83

7. Дадали Е.Л., Щагина О.А., Тибуркова Т.Б., Рыжкова О.П., Иванова Е.А., Поляков А.В. Особенности клинических проявлений и алгоритмы молекулярно-генетической диагностики генетически гетерогенных вариантов наследственных прогрессирующих мышечных дистрофий // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике/ под ред. А.Б. Масленникова. Новосибирск: АртЛайн.-2010.-Вып. 14.-С. 174-183.

8. Рыжкова О.П., Билева Д.С., Дадали Е.Л., Щагина О.А., Шаркова И.В, Поляков А.В. Клинико-генетические характеристики поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии 2А типа // Медицинская генетика. - 2011. -Т.10, 1.-С. 15-21

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АД - аутосомно-доминантный

АР — аутосомно-рецессивный

ВМД - врожденная мышечная дистрофия

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

МГНЦ РАМН - Медико - Генетический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

ПКМД—поясно-конечностная мышечная дистрофия

ПМД - прогрессирующая мышечная дистрофия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

сМ - сантиморганида

CAPN3 — ген белка кальпаина 3

FKRP - ген фукутин-связанного белка

MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NCBI - National Center for Biotechnology Information

OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man

Подписано в печать:

27.01.2011

Заказ № 4905 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Рыжкова, Оксана Петровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "КЛИНИКО-МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОЯСНО-КОНЕЧНОСТНЫХ МЫШЕЧНЫХ ДИСТРОФИЙ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ФЕРМЕНТОПАТИЯМИ"

Научная новизна.7

Практическая значимость.8

Положения, выносимые на защиту.9

Апробация работы.9

Глава I.10

I Обзор литературы.10

1.1 Распространенность и* систематика прогрессирующих мышечных дистрофий.10

1.2 Взаимодействие белков, участвующих в процессе мышечного сокращения.20

1.2.1 Структура мышечного волокна.20

1.2.2 Функция белка кальпаина 3 в мышечной клетке.264

1.2.3 Функция фукутин-связанного белка в мышечной клетке.30

1.3 Этиопатогенез' ПКМД с АР типом наследования, обусловленных мутациями в генах ферментов.331.3.1 Этиология ПКМД2А типа.34

1.3.2 Этиология ПКМД 21 типа.37

1.4 Клиническая картина ферментопатий при ПКМД с АР типом наследования.39 >

1.4.1 Характеристика ПКМД.39

1.4.2 Клиническая характеристика ПКМД2А типа.41

1.4.3 Клиническая характеристика ПКМД21 типа.43

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рыжкова, Оксана Петровна

выводы

1. Установлен вклад мутаций генов САРИЗ и РКЯР, обуславливающих развитие ферментопатий, в структуру изолированных ПКМД в РФ. В выборке из 74 больных мутации гена САРЫЗ явились причиной заболевания у 32 пациентов (43%). У семи пациентов (9%) выявлены мутации гена РКЯР.

2. В гене САРЫЗ обнаружены «горячие» экзоны, информативность диагностики которых составляет 100%. Обнаружены две частые мутации: с.550с!е1А, с.598612с!е1, информативность диагностики которых составляет более 81 %, среди больных ПКМД2А типа. Разработаны эффективные методы диагностики «горячих» экзонов гена САРЫЗ - методом прямого автоматического секвенирования, двух частых мутаций - методом ПДАФ-анализа

3. В гене РКЯР обнаружена частая мутация с.826С>А, выявленная в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии у четырех из семи больных ПКМД21 типа на 50% хромосом с данной мутацией. Показано, что для анализа мутаций при ПКМД21 типа эффективен метод прямого автоматического секвенирования.

4. Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель с.550ёе!А гена С А РИЗ, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя. Время распространения мутации составляет 1700±500 лет. Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель с.826С>А гена РКЯР, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя.

5. Проведен сравнительный анализ частот встречаемости 37 клинических симптомов в трех группах больных с ПКМД2А, ПКМД21 типов и неустановленной формой заболевания. Показано отсутствие специфического симптомокомплекса, позволяющего проводить дифференциацию этих генетических вариантов только на клиническом уровне.

6. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных наследственными ферментопатиями с клиникой изолированной ПКМД, определяющий последовательность анализа мутаций генов САРИЗ и РКЯР. Предложенный алгоритм позволит значительно снизить экономические и временные затраты при проведении диагностики ПКМД в РФ.

Список публикаций по теме диссертационной работы:

1. Рыжкова О.П., Дадали Е.Л., Щагина О.А., Поляков А.В., Молекулярно-генетическое исследование российских больных с наиболее частыми поясно-конечностными мышечными дистрофиями / Материалы VI-го съезда Российского общества медицинских генетиков // Медицинская генетика. - 2010. - Т., прил. к №5. - С. 155.

2. Ryzhkova О. P., Dadali Е. L., Scagina О. A., Rudenskaya G. Е., Polyakov

A. V., The age of mutation c.550delA in CAPN3 gene / European Human Genetics Conference 2010, June 12 - 15, 2010, Gothenburg, Sweden //European J. ofHum.Gen.-2010.-V.18, supp.l.-P.132.

3. Рыжкова О.П., Причина распространенности мутации c.550delA в РФ // Медицинская генетика. - 2009. - Т. 8, № 12. - С. 36-37.

4. Ryzhkova, G. Rudenskaya, Е. Dadaly, О. Schagina, A. Polyakov; CAPN3 mutations in Russian patients with limb-girdle muscular dystrophy, type 2A // European journal of human genetics - 2009 - PI 6.46

5. Дадали E.JI., Щагина О.А., Рыжкова О.П., Руденская Г.Е., Федотов

B.П., Поляков А.В. Клинико-генетическая характеристика кальпаинопатий у российских больных // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике/ под ред. А.Б. Масленникова. Новосибирск: АртЛайн.-2010.-Вып. 14.- С. 83-91.

6. Дадали Е.Л., Щагина О.А., Рыжкова О.П., Руденская Г.Е. , Федотов В.П., Поляков А.В. Особенности клинических проявлений поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии типа 2А у российских больных // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2010. - №4. - С. 79-83

7. Дадали Е.Л., Щагина O.A., Тибуркова Т.Б., Рыжкова О.П., Иванова Е.А., Поляков A.B. Особенности клинических проявлений и алгоритмы молекулярно-генетической диагностики генетически гетерогенных вариантов наследственных прогрессирующих мышечных дистрофий // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике/ под ред. А.Б. Масленникова. Новосибирск: АртЛайн. - 2010. - Вып. 14. - С. 174-183.

8. Рыжкова О.П., Билева Д.С., Дадали Е.Л., Щагина O.A., Шаркова И.В, Поляков A.B. Клинико-генетические характеристики поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии 2А типа // Медицинская генетика. - 2010. - T.l 1, 1. - С. 3-10

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате молекулярно-генетичеекого исследования двух генов, являющихся причиной распространенных ферментопатий с клиникой изолированной ПКМД, выборке больных проживающих на территории РФ, были выявлены частоты и спектр мутаций генов САРЫЗ и ЕКЛР.

Установлено, что мутации гена САРЫЗ, обуславливают около 43% ПКМД, что согласуется с данными других авторов, по которым вклад гена САРЫЗ в структуру заболеваемости изолированной ПКМД оценивается в Европе в 3040%. Мутации выявлены у 32 больных из 74 на 61 хромосоме. У трех больных выявлена только одна мутация в гетерозиготном состоянии, однако, наличие мутации и клиники позволяет предполагать, что причиной заболевания является именно изменения в гене САРЫЗ.

При анализе изменений нуклеотидной последовательности гена САРИЗ, выявленных в выборке больных из РФ, было установлено, что мутации встречаются на веем протяжении гена, однако, существуют «горячие» экзоны, мутации в которых встречаются чаще. В нашей выборке такими экзонами являются 1, 4, 5, 8, 10, 11, 20, 21, 22. В нашем исследовании на данные экзоны приходилось 53 из 61 всех «мутантных» хромосом, что составило 86,9%. При молекулярно-генетической диагностике «горячих» экзонов гена САРЫЗ нами была обнаружена хотя бы одна из «мутантных» хромосом у всех больных. Обе «мутантные» хромосомы при данном анализе обнаружены у 22 из 32 больных ПКМД2А (68,8%).

В гене САРЫЗ выявлены две частые мутации с.550с1е1А и с.598612с1е1, явившиеся причиной заболевания у 26 из 74 больных (35,1%). Мутация с.598612с!е1 встретилась у 4 из 74 больных (5,4%) на 4 хромосомах. Мутация с.550с!е1А встретилась у 23 из 74 (31,2%) на 30 хромосомах в гомозиготном, компаунд-гетерозиготном и гетерозиготном состоянии. Разработана система диагностики двух частых мутаций методом ПДАФ-анализа, информативность которой, среди всех больных ПКМД, составляет около 11%.

Для установления природы высокой частоты мутации c.550delA были проанализированы гаплотипы 23 хромосом с данной заменой с использованием семи микросаттелитных маркеров. Мы обнаружили неравновесие по сцеплению для 6 из 7 этих маркеров, из чего сделали вывод, что причиной столь высокой частоты этой мутации является эффект основателя. На основе проведенного анализа неравновесия по сцеплению аллелей полиморфных маркеров с заболеванием нам удалось определить гаплотип хромосомы, на которой произошла мутация. Наиболее вероятным нам представляется следующий гаплотип основателя D15S994 - D15S968 -D15S514 - D15S779 - CAPN3(mut) - D15S780 - D15S778 - D15S659 : 5-5-7-9-CAPN3(mut) -4-6-7. Мы оценили период времени за который произошло размывание вследствие рекомбинаций гаплотипа предковой хромосомы . Для этого мы использовали подход, предложенный Risch с соавторами (Risch et al., 1995). Полученная нами оценка времени, за которое произошло распространение мутации — около 1700 лет, что не противоречит историческим данным.

Мутации гена FKRP, как и предполагалось, обуславливают около 10% ПКМД, что согласуется с данными других авторов, по которым вклад гена FKRP в структуру заболеваемости изолированной ПКМД оценивается в Европе в 10-25%. Мутации выявлены у 7 больных из 74 на 12 хромосомах. У двух больных выявлена только одна мутация в гетерозиготном состоянии, однако, наличие мутации и клиники позволяет предполагать, что причиной заболевания является именно изменения в гене FKRP.

У четырех больных (5,4%) причиной заболевания явилась одна и та же миссенс мутация единственного кодирующего экзона 4 - Leu276Ile (с.826С>А) в гомозиготном или компаунд гетерозиготном состоянии. Данная замена встретилась на половине мутантных хромосом. Для установления природы высокой частоты данной мутации были проанализированы гаплотипы всех 6 хромосом с данной заменой с использованием пяти микросаттелитных маркеров, а так же одного внутригенного SNP. На основе проведенного анализа нам удалось определить гаплотип хромосомы, на которой произошла мутация. Наиболее вероятным нам представляется следующий гаплотип основателя D19S219 - D19S412 - FKRP 3'GT-FKRP с.135С>Т-FKRP (mut) - SLC1A5 - D19S606: 7-11-3- с. 135Т- FKRP (mut)-\-l.

Нами проведен клинический анализ 36 признаков изолированной ПКМД в группах больных с мутациями генов CAPN3 и FKRP и, у которых мутаций в данных генах выявлено не было. В данном исследовании мы попытались выделить ядро клинических признаков, характерных для этих групп.

В результате, мы определили статистически достоверное отличие по нескольким признакам - снижение силы в проксимальных отделах нижних конечностей, снижение силы в проксимальных отделах верхних конечностей, нарушение ходьбы на пятках, синдром дряблых предплечий, крыловидные лопатки и возраст дебюта более 5 лет - для группы больных с мутациями в гене CAPN3. Для других двух исследуемых групп не выявлено уникального набора симптомов и признаков. Однако, в ходе исследования, мы, как и другие исследователи, не смогли определить алгоритм диагностики ферментопатий на основе клинических признаков.

Создан молекулярно-генетический алгоритм диагностики ферментопатий с клиникой изолированной ПКМД у больных из РФ, в основу которого легли результаты проведенного исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Рыжкова, Оксана Петровна, Москва

1. Balci В., Aurino S., Haliloglu G., Talim В., Erdem S., Akcoren Z., Tan E., Caglar M., Richard I., Nigro V., Topaloglu H., and Dincer P. (2006). Calpain-3 mutations in Turkey. Eur JPediatr 165: 293-8.

2. Beedle A. M., Nienaber P. M., and Campbell К. P. (2007). Fukutin-related protein associates with the sarcolemmal dystrophin-glycoprotein complex. J Biol Chem 282: 16713-7.

3. Bengtsson В. O. a. G. T. (1981). Measuring the strength of associations between HLA antigens and diseases. Tissue Antigens 18: p. 356-363.

4. Bourteel H., Stojkovic Т., Cuisset J. M., Mauragc C. A., Laforet P., Richard P., and Vermersch P. (2007). Phenotypic aspects of FKRP-linked muscular dystrophy type 21 in a series of eleven patients. Rev Neurol (Paris) 163: 189-96.

5. Bourteel H., Vermersch P., Cuisset J. M., Maurage C. A., Laforet P., Richard P., and Stojkovic T. (2009). Clinical and mutational spectrum of limb-girdle muscular dystrophy type 21 in 11 French patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry 80: 1405-8.

6. Bushby К. M. (1995). Diagnostic criteria for the limb-girdle muscular dystrophies: report of the ENMC Consortium on Limb-Girdle Dystrophies. Neuromuscul Disord 5: 71-4.

7. Cobo A. M., Saenz A., Poza J. J., Urtasun M., Indakoetxea В., Urtizberea J. A., Lopez de Munain A., and Calafell F. (2004). A common haplotype associated with the Basque 2362AG —> TCATCT mutation in the muscular calpain-3 gene. Hum Biol 76: 73141.

8. Colombo R. (2000). Age estimate of the N370S mutation causing Gaucher disease in Ashkenazi Jews and European populations: A reappraisal of haplotype data. Am J Hum Genet 66: 692-7.

9. Davies K. E., and Nowak K. J. (2006). Molecular mechanisms of muscular dystrophies: old and new players. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 762-73.de Wazieres B., and Dupond J. L. (2001). Mitochondrial and metabolic myopathies. Rev Prat 51: 256-61.

10. Duguez S., Bartoli M., and Richard I. (2006). Calpain 3: a key regulator of the sarcomere? FebsJ213: 3427-36.

11. Duno M., Sveen M. L., Schwartz M., and Vissing J. (2008). cDNA analyses of CAPN3 enhance mutation detection and reveal a low prevalence of LGMD2A patients in Denmark. Eur J Hum Genet 16: 935-40.

12. Ehler E., and Gautel M. (2008). The sarcomere and sarcomerogenesis. Adv Exp Med Biol 642: 1-14.

13. Ervasti J. M., and Sonnemann K. J. (2008). Biology of the striated muscle dystrophin-glycoprotein complex. Int Rev Cytol 265: 191-225.

14. Esapa C. T., Benson M. A., Schroder J. E., Martin-Rendon E., Brockington M., Brown S. C., Muntoni F., Kroger S., and Blake D. J. (2002). Functional requirements for fukutin-related protein in the Golgi apparatus. Hum Mol Genet 11: 3319-31.

15. Finsterer J. (2004). Limb girdle muscular dystrophies. Nervenarzt 75: 1153-66.

16. Ginjaard H.B. F. W. S., de Mos M., et al. (2000). Classification of limb girdle muscular dystrophy types 1C, 2A and 2B based on protein and/or DNA studies. Neuromuscular Disorder: 731-735.

17. Groen E. J., Charlton R., Barresi R., Anderson L. V., Eagle M., Hudson J., Koref M. S., Straub V., and Bushby K. M. (2007). Analysis of the UK diagnostic strategy for limb girdle muscular dystrophy 2A. Brain 130: 3237-49.

18. Guglieri M., and Bushby K. (2008). How to go about diagnosing and managing the limb-girdle muscular dystrophies. Neurol India 56: 271-80.

19. Hanisch F., Grimm D., Zierz S., and Deschauer M. Frequency of the FKRP mutation c.826C>A in isolated hyperCKemia and in limb girdle muscular dystrophy type 2 in German patients. J Neurol 257: 300-1.

20. Hewitt J. E. (2009). Abnormal glycosylation of dystroglycan in human genetic disease. Biochim BiophysActa 1792: 853-61.

21. Hodgson S., Hart K., Abbs S., Heckmatt J., Rodillo E., Bobrow M., and Dubowitz V. (1989). Correlation of clinical and deletion data in Duchenne and Becker muscular dystrophy. J Med Genet 26: 682-93.

22. Kefi M., Amouri R., Chabrak S., Mechmeche R., and Hentati F. (2008). Variable cardiac involvement in Tunisian siblings harboring FKRP gene mutations. Neuropediatrics 39: 113-5.

23. Krahn M., Bernard R., Pecheux C., Hammouda el H., Eymard B., Lopez de Munain A., Cobo A. M., Romero N., Urtizberea A., Leturcq F., and Levy N. (2006). Screening of the CAPN3 gene in patients with possible LGMD2A. Clin Genet 69: 444-9.

24. Mercuri E., and Longman C. (2005). Congenital muscular dystrophy. Pediatr Ann 34: 5602, 564-8.

25. Milic A., and Canki-Klain N. (2005). Calpainopathy (LGMD2A) in Croatia: molecular and haplotype analysis. Croat Med J 46: 657-63.

26. Munoz-Blanco J. L. (1998). Lipidic myopathies. Rev Neurol 26 Suppl 1: S72-80.

27. Muntoni F., Torelli S., and Brockington M. (2008). Muscular dystrophies due to glycosylation defects. Neurotherapeutics 5: 627-32.

28. Ohnesorg T., Turbitt E., and White S. J. The many faces of MLPA. Methods Mol Biol 687: 193-205.

29. Ono Y., Torii F., Ojima K., Doi N., Yoshioka K., Kawabata Y., Labeit D., Labeit S.,

30. Suzuki K., Abe K., Maeda T., and Sorimachi H. (2006). Suppressed disassembly of autolyzing p94/CAPN3 by N2A connectin/titin in a genetic reporter system. J Biol Chem 281: 18519-31.

31. Panegyres P. K., Mastaglia F. L., and Kakulas B. A. (1990). Limb girdle syndromes. Clinical, morphological and electrophysiological studies. J Neurol Sci 95: 201-18.

32. Parano E., Fiumara A., Falsperla R., Vita G., and Trifiletti R. R. (1994). Congenital muscular dystrophy: correlation of muscle biopsy and clinical features. Pediatr Neurol 10: 233-6.

33. Parano E., Pavone L., Fiumara A., Falsaperla R., Trifiletti R. R., and Dobyns W. B. (1995). Congenital muscular dystrophies: clinical review and proposed classification. Pediatr Neurol 13: 97-103.

34. Peter A. K., Miller G., and Crosbie R. H. (2007). Disrupted mechanical stability of the dystrophin-glycoprotein complex causes severe muscular dystrophy in sarcospan transgenic mice. J Cell Sci 120: 996-1008.

35. Philpot J., Sewry C., Pennock J., and Dubowitz V. (1995). Clinical phenotype in congenital muscular dystrophy: correlation with expression of merosin in skeletal muscle. Neuromuscul Disord5: 301-5.

36. Pollitt C., Anderson L. V., Pogue R., Davison K., Pyle A., and Bushby K. M. (2001). The phenotype of calpainopathy: diagnosis based on a multidisciplinary approach. Neuromuscul Disord 11: 287-96.

37. Poppe M., Cree L., Bourke J., Eagle M., Anderson L. V., Birchall D., Brockington M., Buddies M., Busby M., Muntoni F., Wills A., and Bushby K. (2003). The phenotype of limb-girdle muscular dystrophy type 21. Neurology 60: 1246-51.

38. Sanger F., Nicklen S., and Coulson A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-7.

39. Schara U., and Mortier W. (2005). Neuromuscular diseases 2: muscular dystrophies (MD). Nervenarzl 76: 219-37; quiz 238-9.

40. Shin J. H., Kim H. S., Lee C. H., Kim C. M., Park K. H., and Kim D. S. (2007). Mutations of CAPN3 in Korean patients with limb-girdle muscular dystrophy. J Korean Med Sci 22: 463-9.

41. Sveen M. L., Schwartz M., and Vissing J. (2006). High prevalence and phenotype-genotype correlations of limb girdle muscular dystrophy type 21 in Denmark. Ann Neurol 59: 808-15.

42. Syntichaki P., and Tavernarakis N. (2002). Death by necrosis. Uncontrollable catastrophe, or is there order behind the chaos? EMBO Rep 3: 604-9.

43. Taveau M., Bourg N., Sillon G., Roudaut C., Bartoli M., and Richard I. (2003). Calpain 3 is activated through autolysis within the active site and lyses sarcomeric and sarcolemmal components. Mol Cell Biol 23: 9127-35.

44. Tidball J. G., and Spencer M. J. (2000). Calpains and muscular dystrophies. Int J Biochem Cell Biol 32: 1-5.

45. Todorova A., Georgieva B., Tournev I., Todorov T., Bogdanova N., Mitev V., Mueller C. R., Kremensky I., and Horst J. (2007). A large deletion and novel point mutations in the calpain 3 gene (CAPN3) in Bulgarian LGMD2A patients. Neurogenetics 8: 2259.

46. Todorova A., Kress W., and Mueller C. (2005). Novel mutations in the calpain 3 gene in Germany. Clin Genet 67: 356-8.

47. Topaloglu II., Yalaz K., Renda Y., Kale G., Caglar M., and Gogus S. (1989). Congenital muscular dystrophy (non-Fukuyama type) in Turkey: a clinical and pathological evaluation. Brain Dev 11: 341-4.

48. Tremblay M., and Vezina H. (2000). New estimates of intergenerational time intervals for the calculation of age and origins of mutations. Am J Hum Genet 66: 651-8.

49. Vainzof M., Ayub-Guerrieri D., Onofre P. C., Martins P. C., Lopes V. F., Zilberztajn D., Maia L. S., Sell K., and Yamamoto L. U. (2008). Animal models for genetic neuromuscular diseases. J Mol Neurosci 34: 241-8.

50. Yamamoto L. U., Velloso F. J., Lima B. L., Fogaca L. L., de Paula F., Vieira N. M., Zatz M., and Vainzof M. (2008). Muscle protein alterations in LGMD2I patients with different mutations in the Fukutin-related protein gene. J Histochem Cytochem 56: