Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клиническое и молекулярно-генетическое исследование классического типа синдрома Элерса-Данлоса

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клиническое и молекулярно-генетическое исследование классического типа синдрома Элерса-Данлоса"

На правах рукописи

□□3052697

Курникова Мария Андреевна

КЛИНИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛАССИЧЕСКОГО ТИПА СИНДРОМА ЭЛЕРСА-ДАНЛОСА

03.00.15-"Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА, 2007

003052697

Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Государственном учреждении Медико-генетическом науч-' ном центре РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Мутовин Геннадий Романович Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Петрин Александр Николаевич

доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович

Ведущая организация:

МНИИ педиатрии и детской хирургии

Защита диссертации состоится « »_ 2007 г. в _ часов

на заседании Диссертационного совета К 208.072.03 при Российском государственном медицинском университете по адресу: г. Москва, 117997, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета (г. Москва, 117997, ул. Островитянова, д.1).

Автореферат разослан «__»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Марченко Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Синдром Элерса - Данлоса (СЭД) представляет собой гетерогенную группу наследственных соединительно-тканных заболеваний, объединенных на основе общих клинических признаков - гипермобильности суставов, повышенной растяжимости кожи, нарушений развития скелета, сердечно-сосудистых изменений и другой симптоматики, обусловленной дис-плазией соединительной ткани. По данным некоторых авторов, СЭД является самым частым наследственным соединительно-тканным заболеванием [Burrows N.P., 1999].

В настоящее время выделено 6 типов СЭД, обусловленных различными генетическими причинами [Beighton Р. и соавт., 1998]. Клиническое и молекулярно-генетическое разграничение типов СЭД актуально для медико-генетического консультирования, так как разные типы СЭД имеют разный тип наследования, отличаются по тяжести клинических проявлений и имеют разный прогноз для здоровья пациента и его родственников.

Одним из наиболее часто встречающихся типов СЭД является классический тип (КТ). Его популяционная частота оценивается примерно 1:10000 - 1:40000 [Byers, Р.Н., 2004]. КТ СЭД объединяет два типа заболевания, которые выделялись в предыдущей, Берлинской классификации 1986 года - I (gravis, тяжелый) и II (mitis, умеренный) [Beighton Р., 1986]. При одинаковых критериях диагностики для обоих типов учитывалась тяжесть клинических проявлений. В дальнейшем было установлено, что мутации в одних и тех же генах - генах al- и а2- цепей коллагена V типа -приводят к фенотипическим проявлениям как I, так и II типов СЭД [Burrows N.P., 1996]. На этом основании при пересмотре классификации СЭД в 1997 году эти типы объединили в один, классический, тип [Beighton Р., 1998].

В клинической практике постановка диагноза КТ СЭД вызывает определенные трудности, особенно в случаях умеренно выраженных признаков заболевания, что связано с клиническим полиморфизмом и общностью симптомов между КТ СЭД и другими нозологическими формами соединительно-тканных дисплазий. Во многих исследованиях было продемонстрировано отсутствие морфологических и биохимических маркеров, патогно-моничных для КТ СЭД [Black С., 1980; Steinmann В., 2002; Proske S., 2006].

В связи с этим весьма актуальным представляется молекулярно-генетическое изучение этиологии данного заболевания. За последние годы отмечен значительный прогресс в области изучения этиологии и патогенеза КТ СЭД. На сегодняшний день, по разным данным, примерно в 30-50% случаев при КТ СЭД удается установить генетический дефект. В подавляющем большинстве случаев это мутации в генах коллагена V типа [Malfait F., 2005; Michalickova К., 1998; Nicholls А., 1996].

При подозрении на СЭД чрезвычайно важна стандартизация данных клинического обследования, так как она позволяет максимально подробно и объективно оценить клиническую картину заболевания. Разработка системы регистрации данных клинического и инструментального обследования больных с подозрением на СЭД с учетом основных и дополнительных критериев каждого типа может оказать помощь врачам в постановке клинического диагноза и проведении дифференциальной диагностики между типами СЭД.

В нашей стране ранее не проводилось комплексное клиническое и мо-лекулярно-генетическое исследование ни одного из типов СЭД, включая КТ. Поэтому разработка метода молекулярно-генетической диагностики КТ СЭД позволит проанализировать гено-фенотипические корреляции и использовать данный вид диагностики для подтверждения клинического диагноза.

Цель исследования.

Разработка системы регистрации мутаций в генах коллагена V типа (COL5A1 и COL5A2) и выявление гено-фенотипических корреляций в группе пациентов с КТ СЭД.

Задачи исследования.

1.Разработать стандартную схему клинического обследования и систему регистрации результатов обследования с формированием компьютерной базы данных для больных с подозрением на СЭД.

2.Провести анализ клинических признаков среди пациентов с подозрением на СЭД и установить клинический диагноз.

3.Сформировать выборку пациентов для проведения молекулярно-генетического анализа (исследование генов COL5A1 и COL5A2).

4.Разработать систему регистрации «нулевых аллелей» в гене COL5A1, а также провести молекулярно-генетическое исследование всей кодирующей последовательности и областей экзон-интронных соединений гена COL5A2 в выборке больных.

5.Провести анализ гено-фенотипических корреляций у больных с КТ СЭД.

6.Разработать практические рекомендации для проведения молеку-лярно-генетического исследования при КТ СЭД.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Схема клинического обследования пациента с подозрением на СЭД, составленная с учетом критериев международной классификации СЭД, позволяет стандартизировать клиническое обследование и проводить дифференциальную диагностику различных типов СЭД. Разработанная система регистрации полученных данных может использоваться как на бумажных носителях, так и виде компьютерной базы, позволяющей проводить статистический анализ результатов.

Впервые в России проведено молекулярно-генетическое исследование КТ СЭД. Разработана система регистрации «нулевых аллелей» в гене COL5A1 и система поиска мутаций в гене COL5A2. Показано, что поиск «нулевых аллелей» в гене COL5A1 является эффективным способом моле-кулярно-генетической диагностики заболевания среди пациентов с тяжелым вариантом КТ СЭД.

Положения, выносимые на защиту.

1. Схема обследования пациентов с подозрением на СЭД, разработанная с учетом основных и дополнительных критериев различных типов СЭД в соответствии с международной классификацией, позволяет стандартизировать клиническое обследование, провести дифференциальную диагностику между различными типами и избежать гипердиагностики СЭД.

2. При постановке клинического диагноза «КТ СЭД» следует выделять тяжелый вариант заболевания, характеризующийся генерализованной гипермобильностью суставов, генерализованной гиперрастяжимостью кожи, множественными атрофичными рубцами и подкожными псевдоопухолями.

3. Система регистрации «нулевых аллелей» в гене COL5A1 с использованием полиморфных маркеров является эффективным способом поиска мутаций в гене COL5A1 при тяжелом варианте КТ СЭД.

Апробация работы.

По материалам исследования опубликованы 9 работ. Материалы диссертации были представлены в виде стендовых презентаций на ежегодных научных конференциях Европейского общества генетики человека (ESHG) 2002 и 2003 гг и доложены на I Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (2002 г) и на Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы» (2006 г).

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста; включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список использованной литературы, приложение. Библиография содержит 9 отечественных и 115 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 22 таблицами и 12 рисунками, приложение содержит карту обследования и 8 фотографий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В ходе клинического исследования были обследованы пациенты с направляющим или уже установленным диагнозом «Синдром Элерса-Данлоса». Обследованные пациенты наблюдались на кафедре клинической генетики педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в отделениях ФГУ "МНИИ педиатрии и детской хирургии Росздрава" и отделениях Российской детской клинической больницы.

Всего обследовано 108 человек (56 пробандов и 52 родственника) из 56 семей в возрасте от 2 до 64 лет. Личный осмотр родственников 15 пробандов не представлялся возможным, в остальных случаях были осмотрены один или несколько родственников.

При клиническом обследовании данные о каждом пациенте заносились в разработанную карту, составленную на основании критериев диагностики СЭД согласно классификации 1997 года. Карта имеет разделы, соответствующие системам органов, вовлеченных в патогенез СЭД: кожные покровы, суставы, костно-мышечная система, внутренние органы, сосуды и органы зрения. Каждый раздел включает подразделы, уточняющие клиническое многообразие и выраженность проявлений болезни при разных типах СЭД. Карта также предусматривает возможность внесения дополнительных симптомов, не вошедших в отдельные пункты, а также учитывает

данные семейного анамнеза, результаты дополнительных методов обследования (УЗИ, ЭКГ, Эхо-КГ и др.) и заключения специалистов. Данная карта доступна как на бумажных носителях, так и в виде разработанной компьютерной базы данных (Microsoft Access 2000, Рис.1).

Рис.1.

Пример окна интерфейса компьютерной базы данных пациентов с СЭД.

<t>mníf альное обследование

Ко Mftje /токсин кт

Т —Г '—г

Г ■—г —г

^^rtii^í Ь< н (

Суетay

ЗЯ1-- Г J л** --г

г iû* |Г

г ахи |Г" j

UM г г ■Г™Т

г

tjikjr

У больных, вошедших в выборку для молекулярно-генетического исследования (31 человек), были взяты образцы крови путем венопункции и биопсия кожи. Биопсия кожи (участок диаметром 2-4 мм) производилась с передней средней трети предплечья с использованием одноразового скальпеля и пинцета под местным обезболиванием (0.1 мл 2 %лидокаина подкожно). Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью набора реактивов DlAiom™ DNA /Yep 100 (Isogene Lab,ltd., Россия) по протоколу производителя.

Культивирование фибробластов кожных биопталов осуществлялось в

питательной среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки с периодической сменой среды. Выражаю глубокую благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной биологии с группой клеточных культур ГУ МГНЦ РАМН и лично в.н.с. Терехову С.М.

Выделение тотальной мРНК осуществлялось из культуры клеток кожных фибробластов с использованием набора реактивов RNAgents®Total RNA Isolation System (Promega, США) согласно протоколу фирмы производителя.

Для получения кДНК производили обратную транскрипцию с использованием набора реагентов Promega® Reverse Transcription System, Technical Bulletin No.099 (Promega, США) согласно протоколу фирмы-производителя.

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК и кДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в НПО «Литех» или НПО "SYNTOL".

Исследование полиморфных маркеров проводилось методом ПДРФ-анализа. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакрила-мидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-излучении. В работе использовали эндонук-леазы производства фирмы «СибЭнзим» (Россия), «Fermentas» (Литва) и «Promega» (США).

Для выявления изменений нуклеотидной последовательности гена COL5A2 использовался метод SSCP-анализа [Orita, 1989] с щелочной денатурацией амплифицированных фрагментов кДНК с последующим их электрофорезом в неденатурирующем полиакриламидном геле, окраской геля 1х раствором SYBR® Gold nucleic acid gel stain (Invitrogene™Molecular Probes1M, США) и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-излучении.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ данных клинического обследования.

Среди 108 обследованных было выявлено 86 больных с различной соединительно-тканной патологией (таблица 1), в том числе 56 пробандов и 30 родственников, и 22 условно здоровых индивида (все - родственники пробандов).

Таблица 1.

Спектр соединительно-тканной патологии, выявленной в результате клинического обследования, среди всех больных и в выборке для молекулярно-генетического исследования.

Диагноз Количество больных Количество больных в выборке для молекулярно-генетического исследования

поиск «нулевых аллелей» в гене COL5A1 поиск точковых мутаций в гене COL5A2

Классический тип СЭД тяжелый (I, gravis) и 9 4

умеренный (И, mitis) 13 10 4

Недифференцированная дисплазия соединительной ткани (НДСТ) 47 5 т

Признаки ДСТ у детей в возрасте до 5 лет 4 - -

Кифосколиотический тип СЭД 1 - -

Смешанные фенотипы 10 7 2

Всего 86 31 10

Под «условно здоровыми» в данном случае подразумевали тех индивидов, у которых проявления соединительно-тканной дисплазии либо отсутствовали, либо отмечались отдельные неспецифичные признаки.

Среди 86 больных были дети (56 человек в возрасте от 1,5 до 16 лет, из них 31 мальчик и 25 девочек) и взрослые (27 женщин в возрасте от 20 до 63 лет и 3 мужчины в возрасте от 19 до 48 лет).

В тех случаях, когда у больных наблюдались признаки дисплазии соединительной ткани (ДСТ), однако их набор не соответствовал набору симптомов известного соединительно-тканного заболевания, мы расценивали их как проявления так называемой недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ).

При постановке диагноза «КТ СЭД» клинически были выделены тяжелый и умеренный варианты данного заболевания. Тяжелый вариант подразумевал наличие генерализованной гипермобильности суставов, генерализованной гиперрастяжимости кожи, множественных атрофичных рубцов как обязательных признаков, а также подкожных псевдоопухолей и гладкой, бархатистой, легко ранимой кожи. При умеренном варианте СЭД повышение растяжимости кожи оценивалось как умеренное, гипермобильность суставов оценивалась в 6-8 баллов по шкале Бейггона, а атрофичные рубцы могли быть единичными.

Из 86 больных с различной соединительно-тканной патологией была сформирована выборка больных (N=31) для проведения молекулярно-генетического исследования генов COL5A1 и COL5A2. В данную выборку вошли 19 больных с КТ СЭД. В выборке были также пациенты со смешанными фенотипами СЭД и НДСТ с целью определения роли мутаций в генах коллагена V типа при соединительно-тканных дисплазиях, имеющих отдельные признаки КТ СЭД, но не соответствующих данному диагнозу в соответствии с критериями международной классификации 1997 года.

Суммарные данные анамнеза, осмотра и других методов исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Частота встречаемости признаков СЭД среди всех обследованных, больных, условно здоровых и в выборке пациентов для моле-кулярно-генетического исследования.

Исследуемый признак Частота встречаемости признака (число случаев/% от IV)

Все обследованные N=108 Больные N=86 Условно здоровые N=22 Выборка для молекулярно-генетического исследования N=31

Кожные покровы

Гиперрастяжимость кожи 12(11,1%) 12(14%) - 10(32,3%)

Умеренно повышенная растяжимость кожи 37(34,3%) 37(43%) - 17(54,8%)

Множественные атрофичные рубцы 26(24,1%) 26(30,2%) - 18(58,1%)

Единичные атрофичные рубцы 4(3,7%) 4(4,7%) - -

Длительное заживление ран 24(22,2%) 24(28%) - 12(38,7%)

Бархатистость кожи 21(19,4%) 21(24,4%) - 11(35,5%)

Подкожные узелки 13(12%) 13(15,1%) - 7(22,6%)

Подкожные псевдоопухоли 6(5,6%) 6(7%) - 6(19,4%)

Тонкая, прозрачная кожа 14(13%) 14(16,3%) - 8(25,8%)

Акрогерия - - - -

Выраженная хрупкость кожи (рвущаяся кожа) 2(1,9%) 2(2,3%) - 2(6,5%)

Избыточность кожи 1(0,9%) 1(1,2%) - 1(3,2%)

Мягкая, тестообразная консистенция кожи - - - -

Суставы

Гипермобильность суставов (6 баллов и более) 41(38%) 41(47,7%) - 23(74,2%)

Вывихи, подвывихи 26(24,1%) 25(29,1%) 1(4,5%) 19(61,3%)

Растяжение связок 11(10,2%) 11(12,8%) - 3(9,7%)

Врожденный вывих бедра 6(5,6%) 6(7%) - 2(6,5%)

Хронические артралгии 33(30,6%) 33(38,4%) - 16(51,6%)

Гипермобильность мелких суставов 7(6,5%) 7(8,1%) - 6(19,4%)

Тяжелая генерализованная гипермобильность 1(0,9%) 1(1,2%) - 1(3,2%)

Космно-мышечная система

Сколиоз 50(46,3%) 49(57%) 1(4,5%) 24(77,4%)

Кифосколиоз 8(7,4%) 8(9,3%) - 2(6,5%)

Деформация грудины 32(29,6%) 31(36%) 1(4,5%) 14(45,2%)

Переломы 7(6,5%) 7(8,1%) - 4(12,9%)

Деформация стопы (плоскостопие, плосковальгусные стопы, косолапость) 51(47,2%) 51(59,3%) 24(77,4%)

Мышечная гипотония 12(11,1%) 12(14%) - 4(12,9%)

Разрыв сухожилий и мышц - - - -

Повышенная утомляемость 23(21,3%) 23(26,7%) - 12(38,7%)

Атрофия десневого края - - - -

Аномальный рост зубов 19(17,6%) 19(22,1%) - 12(38,7%)

Внутренние органы и сосуды

Грыжи 21(19,4%) 21(24,4%) - 8(25,8%)

Опущение внутренних органов 28(25,9%) 27(31,4%) 1(4,5%) 14(45,2%)

Пролапс митрального клапана 56(51,9%) 56(65,1%) - 23(74,2%)

Пролапсы других клапанов сердца 3(2,8%) 3(3,5%) - 1(3,2%)

Другая сердечно-сосудистая патология 34(31,5%) 33(38,4%) 1(4,5%) 10(32,3%)

Спонтанный пневмоторакс 1(0,9%) 1(1,2%) - 1(3,2%)

Кровотечения носовые/десенные 37(34,3%) 36(41,9%) 1(4,5%) 16(51,6%)

Кровотечения маточные/почечные/ желудочно-кишечные 8(7,4%) 8(9,3%) 2(6,5%)

Разрывы артерий 1(0,9%) 1(1,2%) - -

Легкое возникновение экхимозов 50(46,3%) 49(57%) 1(4,5%) 22(71%)

Варикозное расширение вен 19(17,6%) 18(21%) 1(4,5%) 10(32,3%)

Глазная патология

Миопия 26(24,1%) 26(30,2%) - 9(29%)

Астигматизм 8(7,4%) 8(9,3%) - 3(9,7%)

Разрывы глазного яблока и роговицы - - - -

Другое 24(22,2%) 22(25,6%) 2(9,1%) 7(22,6%)

Молекулярно-генетическое исследование. Поиск мутаций в гене СОЬ5А2

Первый этап заключался в амплификации 11 последовательных фрагментов всей последовательности кДНК гена СОЬ5А2.

На втором этапе проводилась рестрикция 10 из 11 фрагментов в связи с тем, что длины фрагментов, полученных после рестрикции, были опти-

мальны для проведения SSCP-анализа (не превышали 300 п.н.) (Рис.2).

На третьем этапе проводился SSCP - анализ. В результате исследования 10 образцов кДНК пациентов, из которых у 8 был клинически поставлен диагноз КТ СЭД и у двух - смешанный фенотип СЭД ни в одном из изученных фрагментов изменений электрофоретической подвижности обнаружено не было (Рис.3).

Данные литературы свидетельствуют о сравнительно низкой выяв-ляемости мутаций в гене COL5A2 при КТ СЭД [Malfait F., 2005]. На сегодняшний день в мире описано 7 пациентов с КТ СЭД у которых выявили мутации в этом гене. Учитывая данные других исследований и наши собственные данные, этот метод был расценен нами как малоинформативный, и дальнейшее исследование гена COL5 А2 в нашей работе не проводилось.

Рис. 2.

Схема амплифицируемых фрагментов и соответствующих рест-риктаз для кДНК гена СОЬ5А2.

кДНК 6217 п.н.

FIRI 482 пн

F2R2 531 пи

BglH

214+26S п.н

F3R3

486 п н

Hiofl

219-1312 п.н.

F4R4

450 пн

ЛряЫ

206+280 П.Н.

F5R5

479 ПН

BstEIJ

212*238 u.ti

F6R6 496 п н

SstJ

>27-» 252 п.н.

F7R7 497 пн

F8R8 484 п н

F9R9

482 пн

F10R10

489 п н

F11R11

249 пи -►

F.COS7I 257+239 п и.

■Snml 239+253 п.н

Pstl

230+254

п н

Pvull

264+218 п.н

ЕсоЗИ 266+223 н.и.

Рис.3.

SSCP-аиализ а модифицирован кого фрагмента Fl 1 Rl 1 кДНК* гена COLSA2.

М - маркер молекулярного веса - ДШ фага )., обработанная эндонуклеазой Pstl.

Разработка системы регистрации гап/юнедостаточности в гене COLSAI

Классический тип СЭД является одним из заболеваний, в этиопатогенезе которого продемонстрирована роль механизма деградации мРНК, содержащей преждевременные стоп-кодоны (ПСК) [Schwarze U., 2004; Wenstrup R., 2006]. В англоязычной литературе данный механизм называется «noncence-med iated mRNA decay» (NMD) [Maquat L., 2005].

Возникновение ПСК является частым событием мутагенеза. Известно, что примерно одна треть всех наследственных заболеваний, а также многие формы рака обусловлены нонсенс-мутациями или мутациями, приводящими к сдвигу рамки считывания и возникновением ПСК [Frischmeyer P.A.,1999]. Было продемонстрировано, что большинство транскрип-тов, содержащих ПСК, распознаются и эффективно разрушаются в клетке с помощью механизма NMD. Этот механизм универсален для эукариот и, как полагают, защищает организм от доминантных эффектов утрачивания или приобретения каких-либо функций, к чему могли бы привести укороченные белки в случае стабильности транскриптов с ПСК.

Деградация транскрипта, содержащего ПСК, обнаруживается при сравнительном анализе ДНК и кДНК с использованием специфичных внутриэкзонных полиморфизмов как полная или частичная потеря гетеро-зиготности в образцах кДНК.

Дня обозначения понятия «потеря гетерозиготности» в литературных источниках используют также термины «гаплонедостаточность» и «нулевой аллель».

При классическом типе СЭД поиск «нулевых аллелей» имеет ряд преимуществ перед другими способами поиска молекулярно-генетических изменений:

1 .Наибольшее количество мутаций при KT СЭД локализовано в гене COL5A1; при этом большинство из этих мутаций приводит к возникновению ПСК [Malfait F., 2005].

2.Прямое секвенирование при поиске мутаций в гене COL5A1 затруднено в связи с большой протяженностью общей и кодирующей последовательностей, отсутствием повторяющихся мутаций и регионов максимальной их концентрации.

З.Этот метод позволяет косвенно выявить не только нонсенс-мутации, но и делеции/инсерции, приводящие к сдвигу рамки считывания, а также протяженные делеции, не поддающиеся идентификации методами, обычно используемыми для поиска точковых мутаций (SSCP, DGGE, секвенирование и др.).

4.Для определения мутаций в последовательности кДНК, приводящих к формированию преждевременного стоп-кодона и последующей деградации нонсенс-транскрипта, перед выделением мРНК клеточные культуры должны быть обработаны циклогексимидом, в присутствии которого происходит стабилизация нонсенс-транскрипта мРНК. В противном случае при секвенировании фрагментов кДНК с обнаруженной потерей гетерозиготности, включающих область геномной мутации, определяется последовательность только нормального аллеля, а мутация не выявляется.

5.По данным ряда исследований, в некоторых случаях при выявлении «нулевых аллелей» обнаружить мутацию не удается [Wenstrup RJ, 2000].

Таким образом, метод поиска гаплонедостаточности в гене COL5A1,

по данным разных исследований, на сегодняшний день является наиболее эффективным методом определения генетической причины заболевания среди других известных молекулярно-генетических методов у пациентов с КТСЭД.

Анализ внутриэкзонных полиморфизмов в образцах ДНК.

Первый этап молекулярно-генетического исследования гена COL5A1 заключался в анализе однонуклеотидных полиморфизмов в гене COL5A1 в образцах ДНК пациентов с целью определения гетерозиготного состояния по исследуемому маркеру в генотипе каждого пациента.

Критериями выбора полиморфизмов, помимо локализации в кодирующей части гена, были информативность (гетерозиготность) и расположение как 5', так и 3'- области гена. Праймеры для исследования ДНК выбирались как в экзонной, так и в интронной последовательностях, а для кДНК - только в экзонной части гена (Рис.4).

Рис. 4.

Схема полиморфных маркеров и амплифицируемых фрагментов для ДНК и кДНК при поиске гаплонедостаточности в гене

COL5A1.

4S

С1120Т (ЕхЗ/Pstî)

-oto—

332 пн

G4S64C (Ex58/Bsc4i)

~it~

^ Ex 58

142 п н

5A

J7intF

58R

ih

T5982C (Ехбб/Bst ENII)

lExtt I

599 п h

65intF

3'R

ДНК

C1120T G4864C T5982C

(ExS/PstI) (Ex58/Bsc41) (Ехбб/Bst ENII) l ._ I | 3'

ExS | F-\6 | Ex7 |-1 Exi2 I Ex» I Ex54 | ExSS | Ex56 | ExS7 | Ex^SS j'-E

366 П H

404 П H

| Ex 66 \

,660 n.l^

кДНК

5F

7R

52F

58R

65F

3'R

Для анализа были выбраны 6 полиморфизмов: С1120Т (rs3124299), меняющий сайт узнавания для рестриктазы Л/1 в экзоне 5; G4504A (rs3827848), меняющий сайт узнавания для рестриктазы AsuHPl в экзоне 52; G4864C (rs3811146), меняющий сайт узнавания для рестриктазы Bsc4\ в экзоне 58; С5652Т (rs2229817), меняющий сайт узнавания для рестриктазы Styl в экзоне 65; Т5982С (rsl3946), меняющий сайт узнавания для рестриктазы BsíEMl в экзоне 66 (в З'-нетранслируемой области, З'-UTR) и Т6166С (rs 12722), меняющий сайт узнавания для рестриктазы BstUl в экзоне 66 (в З'-UTR). Идентификационные номера SNP приводятся в соответствии с базой SNP, а номера нуклеотидов - в соответствии с референс-ной последовательностью мРНК гена COL5A1 NM_000093. Для системы выявления «нулевых аллелей» в итоге были выбраны 3 полиморфизма, которые оказались наиболее информативными - Cl 120Т, G4864C и Т5982С.

Рис.5.

Пример определения информативности внутриэкзонного маркера в гене COL5A1 в образцах ДНК при исследовании полиморфизма G4864C (Bsc4\) в экзоне 58.

s*. • . -

, ' /•- ' /

142 п.н.-

-:-- -s ***

izo п.н. -

M 1 2 Pl Р2 РЗ Р4 Р5 Р6 Р7 Р8 Р9 Р10

M - маркер молекулярного веса - ДНК фага X, обработанная эндонуклеа-зой Pstl. 1, 2 - фрагменты ДНК пациентов до обработки эндонуклеазой рестрикции Bsç4I (длина 142 п.н.) После обработки фрагмента кДНК эндонуклеазой рестрикции Bsc4I возможно образование фрагментов длиной 126+16 п.н.(С-аллель) или сохранение фрагмента 142 п.н. (G-аллель). У пациентов Р2, Р4, Р6, Р9 выявлено гетерозиготное состояние гена COL5A1 по полиморфному маркеру G4864C.

В образцах геномной ДНК из 31 пациента 13 (42%) были гетерозиготны по полиморфизму С1120Т (Pstï) в экзоне 5, 18 (58%) были гетерозиготны по полиморфизму G4864C (Bsc4l) в экзоне 58 и 14 (45%) были гетерозиготны по полиморфизму Т5982С (BstENll) в экзоне 66. Таким образом, 26 из 31 пациента (84%) были информативны по одному или нескольким полиморфизмам (Рис.5).

Анализ информативных внутриэкзонных полиморфизмов в образцах кДНК

Количество экспрессируемых аллелей гена COL5A1 в образцах кДНК определяли по тем полиморфным маркерам, которые оказались информативными при исследовании ДНК данного больного.

При исследовании образцов кДНК по маркеру G4864C была обнаружена полная потеря гетерозиготности у четырех пациентов - Р9, PI 1, Р12 и Р12.1, а также частичная потеря гетерозиготности у Р21. По маркеру С1120Т выявлена частичная потеря гетерозиготности у Р21 (так же, как и по маркеру G4864C). По маркеру Т5982С выявлена полная потеря гетерозиготности у Р12 (так же, как и по маркеру G4864C). (Рис.6).

Таким образом, из трех маркеров наиболее информативным при выявлении потери гетерозиготности оказался маркер G4864C (Bsc4ï) в экзоне 58.

Следует особо отметить результаты, полученые у Р9. В отличие от остальных пациентов, из трех информативных маркеров — Cl 120Т, G4864C и Т5982С - потеря гетерозиготности в образце кДНК этой больной была обнаружена только для маркера G4864C, расположенного в экзоне 58, а при исследовании маркеров, расположенных в экзонах 5 и 66, гетерозиготность в образце кДНК была сохранена. Можно предположить, что изменения структуры ДНК таковы, что при процессинге мРНК теряется участок, содержащий полиморфизм G4864C в экзоне 58, но не происходит образова-

Для анализа были выбраны 6 полиморфизмов: С1120Т (rs3124299), меняющий сайт узнавания для рестриктазы Psî\ в экзоне 5; G4504A (rs3S27843), меняющий сайт узнавания для рестриктазы ÂsuHPl в экзоне 52; G4864C (rs3811146), меняющий сайт узнавания для рестриктазы Bsc4l в экзоне 58; С5652Т (rs22298I7), меняющий сайт узнавания для рестриктазы Sfyl в экзоне 65; Т59&2С (rs 13946), меняющий сайт узнавания для рестриктазы &si£MI в экзоне 66 (в З'-нетранслируемой области, З'-UTR) и T6I66C (rs12722), меняющий сайт узнавания для рестриктазы BstU\ в экзоне 66 (в З'-UTR). Идентификационные номера SNP приводятся в соответствии с базой SNP, а номера муклеотидов - в соответствии с референс-ной последовательностью мРНК гена COL5A1 NM_000093. Для системы выявления «нулевых аллелей» в итоге были выбраны 3 полиморфизма, которые оказались наиболее информативными - Cl 120Т, G4864C и Т5982С.

Рис.5.

Пример определения информативности внутрнэкзонного маркера в гене COL5A1 » образцах ДНК при исследовании полиморфизма G4864C (Bsc41) в экзоне 58.

Î42 п.н 126 п.н

М - маркер молекулярного веса - ДНК фаш X, обработанная эндонуклеа-зой Ра 11. 1, 2 - фрагменты ДНК пациентов до обработки эндонуклеазой рестрикции Взс41 (длина 142 п.н,). После обработки фра] мента кДНК эндонуклеазой рестрикции Взс41 возможно образование фрагментов длиной 126+16 п.н.{С-аллель) или сохранение фрагмента 142 п.н. (О-аллель). У пациентов Р2, Р4, Р6, Р9 выявлено гетерозиготное состояние гена СОЬ5А1 по полиморфному маркеру 04К64С.

4« ;у

t. , v 4 -

. . . ;■ - и Я-

M 1 2 PI К ?3 P4 PS P6 P7 P8 P9 P10

Таблица 3.

Клинические характеристики пациентов, у которых была выявлена

гаплонедостаточность гена COL5A1.

№ семьи Пациент, пол и возраст (лет) Гиперрастяжимость кожи Бархатистость кожи Атрофичные рубцы Подкожные Гипермобильность суставов (баллы по шкале Бейгтона) Другие симптомы

9 Р9 Ж/16 +/- - - - 6 Вывих локтевого сустава, нефроптоз, пролапсы сердечных клапанов, сколиоз, воронкообразная деформация грудины (оперированная), кровоточивость, косоглазие, миопия

11 РП Ж/37 + - + - 9 Кровоточивость, кифосколиоз, плоскостопие, воронкообразная деформация грудины, пролапс митрального клапана, варикозное расширение вен, артралгии, недостаточность шейки матки, подкожные узелки, эпикант

12 Р12 М/16 + + + + 7 Артралгии, нефроптоз, сколиоз, плоскостопие, воронкообразная деформация грудины, пролапс митрального клапана, мышечная гипотония, повышенная утомляемость

12 1 Ж/45 + + + + 9 Вывихи голеностопных и плюсневых суставов, плоскостопие, остеохондроз, артрозы

21 Р21 Ж/38 + + + - 9 Вывихи коленных суставов, артралгии, сколиоз, плоско-вальгусная деформация стоп, варикозное расширение вен, пролапсы сердечных клапанов, нефроптоз, сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит

Среди пациентов с выявленной гаплонедостаточностью больные

Pli, Р12, Р12.1 и Р21 имели клинический диагноз «тяжелый вариант (I) КТ СЭД. Эти случаи были семейные, с аутосомно-доминантным типом наследования. У пациентки Р9 был определен смешанный фенотип СЭД,

в симптоматике заболевания преобладали сердечная патология, скелетные изменения и глазная патология при умеренно выраженных изменениях кожи и суставов. В данном случае семейный анамнез не выявил родственников со сходными клиническими проявлениями (при осмотре матери специфической для СЭД патологии не выявлено, обследование других родственников провести было невозможно).

При сравнении частоты встречаемости различных признаков среди всех больных и больных с тяжелым вариантом КТ СЭД можно отметить, что при тяжелом варианте КТ СЭД у всех пациентов присутствовали гиперрастяжимость кожи, множественные атрофичные рубцы и гипермобильность суставов, причем в 10 из 11 случаев она составляла 9 баллов по шкале Бейгтона. Подкожные псевдоопухоли и выраженная хрупкость кожи отмечались не у всех пациентов с тяжелым КТ СЭД, но при этом встречались только у пациентов с этим диагнозом среди всей группы больных. У 10 из 11 больных с тяжелым КТ СЭД отмечалась бархатистость (необычная мягкость) кожи, а также склонность к легкому возникновению экхимозов (таблица 4).

Таблица 4.

Сравнение частот встречаемости различных жалоб и признаков в группе всех больных и в группе пациентов с тяжелым вариантом КТ СЭД.

Исследуемый признак Частота встречаемости признака (число случаев/% от IV)

Больные N=86 Больные с тяжелым вариантом КТСЭД N=11

Гиперрастяжимость кожи 12(14,1%) 11(100%)

Умеренно повышенная растяжимость кожи 37(43,5%) -

Множественные атрофичные рубцы 26(30,6%) 11(100%)

Единичные атрофичные рубцы 4(4,7%) -

Длительное заживление ран 23(27,1%) 5(45,5%)

Бархатистость кожи 21(24,7%) 10(90,9%)

Подкожные узелки 13(15,3%) 6(54,5%)

Подкожные псевдоопухоли 6(7,1%) 6(54,5%)

Тонкая, прозрачная кожа 14(16,5%) 7(63,6%)

Выраженная хрупкость кожи (рвущаяся кожа) 2(2,4%) 2(18,2%)

Гипермобильность суставов (6 баллов и более) 40(47,1%) 11(100%)

Вывихи, подвывихи 25(29,4%) 6(54,5%)

Хронические артрапгии 33(38,8%) 8(72,7%)

Грыжи 20(23,5%) -

Опущение внутренних органов 27(31,8%) 2(18,2%)

Пролапс митрального клапана 55(64,7%) 7(63,6%)

Пролапсы других клапанов сердца 3(3,5%) 1(9,1%)

Другая сердечно-сосудистая патология 32(37,6%) 2(18,2%)

Кровотечения носовые/десенные 35(41,2%) 2(18,2%)

Легкое возникновение экхимозов 49(57,6%) 10(90,9%)

Миопия 26(30,6%) 2(18,2%)

Особое внимание следует обратить на тот факт, что среди всех обследованных нами пробандов было 7 пациентов с тяжелым вариантом KT СЭД. При этом 1 пациент при исследовании гена COL5A1 не имел информативных маркеров в образце ДНК, а среди 6 остальных гаплонедостаточ-ность гена COL5A1 была нами обнаружена у 3-х больных. Небольшое количество анализируемых случаев тяжелого варианта KT СЭД не позволяют делать статистически достоверных выводов, однако выявление гаплонедо-статочности в гене COL5A1 у 3 среди 6 информативных пациентов соответствует данным зарубежных исследований о максимальной частоте ее выявления при KT СЭД, оцениваемой в 50% [Schwarze U., 2000]. Мы полагаем, что эти данные оправдывают наше мнение о целесообразности клинического разделения тяжелого и умеренного вариантов KT СЭД, сущест-

вовавшего ранее, в предпоследней из классификаций СЭД. Это мнение разделяют и другие исследователи [Byers Р., 2003].

В то же время у большинства пациентов с клиническим диагнозом «СЭД» отмечаются признаки умеренного варианта KT СЭД, который наиболее сложен для дифференциальной диагностики. Вероятно, «умеренный вариант KT СЭД» представляет собой гетерогенную группу заболеваний. Это подтверждает тот факт, что уже на сегодняшний день при исследованиях в группах пациентов с клиническим диагнозом «KT СЭД» на основании выявленных молекулярно-генетических изменений и тщательного анализа соответствующего им фенотипа выделены две отдельных формы -классический тип СЭД с тяжелым поражением сердечных клапанов (мутации в генах COLI AI и COL1A2) [Schwarze U., 2004] и синдром, напоминающий классический тип СЭД, связанный с дефицитом тенасцина X (мутации в гене TNXB) [Schalkwijk, J., 2001].

Особо следует отметить, что в отечественной практике существует клиническая гипердиагностика СЭД. В нашем исследовании среди 56 про-бандов, направленных с предварительным диагнозом «СЭД», у 30 из них не было симптомов, патогномоничных для какого-либо из типов СЭД. В большинстве таких случаев присутствовали признаки ДСТ, которые действительно могут встречаться при СЭД, но являются только дополнительными диагностическими критериями (например, сколиоз, плоскостопие, пролапс митрального клапана, миопия).

Таким образом, небольшой процент выявления гаплонедостаточности гена COL5A1 в нашей выборке больных с KT СЭД мы объясняем, прежде всего, неоднократно продемонстрированной ранее гетерогенностью заболевания и клинической гипердиагностикой KT СЭД в группе пациентов с умеренным типом KT СЭД.

выводы

1. Предложенная схема клинического обследования пациентов с подозрением на СЭД с использованием специальной карты и компьютерной базы данных позволяет стандартизировать клиническое обследование, провести дифференциальную диагностику между типами СЭД и избежать гипердиагностики.

2. Поиск точковых мутаций в гене COL5A2 при классическом типе СЭД является малоинформативным методом.

3. Разработана система регистрации потери гетерозиготности (га-плонедостаточности) в гене COL5A1 как метод молекулярно-генетической диагностики КТ СЭД. При использовании трех внутриэкзонных полиморфизмов (Cl 120Т, G4864C и Т5982С) общая информативность системы составила 84%. Потеря гетерозиготности была выявлена у 5 пациентов из 4 семей.

4. Наибольшая информативность метода выявления потери гетерозиготности в гене COL5A1 наблюдается в группе больных с тяжелым вариантом КТ СЭД (в 3 из 6 информативных случаев), характеризующимся выраженной гипермобильностью суставов, гиперрастяжимостью кожи, наличием тонной, бархатистой кожи, множественных атрофичных рубцов и подкожных псевдоопухолей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1 Блинникова О Е , Курникова М.А, Мутовин Г Р «Современные представления о синдроме Элерса-Данлоса Значение молекулярно-генетических исследований (обзор литературы)»//Альманах «Исцеление», вып 5, «Тривола»,- Москва. -2001,- С 154-156

2. Курникова М.А , Семячкина А Н., Тверская С.М, Поляков А.В., Блинникова О.Е., Мутовин Г.Р. «Клиническое и молекулярно-генетическое исследование классического типа синдрома Элерса-Данлоса»// Тез.докл.1 Всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» - Москва -2002.- С.126-127

3. Курникова М.А., Блинникова О.Е., Мутовин Г.Р., Семячкина А.Н, Тверская С.М , Поляков А.В. «Современные представления о синдроме Элерса-Данлоса»// Медицинская генетика. -2004 -Т 3, №1. - С.10-17.

4 Курникова М.А., Блинникова О.Е, Мутовин Г.Р, Семячкина А Н , Терехов С.М , Тверская С.М, Поляков А В. «Гаплонедостаточность гена COL5A1 у пациентов с классическим типом синдрома Элерса-Данлоса»// Медицинская генетика. - 2006.-№5(47). - С 2531.

5 Курникова М.А., Семячкина А.Н, Тверская С.М., Поляков А В, Мутовин Г.Р. «Выявление гаплонедосгаточности гена COL5A1 среди пациентов с классическим типом синдрома Элерса-Данлоса»// V Всероссийский конгресс «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» сборник материалов конгресса - Москва.-2006 - С 59-60

6 Курникова М.А., Тверская С.М, Поляков А В «Деградация мРНК, содержащей преждевременные стоп-кодоньг механизм, биологическая значимость и медико-генетические аспекты»// Медицинская генетика -2006 -Т.5, прил 1 - С.44-53

7 Kournikova М., Blmnikova О, Semyachkina A., Mutovin G, Tverskaya S , Polyakov A "Clinical and molecular genetic investigation of the classic type of Ehlers-Danlos syndrome in Russia"// Europ J of Hum Genet. - Vol 10, suppl 1,- Abst. Annual meeting of the European Society of Hum Genet-Strasbourg -2002 -P.126

8 Kournikova M., Blmnikova О, Mutovin G , Semyachkina A, Tverskaya S , Polyakov A "COL5A1 haplomsuffictency in a patient with the classical form of Ehlers-Danlos syndrome"// Europ J of Hum Genet - Vol 11, suppl 1 - Abst Annual meeting of the European Society of Hum Genet -Birmmgham.-2003.-P.97

9. Kournikova M., Blituukova О , Semyachkina A, Mutovin G., Tverskaya S , Polyakov A. "COL5AI haplomsufficiency in Russian patients with classic Ehlers-Danlos syndrome'7/Europ J ofHum Genet -Voll4, suppl l.-Abst Annual meeting of the European Society of Hum Genet-Amsterdam-2006-P 248

Принято к исполнению 22/02/2007 Исполнено 22/02/2007 Усл.п.л. -1,5 Заказ № 137 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36

(495) 975-78-56

www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Курникова, Мария Андреевна

Список сокращений

Глава Обзор литературы

1 История изучения СЭД

1 Классификация СЭД

1 Этиология и патогенез СЭД

1 1 Типы коллагенов и их структура I 2 Строение генов фибриллярных

1 Типы СЭД

1 1 Классический тип I 2 Гипермобильный тип

1 3 Васкулярныи тип

1 4 Кифосколиотический тип

14 Артрохалазия

1 6 Дерматоспараксис

1 Клиническая характеристика классического типа СЭД

1 Этиология и патогенез классического типа СЭД

1 б Роль коллагена V типа

1 2 Гены кодирующие коллаген V типа и мутации в н

162 reHCOLSAl

16 2 Ген COL5A

162 Ген COL5A

1 3 Другие белки соединительной ткани вовлеченные патогенез при классическом типе СЭД

1 Деградация мРНК содержащей преждевременные стоп кодоны механизм биологическое значение и роль в патогенезе классического типа СЭД

Глава Материалы и методы исследования

2 Клиническое исследование

2 Моле куля рно-генетическое исследование

Глава Результаты и обсуждение

3 ! Анализ данных клинического обследования

3 Поиск мутаций в гене СOL5A

3 Разработка системы выявления «нулевых аллелейи в гене C0L5A! 3 1 Анализ внутриэкзонных полиморфизмов в образцах ДНК

3 2 Анализ информативных внутриэкзонных полиморфизмов в образцах кДНК

3 Гено-фенотипические корреляции у пациентов с выявленными «нулевыми аллелями» в гене C0L5A

3 Влияние механизма деградации мРНК содержащей преждевременные стоп-кодонь: (NMD), на гено-фенотипические корреляции

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клиническое и молекулярно-генетическое исследование классического типа синдрома Элерса-Данлоса"

Глпм I О&юр autepfttj-pu

1.1.История изучения СЭД.9

1.2 . Класс ифинация С'ЭД .9

13,Этнологи* и патогенез СЭД.12

IJ.I Типы коллагенов и их структура.13

IJ2. Строение генов фибриллярных коллагенов.21 .4,Типы СЭД

1,4.1 Классический тип.

30 t.4,5. Артрохалмия. .— 32 .32

1.5.Клиническая характеристика классического типа СЭД.33

Гб.Этмыюпм и патогенез классического типа СЭД

1.6.1. Роль коллагена V типа.„.34

1.6.2. Гели, кодирующие коллаген Vтипа, и ыутицин в них

1-6,21. Геи COL5Al.„---------------------------„------Jfr.

1.6.2.2. Геи CQL3A2.43

1.6.23. Ген COL5 A3.«

1.6-3. Другие белки соединительной тжанн, вовлеченные п патогенез при классическом типе СЭД-.™.„.45

1.7.Деградация мРНК, содержащей преждевременные стонкодоны: механик«, биологическое значение и роль в патогене« я сад.—---------—.„46

Глава 2, Материалы H M СТОЛЫ ИССЛеДОМИНЯ

2,1 Клиническое исследование.«.51

2.2-Молскудярно-ренстнчсекос исследование.52

Глава ]. Результаты и обсуждение

3.1 Лналш данных клинического обследования.—59

J.2- Поиск мутаций в гене COL5A2.71

3.3. Разработка системы пин иле кик «пул спич оллелейп п гене COL5AI

3 3,1 Лиашп юнутридскжпых полиморфизмов в образцах

-------------------------------^.,„73

3.3.2- Аналю информативных вмуфижммиых поличюрфтчов ■ образцах кДНК.—76

3.4. Гено-фсмотнпические корреляции у пациентов с выявленными «нулевыми аллелями.» в гене COLS Al.,80

3.5. Влияние ыеханияада деградации мРНК.содержащей преждевременные стоп-кодоны (NMD), на гено-фенотнпнчсскис корреляции.87

Заключение. „„.„.„„.„., .

Выводы.„.94

Практические рекомендация.95

Синеок лзггературы.96

Приложение.113

СПИСОК СОКРАЩЕННА

СЭД - сИКЛрОМ Элерса-Данлосд

KT СЭД - класагчсскнй тип СЭД

ВТ СЭД - васкуаярмый тип СЭД

КС СЭД - кмфосколмотнческий тип СЭД

ДСТ - дисллизш сосднннтельной тайн

НДСТ - недифференцированная ДСТ

ПСК - преждевременный ткннцм

СС - сайт сплайсинга

ДНК - дезокеярибонуклеиноваи кислота кДНК - комплементарна* ДНК

РНК - метричмм рибонуклеиновая кислота

АЛ - акрндпкид

БнсЛА - мстилея-бнсаяриламнл

ПААГ - подиаириламмдный гель

ПДРФ - полиморфны длин рестрнкииоиних фра)ментов ГЩР - яолнчерадна* »«иная редкий* ЭДТА - этиленлипминтетрауксусиая кислота

SSCP - Single Strand Conformation Pohmocptüsm, полиморфизм конфориацин одноннтевих фрагментов TBE - трис-бо ратный буфер &8ыМ тртге-борат ИЧ.чМ борная кислота ЗыМЭДТА

NMD - «нонсеис-впосредоианиан деградация мРНК». «nonccncc-nwdialed mRNA decay»

ВВЕДЕНИЕ

Аь-гУалмиХТ1. исследования Синдром Элсрса - Да и,юс а (СЭД) представляет собой гетерогенную группу наследственных соедини мльно-ткоиних мйюлеваннГ«, объединенных на 0С1ЮК общих клинических признаков - гнпермобильности суставов, повышенной растяжимости кожи, нарушений развития скелета, сердечнососудистых изменений и другой симптоматики, обусловленной диенлазией соещшлшВ ткани Данные о частоте встречаемости СЭД значительно варьируют - от 1:560000 до 1:5000 |!4]- Наряду' с относительно благоприятными формами существуют тяжелые формы болезни. приводящие к ранней инщаяиди яцим и даже гибели больных.

В настоящее время выделено 6 типов СЭД, обусловленных различными генетическими причинами. Клиническое и генетическое разфаннченне типов СЭД и их дифференциальная диагностика с другими наследственными соединительно-тканными заболеваниями является не только интересной ti иэжной научной проблемой, но. » первую очередь, край»« нпаюВ с практической точки зрения, так как дм различных типов СЭД характерно различное течение заболевания, что влияет на прогноз здоровья пациента и его родственников.

Среди все* типов СЭД одним КЗ наиболее часто встречающихся является классический тип (KT) Его популядионная частота оценивается примерно 1:10000- 1:40000 [261

KT СЭД объединяет два типа, которые шделмнсь в предыдущей. Берлинской классификации 19Й6 гола - I (gravis, тяжелый) и [I (mît is, умеренный). При одинаковых критериях диагностики для обоих i и пои учинмма тяжесть клинических проявлений, В щшкйм было установлено, что мутации в одних н тех же генах - генах al- н а2- цепей коллагена V типа - приводят к фенотипнческим проявлениям как 1, так н It I типов СЭД [2* |. Ни том основании при пересмотре классификации СЭД в 1997 году mi гнпы обюнншм в (шн, клпсснческий. тип [16],

В клинической практике постановка диагноза КТ СЭД нередко иьпывиет определенные трудности, особенно в случаях умеренного проявления признаков заболевания. что связано с клиническим полиморфизмом и общностью симптомов между КТ СЭД и другими нозологическими формами соединительно-тканных лис плозий [1]. Во ыношх исследованиях было цршкманстриромпо отсутствие морфологически* и биохимических uipccpoi, гапогномоиичных для КТ СЭД 118,93),

В связи с этим весьма актуальным представляется молехудярно-геиетнчеекое научение этнологии данного заболевания. За последние годи п мире достигнут значительный прогресс и области иэучеиия этнологии и патогенен КТ СЭД позволяющий на сегодняшний день установить причину, по резным данным, в 30-50% случаев заболевания [71,72,118]. В подавляющем большинстве случаев это мутации в генах коллагена V типа.

При подозрении на СЭД чрывычаЯио важна стандартизация данных мимического обследования, ta* хак она помогает максимально подробно н обьективио оценить клнинческую картину заболевания Разработка системы регистрации данных клинического н инструментального обследования больных с подозрением па СЭД с учетом основных и дополнительных критериев диагностики каждого типа СЭД может окпать помощь врачам в постановке клинического диагноза и проведении дифференциальной диагностики между типами СЭД.

В nauteft стране ранее не проводилось комплексное клиническое и мол е куля р i ю- re нети чес кос исследование ни одного иэ типов СЭД включая КТ. Поэтому разработка метода чолскулярно-генстнчсской диагностики КТ СЭД 1|<пяолнт проанализировать геио-фсиотипическне корреляции и использовать данный вид диагностики для подтверждения клинического диагноза, j

Псль исследования : рюработка системы регистрации мутаинй в генах коллаген) V типа (COL5A1 и COL5A2) и выявление геио-феиотипичееких корреляций о группе пациентов с КТ СЭД.

Задач» исследования: Разработать стандартную схему клинического обследования и систему регистрации результатов обследования с формированием компьютерной баги данник дм больных с подареинсы на СЭД.

2. Провести ли длит клинических нризидкоп среди пациентов с подозрением на СЭД il установить клинический диагноз

3. Сформировать выборку пациентов дгш проведения модекул*рио-генетическою амалюа (исследования Генов COL5A1 и COL5A2).

Разработать систему регистрации «нулевых аллелей» и провести исследование гена COL5A1, а также провести ыолеяулярно-гсиетнческое исследование всей кодирующей последовательности и областей чтои-jriitptncnu4 соединений гена COLSA2 в выборке бсиппых с КТ СЭД

5. Провести анализ ГСио-феноткличееккх корреляций у больных с КТ СЭД

6. Разработать практические рекомендации для проведении молехулярно-генетического исследования при КТ СЭД

HPTfM^^i^i^uffi^t^iflooa'niMflynf гав>та

Схема клинического обследования пациента с полозреинем на СЭД составленная с учетом критерии международной шонфиош СЭД, позволяет стандартизировать клиническое обследование и проводить дифференциальную диагностику различных типов СЭД Разработанная система регистрации полученных данных может исполыомпмя как на бумажных носителях, так и виде компьютерной базы, позволяющей проводить статистический анализ результатов.

Впервые в России проведено мвлскулярно-геиетичеекое исследование КТ СЭД Разработана система регистрации «нулевых аллелей» в гене COL5AI и система поиска мупший в гене СОЬ5А2 Показано, что поиск «нулевых аллелей» п гене СОЬ5АI является эффективным способом мояекулярно-генетнческой дногностнкз! заболевания ереди пациентов с тяжелым вариантом КТ СЭД

1. Схема обследования пациентов с подозрением на СЭД, разработанная с учетом «полных н дополнительных критериев различных типол СЭД в соответствии с международной классификацией. позволяет стандартизировать клиническое обследование, провести дифференциальную диагностику между различными тинами и избежать гипердиагностики СЭД.

2. При постановке клинического диагноза «КТ СЭД» следует выделять тяжелый вариант заболевания, характеризующийся генерализованной гнпермобнльностью суставов, генерализованной гнперрастяжнмостью кожи, множественными атрофичнымн рубцами и подкожными пеевяооиуходямм

3. Система регистрации «нулевых, аллелей» к гене СО[,5А1 с испмтнннен полиморфных маркероп имяетея эффективным способом поиска мутаций в гене СОЬ5А1 при тяжелом варианте КТ СЭД

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Курникова, Мария Андреевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синдром Элерса-Данлоса является одним из часто встречаемых заболевании в практике врача-генетика

Особенностью данного синдрома является то. что он объединяет гетерогенную группу наследственных соеднннтелыю-ткаииых заболеваний на основе некоторых общих клинических проявлений, прежде всего, со стороны кожи и сустаиж

В настоящее время выделяют 6 типов СЭД (классический, типермобндьныи. васкулярный. кнфосхолнотнческий, зртрохалдзию и дерматоспаракик), имеющих различную элюлопцо. тип ^следования и клиническую симптоматику,

Разграничение типов СЭД при клиническом исследовании является важно!) диагностической задачей, так как определение типа этого синдрома существенно влияет на прогноз течения заболевания и тактику ведения пациент с учетом возможных осложнений.

Сложность клинической дивлюстнки СЭД заключается в отсутствии количественных критериев при оценке отдельных признаков, а также в перекрывании симптомов как разных типов СЭД между собой, так и типом СЭД с другими наследственными соелннительно-ткаинммн заболеваниями (несовершенным остеогенеюм. синдромом Марфшга и др.), Кроме этого, существует большое количество недифференцированных форм соединительно-тканных дисплазий, проявления которых могут напоминать СЭД, и именно эти форм« нередко расценивают как СЭД что является основной причиной гипердиагностики D связи с вышесказанным актуальность задачи по разработке алгоритмическою подхода к клиншнхкой диагностике СЭД не вызывает сомнений,

В России молскулирно-генсткчсекос исследование ни одного из типов СЭД ранее не проводилось. Одной из причин этого является то. что гены коллагенов, мутации в которых ониеаны при ОД являются сложными по еаоей структуре для «(»лекулярио-генетическогта ¡толки

В данной работе всего клинически било обследовано IÚÉS человек, ш них s6 пробандов с ранее установленным ilih направляющим диагнозом «Синдром Элерев-Двндоса» н 52 члена их семей.

Диагноз чклвсснчесхнй тип СЭД» (КТ СЭД) был впервые поставлен или подтвержден у 24 бальных нт 17 семей, причем в 11 случаях отмечалась тяжелая форма синдрома, a a 13 - умеренная,

У одной пациентки был поставлен диагноз кифосколнотнпеского nina СЭЛ

У 47 ими te »itoti отмечались признаки НДСТ ратной степени выраженности

В отдельную группу вошли дети до 5 лет с признаками ДСГ (4 случа*}. возраст которых не превышал 5 лет.

Смешанные фенотипы различных типов СЭД и НДСТ были отмечены в 10 случаях.

Следует отмстить, что в нашем исследовании среди 56 пробандов, направленных с предварительным диагнозом "СЭД», у 30 пробандов не было симптоме*, иатогиемоиичных им для одного из типов СЭД, что свидетельствует о часто встречающейся клинической гипердиагностике данного заболевания.

Для проведешм молекулярно-генетичеекого исследования была сформирована выборка пациентов, и которую вошли (9 пробандов и 12 родственников различной степени родства из 29 семей. В выборку вошли 9 больных с тяжелым вариантом КТ СЭД 10 больных с умеренным вариантом КТ СЭД 7 пациентов со смешанными фенотипами СЭД и 5 пациентов с недифференцированной дисплазией соединительной ткани разной степени выраженности.

Поиск мутаций в нашей выборке проводился в генах коллагена V типа (COL5AJ и COL5A2) и определялся анализом литературных данных, так как примерно в 50% случаев у пациентов с КТ СЭД выявлены мутации именно в этих генах.

Дня поиска точковдх мутаииА я гене С015А2 бил выбран метод 5!»СР -анализа, В группу пациентов, у которых было проведено исследование гена СОЬ5А2, вошло 10 больных (в пациентов с КГ СЭД и 2 пациента со смешанным фенотипом СЭД), н ни в одном случае изменений шктрофоретнчеошй подвижности обнаружено ж было. Учитывая данные других исследований и наши собственные данные, этот метод был расценен нами как малониформатнвный, и дальнейшее исследование гена С01.5А2 в нашей работе не проводилось.

Для исследования гена СОЬ5А1 была разработана система поиска потерн гетерозиготности («нулевых аллелей», гаплонедоетаточности) как наиболее эффективная система поиска возможных мутаций а данном гене в связи с большинством опнсаиных мутаций, приводя шнх к преждевременному стоп-колоиу, и деградацией мутантного транскрипта посредством механизма NN10.

Первый этап молекулярно-генетическою исследована гена С01.5А1 заключался в анализе одионукдеотилных полиморфизмов в образцах ДНК пациентов с целью определения генотипа каждого пациента. Дня системы выявления «нулевых аллелей* били выбраны 3 полиморфизма, которые оказались наиболее информативными - С1120Т (зюон 5). С4864С (экэон 58) и Т5ЗД2С(даоиб6).

При анализе образцов ДНК 26 из 31 пациента (84%) были информативны по одному или нескольким полиморфизмам

На втором лапе проводилось исследование информативных маркеров а обратив* кДНК. При исследовании образцов кДНК была обнаружена полна* потеря гетерозиготности у четырех пациентов - Р9. Р11, Р12 и Р 12-2, в также частичная потеря гетерозиготности у Р2|,

Следует особо отметить результаты. 1юлученные у В отличие от остальных пациентов, из трех информативных маркеров - С1120Т, й4864С и Т5982С - потеря гетерозиготноетн в образце кДНК згой больной была обнаружена только для маркера С4864С, расположенного в зкзоне 58. а при исследовании маркеров, расположенных в жюнак 5 и 66, гегеротиютиость о образце кДНК была сохранена- Можно предположить, что изменения структуры ДНК таковы, что при процессннге мРНК теряется участок, содержащий полиморфизм С4864С" в экзоие 58, но не происходит образования преждевременного стоп-кодона, и, следовательно, элиминации трйнскриптов с этой копии гена нехвнт-чом ММО, Возможно, специфика молекулярно-гснетнчсских изменений определяет фенотип данного больного, который отличался от фенотипа тяжелого варианта К Г СЭД. выявленного у других паши»гтов с потерей гетерозиготности в кДНК,

Таким образом, среди 31 больного из 29 семей у 5 была обнаружена гаплонсдостаточность гена СО[-5 АI.

И) 4-х неродственных пациентов с выявленной юплоиедостаточностыо у троих наблюдался тяжелый варнант КГ СЭД Особое внимание следует обратить на тот факт, что среди всех обследованных нами нробондов было 7 пациентов с тяжелым вариантом КТ СЭД. При этом ] папист не имел информативных маркеров в образце ДНК, а среди 6 «стальных наибольшая информативность метола выявления потерн гетеротнготносш в гене С01.5А1 наблюдается в группе болышх с тяжелым вариантом КТ СЭД. характеризующимся выраженной гипермобнльностыо сустмю». множественных атрофичных рубцон и подкожных псевдоопухолсй.

Таким образом, выявление иотрен гетерозиготности в гене С01.5А1 можно проводить »о всех случаях подозрения днапнт КТ СЭД как метода молекулярно-пяктической диагностики лв1гного заболевания- Однако, учитывая полученные нами данные, проведение такой диагностики целесообразно в первую очередь среди пациентов с тяжелым вариантом КТ была нами обнаружена у 3-х больных- Следовательно, кожи. наличием тонной, бархатистой кожи.

СЭД

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Курникова, Мария Андреевна, Москва

1. Блинникова О Е Характеристика и генетический анализ клинического полиморфизма синдрома Элерса-Данлоса» Текст. дис канд мед наук/Блинникова Ольга Евгеньевна - М 1986 -143 с

2. Кадурина Т И Наследственньсе коллагенопатин (клиника, диагностика лечение и диспансеризация) / Т И Кадурина — СПб Невский диалект, 2000 - 271 с

3. Лелис И И Приоритет А Н Черногубова при описании так называемого синдрома Элерса-Данлоса - Вести Дерматологии и венерологии, 1972,№3 - с 57-61

4. Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование атлас-справочник/ Козлова С И и др., под ред ЕК Гинтера- 2-е изд.перераб идоп -М Практика, 1996—416с

5. Нечаева Г И , Викторова И А , Желтухова Е В , Майоров А М Частота встречаемости признаков дисплазии соединительной ткани у подростков (Дисплазия соединительной ткани Матер симпоз ) //Под ред Г И Нечаевой - Омск, Изд-во ОмГМА 2002-С 61-72

6. Румянцева В А Клинико-генетическое исследование гипермобильности суставов при наследственных формах генерализованной патологии соединительной ткаии Текст. дис канд мед наук / Румянцева Виктория Алексеевна - М , 2001 -149 с

7. Семячкина А R Клинический полиморфизм наследственных болезней соединительной ткани у детей Текст. дис канд мед наук / Семячкина Алла Николаевна - М , 1995

8. Яковлев В М Нарушения ритма и проводимости при соединительнотканной дисплазии сердца / В М Яковлев, Р С Карпов, ЮБ Белан -Омск Изд-во«Агенствокурьер»,2001 - 160с

9. Ameye L, Young MF Mice deficient in small leucine-ncVi proteoglycans novel in VIVO models for osteoporosis, osteoarthritis, Ehlers-Danlos syndrome, muscular dystrophy and corneal diseases Glycobiology 2002 Sep,12(9) 107R-I6R

10. Andnkopoulos K, Lm X, Keene DR, Jaenisch R, Ramirez F Targeted mutation m the col5a2 gene reveals a regulatory role for type V collagen during maU-ix assembly Nat Genet 1995 Jan,9(l) 3! 6

11. Barabas AP Ehlers-Danlos syndrome associated with prematurity and premature rupture of foetal membranes, possible increase in incidence Br MedJ, 1966 Sep 17 5515 682-4

12. Barabas AP Heterogeneity of the Ehlers Danlos syndrome description of three clinical types and a hypothesis io explain the basic defcct(s) Br Med J, 1967 Jun 3,2(552) 612-3

13. Beighton P Ehlers-Danlos syndrome Ann Rheum Dis, 1970 May 29(3) 332-3

14. Beighton P, De Paepe A, Sleinmann B, Tsipouras P, Wenstrup RJ Ehlers-Danbs Syndromes Revised Nosology, Villefranche, 1997 Ehlers-Danlos National Foundation (USA) and Ehlers-Danlos Support Group (UK) Am J of Med Genet, 1998, Apr 28, 77 (1), p 31-37

16. Black C, Gathercole L, Bailey A J , Beighton P The Ehlers-Danlos syndrome An analysis of the structure of the collagen fibers of the skin Bnt J Derraat, 19S0, 102, p 85-96

17. Brocke, К S , Neu-Yilik, G, Gehnng, N H, Hentze, M W and Kulozik, A E The human intronless melanocortin 4-receptor gene is NMD insensitive Hum Mol Genet 2002, ll.p331-335

18. Buhler M, Wilkinson M F , Muhlemann О Intranuclear degradation of nonsense codon-containmg mRNA EMBO reports, 2002, 3, no 7 p 645-

19. Burch G H , Gong Y Lm W, Dettman RW Tenascm X deficiency is associated wilh Ehlers Danlos syndrome Nature Genetics 1997, vol i7, September, p 104-108

20. Burrows NP The molecular genetics of the Ehlers-Danlos syndrome Clinical and Experimental Dermatology, 1999, 24, p99-106

21. Burrows NP, Nicholls AC, Yates JR, Gatward G, Sarathachandra P, Richards A, Pope FM The gene encoding collagen alpha-!(V) (COL5A1) IS linked to mixed Ehlers-Danlos syndrome type I/Il J Invest Dermatol 1996Jun,106(6) 1273-6

22. Burrows NP. Nicholls AC, Yates JR, Richards AJ, Pope FM Genetic linkage to the collagen alpha 1 (V) gene (C0L5A1) in two Bntish Ehlers-Danlos syndrome families with variable type I and II phenotypes Clin Exp Dermatol 1997 Jul, 22(4) 174-6

23. Byers PH An exception to the Rile N Engl J Med 2001 Oct 18, 345(16)1203-5

24. Byers PH Killing the messenger new insights into nonsense-mediated mRNA decay J Clin Invest 2002 Jan, 109(1) 3-6 Review

26. Chan С С Dosue, J Diem, M D, Feng, W Mann, M, Rappsilber, J and Dreyfiiss, G eIF4A3 is a novel component of the exon junction complex RNA,2004, 10,p 200-209

27. Chanut-Delalande H, Bonod-Bidaud C, Cogne S, Malbouyres M, Ramirez F, Fichard A, Ruggiero F Development of a fiinctional skin matrix requires deposition of collagen V heterotnmers Mol Cell Biol 2004 Jul, 24(13) 6049-57

28. Chiu, S Y, Lejeune, F , Ranganathan, A С and Maquat, L E The pioneer translation initiation complex is functionally distinct from but stracturally overlaps with the steady-state translation initiation complex Genes Dev, 2004,18, p 745-754

29. Chiu, S Y, Serin, G, Ohara, О and Maquat, L E Characterization of human Smg5/7a A protein with similarities to Caenorhabdiiis elegans SMG5 and SMG7 that functions in the dephosphorylation of Upfl RNA, 2003, 9, p 77-87

30. Cougot, N, Babajko, S and Seraphin, В Cytoplasmic foci are sites of mRNA decay m human cells J Cell Bioi, 2004, 165, p31-40

31. Emanuel, В S, Cannizzara, L A, Seyer, J M Myers, J С Human alpha-1 (III) and alpha-2(V) procollagen genes are located on the long arm of chromosome 2 Proc Nat Acad Sci 82 3385-3389, 1985

32. Francomano CA Key role for a mmor collagen Nat Genet 1995 Jan, 9(1)6-8

33. Frischmeyer P A, Dietz H С Nonsense mediated mRNA decay in health and disease HumMol Genet, 8(10) 1999,p 1893-1900

34. Grahame R, Bird HA, Child A The revised (Bnghton 1998) criteria for the diagnosis of benign joint hypermobility syndrome (BJHS) J Rheumatol 2000 Jul,27(7) 1777 9

35. Green, RE et al Widespread predicted nonsense mediated mRNA decay of alternatively-spliced transcripts of Ьшпап normal and disease genes Bioinformatics,2003, 19, Suppl 1,рП18-1121

36. Greenspan, D S, Byers, M G, Eddy, R L, Cheng, W, Jani-Sait, S, Shows, T В Human collagen gene COL5A1 maps to the q34 2-q34 3 region of chromosome 9, near the locus for nail-patella syndrome Genomics 12 836-837,1992

37. Greenspan DS, Cheng W, Hoffman GG The pro-alpha 1(V) collagen chain Complete pnmary structure, distribution of expression, and companson with the pro-alpha 1(XI) collagen chain J Biol Chem 1991 Dec 25,266(36) 24727-33

38. Grond-Ginsbach C, Weber R, Haas J, Orberk E, Kunz S, Busse 0, Hausser I, Brandt T, Wildemann В Mutations ш the C0L5A1 coding sequence are not common in patients with spontaneous cervical arlery dissections Stroke Sep,30(9) 1887-90, 1999

39. Grond-Ginsbach C, Wigger F, Morcher M von Pein F, Grau A, Hausser I, Brandt T Sequence analysis of the COL5A2 gene in patients with spontaneous cervical artery dissections Neurology 2002 Apr9 58(7) 1103-5

40. Giunta C, Nuytinck L Raghunath M, Hausser I, De Paepe A Sleinmann В Homozygous Gly530Ser substitution in C0L5A1 causes mild classical Ehlers-Danlos syndrome Am J Med Genet 2002 May 15, 109(4) 284-90

41. Giunta C, Randolph A, Al-Gazaii LI, Brunner HG, Kraenzlin ME, Steinmann В Nevo syndrome is allelic to the kyphoscoliotic type of the Ehlers-Danlos syndrome (EDS VIA) Am J Med Genet A 2005 Mar 1,133(2) 158 64 Review

42. Grahame R Joint hypermobility and genetic collagen disorders are they related''Arch Dis Child 1999 Feb, 80(2) 188-91

44. Hausser I, Anton-Lamprecht I Differential uHrastructural aberrations of collagen fibrils in Ehlers Danlos syndrome types I IV as a means of diagnostics and classification Hum Genet 1994 Apr, 93(4) 394-407

45. Holbrook KA, Byers PH Skin is a Window on heritable disorders of connective tissue AmJMedOenet 1989 Sep, 34(1) 105-21 Review

47. Holbrook J A, Neu-Yilik G . Hentze M W , Kulozik AE Nonsense- mediated decay approaches the clinic Nat Genet, 2004, vol 36, no 8, p 801-808

48. Hyland J, Aia-Kokko L, Royce P, Steinmann B, Kivinkko KI, Myllyla R A homozygous stop codon in the lysyi hydroxylase gene in two siblings with Ehlers-Danlos syndrome type VI Nat Genet 1992 Nov, 2(3) 228-31

49. Iborra F J, Jackson D A , Cook P R The case for nuclear translation J Cell Sci, 2004, Nov 15, 117 (Pt24), p 5713-20

50. Inoue, К et al Molecular mechanism for distinct neurological phenotypes conveyed by allelic trancating mutations Nat Genet 2004 36 p 361-

51. Ishigaki, Y, Li, X, Serin, G and Maquat, L E Evidence for a pioneer round of mRNA translation mRNAs subject to nonsense-mediated decay in mammalian cells are bound by CBP80 and CBP20 Cell, 2001, 106, p 607-617

53. Kadlec, J , Izaurralde E and Cusack, S The structural basis for the interaction between nonsense mediated mRNA decay factors UPF2 and UPF3 Nat Struct Mol Biol, 2004, 11 330-337

54. Khajavi M, Inoue К , Lupski J R Nonsense-mediated mRNA decay modulates clinical outcome of genetic disease Europ J of Hum Genet, 2006 p 1-8

55. Kim, Y K, Furic, L, DesGroseiliers, L and Maquat L E Mammalian Staufenl recruits Upfl to specific mRNA 3'UTRs so as to elicit mRNA decay Cell, 2005,120, p 195-208

56. Kobayasi T, Oguchi M , Asboe-Hausen G Derma! changes in Ehlers- Danlos syndrome Cim Genet, 1984, 25, p 477-484

57. Le Hir, H, Gatfield, D, Izaurralde, E and Moore,M J The exon-exon junction complex provides a binding platform for factors involved in mRNA export and nonsense-mediated mRNA decay EMBO J, 2001, 20, p 4987-4997

58. Lejeune, F , Li, X and Maquat, L E Nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells involves decapping, deadenylating, and exonucleolytic activities Mol Cell, 2003, 12, p 675-687

59. Lewis, В P, Green, R E & Brenner, S E Evidence for the widespread coupling of alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100, p 189-192

60. Li, S & Wilkinson, MF Nonsense surveillance in lymphocytes'' Immunity, 1998,8,p 135-141

61. Lindor NM, Bristow J Tenascin-X deficiency in autosomal recessive Ehlers-Danlos syndrome Am J Med Genet Part A 2005 May 15, I35(!) 75-80

62. Loughtm J , Irven С , Hardwick L J , Butcher S , Walsh S, Wordsworth P.SykesB Linkageof the gene that encodes the alpha-1 chain of typeV collagen (C0L5A1) to type II Ehlers-Danlos syndrome (EDS 11) Hum Molec Genet, 1995,4, pl649-!65i

63. Maeda Т, Suzuki Y, Haeno S, Asada M, Hiramatsu R, Tanaka F, Okada M, Suzuki T Ehlers-Danlos syndrome and congenital heart anomalies Iniem Med 1996 Mar, 35(3) 200-2

64. Malfait F, Coucke P, Symoens S, Loeys B, Nuytinck L, De Paepe A The molecular basis of classic Ehlers-Danlos syndrome a comprehensive study of biochemical and molecular findings in 48 unrelated patients Hum Mutat, 2005, 25 28-37

65. Malfait F, De Paepe A Molecular genetics in classic Ehlers-Danlos syndrome Am J Med Genet С Semin Med Genet 2005 Nov 15,139(1) 17-

66. Malfait F, Hakim AJ, De Paepe A, Grahame R The genetic basis of the joint hypermobility syndromes Rheumatology (Oxford) 2006 May, 45(5)502-7 Epub2006Jani7 Review

68. Maquat L E Nonsense-mediated niRNA decay ш mammals Journal of Cell Science, 2005, 118, p 1773-1776

69. Maquat, L E Nonsense-mediated mRNA decay a comparative analysis of different species Curr Genomics, 2004, 5,p 175-190

71. Mendell, J T, Shanfi, N A, Meyers, J L , Martinez-MuriHo, F and Dietz, H С Nonsense surveillance regulates expression of diverse classes of mammalian transcripts and mules genomic noise Nat Genet, 2004, 36, p 1073-1078

72. Mudryj, M , Merry, D E , de Crombrugghe, В , McBnde, О W Human collagen III {C0L3AI) is on chromosome 2q (Abstract) Cytogenet Cell Genet 40 704, 1985

74. Neu-Yihk G, Gehnng. N H , Hentze, M W , Kuiozik, AE Nonsense- mediaied niRNA decay from vacuum cleaner to Swiss army knife Genome Biol 2004 5 p2.8]-2184

76. Nicholls ACValler D, Wallis S, Pope FM Homozygosity for a splice site mutation of the COL1A2 gene yields a поп-functional pro(alpha)2(I) chain and an EDS/OI clinical phenoiype J Med Genet 2001 Feb, 38(2) 132-6

78. Olsen BR New insights into the function of collagens from genetic analysis Cun-Qpin Cell Biol 1995 Oct,7(5) 720-7 Review

79. Pace JM, Corrado M, Missero С Byers PH Identification, characterization and expression analysis of a new fibrillar collagen gene, COL27A1 Matrix Biol 2003 Mar,22(1)3 14

80. Poumeau-Dellile GA, Soulie P Un cas d'hyperlaxite cutanee et articulaire avec cicatrices atrophiques et pseudo-tumeurs molluscoides (syndrome d'Ehlers-Danlos) Bull Soc Med Hopitaux de Pans 1934, 50 593-5

81. Pepm, M, Schwarze, U, Superti-Furga, A, Byers, P H Clinical and genetic features of Ehlers-Danlos syndrome type IV, the vascular type New Eng J Med 342 673-680, 2000

82. Prockop DJ, Kivirikko KI Collagens molecular biology, diseases, and potentials for therapy Annu Rev Biochem, 1995,64 p 403-34

85. Richards AJ, Martin S, NichoUs AC, Harrison JB, Pope FM Burrows NP A single base mutation in COL5A2 causes Ehlers-Danlos syndrome type II JMed Genet 1998 Oct, 35(10)846-8

87. Schievink, W I , Limburg, M Angiographic abnonnalities mimicking fihromuscular dysplasia in a patient with Ehlers-Danlos syndrome, type IV (Letter) Neurosurgery 25 482-483,1989

88. Schwabe, G С et al Distinct mutations in the receptor tyrosine kinase gene R0R2 cause brachydactyly type В Am J Hum Genet, 2000, 67, p 822-

90. Shibuya, T, Tange, T О, Sonenberg, N and Moore, M J eIF4AIll binds spliced mRNA in the exon junction complex and is essential for nonsense-mediated decay Nat Struct Mol Biol,2004, Il,p346-3S1

91. Sokoiov BP et al Exclusion of COLIAI. COL1A2 and C0L3A1 genes as candidate genes for Ehlers-Danlos syndrorne type i in one large family Hum Genet, 1991, 88,pl25-l29

92. Steinmann В, Royce PM, Superti-Furga A The Ehlers-Danlos syndrome. In Royce PM, Stemmann В eds Connective Tissue and its Heritable Disorders Molecular Genetic and Medical Aspects New York Wiley-Liss Inc, 1993 p 351-407

94. Sulica V, Cooper P, Pope M et al Cutaneous histological features in Ehlers-Danlos syndrome Arch Dermatol, 1979, lI5,p40-42

95. Superti-Furga, A, Gugler, E, Gitzelmann, R, Steinmann, В Ehlers- Danlos syndrome type IV a multi-exon deletion ш one of the two C0L3A1 alleles affecting structure, stability, and processing of type III procollagen J Biol Chem 263 6226-6232.1988

96. Takahara K, Hoffman, G G, Greenspan, D S Complete structural organization of the human alpha-l(V) collagen gene (C0L5AI) divergence from the conserved organization of other characterized fibrillar collagen genes Genomics 29 588-597,1995

98. Them, S L Genetic insights into the clinical diversity of beta thalassaemra Br J Haematol, 2004, 124,264-274

99. Trackman PC Diverse biological functions of extracellular collagen processing enzymes JCellBiochem 2005 Dec 1,96(5)927-37

100. Uitto J The Ehlers-Danlos syndrome—phenotypic spectrum and molecular genetics Eur J Dermatol 2005 Sep-Oct, 15(5)311-2

101. Valkkiia M, Melkoniemi M, Kvist L, Kuivamemi H, Tromp G, Ala-Kokko

102. Genomic organization of the human C0L3A1 and COL5A2 genes COL5A2 has evolved differently than the other mmor fibrillar collagen genes Matrix Biol 2001 Sep, 20(5-6) 357-66

103. Viljoen D, Goldblalt J , Thompson D , Bei^ton,P Ehlers Danbs syndrome yet another type''Clin Genet, 1987,32 196-201 I l l

104. Vogel A, Holbrook K, Steinmann M et al Abnormal collagen fibnl structure in the gravis forni (type I) of Ehlers-Danlos syndrome Lab Invest, 1979, 40, p 201-206

105. Wenstrup RJ, Florer JB, Brunskill EW, Bell SM Chervoneva I Birk DE Type V collagen controls the initiation of collagen fibril assembly J Biol Chem 2004 Dec 17,279(51)53331-7

106. Wenstrup RJ, Florer JB Willing MC, Giunta С Steinmann B, Young F, Susie M Cole WG COL5A1 haploinsufficiency is a common molecular mechanism underlying the classical form of EDS Am J Hum Genet 2000 Jun 66(6) 1766-76

107. Wu J, Utani A, Endo H Shinkai H Deficiency of the decorm core protein in the variant fonn of Elilers-Danlos syndrome with chronic skin ulcer J Dermatol Sci 2001 Oct,27(2) 95-103

108. Zweers MC, Bnstow J, Steijlen PM, Dean WB Hamel ВС, Otero M, Kucharekova M, Boezeman JB Schalkwijk J Haploinsufficiency of TNXB IS associated with hypermobility type of Ehlers-Danlos syndrome Am J Hum Genet 2003 Jul 73(1)214 7

109. Zweers МС, Kucharekova М, Schalkwijk J Tenascin-X a candidate gene for benign joint hypermobility syndrome and hypermobility type Ehlers-Danlos syndrome'' Ann Rheum Dis 2005 Mar, 64(3) 504-5 Электронные ресурсы

110. Onhne Mendelian Inheritance m Man (OMIM) http/www neb I nlm nih gov/Omim/

111. Human Gene Mutation Database, Cardiff http //archive uwcm ac uk/uwcm/mg/hgmdO html

112. Сайт Омской государственной медицинской академии http //www omsk-osma ru/

113. Ehlers Danlos National Foundation http //www ednf 01^