Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико - генетическое исследование хронической истинной экземы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клинико - генетическое исследование хронической истинной экземы"

На правах рукописи

Денисова Яна Евгеньевна

КЛИНИКО - ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ИСТИННОЙ ЭКЗЕМЫ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4 ДЕК 2014

005556240

Белгород-2014

005556240

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель:

Чурносов Михаил Иванович, доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты:

Куцев Сергей Иванович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, заместитель директора по научной работе

Амелина Светлана Сергеевна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, заведующая отделом прикладной биологии Научно-исследовательского института биологии Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «11» декабря 2014 года в «12» часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Автореферат разослан «27» октября 2014 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13

доктор биологических наук

В.И. Кочкаров

Общая характеристика работы Актуальность темы. Истинная экзема это аллергическое воспалительное заболевание кожи, склонное к хроническому течению и обострениям, вызываемое различными экзогенными и эндогенными факторами и характеризующееся полиморфизмом элементов, среди которых на первое место выступают везикулы [Скрипкин Ю.К. и др., 2009]. Экзема составляет 30-40% всех кожных заболеваний. По данным разных авторов, заболеваемость колеблется от 6,0 до 15,0 случаев на 1000 населения. Экзему регистрируют во всех странах и у представителей всех рас с одинаковой частотой у мужчин и женщин. Заболевание может возникнуть как в раннем детском возрасте, так и у лиц пожилого возраста. Пик заболеваемости отмечается в возрасте 40 лет [Оспанова С.А., 2008].

Экзему принято считать мультифакториальным заболеванием, формирование которой связано с действием таких эндо- и экзогенных факторов, как дисфункция эндокринной и нервной систем, вторичный иммунодефицит, инфекционные и аллергические процессы, а также генетическая предрасположенность fSanja Kezic, 2009; Davis J.А., 2010; Zammiti W., 2010]. По современным представлениям, в развитии экземы главную роль играют Т-лимфоциты, которые несут на своей поверхности специфические рецепторы к антигену и выделяющие ряд провоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-а [Павлова О.В., 2010]. При этом в эпидермисе и дерме развивается хроническое рецидивирующее воспаление на фоне циркулирующих микробных антигенов, формируются патологические иммунные комплексы, которые повреждают собственные микроструктуры с образованием аутоантигенов и инициируют формирование аутоантител [Brian Е.С. ,2010; Lan С. С., 2011; Schulz F, 2011].

Как свидетельствуют результаты ряда исследований [Novak N. et al., 2008; Weidinger S., 2008; Chen Y.C. et al., 2012] важную роль в развитии хронической истинной экземы (ХИЭ) играют генетические факторы. Изучение этиопатогенеза экземы с применением современных методов исследования выявило значимую роль таких процессов, как инвазия, пролиферация, апоптоз, воспаление в формировании истинной экземы [Ruzicka Т., 2008; Balato А., 2011; Carlsen B.C., 2011]. Важную роль в развитии, клинике и прогнозе заболевания играют факторы некроза опухолей и их рецепторы [Hammonds L.M., 2009; Davis J.А., 2010; McFadden J.P., 2011]. Однако, следует отметить, что подавляющее число генетических исследований ХИЭ проведено за рубежом и характеризуется противоречивостью полученных данных [Moberg С., 2009; Mucoz D., 2009; Rui F, 2010]. В российских популяциях роль полиморфизмов генов факторов некроза опухолей и их рецепторов в развитии истинной экземы не изучена. Этот факт диктует необходимость проведения подобных исследований в российских популяциях с подробным анализом клинического значения патогенетически значимых полиморфизмов генов этих цитокинов при истинной экземе.

Цель исследования:

Изучить вовлеченность полиморфных вариантов генов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование и клиническое течение хронической истинной экземы.

Задачи исследования:

1. Исследовать роль полиморфных маркеров генов фактора некроза опухоли б (-308G/A TNF6), лимфотоксина б (+250A/G Lt б), рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36AJG TNFRJ), рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа (+1663A/G TNFR2) и их комбинаций в формировании хронической истинной экземы.

2. Выявить особенности ассоциаций генетических полиморфизмов цитокинов с формированием ХИЭ в зависимости от пола.

3. Проанализировать ассоциации генов-кандидатов со стадиями и степенью тяжести хронической истинной экземы.

4. Изучить роль наследственной отягощенности в характере ассоциаций генов-кандидатов с формированием хронической истинной экземы.

5. Провести математическое моделирование развития осложнений хронической истинной экземы и разработать способ прогнозирования риска их развития на основе генетических данных.

Научная новизна работы. Впервые установлена вовлеченность генетических полиморфизмов фактора некроза опухоли б (--308G/A TNF б), лимфотоксина б (+250A/G Lt б), рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36A/G TNFR1) и рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа (+1663A/G TNFR2) в формировании хронической истинной экземы.

Установлены комбинации генетических вариантов цитокинов, определяющих подверженность к хронической истинной экземе. Выявлены особенности ассоциаций генетических полиморфизмов цитокинов с формированием ХИЭ в зависимости от пола.

Определены молекулярно-генетические факторы риска развития хронической истинной экземы различных степеней тяжести и стадий развития. Выявлены различия в характере ассоциации генов-кандидатов с формированием хронической истинной экземы в зависимости от наличия наследственной отягощенности.

Установлены прогностически значимые факторы риска развития осложнений хронической истинной экземы: генетический вариант по локусу +250A/G Lta, наличие очагов хронической инфекции, уровень лейкоцитов.

Научно-практическое значение. Результаты проведённого исследования расширяют представления о молекулярно-генетических детерминантах формирования и клинического течения хронической истинной экземы.

Разработанная модель индивидуального прогнозирования риска развития осложнений хронической истинной экземы может быть использована в практической дерматологии для определения индивидуумов с неблагоприятным клиническим течением данного заболевания.

Результаты исследования используются в практической деятельности

врачей — дерматовенерологов ОГБУЗ «Кожно-венерологический диспансер» и НУЗ «Отделенческая больница на ст. Белгород ОАО РЖД», а также в учебной работе в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: 77-й Российской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию БГМУ (Уфа, 2012); 77-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием "Молодежная наука и современность", проводимой в рамках "Недели медицинской науки" (Курск, 2012); X научно-практической конференции студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвященной 10-летию Института последипломного медицинского образования (Белгород, 2012); 40-й конференции молодых ученых и 64-ой студенческой научной конференции Смоленской государственной медицинской академии с международным участием (Смоленск, 2012); VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013).

Личный вклад автора. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, определены цель и задачи исследования, лично разработаны подходы для их решения, проведено клиническое обследование всех больных ХИЭ, выполнен сбор анамнестических данных. Автор лично участвовал в выполнении молекулярно-генетических исследований, проводил обработку, анализ и обобщение полученных результатов, подготовку публикаций по выполненной работе, написание и оформление рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфные маркеры -308G/A TNF a, +250A/GLta, +36A/G TNFR1, +1663A/G TNFR2 и их комбинации вовлечены в подверженность к формированию хронической истинной экземы.

2. Вклад генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в предрасположенность к развитию ХИЭ различается у мужчин и женщин.

3. Гены-кандидаты определяют особенности клинического течения заболевания.

4. Характер ассоциаций генетических вариантов цитокинов с развитием ХИЭ различается у индивидуумов с наследственной отягощенностью и без отягощенного семейного анамнеза.

5. Генетический вариант по локусу +250A/G Lía, наличие очагов хронической инфекции, уровень лейкоцитов в крови являются прогностически значимыми факторами развития осложнений хронической истинной экземы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов

и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации, список литературы и приложение. Материалы диссертации изложены на 158 страницах машинописного текста и содержат 29 таблиц и 17 рисунков. Библиографический указатель содержит 209 наименований, из которых 137 иностранных.

Материалы и методы исследования Клиническая характеристика обследованных больных В основу настоящей работы положены данные клинико-генетических исследований 552 человек: 230 больных с хронической истинной экземой и 322 человека контрольной группы. Среди больных ХИЭ мужчин было 84 человека (36,53%), женщин 146 человек (63,47%). В контрольной группе распределение по полу было аналогичным: мужчин 121 человек (37,58%), женщин 201 человек (62,42%) (р>0,05). В исследуемые выборки включались лица русской национальности, которые являлись уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имели родства между собой.

Средний возраст больных хронической истинной экземой составил 45,91 ± 2,68 (варьировал от 18 лет до 86 лет), контрольной выборки- 43,62 ±3,46 (варьировал от 20 до 76 лет) (р>0,05).

Клиническое и клинико-лабораторное обследование больных проводили на базе поликлинического отделения ОГБУЗ «Кожно-венерологический диспансер».

Всем пациентам с ХИЭ и индивидуумам контрольной группы проводилось типирование генетических полиморфизмов фактора некроза опухоли а (-308G/A TNF «), лимфотоксина a (+250A/G Lía), рецепторов фактора некроза опухоли 1-го и 2-го типов (+36AJG TNFR1 и +1663А/G TNFR2).

Молекулярно-генетические методы Материалом для исследования была венозная кровь (объем 8-9 мл) из локтевой вены пробанда. Венозную кровь помещали в пробирку с консервантом, который содержал 0,5 M раствора ЭДТА (рН=7,8).

Анализ локусов -308G/A TNFa, +250G/A Lía, +36A/G TNFR1, +1663A/G TNFR2 осуществлялся методами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе CFX 96 с системой ПЦР в режиме real time. Использовали ДНК-полимеразу Thermus aquaticus (производитель фирма «Силекс-М») и олигонуклеотидные праймеры и зонды, синтезированные фирмой «Синтол».

Статистические методы Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программного пакета «STATISHCA for Windows 6.1». Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами [Вейр Б., 1995]. Исходя из равновесия Харди-Вайнберга, с целью оценки соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, использовали критерий х2

Об ассоциации молекулярно-генетических маркеров с предрасположенностью к ХИЭ, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности (характер течения, степень

тяжести и наследственная отягощенность) судили по величине отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом [Schlesselman J., 1982]. При множественных сравнениях вводили поправку Бонферрони [Реброва О.Ю., 2006]. Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ХИЭ проведен с помощью программного обеспечения APSampler (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику [Favorov А. V., et al., 2005]. За статистически значимый принимали уровень р, полученный после пермутационного теста Ppcrm 20,05 (выполнено 100 пермутаций).

При изучении связей молекулярно-генетических маркеров с количественными признаками ХИЭ, использовались подходы непараметрической статистики - рассчитывали медиану (Ме) и интерквартильный размах (Q25-Q75), критерий Манна-Уитни [Реброва О.Ю., 2006].

С целью прогнозирования риска развития осложнений у больных ХИЭ в работе использован метод математического моделирования -дискриминантный анализ [Реброва О.Ю., 2006].

Результаты исследования и их обсуждение 1. Изучение роли генетических полиморфизмов в формировании хронической истинной экземы При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов фактора некроза опухоли a (-308G/A TNFa), лимфотоксина a (+250A/G Lta), рецепторов фактора некроза опухоли 1-го и 2-го типов (+36A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2) среди больных ХИЭ и контрольной группы установлена более высокая концентрация аллеля +250G Lta у больных ХИЭ (30,05%) по сравнению с контролем (24,38%, Х2=3,93, р=0,05 OR=l,33 95% CI 1,00-1,77).

Проведенный биоинформатический анализ показал, что сочетание аллелей +250G Lta с +1663G TNFR2 является фактором риска развития ХИЭ, об этом свидетельствует отношение шансов равное 1,60 (95% CI 1,11-2,30). 39,13% больных ХИЭ имеют эту комбинацию генетических маркеров, а в контрольной группе данный показатель составил 32,30% (pperm=0,009).

Выявлены особенности ассоциаций исследуемых генов-кандидатов с формированием хронической истинной экземы в зависимости от пола. Факторами повышенного риска развития ХИЭ у мужчин являются -308А TNFa 0с2=5,77, р=0,02, OR=2,08 95% CI 1,13-3,83), -308GA TNFa (х2=6,54, р=0,01, Pcor=0,03, OR=2,42 95% CI 1,21-4,86), +250G Lta (х2=9,83, р=0,003, OR=2,08 95% CI 1,30-3,32), +250GG Lta (x2=9,20, p=0,003, pcor=0,009,OR=6,94 95% CI 1,74-32,21), +1663G TNFR2 (x2=12,06, p=0,001, OR=2,14 95% CI 1,383,32) и +1663GG TNFR2 (x2=6,14, p=0,01, pcor=0,03, OR=2,36 95% CI 0,184,75). Протективное значение имеют генетические варианты -308GG TNFa (Х2=6,72, р=0,01, Рсог=0,03, (Ж=0,41 95% CI 0,21-0,82) и +1663АА TNFR2 (Х2=7,49, р=0,007, pcor=0,021, (Ж=0,37 95% CI 0,17-0,77) (рис. 1).

Также у лиц мужского пола факторами риска развития ХИЭ являются следующие сочетания генетических вариантов: +250G Lta с +36А TNFR1 (pPcrm=0,02, OR=2,18, 95%CI 1,21-3,93), -308A TNFa с +36А TNFR1 (pperm=0,01, OR=2,68, 95% CI 1,36-5,30), + 250G Lta с +1663G TNFR2 (ppe^O.002, OR=2,81, 95% CI 1,51-5,24), -308G TNFa с +1663G TNFR2 (ppCrm=0,01, OR=2,85, 95% CI 1,41-5,77), -308A TNFa с +250G Lta (рРеП„=0,01, OR=2,95 95% CI 1,50-5,78), -308G TNFa, + 250G Lta с +1663G TNFR2 (pperm=0,001, OR=3,04 95% CI 1,61-5,71), -308A TNFa, +250G Lta с +36A TNFR1 (pPerm=0,002, OR= 3,40 95% CI 1,65-7,00), -308 A TNFa, +250G Lta с +1663G TNFR2 (pperm=0,002, OR=3,89 95% CI 1,73-8,74), а протективное значение имеют следующие комбинации: +250A Lta с +1663АА TNFR2 (pperm=0,009, OR=0,32 95% CI 0,16-0,66), -308GG TNFa с + 250A Lta (pperm=0,002, OR= 0,34 95% CI 0,18-0,65), -308GG TNFa с +1663A A TNFR2 (ppeml =0,002, OR= 0,35 95% CI 0,19-0,65), +36G TNFR1 с +1663A TNFR2 (ppcrm=0,002, OR= 0,45 95% CI 0,25-0,81) (рис. 1).

-308ATNFa rír. - V, -¡ 0.7=2,9J Формирование ХИЭ у лиц мужского пола 0R=0,41

í 011=3,40 .. -308GGTNFa

-308GTNFa

... OR=2,42 „ 011=0,34 ,

i

-308GA TNFa ! 011=189 011=2,08 í Ой=0,35 - +250ALta

+2S0GLta ) -1-5> 0Я=3,04 . OR=(í,32 <-

"j 0R=6,94 _ ^ 0ñ=0,45 +36GTNFR1

+250GGLta i -5>

— • 011=2,68

+36ATNFR1 — i ---? O/MÍI +1663ATNFR2

OR=2,U _

+1663GTNFR2 ; - . > or=2,bs ? . 011=0,37

+1663GG TNFR2 OR=2,3S < "" -..... +1663AA TNFR2

Рис. 1. Вклад генов факторов некроза опухолей и их рецепторов в генетическую предрасположенность к хронической истинной экземе у лиц мужского пола

Среди женщин значимых ассоциаций изучаемых молекулярно-генетических маркеров с развитием ХЙЭ не выявлено.

Далее нами изучены особенности связей молекулярно-генетических маркеров факторов некроза опухолей и их рецепторов с формированием ХИЭ в зависимости от наследственной отягощенности. Выявлено, что в группе больных ХИЭ без отягощенного семейного анамнеза концентрации генетических вариантов -308А TNFa (15,44%), +250G Lta (32,73%), +250GG Lta (10,80%) достоверно выше, чем'в контрольной группе, где эти показатели составили 10,47% (х2=4,03, р=0,04, OR=l,56, 95% CI 1,01-2,41), 24,38% (Х2=6,48, р=0,01, OR=l,51, 95% CI 1,1-2,08) и 4,04% (%2=6,63, р=0,01, рсог=0,03, OR=2,88, 95% CI 1,25-6,64), соответственно (рис.2). Среди больных ХИЭ чаще встречаются и комбинации этих маркеров +250G Lta с +1663G TNFR2 (40,00%), -308А TNFa с +250G Lta (25,33%), в сравнении с контролем (32,30% , рРеп„=0,04, OR=l,68, 95%CI 1,11-2,55 и 18,01%, pperm=0,04, OR=l,77 95%CI 1,11-2,83, соответственно).

т.308ATNFO OR=1,56 Формирование ХЙЭ у больных без наследственной отягощенности

OR=],77 ^

+250GLta 0R=1,S1 ^

011=2,88 ^

+250GGLta

Р OR=1,68

+1663G TÑFR2 - ---?

Рис. 2. Генетические варианты цитокинов и формирование хронической истинной экземы у больных без отягощенного семейного анамнеза

Среди больных ХИЭ, имеющих наследственную отягощенность, частота генетического варианта +16630 (66,67%) и его сочетание с

аллелем -3(Ж? ТЫРа (78,75%) превышают аналогичные показатели контрольной группы (55,95%, Х2=5,08, р=0,025, <Ж=1,58, 95% С1 1,06-2,35 и 74,84%, рРепп=0,04, <Ж=2,54 95% С1 1,11-5,80, соответственно). Таким образом, нами установлены особенности подверженности к формированию ХИЭ у индивидуумов в зависимости от отягощенного семейного анамнеза: предрасположенность к развитию ХИЭ у индивидуумов с отягощенным семейным анамнезом связана с генетическими полиморфизмами -308С/А TNFa и +1663А/й Т№К2, тогда как подверженность к формированию ХИЭ

у индивидуумов без наследственной отягощенности определяют полиморфные маркеры -308G/A TNFa, +250A/GLta и +1663A/G TNFR2. Полученные нами данные о вовлеченности генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей в формирование ХИЭ согласуются с литературными материалами о функциональном значении этих цитокинов в организме. В соответствии с данными литературы (Hulkkonen J., 2002, Пальцев М. А. и др., 2003, Осташкин А. С. и др., 2008) лимфотоксин а и фактор некроза опухоли а участвуют в реализации широкого спектра медико-биологических эффектов в организме (цитотоксическое действие, влияют на развитие иммунного ответа, активируют иммуновоспалительные реакции, стимулируют образование пероксид-ионов в нейтрофилах, являются хемоаттрактантами для них, стимулируют активность фибробластов и др.). Данные медико-биологические эффекты имеют важное значение в этиопатогенезе хронической истинной экземы, при которой наблюдаются нарушения в системе апоптоза, активно осуществляется пролиферация патологического клона лимфоцитов, формируется дисбаланс иммунной системы, развиваются бактериальные осложнения [Chen G. et al., 2002].

2. Изучение ассоциаций генетических вариантов с клиническими признаками хронической истинной экземой

Установлены значимые связи трех (-308G/A TNFa, +250A/G Lta и +1663A/G TNFR2) из четырех анализируемых генетических полиморфизмов с характером течения и стадией ХИЭ. Выявлено, что у пациентов с ХИЭ средней тяжести концентрация молекулярно-генетического маркера +250G Lt б (34,56%) в 1,42 раза выше по сравнению с контрольной группой (24,38%, х2=5,51, р=0,02, OR=l,64, 95% CI 1,08-2,49). Установлена ассоциация сочетания аллелей +250G Lta и +1663G TNFR2 с формированием средней степени тяжести ХИЭ. У 52,78% больных ХИЭ средней тяжести имеется данное сочетание генетических маркеров, тогда как в контрольной группе оно выявлено у 32,3% (ppeim=0,001). Данная комбинация полиморфных вариантов генов является фактором риска развития ХИЭ средней степени тяжести (OR=2,52, 95%, CI 1,48-4,3). Также, факторами риска развития ХИЭ средней степени тяжести являются сочетания аллелей -308А TNFa с +1663G TNFR2 (OR=2,26) и -308G TNFa с +250G Lta (OR=2,13). Эти комбинации встречаются у 27,77% и 58,33% больных ХИЭ, соответственно, и у 15,22% (pperm=0,008) и 43,79% (Pperm=0,007), соответственно в контроле. Протективным фактором развития ХИЭ средней тяжести служит сочетание генетических вариантов -308G TNFa и +250 АА Lta, которое регистрируется у 34,72% больных и 54,66% индивидуумов контрольной группы (Pperm=0,008, OR=0,48 95%, CI 0,28-0,84).

У пациентов в подострой стадии заболевания концентрации молекулярно-генетических маркеров -308А TNFa и -308GA TNFa составляют 20,21% и 36,17%, соответственно, и являются наибольшими по сравнению с

контрольной группой (10,47%, х2=6,61, р=0,01, OR=2,17 95% CI 1,19-3,93 и 19,06%, х2=6,18, р=0,01, pcor=0,03, OR=2,41 95% CI 1,18-4,86, соответственно), тогда как концентрация генотипа -308GG TNFa равна 61,70% и является наименьшей по сравнению с контролем (80,00%, %2=6,89, р=0,009, pcor=0,027, OR=0,40 95% CI 0,20-0,81). Наряду с этим, среди больных с подострой стадией ХИЭ концентрация аллеля +1663G TNFR2 (68,27%) достоверно выше, чем в контрольной группе (55,95%, х2=5,05, р=0,03, OR= 1,69 95% CI 1,06-2,70).

Установлены различия в частотах сочетания аллелей -308А TNFa и +1663G TNFR2 между больными ХИЭ с подострой стадией течения и контролем. Концентрация этой комбинации генетических вариантов в контрольной группе составляет 15,22%, тогда как среди больных данный показатель равен 33,33% (ppcrm=0,0001, OR=3,54 95% CI 1,81-6,91). Наряду с этим, зарегистрированы различия в распространенности сочетания двух генетических маркеров -308А TNFa с +250G Lía, между больными ХИЭ в подострой стадии (31,48%) и контролем (18,01%) (pPem.=0,01, OR=2,65 95% CI 1,36-5,14), а также различия в частоте сочетания +250G Lía с +1663G TNFR2 между сравниваемыми группами больных (44,44%) и контроля (32,3%) (Ppem,=0,03, OR=2,17 95% CI 1,16-4,05). Все три комбинации полиморфных вариантов генов факторов некроза опухолей являются факторами риска развития подострой стадии ХИЭ (OR=2,17-3,54) (рис. 3).

Таким образом, нами установлено, что в формирование как средней степени тяжести так и подострой стадии ХИЭ вовлечены генетические полиморфизмы -308G/A TNFa, +250A/G Lía и +1663A/G TNFR2. В основе выявленных связей могут лежать следующие медико-биологические механизмы. Генетические полиморфизмы -308G/A TNF а и +250A/G Lta как свидетельствуют литературные данные [Kroeger К.М. et al., 2000], имеют важное функциональное значение. Так, полиморфизм -308G/A промоторной области гена TNFa (замена гуанина на аденин в позиции 308) обусловливает возникновение высокопродуктивного аллеля -308А TNFa [Abraham LJ. et al., 1999; Hajeer A.H. et al., 2001]. При этом происходит 6-7-кратное увеличение индуцируемого уровня транскрипции гена TNFa. По локусу +250A/G Lta высокопродуктиным генетическим вариантом, согласно литературным материалам [Patuzzo С. et al., 2000], является аллель +250G Lta. У больных ХИЭ, имеющих высокопродуктивные генетические варианты (-308А TNFa, +250G Lta), можно ожидать и более выраженные патогенетические эффекты фактора некроза опухоли а и лимфотоксина а при развитии заболевания (иммуновоспалительные реакции, цитотоксическое действие), что в конечном итоге может привести к более неблагоприятному клиническому течению ХИЭ (развитие среднетяжелого течения и подострой стадии ХИЭ). Эти медико-биологические эффекты мы и зарегистрировали в нашем исследовании.

Рис. 3. Ассоциации генов цитокинов с развитием подострой стадии ХИЭ

3. Исследование связей генетических полиморфизмов цитокинов с развитием осложнений ХИЭ, прогнозирование риска развития осложнений у больных ХИЭ

В исследуемой группе больных ХИЭ осложнения были выявлены у 48 пациентов (20,87%), больных без осложнений было 182 человека (79,13%). Среди осложнений наблюдались: вторичная грибковая (9,13%) и вторичная бактериальная инфекции (11,74%).

Установлено, что группе больных ХИЭ с осложнениями концентрации аллелей -308A TNFa (18,48%), +250G Lt6 (39,36%), +36G TNFR1 (61,96%) статистически достоверно превышают аналогичные показатели контрольной группы, где они равняются - 10,47% (х2=4,32, р=0,04, OR=l,94 95% CI 1,043,60), 24,38% (Х2=8,75, р=0,004, OR=2,01 95% CI 1,25-3,24) и 50,47% (Х2=3,81, р=0,05, <Ж=1,60 95% CI 1,00-2,57), соответственно. Наряду с этим, среди больных ХИЭ с различными осложнениями заболевания частота генотипа +250АА Lt6 (34,04%) наименьшая по отношению к контролю (55,28%, х2=6,59, р=0,01, pcor=0,03, OR=0,42 95% CI 0,21-0,83) (рис.4).

Целый ряд достоверных различий зарегистрирован в распространенности сочетаний генетических вариантов цитокинов у больных ХИЭ с осложнениями в сравнении с контрольной группой (рис:б). У больных с осложненной ХИЭ сочетания +250GLt б с +36G TNFR1 (54,17%) и +250G Lt6 с +1663G TNFR2 (52,08%) в 1,6 раз встречаются чаще, чем в контрольной группе, где эти показатели составили 33,85% (ррегт= 0,005, OR= 2,53 95% CI 1,35-4,73) и 32,30% (pperm=0,005, OR=2,49 95% CI 1,32-4,69), соответственно. Сочетание генетических маркеров +250АА Lía и +1663A TNFR2, наблюдается у 12,5% больных ХИЭ с осложнениями и 36,96% контрольной группы (ppcrm=0,005). Комбинация трех маркеров -308G TNFa , +250А Lta и

+36 A TNFR1 встречается у больных ХИЭ с осложнениями (45,83%) в 1,54 раза реже, чем в контроле (70,5%). Данные сочетания являются протективными факторами развития осложнений ХИЭ ((Ж=0,25 95% CI 0,100,60 и OR=0,38 95% CI 0,21-0,73, соответственно). Также, протективную направленность имеют сочетание генетических вариантов +250GG Lta и +36A TNFR1: у больных ХИЭ с осложнениями это сочетание встречается у 35,42%, а в контроле у 59,01% (<Ж=0,41 95% CI 0,22-0,78) и сочетание +250А Lta и +36Á TNFR1,которое наблюдается у 47,92% больных с осложненной ХИЭ и 71,43% индивидуумов контроля (OR=0,40 95% CI 0,21-0,74). Для всех сочетаний ррепп=0,005.

С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития осложнений хронической истинной экземы на основании исследованных полиморфных вариантов генов факторов некроза опухолей и других возможных факторов риска с целью выявления больных, предрасположенных к осложнениям ХИЭ. С помощью математических методов моделирования (дискриминантный анализ) нами построена статистическая модель индивидуального прогнозирования риска развития осложнений у больных ХИЭ. Согласно этой модели наиболее прогностически ценными при определении риска развития осложнений у больных ХИЭ являются следующие факторы: наличие очагов хронической инфекции (р=0,003), уровень лейкоцитов в крови (р<0,001) и генетический вариант по локусу +250A/G Lta (р=0,05). Для групп больных ХИЭ с Ьсложнениями и без осложнений получены два уравнения линейных дискриминантных функции (ЛДФ):

у= -114,015+ 108,475xi+l,267х2+2,743х3 - для отнесения в группу больных ХИЭ без осложнений;

у= -114,720+103,793xi+2,370x2+3,399х3 -для отнесения в группу больных ХИЭ с осложнениями;

где xi - наличие очагов хронической инфекции (да-1;нет-2), х2- уровень лейкоцитов (1012/л), х3- генетический вариант по локусу +250 AJG Lta (АА-1; AG-2; GG-3).

В вышеуказанные уравнения ЛДФ подставляются значения соответствующих показателей у конкретного индивидуума и рассчитываются новые признаки - у. Индивидуума следует отнести в ту группу больных ХИЭ, для которой новый признак у является максимальным .

Например, у больного ХИЭ А. определены следующие показатели: наличие очагов хронической инфекции - да, уровень лейкоцитов в крови -7,3х10|2/л, генетический вариант по локусу +250A/G Lta - АЛ. Подставляем эти значения признаков в два вышеуказанных уравнения ЛДФ и находим в каждом уравнении новый признак у.

у (больные ХИЭ без осложнений) = у= -114,015+ 108,475*1+1,267*7,3+2,743*1=6,452; у (больные ХИЭ с осложнениями) = у=-114,720+103,793* 1+2,370*7,3+3,399* 1=9,773

Рис. 4. Вовлеченность полиморфных вариантов цитокинов в формирование осложнений у больных ХИЭ

Максимальное значение нового признака у для данного больного выявлено при расчётах в уравнении ЛДФ для больных ХИЭ с осложнениями, что позволяет отнести этого мужчину в группу больных ХИЭ с осложнениями. Дальнейшее детальное клинико - лабораторное обследование данного пациента подтвердило наш прогноз - у больного А. было обнаружено осложнение ХИЭ в виде вторичной грибковой инфекции.

Для больного ХИЭ В. были определены следующие показатели: наличие очагов хронической инфекции - нет, уровень лейкоцитов в крови -4,2х1012/л, генетический вариант по локусу +250A/G Lta - GG. Подставляя эти значения признаков в два вышеуказанных уравнения ЛДФ, при расчетах мы выявили максимальное значение у для больных без осложнений: у (больные ХИЭ без осложнений) = у= -114,015+ 108,475*2+1,267*4,2+2,743*3=116,485; у (больные ХИЭ с осложнениями) = у=-114,720+103,793*2+2,370*4,2+3,399*3=113,017 Это дает нам возможность отнести больного В. в группу больных ХИЭ без осложнений. Дальнейшее наблюдение за этим пациентом подтвердило этот прогноз.

Разработанная нами модель прогнозирования риска развития осложнений ХИЭ позволит формировать среди больных ХИЭ на ранних стадиях развития заболевания группы риска по развитию осложнений, что будет способствовать более эффективной реализации лечебно-

профилактических мероприятий по предупреждению осложнений данного заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Генетические полиморфизмы фактора некроза опухоли a (-308G/A TNFa), лимфотоксина a (+250A/G Ltd), рецепторов фактора некроза опухоли 1-го и 2-го типов (+36A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2) и их комбинации ассоциированы с формированием хронической истинной экземы, ее степенью тяжести, характером течения и развитием осложнений.

2. Генетическим маркером повышенного риска развития ХИЭ является аллель +250G Lta (OR=l,33), а также его сочетание с +1663G TNFR2 (OR=1,60). Среди мужчин значимый вклад в подверженность к ХИЭ имеют генетические полиморфизмы -308G/A TNFa, +250A/G Lt a, +36AJG TNFR1, +1663A/G TNFR2, а у женщин они не ассоциированы с развитием хронической истинной экземы.

3. У индивидуумов с наследственной отягощенностью фактором риска развития ХИЭ служит +1663G TNFR2 (OR=l,58) и его комбинация с -308G TNFa (OR=2,54). С развитием ХИЭ у индивидуумов без отягощенного семейного анамнеза ассоциированы генетические варианты -308A TNFa (OR=l,56), +250G Lta (0R=1,51), +250GG Lta (OR=2,88), и комбинации +250G Lta с +1663G TNFR2 (OR=l,68) и -308A TNFa с +250 G Lta (OR=l,77).

4. Определяют подверженность к формированию ХИЭ средней степени тяжести аллель +250G Lta (OR=l,64) и сочетания генетических вариантов: +250G Lta с +1663G TNFR2 (OR=2,52), -308А TNFa с +1663G TNFR2 (OR=2,26), -308G TNFa с +250G Lta (OR=2,13), протективную направленность имеет комбинация -308G TNFa с +250АА Lta (OR=0,48). Генетические варианты -308A TNFa (DR=2,17), -308GG TNFa (OR=0,40) -308GA TNFa (OR=2,41) и +1663G TNFR2 (OR=l,69), a также их комбинации: -308 A TNFa с +1663G TNFR2 (OR=3,54), -308A TNFa с +250G Lta (OR=2,65), +250G Lta с +1663G TNFR2 (OR=2,17) ассоциированы с развитием подострой стадии ХИЭ.

5. Генетическими факторами риска развития осложнений ХИЭ являются аллели -308А TNFa (OR=l,94), +250G Lta (OR=2,01), +36G TNFR1 (OR=1,60) и их сочетания +250G Lta с +36G TNFR1 (OR=2,53), +250G Lta с +1663G TNFR2 (OR=2,49). Протективную направленность при развитии осложнений ХИЭ имеют генотип +250АА Lta (OR=0,42) и комбинации генетических вариантов +250АА Lta с +1663A TNFR2 (OR=0,25), -308G TNFa , +250А Lta с +36A 7Wf7?/(OR=0,38), +250А Lta с +36А TNFR1 (OR=0,40), -308GG TNFa с +36A TNFR1 (OR=0,41). Прогностически значимыми факторами развития осложнений у больных ХИЭ является генетический вариант по локусу +250A/G Lta, наличие очагов хронической инфекции и уровень лейкоцитов в крови.

Практические рекомендации

1. В дерматологических стационарах при обследовании пациентов с хронической истинной экземой в качестве маркеров формирования

подострой стадии заболевания следует использовать генетические полиморфизмы -3080/А ШРа и +1663А/в ТЫРЯ2, а маркерами среднетяжелого течения ХИЭ могут являться -3080/А ТЫ Ра, +250А/0 &а и +36А/О ТЫРЮ.

2. Для индивидуального прогнозирования риска развития осложнений ХИЭ использовать уравнения линейной дискриминантной функции, включающие в себя следующие факторы: генетический вариант по локусу +250А/0 Ыа, наличие очагов хронической инфекции и уровень лейкоцитов в крови.

Список сокращений

ТЫ Ра - фактор некроза опухоли а Ыа- лимфотоксин а

ТЫРЮ-рецептор фактора некроза опухоли 1-го типа

ЮТК2 - рецептор фактора некроза опухоли 2-го типа

ХИЭ - хроническая истинная экзема

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЛДФ - линейная дискриминантная функция

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Крикун, Я.Е. Распространенность заболеваемости экземой среди населения Белгородской области [Текст] / Я. Е. Крикун // Вопросы теоретической и практической медицины : материалы 77-й Рос. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвящ. 80-летию БГМУ : в 2 т. / редкол.: В. Н. Павлов [и др.]; Башкир, гос. мед. ун-т МЗ и соц. развития РФ, Рос. союз молодых ученых. — Уфа, 2012. — Т. 1. — С. 312-313.

2. Крикун, Я. Е. Распределение полиморфизма гена лимфотоксина альфа среди населения Центрального Черноземья России [Текст] / Я. Е. Крикун // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины : сб. трудов X науч.-практ. конф. студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых учёных, посвящ. 10-летию Инта последиплом. мед. образования / НИУ БелГУ. - Белгород, 2012. - С. 67-68.

3. Крикун, Я. Е. Распределение полиморфизма гена фактора некроза опухоли альфа среди населения Белгородской области [Текст] / Я. Е. Крикун // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - 2012. -Спец. вып. - С. 26-27.

4. Крикун, Я. Е. Распределение некоторых молекулярно-генетических маркеров ФНО среди населения Центрального Черноземья России [Текст] / Я. Е. Крикун // Молодежная наука и современность : материалы 77 всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, Курск, 18-19 апр. 2012 г. : в 3 ч. / редкол.: В. А. Лазаренко, П. В. Калуцкий ; Курск, гос. мед. ун-т, Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, РАЕН. - Курск, 2012. -Ч. 1.-С. 95.

5. Денисова, Я. Е. Распределение полиморфизма гена рецептора фактора некроза опухоли 1 типа среди населения Центрального Черноземья

России [Текст] / Я. Е. Денисова // Вестник РГМУ. -2013,- Спец. вып. № 1. -С. 252-253.

6. Денисова, Я. Е. Современные представления о молекулярно-генетических механизмах возникновения истинной экземы [Текст] / Я. Е. Денисова // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. -2013. — № 18 (161), вып. 23. - С. 5-11.

7. Денисова, Я. Е. Ассоциация полиморфизма лимфотоксина а (+250 АДЗ Ыа) с формированием хронической истинной экземы [Электронный ресурс] / Я. Е. Денисова, М. И. Чурносов // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 3. - Режим доступа: 11йр:/7\у\у\у.5с1епсе-education.rU/l 17-13677.

Подписано в печать 24.10.14. Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman. Усл. п.л. 1,0.Тираж 100 экз. Заказ 6051. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ЗАО «Белгородская областная типография», г. Белгород, пр.Б. Хмельницкого, 111а