Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные и молекулярные механизмы разрушения суставного хряща при остеоартрозе

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные и молекулярные механизмы разрушения суставного хряща при остеоартрозе"

На правах рукописи

ЧЕТИНА Елена Васильевна

КЛЕТОЧНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗРУШЕНИЯ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2011

4840247

Работа выполнена в МакГилльском Университете г. Монреаль, Канада и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте ревматологии РАМН

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Макарова Ольга Васильевна Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН, Москва

доктор биологических наук, член-корреспондент РАМН, профессор Ярыгин Константин Никитич Российский государственный медицинский университет им.

Н.И .Пирогова, Москва

доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Ведущая организация: Первый Московский государственный

медицинский университет имени И.М. Сеченова

Защита состоится «17» мая 2011 г. в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

119991, Москва, Воробьевы горы, д.1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « $ » 02 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета J

кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность проблемы

Остеоартроз (ОА) - это наиболее распространенное заболевание лиц пожилого возраста. Основным проявлением этого заболевания является эрозия суставного хряща, которая развивается вследствие повреждения и резорбции внеклеточного матрикса (ВКМ), окружающего хондроциты. ВКМ состоит преимущественно из коллагена второго типа и протеогликана аггрекана [Poole,2005]. В разрушении ВКМ принимают участие коллагеназы, в частности, коллагеназа 3 (ММР-13) и другие металлопротеиназы матрикса (ММР). Разрушение хряща при ОА сопровождается воспалительным процессом и характеризуется повышением экспрессии цитокинов, таких как интерлейкины (IL)-l a /ß и фактор некроза опухолей (TNF)a, которые, как предполагается, активируют металлопротеиназы [Sandell et al.,2001]. В настоящее время считается, что разрушение хряща при ОА инициируется повышенной активностью цитокинов [Pelletier et al.,2006].

Вместе с тем при ОА в хряще также активируются анаболические процессы, которые могут быть причиной фенотипических изменений хондроцитов. В частности, такие фенотипические изменения могут включать элементы терминальной дифференцировки хондроцитов, характеризующейся повышением экспрессии коллагена 10 типа, признаки ранних фаз дифференцировки хондроцитов, о чем свидетельствует появление в матриксе коллагена 2А типа и де-дифференцировки клеток хрящевой ткани, что сопровождается экспрессией коллагенов 1 и 3 типов [Aigner et al.,2002].

Следует отметить, что изменения в клетках суставного хряща при ОА, в частности, очаги пролиферации хондроцитов с образованием клонов отдельных клеток, а также экспрессия генов коллагена 10 типа, аннексинов, щелочной фосфатазы и белка, родственного паратироидному гормону (РТНгР), кальцификация матрикса и гибель клеток посредством апоптоза, включая ускоренное расщепление коллагена 2 типа посредством ММР-13, также наблюдаются в

гипертрофных хондроцитах ростковой пластинки при эмбриональном развитии [Szuts et al, 1998].

В настоящее время не существует эффективных лекарственных препаратов, способных восстановить хрящевую ткань. Лечение заболевания проводится противовоспалительными и болеутоляющими средствами, которые могут вызвать осложнения [Роо1е,2005].

В связи с этим существует настоятельная необходимость поиска других подходов к лечению ОА, основанных на понимании клеточных и молекулярных механизмов этого заболевания.

Гипотеза: Поскольку в онтогенезе происходит резорбция хряща при замене его костью, мы предположили, что разрушение коллагенового матрикса при остеоартрозе может регулироваться механизмами, сходными с теми, которые ответственны за терминальную дифференцировку хондроцитов и резорбцию внеклеточного матрикса при развитии скелета.

Цель настоящей работы: .

Исследовать роль клеточных и молекулярных механизмов в разрушении коллагенового матрикса суставного хряща при остеоартрозе.

Задачи исследования:

1. Определить маркерные гены, ответственные за процессы пролиферации и гипертрофии хондроцитов ростковой пластинки.

2. Сопоставить уровень активности расщепления коллагена 2 типа и характер экспрессии генов, отвечающих за дифференцировку хондроцитов, при развитии ранних фокальных повреждений хряща, подобных наблюдаемым при остеоартрозе у лиц пожилого возраста.

3. Изучить особенности экспрессии генов при дифференцировке хондроцитов здорового зрелого суставного хряща, при стимуляции расщепления коллагена.

4. Разработать способы подавления разрушения хряща путем подавления расщепление коллагена 2 типа, используя факторы, замедляющие процессы перехода хондроцитов к гипертрофии.

Научная новизна

Обосновано новое понимание механизма развития остеоартроза, дополняющее общепринятое представление о разрушении хряща при развитии заболевания, вследствие повышенной активности коллагеназ, индуцированных цитокинами.

Разрушение хряща при ОА происходит в результате изменений метаболизма суставных хондроцитов, сходных с теми, что наблюдаются при гипертрофии хондроцитов ростковой пластинки при морфогенезе и сопровождаются разрушением ВКМ. Наряду с процессом пролиферации, ранее описанным как клонирование хондроцитов в хряще больных ОА, они переходят в состояние сходное с состоянием фетальных хондроцитов из зоны гипертрофии, а именно экспрессируют коллаген 10 типа, ростовые факторы TGFpl и Indian hedgehog (Ihh), металлопротеиназы, включая коллагеназы. Именно коллагеназы, индуцированные гипертрофными изменениями суставных хондроцитов, разрушают коллаген внеклеточного матрикса, что приводит к деградации хрящевой ткани. На начальном этапе этот процесс может проходить при отсутствии воспаления.

1. В связи с этим впервые показано, что в относительно здоровых хрящах пожилых людей образование ранних ОА-подобных повреждений связано с усилением расщепления коллагена, что сопровождается повышением экспрессии генов гипертрофной фазы дифференцировки хондроцитов ростковой пластинки.

2. Впервые показано, что в случае искусственной стимуляции расщепления коллагена 2 типа в здоровом хряще также происходит усиление экспрессии генов и синтеза белков, свойственных гипертрофной фазе дифференцировки хондроцитов.

3. Впервые показано, что в культурах эксплантатов хрящей больных ОА на поздней стадии заболевания можно подавить расщепление коллагена 2 типа с одновременным ингибированием экспрессии генов, ответственных за гипертрофию фетальных хондроцитов, а также индукторов

воспаления - цитокинов, в присутствии TGFP2 или при низких концентрациях простагландина Е2 (PGE2).

4. Впервые установлено, что в зрелых хондроцитах суставного хряща при ОА процессы расщепления коллагена 2 типа и экспрессия гипертрофного фенотипа взаимообуславливают друг друга и механизм деградации ВКМ в суставном хряще при ОА идентичен процессу разрушения внеклеточного матрикса хондроцитов ростковой пластинки при морфогенезе.

Научно-практическая значимость работы

Поскольку в основе повреждения коллагена 2 типа, а следовательно, разрушения хрящевой ткани при ОА лежат механизмы, сходные с теми, что наблюдаются при гипертрофии хондроцитов, регуляция гипертрофии может быть одним из перспективных направлений в терапии разрушения суставного хряща при ОА.

В частности, повышение уровня TGFP2 и поддержание низких уровней PGE2 в суставной сумке будет способствовать подавлению расщепления коллагена и разрушению хрящевой ткани при ОА.

Предложенная в данной работе новая интерпретация механизма возникновения ОА позволит определить новые фармакологические мишени для лечения заболевания или предотвращения его развития на самой ранней стадии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хондроциты суставного хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым у фетальных хондроцитов ростковой пластинки, и этот процесс лежит в основе резорбции хряща при остеоартрозе.

2. Дифференцировку хондроцитов суставного хряща можно инициировать in vitro агентами, стимулирующими первичное расщепление коллагена коллагеназой.

3. Дифференцировка хондроцитов лежит в основе разрушения хряща при возрастных изменениях, сходных с остеоартрозными, причем начинается она до изменений хряща, регистрируемых гистологически, и проявляется в повышении экспрессии генов,

которые активны в зонах пролиферации и гипертрофии ростковой пластинки,

4. Разрушение матрикса суставного хряща больных остеоартрозом можно остановить действием ростовых факторов, которые способны блокировать дифференцировку хондроцитов ростковой пластинки. Это сопровождается ингибированием маркерных генов дифференцировки хондроцитов и подавлением активности расщепления коллагена коллагеназой.

Конкретное участие автора заключалось в создании дизайна исследования, составлении программы, методики проведения работы, разработке методологии и анализе полученных результатов. Сбор и обработка первичного материала, получение научных результатов, статистическая обработка данных, формулировка научных положений и выводов на основании данных, собранных в Детской больнице Шрайнерсов при МакГилльском Университете г. Монреаль, Канада и Научно-исследовательском институте ревматологии РАМН, включенных в исследование, проводились диссертантом самостоятельно.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на III Российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека» (Санкт-Петербург, 2010); X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); VIII конгрессе Российского Артроскопического Общества (Москва, 2009); на Российском конгрессе ASAMI (Курган, 2009); на Всемирном конгрессе общества по исследованю кости и минерала (American Society for Bone and Mineral Research) (Сиэтл, 2004; Сан Антонио, 2002); Всемирном конгрессе Американского общества ревматологов (American College of Rheumatology) (Новый Орлеан, 2002; Сан Франциско, 2001; Филадельфия, 2000); Всемирном конгрессе общества ортопедов (Orthopaedic Research Society) (San-Francisco, 2001; Даллас, 2002); Всемирном конгрессе по остеоартрозу (OARSI) (Берлин, 2003); Конференции Канадской лиги по исследованию артрита (Canadian Arthritis Network) (Монреаль, 2003); Канадской конференции по соединительной ткани (Canadian Connective Tissue

Conference) (Монреаль, 2003; 1999; Шербрук, 2002; Торонто, 2001; Квебек, 2000; Лондон, 1998).

Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании Ученого совета Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института ревматологии РАМН 16 марта 2010 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 47 печатных работ: 19 журнальных статей (из них 12 статей в зарубежных журналах) и 28 тезисов (в том числе 23 - на зарубежных симпозиумах).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, основных результатов исследования ростковой пластинки, здорового суставного хряща быка и человека и поврежденного суставного хряща больных остеоартрозом, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 55 рисунками и 5 таблицами. Библиография включает 465 публикаций, в том числе 27 отечественных и 438 зарубежных авторов.

Работа выполнена в Детской больнице Шрайнерсов при МакГилльском Университете г. Монреаль, Канада и Научноисследовательском институте ревматологии РАМН, Москва. Сбор материала производился в отделе суставных заболеваний Детской больницы Шрайнерсов при МакГильском Университете (г.Монреаль, Канада) (заведующий - профессор А.Р. Пул (Poole A.R., DSc, PhD) и хирургическом отделении Научно-исследовательского института ревматологии РАМН (директор - академик РАМН, профессор Е.Л.Насонов).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Структура выборки (п=147). В работе проанализированы 18 образцов ткани фетальной ростковой пластинки теленка в возрасте гестации 120-240 дней, а также 16 образцов хряща фалангометакарпальных суставов быков в возрасте 18-24 месяцев, полученных на мясокомбинате г. Монреаль.

Исследовано также 37 аутопсийных образцов хряща здоровых лиц. Среди них было 27 мужчин, средний возраст 57.1 г. (от 26 до 71 г.) и 10 женщин, средний возраст 61.6 г. (от 51 до 69 лет). Пациенты погибли в результате несчастного случая или скончались скоропостижно. Ни один из пациентов не подвергался химиотерапии, не имел сахарного диабета, врожденной дисплазии, или сосудистой недостаточности нижних конечностей, а также заболеваний опорнодвигательного аппарата.

Кроме того, в работе было использовано 76 образцов хрящей коленного сустава больных идиопатичеким остеоартрозом, диагностированным в соответствии с критериями Американской Коллегии по Ревматологии. Хрящ был получен после артропластической операции, проведенной в Общей или Еврейской больницах г. Монреаля (Канада) и хирургическом отделении НИИ ревматологии РАМН (Москва, Россия). Среди пациентов были 28 мужчин, средний возраст 72.9 г. (от 55 до 82 лет) и 48 женщин, средний возраст 75.4 г. (от 50 до 90 лет).

Подготовка эмбриональных тканей теленка. Препараты ростковой пластинки получали, как описано ранее ТсЬейпа е1 а1., [2003].

Подготовка суставного хряща, имеющего фокальные повреждения. Суставной хрящ человека снимали при вскрытии (не более, чем через 12 час после смерти пациента) с дистальной поверхности мыщелка бедренной кости коленного сустава, сочлененного с коленной чашечкой.

При гистологическом исследовании препаратов хряща патологические изменения в них соответствовали 1 по шкале • Манкина или в них выявлялись очень ранние фокальные поражения с показателями 3 или 4 по Манкину.

Рис.1. Схема изъятия материала для исследования ранних повреждений хряща при старении.

Прободения хряща до кости не наблюдалось. Хрящ срезали полностью до субхондральной кости в виде полосок Змм шириной и 20мм длиной каждая, от центральной к латеральной части мыщелка (Рис.1). Хрящевые полоски разрезали поперек на фрагменты 2мм х Змм и анализировали по отдельности гистологически (е и ¿), на активность расщепления коллагена (30-50 мг хряща по сырому весу -с, f и 1) и экспрессию генов (100-200 мг сырого веса хряща оставшихся фрагментов). Все фрагменты хряща оценивали гистологически на степень разрушения, используя систему Манкина, модифицированную для хрящей, отделенных от субхондральной кости, в которой более низкие показатели соответствуют более здоровому хрящу.

Подготовка суставного хряща больных О А. Суставной хрящ дистальной части бедренной кости человека получали после полного удаления коленного сустава для замены его на искусственный. Заболевание ОА было предварительно диагностировано в соответствии с критериями Американской Коллегии по Ревматологии. Подготовку хряща для культивирования проводили в соответствии с методикой е! а1. [2000].

Подготовка суставного хряща взрослого быка. Суставные хрящи фаланго-метакарпальных суставов срезали непосредственно после

получения материала. Подготовку хряща для культивирования проводили в соответствии с методикой Mwale et al. [2000].

Культивирование хрящевых эксплантатов. Среду меняли через 48 ч. (и считали это началом опыта: день 0), а затем - через каждые 4 дня. Смесь ростовых факторов добавляли в конечной концентрации Юнг/мл TGF (трансформирующий ростовой фактор) 02 (R&D Systems), Юнг/мл FGF (ростовой фактор фибробластов)-2 (R&D Systems) и 100нг/мл инсулина (Sigma) в соответствии с ранее проведенными исследованиями фетальных хондроцитов Szuts et al. [1998].

Смесь бром-циановых (CNBr) фрагментов, обогащенный фрагмент коллагена СВ 12, или синтетические пептиды СВ 12 добавляли в среду также при каждой ее смене в концентрации 10 мкМ. В контрольные образцы не добавляли ни фрагментов коллагена, ни его пептидов.

Культивирование суставных хондроцитов в виде осадочных культур. Отмытые фрагменты суставного хряща взрослого быка после переваривания осаждали и культивировали в конических пробирках, как описано Wu et al. [2002].

Фракционирование и культивирование эмбриональных хондроцитов. Бычьи фетальные хондроциты из ростковых пластинок выделяли, фракционировали и культивировали, как описано в работе Alini et al. [1994], используя градиент перкола и получали субпопуляции А (верхняя фракция - хондроциты резервной зоны), В, С, D (нижняя фракция - гипертрофные хондроциты).

Определение активности расщепление коллагена IIтипа коллагеназой с использованием фермент-зависимого иммуносорбентного метода (ELISA). Метод определяет содержание нео-эпитопа, генерируемого коллагеназами на СООН-конце Уа фрагмента при раскручивании тройной спирали коллагена 2 типа этими ферментами и подробно изложен в статье Dahlberg et al. [2000].

Определение минерализации матрикса, используя включение кальция (SC(?*), проводили, как описано ранее Alini et al. [199.4].

Биосинтез коллагена и общий оборот белка. Для оценки биосинтеза коллагена использовали включение 3Н-пролина [Wu et al., 2002]. Общий синтез белка и белок, освобожденный в культуральную среду, определяли в присутствии 358-метионина [Wu et al., 2002].

Определение содержания общего количества коллагена 2 типа или степени его денатурации. Общее содержание коллагена 2 типа измеряли по количеству внутреннего эпитопа, который экспонируется только после раскручивании структуры тройной спирали коллагена, как описано в статье Billinghurst et al. [1997].

Определение содержания свободных протеогликанов. Протеогликаны тестировали колориметрическим методом Famdale et al. [1986].

Определение содержания общего кальция и фосфата. Кальций измеряли методом, описанным Ames, [1966]. Концентрацию Pi определяли, используя метод Baginsky et al. [1973].

Количественное определение секреции простагландина (PG) Е2. Количество PGE2 оценивали, используя набор для конкурентного фермент-зависимого иммуносорбентного определения, в соответствии с инструкциями производителя (Cayman Chemical Company).

Очистка коллагена 2 типа и синтез его производных пептидов. Коллаген 2 типа очищали из бычьего фетального эпифизарного хряща по методу Miller et al. [1971]. Фракции коллагена денатурировали при 56°С ЗОмин. Готовили бром-циановые фрагменты (CNBr) бычьего коллагена 2 типа, а затем отделяли пептид СВ 12 от других СВ-фрагментов посредством высоко эффективной хроматографии в жидкой фазе (HPLC). Идентичность полученных белков СВ 12 подтверждали секвенированием аминотерминальных последовательностей.

В соответствии с опубликованной первичной последовательностью и известными пост- трансляционными модификациями бычьего коллагена 2 типа, 4 перекрывающихся пептида СВ 12 были синтезированы на 0.25 ммол шкале с использованием стандартной 9-фторенилметоксикарбоновой (Fmoc) химии на твердофазном синтезаторе белков модели 431A (Applied Biosystems).

Электрофорез и иммуноблоттинг. Для Вестерн блотов 500мкл культуральной среды хондроцитов осаждали 2 объемами 100%

этанола. Белки разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях по стандартной методике. Иммуногистохимические методы

Подготовка криосрезов хряща. Фрагменты хряща быка или человека в конце культивирования замораживали в ОСТ-реагенте и готовили срезы толщиной 7.5мкм с использованием криостата. Срезы фиксировали 5мин в растворе 4% параформальдегида и обрабатывали, как описано в работе Tchetina et al. [2007).

Выявление локализации коллагенов 10 и 2 типов. Срезы инкубировали 30 мин при комнатной температуре во влажной камере с добавлением по 50мкл на срез разведенного раствора антител. Для визуализации коллагенов 10 и 2 типов использовали моноклональные антитела домена NC1 коллагена 10 типа (асцитная жидкость, разведенная 1/100) или раствор моноклональных антител С2С к неоэпитопу, образуемому при расщеплении коллагена 2 типа коллагеназой как описано в работе Tchetina et al. [2007).

Определение пролиферативной активности. Для оценки пролиферативной активности использовали моноклональные мышиные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) (DakoCytomation) или моноклональные мышиные антитела к кроличьему антигену Ki67, как описано в работе Tchetina et al. [2007).

Выявление апоптозных клеток. Для выявления апоптозных клеток использовали систему TUNEL (Roche Diagnostics) в соответствие с инструкциями производителя.

Ядра окрашивали бромистым этидием. Процент клеток, ядра которых оказались мечеными флуоресцеином (апоптозных) к общему числу клеток, ядра которых были окрашены бромистым этидием, определяли подсчетом числа тех и других клеток в 10 полях зрения (увеличение 200) микроскопа для каждой экспериментальной группы. Каждое поле зрения содержало 200-400 клеток.

Гистологический анализ клеточных культур хондроцитов Клеточные культуры хондроцитов фиксировали 2% глютаральдегидом в 0.1М какодилате натрия, pH 7.2 в течение ночи при 4°С. Ткани дегидратировали в восходящих концентрациях этанола и заключали в смолу Spurr (Polysciences, Inc., Washington, РА USA). Срезы толщиной 1-2мкм окрашивали реагентом Von Kossa или толуидиновым голубым.

Выявление пептида СВ12-2 в суставном хряще человека Экспонирование пептида СВ 12-2 в разрушенном коллагене 2 типа хряща больных ОА оценивали с помощью кроличьей антисыворотки к данному пептиду путем его ковалентного связывания с овальбумином [Wu et al., 2002].

Выделение общей РНК Суммарную РНК выделяли из эксплантатов хрящей больных ОА после их культивирования в течение 6-48 час, используя раствор D по стандартной методике. Дальнейшую очистку РНК проводили, используя набор RNeasy (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Обратная транскрипция (ОТ). В реакции использовали SuperScript TMIIH ОТ и суммарную РНК хряща. Реакцию проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя (Invitrogen).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В работе использовали олигонуклеотидные последовательности праймеров для амплификации 27 генов. ПЦР проводили, используя AmpIiTaq ДНК-полимеразу в соответствии с рекомендациями производителя (Perkin Elmer). Результаты анализировали, используя программное обеспечение NIH 1.60.

Количественный анализ экспрессии генов посредством ПЦР в режиме реального времени. Праймеры и зонды для TaqMan анализа образцов хряща быка и человека изготавливали на заказ (Applied Biosystems). Количественный анализ уровня экспрессии мРНК проводили с использованием системы ПЦР в реальном времени 7500 в соответствии с рекомендациями изготовителя (Applied Biosystems).

Относительную экспрессию мРНК рассчитывали с использованием метода вторичной производной (ddCT) в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosystems).

Статистический анализ. Данные количественных экспериментов представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение. Анализы проводили по меньшей мере в трех повторностях. Для статистической обработки результатов использовали тесты Ман-Уитни и парный тест Стьюдента (t-тест). Значения вероятности менее 0.05 считались достоверными. Достоверно отличающиеся от контроля показатели обозначены на рисунках звездочкой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Координация экспрессии генов и белков в хондроцитах пролиферативной и гипертрофной зон ростковой пластинки

Используя микроаналитический метод, при помощи которого в ОТ-ПЦР анализировали кДНК, 12 последовательных поперечных срезов первичной ростковой пластинки большой берцовой кости плода теленка, представляющих зоны гипертрофии (А-С), созревания (Т)-Р), а также нижнюю и верхнюю зоны пролиферации (О-Ь) (Рис.2).

Резервная зона

Пролиферативн ая зона

Гипертрофная

зона

Рис. 2. Схема строения ростковой пластинки плода быка

На Рис. 3. представлены профили экспрессии генов, полученной в ОТ-ПЦР. Интенсивную экспрессию гена СОЫОА1, маркера гипертрофии, наблюдали в срезе С, что определяет верхнюю границу гипертрофной зоны. По отношению к ОАРБН экспрессия этого гена еще более увеличивалась в срезах В и А. На срезе А СОЫОА1 ко-экспрессировался с остеокальцином, который обычно экспрессируется в наиболее зрелых гипертрофных хондроцитах, а также в остеобластах первичной губчатой кости. Следовательно, зона

Пролиферативная Гнпертрофная Зоны

U J I Н К F Е ole 8 *

Ю1Ш

Циклин В2 I

Остеокаль- I цин

стай

SoiS

С№1

К1ГЙР-13

МИР-5

TGF31

TGFiii *

№ п.-ТОМ» w -* "

шин

»•»И -(JSIlf

ш

- *-5!«? «**-U№bp

1 ! ;; ■;

■т ~

щр 2-т фн» -imp

»f -iStjl «М* -ЗЩ

« »g-iiiibp „,-ЗЯГЬр -1«4Ьр

Пролиферативная Гнпертрофная Зоны

L К 4 I 1.в ..Р..Л ?i С

М СОИОА1

L 8 П il U Е О С И

Срезы Срезы

Рис. 3. Экспрессия генов ростовых факторов в ассоциации с экспрессией генов матрикса в ростковой пластинке плода быка

гипертрофии соответствует срезам А, В и С. Экспрессия остеокальцина, в отсутствие COLlOAl, не связанная с гипертрофией, наблюдалась также на срезе L, вблизи зоны экспрессии циклина В2 на срезе J.

В отличие от COLlOAl экспрессия COL2A1 обнаружена во всех образцах. Между тем, когда в ПЦР использовали серийные разведения кДНК, наблюдали три пика экспрессии COL2A1, а именно в срезах К, D и А. Следует отметить, что пик экспрессии в срезе D соседствовал с пиком экспрессии COLlOAl. Это сопровождалось пиками экспрессии транскрипционного активатора этого коллагена - Sox 9.

Пик экспрессии Cbfal обнаружен только в гипертрофной зоне, где этот транскрипционный фактор коэкспрессировался с Sox 9,

COL2A1, COLlOAl, Ihh и ММР-13. При этом имелся промежуточный пик экспрессии Cbfal, одновременно с ММР-9 на срезе Е по соседству с гипертрофной зоной.

Коллагеназа ММР-13 слабо экспрессировалась в зоне пролиферации и созревания хондроцитов, хотя как и COL2A1 и Sox

9, фермент имел слабый пик экспрессии в верхней пролиферативной области (срез К). Его экспрессия постепенно увеличивалась к зоне гипертрофии, где наблюдалось значительное повышение экспрессии COL2A1, COLlOAl и Cbfal. Кроме того, экспрессия этого фермента на низком уровне наблюдалась во всех зонах ростковой пластинки. Эти результаты также подтверждают сообщения о существовании раннего пика активности расщепления коллагена коллагеназой в пролиферативной зоне в дополнение к значительному увеличению этой активности в гипертрофной зоне [Alvarez et al., 2005].

Напротив, ММР-9 (желатиназа В) экспрессировалась в прегипертрофных и в гипертрофных хондроцитах и не обнаружена в пролиферативной зоне. Как указывалось выше, этот фермент коэкспрессировался с Cbfal.

В ростковой пластинке теленка мы наблюдали несколько пиков экспрессии циклина В2, а именно в срезах J, Н, D и А. Поскольку циклин В2 экспрессируется не только хондроцитами, максимумы его экспрессии, вероятно, указывают на пролиферативные процессы в разных клетках, присутствующих в каждом срезе. К таким клеткам могут относиться, например, эндотелиальные клетки кровеносных сосудов ростковой пластинки. Поскольку врастание кровеносных сосудов происходит из зоны кости, оно может приводить к увеличению экспрессии циклина В2 в срезах А, С и D. Напротив, увеличение экспрессии циклина В2 в пробах J и Н скорее всего обусловлено пролиферацией хондроцитов. Кроме того, увеличение экспрессии циклина В2 в пробах J и Н сопровождалось уменьшением экспрессии COL2A1 и фактора его транскрипции Sox 9 в срезах Н и J. Это может свидетельствовать о сокращении активной сборки коллагена, что благоприятствует клеточному делению.

Известно, что процесс роста и перестройки ростковой зоны регулируется ростовыми факторами [Poole,1991]. Профили экспрессии генов, кодирующих некоторые из этих регуляторных

молекул, также показаны на Рис. 3. Кратковременные пики экспрессии FGF-2, РТНгР и TGFß2 обнаружены в срезе К. Экспрессия FGF-2 и РТНгР постепенно уменьшалась в соседних срезах, тогда как экспрессия TGFß2 снова увеличивалась в срезе G, а также в срезе С гипертрофной зоны. Следующий пик экспрессии этого ростового фактора наблюдали в срезе А, примыкающем к зоне первичной губчатой кости и сайту экспрессии остеокальцина.

В ростковой пластинке быка мы наблюдали понижение экспрессии РТНгР с повышением экспрессии циклина В2 (в верхней пролиферативной зоне), которое также сопровождалось уменьшением экспрессии TGFß2 и FGF-2.

Экспрессию TGFß2 мы наблюдали как в зоне кальцификации, так и в пролиферативной и гипертрофной зонах ростковой пластинки, в виде локальных максимумов в этих зонах. Напротив, пик экспрессии TGFßl мы обнаружили исключительно в гипертрофной зоне (срез С), что согласуется с мнением о том, что этот ростовой фактор является продуктом гипертофных хондроцитов [Homer et al., 1998].

Экспрессия Ihh также ограничивалась гипертрофной зоной (срезы С и В), где также экспрессировался COL 1ОА1.

Таким образом, наши оригинальные исследования экспрессии в серийных срезах ростковой пластинки быка позволили выявить гены, которые специфически экспрессируются либо пролиферативной, либо в гипертрофной зонах.

Признаки дифференцировки и гипертрофии хондроцитов при

формировании ранних повреждений хряща у лиц пожилого

возраста

Поскольку замещение хрящевой ткани на костную в гипертрофной зоне ростковой пластинки в эмбриогенезе происходит также при участии коллагеназ, разрушающих В КМ и продуцируемых хондроцитами, экспрессирующими маркеры гипертрофии, мы предположили, что разрушение коллагенового матрикса при раннем ОА может включать те же клеточные и регуляторные механизмы, которые управляют нормальной терминальной дифференцировкой и резорбцией ВКМ при развитии скелета.

Нами были проанализированы образцы ранних повреждений хряща 37 пациентов. Наиболее типичные результаты исследования ранних повреждений хряща трех пациентов представлены ниже. Ранним повреждением хряща считался участок на дистальной поверхности мыщелка бедренной кости, сочлененной с коленной чашечкой, где наблюдалась повышенная коллагеназная активность по сравнению с окружающей тканью, которая сопровождалась разрушением ткани не ниже 3 по Манкину. Участок здорового хряща (более 2 полосок от повреждения) служил контролем по отношению к месту повреждения.

Образец поврежденного хряща бедренной кости мужчины в возрасте 71 г. (Рис. 4) гистологически не отличался от здорового хряща (степень 1 по Манкину, за исключением полоски 3, локализованной в срединной части, где наблюдались ранние признаки дегенерации (степень 3 по Манкину). Усиленное расщепление коллагена 2 типа посредством коллагеназы наблюдали только в полосках 3 и 4, имеющих наибольшее значение деструкции ткани по Манкину. В области повреждения (полоски 3 и 4) проведенное тестирование выявило экспрессию генов ремоделирования ВКМ, а именно коллагена 2 типа (преимущественно в полоске 4) и аггрекана (полоска 4), а также коллагеназ ММР-13, ММР-1, а также ММР-3 и АОАМТ8-5 (аггреканаза 2) в полоске 4, где сохранялась нормальная гистология хряща, но активность расщепления коллагена коллагеназой была усилена. Пик экспрессии МТ1-ММР обнаружен в полоске 1, т.е. в области, примыкающей к повреждению, где также наблюдалась экспрессия ММР-13, ММР-1 и ММР-3. Катепсин К очень слабо экспрессировался в сайте повреждения и в его непосредственной близости (полоски 2 и 3). Процесс деградации ВКМ и его ремоделирования также сопровождался экспрессией генов-регуляторов дифференцировки хондроцитов. Так, экспрессия генов, ассоциированных с пролиферацией хондроцитов в ростковой пластинке, а именно РТНгР (полоски 1-4) и БОР-2 (преимущественно в полоске 1 и незначительно в полосках 2 и 4) наблюдалась как внутри повреждения, так и вблизи него (полоски 1-4), а также менее выражено - вдали от повреждения (полоски 8 и 9 для РТНгР и полоска 9 для РвР-2), тогда как ММР, коллаген 2 типа и аггрекан

Степень разрушения по Манкину

1 ч а 1 т 1 1 _ 1___I

¡г ир.та

» ни-I т-| «•

,е »

Больной, 71 г.

Л {¿У»

соши Й9 *#

МКМ Ш - 1

№-,ьЯ1 *т

ч. ■ - :

тс.-л щщ т к-.™.,. я " •*

Лг*» '«*

-3>

1«ИШ

РТНг?

ФЗВДЦР ~ -

т' 1:

Циклин В2

як 'М

т№и —

М«МЙЬ 1,«» ■-■ ,

мп-ммр Щ;: ; , : : ' .

г.М к ■-. . .

ир.з к»*-«««», чк'тт*» ■ Ш'

шты

МЖГВД I' л - ш*

«ым ■ «• . ** ■:

Аггрекан *’* •** «■» ^

Ш>[+ • - -

8 г г I > е г а % Полоски

Полоски

Рис. 4. Активность расщепления коллагена и экспрессия генов в области раннего повреждения хряща у мужчины в возрасте 71 г.

обычно экспрессировались в обоих сайтах. Экспрессия ТО¥-2 не обнаружена в полосках 5, б и 7. Ген ММР-9, связанный с терминальной дифференцировкой хондроцитов, незначительно экспрессировался внутри повреждения, хотя его экспрессия была выражена вблизи повреждения (полоска 1). Гены, которые наиболее

активно экспрессировались как в пролиферативной, так и в гипертрофной зонах бычьей ростковой пластинки, а именно ТОР(32 и ММР-13, экспрессировались внутри повреждения и вблизи него (полоски 1 и 2), а также вдали от повреждения (полоски 7,8). Хотя коллаген 10 типа и ТСР|31 экспрессировались только в гипертрофной зоне ростковой пластинки, в процессе образования повреждения гиалинового хряща их экспрессия обнаружена как внутри (полоска 4) и вблизи (полоска 1), так и в более отдаленных от повреждения участках хряща (полоска 9). Напротив, экспрессия 8ох9 наблюдалась в полоске 5 вблизи повреждения и в полоске 8 вдали от него, где также выявлялась экспрессия СОЬ2А1. Экспрессия гена каспазы 3, которая указывает на готовность клеток к апоптозу[А1£щег е! а1.,

2002], наблюдалась только внутри повреждения (полоски 3 и 4). Слабая экспрессия циклина В2 видна в полосках б и 9. Слабая экспрессия цитокинов 1Ь-1(3 и ЮТсс наблюдалась внутри повреждения и вблизи него (полоски 1-4), а экспрессия 1Ь-1р очень слабо была выражена вблизи повреждения в полоске 2.

В зоне наибольшего разрушения коллагена (полоска 3, степень 3 по Манкину) и наиболее высокой коллагеназной активности, мы не наблюдали высокой экспрессии генов, связанных с дифференцировкой хондроцитов по сравнению с полоской 4, расположенной в непосредственной близости от повреждения и имеющей высокую экспрессию генов и коллагеназную активность при низкой (= 1) степени разрушения по Манкину. Поскольку эти образцы хряща имели одинаковую экспрессию конститутивного гена домашнего хозяйства (ОАРОН) и поэтому не отличались по количеству мРНК, полученные данные свидетельствуют о действительных различиях в экспрессии исследованных генов в зоне ранного повреждения хряща данного пациента. При этом следует отметить, что пролиферация и гипертрофия суставных хондроцитов, выявляемая по экспрессии соответствующих генов, вероятно, являются кратковременными процессами, которые предшествуют расщеплению коллагена, который связан с процессом терминальной дифференцировки хондроцитов в гипертрофной зоне ростковой пластинки.

При рассмотрении экспрессии генов во всех полосках исследуемых пациентов, где активность коллагеназы находилась на «фоновом» уровне или была «повышена» по сравнению с фоновой,

оказалось, что более высокая экспрессия генов, связанных с гипертрофией хондроцитов более часто наблюдалась в полосках, где коллагеназная активность повышена (Рис. 5). Например, каспаза экспрессировалась только в полосках с активной коллагеназой. Экспрессия СОЫОА1, ММР-1, АБАМТБ-З,1Ь-1а/р также была выше при повышенной активности коллагеназы. Напротив, экспрессия 8ох9, ТОРр1/2, Т№а и аггрекана была ниже при повышении коллагеназной активности.

90- ---------------------- - --- -

№}

Частота 7В экспрессии ве генов (%) до

ю

50 Ж

ю 0.

Рис. 5. Частоты распределения экспрессии генов во фрагментах суставного хряща из зоны сочленения с коленной чашечкой, разделеных в соответствии с «фоновым» (черные столбики) или «повышенным» (серые столбики) уровнем коллагеназной активности

Следовательно, усиление расщепления коллагена в локусах образования ранних повреждений хряща сопровождается не только усилением экспрессии генов, ответственных за разрушение матрикса, но и генов, связанных с конечной дифференцировкой хондроцитов, подобно той, что наблюдается в гипертрофной зоне ростковой пластинки. Поэтому, вероятно, дифференцировка хондроцитов тесно связана с очень ранним повреждением хряща, которое происходит при ОА.

Способность фрагмента коллагена 2 типа индуцировать расщепление коллагена и гипертрофию суставных хондроцитов в здоровом хряще быка и человека

Если механизмы резорбции ВКМ в ходе дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке лежат в основе последующего разрушения гиалинового хряща, то дифференцировка хондроцитов должна предшествовать разрушению коллагена в нормальном хряще при воздействии агентов, способных стимулировать расщепление коллагена.

Одним из таких агентов является обнаруженный нами пептид, производное коллагена 2 типа - СВ 12-2. Этот фрагмент коллагена 2 типа оказался способным стимулировать экспрессию ММР-13 и опосредованное коллагеназой расщепление коллагена 2 типа [Уавиёа Й а1., 2006].

Количественное определение экспрессии генов посредством ПЦР в режиме реального времени показало, что экспрессия ММР-13 значительно повышалась в присутствии пептида СВ 12-2 на 1-е и 4-е сутки (Рис, 6). Экспрессия коллагена 10 типа также усиливалась, но только на 4-е сутки после добавления СВ 12-2. '

кэ

40

30

го

ю

Относительная 25 экспрессия зя

(.*

. а *■

* А А А

Контроль I Контроль I

СВ12-2 СВ12-2

24ч. 96ч. .

Рис. 6. Влияние пептида СВ12-2 на экспрессию коллагена 10 типа (а) и ММР-13 (б) в эксплантатах хряща. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

1

б г п1

Локализация коллагеназной активности, стимулированной пептидом СВ12-2

Окрашивание неоэпитопа, образующегося при расщеплении коллагена 2 типа (С2С) под действием пептида эксплантатами бычьего хряща, культивируемого в присутствии или без СВ 12-2, анализировали на 4-е и 6-е сутки (Рис. 7).

у

а

Рис. 7. Динамика изменения локализации коллагеназной активности в эксплантатах хряща, культивируемых в присутствии пептида СВ 12-2 на 4-ый (а,б) и 6-ой (в,г) дни. Контроль с преадсорбцией иммунизирующим пептидом (д). Масштабная полоска=150мкм.

Специфическое окрашивание С2С эпитопа в присутствии СВ 12-2 усиливалось на 4-е сутки в начале в средней зоне эксплантатов хрящей быка. На 6-е сутки специфическое окрашивание распространялось на поверхностную зону. В контрольных образцах наблюдаемое окрашивание было значительно меньшим. Никакого окрашивания не наблюдалось в поверхностной и средней зонах в эксплантатах, обработанных СВ 12-2 после преадсорбции С2С антител иммунизирующим пептидом.

Локализация маркеров пролиферации РС1УА и К167 Пролиферацию хондроцитов в эксплантатах бычьего хряща, культивируемого в присутствии СВ 12-2 или без него, выявляли путем окрашивания на маркеры пролиферации РСИА и Кл67 (Рис. 8).

■»

Рис. 8. Динамика изменения локализации маркеров пролиферативной активности Кл67 (а, б, д, е) и РСХА (в, г, ж, з) хондроцитов в эксплантатах хряща, культивируемых в течение 1 -го (а-г) или 4-х (д-з) дней в присутствии (б, е, г, з) или без (а, в, д, ж) пептида СВ 12-2. Масштабная полоска = 150мкм.

На первый день окрашивание в области ядер хондроцитов, расположенных в вертикальных стопках в средней и глубокой зонах, как в случае РСМД, так и Кл67 усиливалась в хрящах, культивируемых с пептидом. Окрашивание изначально не наблюдалось в поверхностной зоне, но присутствовало в средней зоне. Это увеличение было статистически значимым (Табл. 1). На 4-е сутки в присутствии пептида окрашивание пролиферативных антигенов оставалось интенсивным и включало большее число клеток также и в поверхностной зоне (Рис. 8; Табл. 1), хотя увеличение окрашивания в контроле в отсутствии пептида также наблюдалось.

Кроме того, одновременно диффузное окрашивание клеток и матрикса на антиген PCNA наблюдали в поверхностной и средней зонах, что возможно, свидетельствует о нарушении клеточной мембраны.

Вариабельность между контролем и СВ 12-2 показана с правой стороны таблицы, Вариабельность между 1 и 4 сутками (Ki67, PCNA) и 4 и 7 сутками (TUNEL) показаны под каждым сравнением.

Пролиферация хондроцитов в присутствии пептида была в 1.6 раза выше для KÍ67 в обеих точках, и в 1.9 раз больше в 1-е сутки и в 2.6 раза больше на 4-е сутки для PCNA по сравнению с контрольными образцами. Эти изменения происходят в тех же зонах и в том же порядке, как и в случае индукции расщепления коллагена, описанного выше.

Таблица 1.

Процент пролиферирующих клеток, детектируемых посредством окрашивания на антигены KÍ67 или PCNA и апоптозных клеток, детектируемых в реакции TUNEL в эксплантатах нормального бычьего суставного хряща, культивируемого в течение 4 суток в присутствии 10 мкМ СВ 12-2 или без него (контроль)

Краситель Время (сутки) Контроль СВ 12-2

___________культивирования (п=10)_________________(п=10)

KÍ67

PCNA

1 13.4± 3.4 21.0+4.9 0.0011

4 18.3+4.2 29.1+7.3 0.0001

Р=0.006 Р= 0.25

1 9.813.7 25.5+4.5 0.0001

4 15.6±2.4 29.1±5.9 0.0013

Р=0.006 Р=0.035

1 0 0

TUNEL 4 1.8+0.7 3.9+0.5 0.0002

2.1+0.4 Р=0.05

7.8+1.5 0.0001

ÍMX0025

Локализация коллагена 10 типа

Окрашивание коллагена 10 типа наблюдалось только в матриксе эксплантатов, культивируемых в присутствии пептида СВ 12-2 начиная с 4-х суток, когда впервые обнаруживалась экспрессия гена СОЫОА1 (Рис. 9).

Окрашивания не наблюдалось в контрольных образцах, культивируемых в отсутствии пептида. Внеклеточный матрикс средней зоны суставного хряща интенсивно окрашивался на 4-е сутки. Окраска распространялась на поверхностную зону к 6-м суткам, повторяла распределение и совпадала по времени с изменениями расщепления коллагена и распределением пролиферирующих хондроцитов. На специфичность окраски указывает ее ингибирование посредством преадсорбции антител иммунизирующим пептидом.

Рис. 9. Динамика изменения локализации маркера гипертрофии -коллагена 10 типа в эксплантатах хряща, культивируемых 4 (а, б) или 6 (в, г) дней в присутствии (б,г) или без (а, в) пептида СВ 12-2. Отсутствие окрашивания в случае преадсорбции антитела иммунизирующим пептидом (д). Масштабная полоска=150мкм.

Локализация апоптозной активности в эксплантатах суставного хряща

Для выяснения вопроса, индуцирует ли пептид СВ 12-2 фрагментацию ДНК, характерную для апоптоза (который наблюдается в терминальной стадии дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке), эксплантаты суставного хряща быка культивировали в присутствии или в отсутствии СВ 12-2. Образцы анализировали на 1-, 4- и 7-е сутки, используя вышеприведенный протокол оптимизированный для ростковой пластинки. После 1-х суток апоптозные клетки не выявлялись как в присутствии пептида, так и без него (Табл. 1).________________

Рис. 10. Локализация апоптозных клеток в эксплантатах хряща, культивируемых в присутствии (б) или без (а) пептида СВ 12-2 на 7-е сутки. Масштабная полоска=150мкм.

На 4-е сутки аиоптозные клетки наблюдались только в глубокой зоне в обработанных пептидом и контрольных образцах. На 7-е сутки срезы контрольных эксплантатов продолжали содержать апоптозные клетки в глубокой зоне, однако значительное увеличение числа апоптозных клеток наблюдалось также в поверхностной зоне эксплантатов, которые культивировали в присутствии СВ 12-2 (Рис. 10, Табл. 1).

Индукция повышенного расщепления коллагена посредством коллагеназы под действием пептида СВ12-2 сопровождается активацией металлопротеиназ матрикса и дифференцировкой хондроцитов в здоровом хряще человека

В эксплантатах здоровых хрящей взрослого человека мужского пола в возрасте 26 лет также происходило повышение активности расщепления коллагена 2 типа при воздействии пептида СВ 12-2 (Рис. 11),

Активность

расщепления

коллагена

Дни

Контроль

СВ12-И

Рис. 11. Индукция активности расщепления коллагена 2 типа в среде (а) и суммарно в среде и хряще (б) в эксплантатах человека. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

которое сопровождалось увеличением экспрессии металлопротеиназ матрикса ММР-13, -9, -1, МТ1-ММР, маркера гипертрофии -коллагена 10 типа, маркера пролиферации циклина В2, цитокинов ГР-1(3, ТЫ Ра, сопутствующих воспалительному процессу, каспазы 3, свидетельствующей о готовности клеток к апоптозу, и ростовых факторов ТСР(31 и 2, РТНгР, РСР-2, ГЬЬ, активирующихся в хондроцитах, как пролиферативной, так и гипертрофной зонах ростковой пластинки (Рис. 12).

Дни 8 1 4 8 12

СВ12-2 э - + - + - + - +

Рис. 12. Влияние пептида СВ 12-2 на экспрессию генов в эксплантатах хряща человека.

Повышение экспрессии генов сопровождалось повышенным синтезом соответствующих белков. На Рис. 13 представлена

локализация коллагена 10 типа в эксплантате хряща человека в присутствии пептида СВ 12-2.

Контроль СВ 12-2

Рис. 13. Локализация коллагена 10 типа в эксплантатах хряща человека, культивируемых в присутствии пептида СВ 12-2 в течение 8 дней.

В отличие от бычьих тканей дегенеративные процессы в хряще человека начинались в поверхностных участках ткани, где экспрессировались индуцированные пептидом коллаген 10 типа на 8 день культивирования, а на 12 день - апоптозные клетки (Рис. 14).

КОНТРОЛЬ День 1 СВ12-2

Лень 12

■I п

Рис. 14. Формирование апоптозных клеток в эксплантатах хряща человека, культивируемых в присутствии пептида СВ 12-2.

Таким образом, изменения в клетках, подобные тем, что наблюдаются при дифференцировке хондроцитов ростковой пластинки, предваряют расщепление коллагена, индуцированное искусственно. Кроме того, наши данные показывают, что продукты расщепления коллагена 2 типа могут участвовать в индукции гипертрофии, как в морфогенезе, так и при развитии патологии хряща при ОА.

Роль ростовых факторов в подавлении разрушения коллагена и гипертрофии хондроцитов при остеоартрозе

Поскольку ТОБр2, РйР-2 и инсулин, действуя совместно, могут подавлять гипертрофию фетальных хондроцитов (ЗгШз е1 а1., 1998), а по нашим данным, изложенным выше, активное расщепление коллагена и гипертрофия хондроцитов являются ключевыми компонентами развития ОА, мы предположили, что эти ростовые факторы могут подавлять усиленное расщепление коллагена 2 типа при ОА, если это расщепление связано с гипертрофией хондроцитов, как в ростковой пластинке.

Ингибирование коллагеназной активности ростовыми факторами

Ростовые факторы ТСРр2 (Юнг/мл), Б ОБ-2 (Юнг/мл) и инсулин (100нг/мл) по отдельности или в комбинации (ОБ), которую раньше использовали для подавления гипертрофии изолированных хондроцитов ростковой пластинки, были способны ингибировать расщепление коллагена 2 типа коллагеназой в культуре эксплантатов суставного хряща у 49 больных ОА. Детальное исследование пяти больных ОА приведено на рисунке 15.

Как видно из показателей уровня накопления эпитопа С1,2С в контрольных эксплантатах, коллагеназная активность у больных ОА варьировала. Степень ингибирования расщепления коллагена ростовыми факторами также различалась в исследованных образцах. Так, средний показатель ингибирования коллагеназной активности при использовании комбинации ростовых факторов составил 56.5%, а индивидуальные ингибирования результаты варьировали от 45 до 70.3%.

Рис. 15. Ингибирование коллагеназной активности (а) и освобождения в среду общего протеогликана (ОАО) (б) в эксплантатах хряща пяти больных ОА в присутствии ростовых факторов. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Однако изучение вклада каждого ростового фактора по отдельности показало, что только ТОР[32 всегда ингибировал коллагеназную активность, как во всех пяти индивидуальных эксплантатах хрящей (Рис. 15), так и в 19 других эксплантатах (Рис. 16).

34

Активность

расщепления

коллагена

40

30

го

10

о

зо-

го-

ю-

1 Контроль!

пщз

б

т

(>(

Па»

I Контроль I Т4Р{Й

П-19 П~19

Рис. 16. Ингибирование активности расщепления коллагена в эксплантатах хряща больных ОА в присутствии ТОР ¡32 (б) или смеси ростовых факторов (ОБ) (а). Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Анализ пяти индивидуальных случаев также показал, что средний уровень ингибирования посредством ТСР|32, равный 59.2% (вариабельность от 54.6 до 62.4%) соответствовал степени ингибирования ростовыми факторами в комбинации. ТОРр2 оказался более эффективен, чем инсулин (в среднем 48.5%; вариабельность от 25.8 до 64.5%), который существенно ингибировал расщепление коллагена только в четырех из пяти культур эксплантатов. РОР-2 индивидуально ингибировал расщепление коллагена в среднем только на 26.5% (вариабельность от 0 до 61%) и только в двух эксплантатах из пяти.

Изменения экспрессии генов в эксплантатах хряща больных ОА под действием ростовых факторов

Предварительные исследования экспрессии генов в образцах суставного хряща больных О А, собранных непосредственно после операции по артропластике, показали, что экспрессия генов COLlOAl (р=0.04), маркера гипертрофии хондроцитов, а также генов, связанных с разрушением внеклеточного матрикса: ММР-13 (р=0.01) и ММР-9 (р=0.01) значительно превышает таковую у здоровых доноров (Рис. 17). Кроме того, у больных ОА наблюдалась экспрессия ММР-1 и TNFa, однако степень превышения экспрессии этих генов не удалось оценить количественно, поскольку они не экспрессировались в хряще здоровых людей. Повышенные уровни экспрессии этих генов сохранялись в эксплантатах хряща при его культивировании in vitro.

Рис. 17. Относительная экспрессия генов, участвующих в деградации внеклеточного матрикса в хряще больных ОА (п=11) по сравнению со здоровыми донорами (п=Т0). Статистически значимые различия по сравнению с контролем (С) обозначены звездочками.

Эксплантаты хряща шести больных ОА культивировали в присутствии ТСР(32.(Юнг/мл) или без него для изучения экспрессии генов хондроцитами. Во всех шести случаях добавление ростового фактора значительно понижало активность расщепления коллагена

эксплантатами хрящей. Результаты представлены на Рис. 18 и суммированы в Табл. 2.

Результаты оценивали в рамках альтернативной системы: да - 1, нет- 0. Для резюмирования данных учитывали общее изменение экспрессии (понижение, повышение, отсутствие изменений или отсутствие экспрессии) либо в контроле, либо в присутствии ТСРр2 в каждый момент времени и для каждого пациента. Максимальное значение для каждого пациента по каждому гену было равно 3.

Общее возможное число вариантов -18 для трех временных точек и шести пациентов суммировалось. Анализ влияния ТОРр2 проводили в течение 48 ч., при этом изменения экспрессии генов регистрировали на 6, 24 и 48 ч.

1-ый пациент 2-ой пациент 3-ий пациент

4-ый пациент 5-ый пациент 6-ой пациент

т >: !:.г, ^

СОП0А1 тт -тт тт г,- 'Т'-' 35 " тт ■щт та ***'

РТНгР _ Ш ■ г Ш: : V Ш: -Ш' *&•.

ММР-13 т Ш- ш •*шг «•

ММР-Э -ш ш

1ИР ф ■ящо Щь т т- ш

Т^а Аж. ш- ■Ш; щ...

Р6Е5-1 щт. ■¿4т *0* тт тт ■:тф V«#

6ч. 24ч. 48ч. 6ч. 24ч. 48ч. 6ч. 24ч. 48ч.

Рис. 18. Экспрессия генов в эксплантатах хряща шести больных ОА при культивировании в присутствии или без Т0Рр2.

Как видно из Табл. 2 и Рис. 18, экспрессия генов регистрировалась в большинстве случаев. Для всех исследованных генов за исключением РОЕ синтазы 1 (Р0Е8-1), экспрессия которой обычно

повышалась (в 16 из 18 образцов), ТСЕ(32 ингибировал экспрессию генов (10-18 из 18). Кроме РОЕБ-1 наблюдалось слабое увеличение экспрессии также в случае РТНгР (4 из 18), который обладает способностью подавлять гипертрофию хондроцитов [ТегкекаиЬ ег а1., 1998]. В небольшом числе случаев (обычно 0-3 из 18 для каждого гена) никаких изменений не наблюдалось. Так, ТОР(32 подавлял экспрессию цитокинов 1Ь-1 (3 (15 из 18) и Т№а (11 из 12, в образцах, где этот цитокин экспрессировался), а также ингибировал экспрессию маркеров дифференциации, а именно СОЫОА1 (28 из 18), ММР-13 (10 из 12)иММР-9(11 из 13).

Таблица 2.

Экспрессия генов при культивировании эксплантатов суставного хряща больных ОА в присутствии ТСР[32______________:_____

Изменение экспрессии генов при культивировании с ТвБ-Р*

Снижение Увеличение Отсутствие изменений Отсутствие экспрессии

СОЫОА1 18 0 0 0

РТНгР 10 4 3 1

ММР-13 10 0 2 6

ММР-9 11 0 2 5

Л-73 15 0 1 2

7Жа 11 0 0 7

РСЖ?-/ 0 16 2 0

Примечание. * Данные представляют результаты воздействия ТОРр2 для всех эсплантатов во всех трех временных точках. Максимальное значение для каждого пациента равно 3, поэтому максимальное значение для шести пациентов равно 18. ,

Увеличение образования РОЕ2 под действием ТСР/32 Повышение экспрессии РОЕ8-1 при действии ТОР(32 в тех же культурах, которые анализировали на экспрессию генов, сопровождалось увеличением освобождения РОЕ2 в культуральную среду (Рис. 19). При этом обработка этим ростовым фактором эксплантатов хряща больных ОА приводила к значительному увеличению содержания РОЕ2 в 4 из 6 исследуемых образцов.

PGE2

(пг/мг

TGFj32 - +

Пациенты 82М

82Ж 79М

+

+

71Ж 73М

+ - +

64Ж

+

Рис. 19. Освобождение PGE2, индуцированное TGFp2, эксплантатами хряща больных ОА. Статистически значимые различия по сравнению с контролем (без TGFp2) обозначены звездочками.

Способность малых доз простагландина Е2 подавлять разрушение коллагена и гипертрофию хондроцитров в эксплантатах суставного хряща больных ОА

Воспаление индуцирует увеличение синтеза простагландинов (PG), зависимых от циклооксигеназы (СОХ) -2, которые сенсибилизируют периферические окончания носисепторов и вызывают ощущение боли [Luo et al., 2005]. Поэтому нестероидные противовоспалительные препараты и специфические СОХ-2 ингибиторы широко используются для подавления боли, поскольку ингибируют продукцию PG циклооксигеназой.

Между тем PGE2, генерируемый хондроцитами, как показано ранее, необходим для поддержания гомеостаза хряща [Amin et al., 1997], поскольку СОХ-2 экспрессируется в физиологических условиях в некоторых тканях и может оказывать противовоспалительное действие [Gilroy et al., 1999]. PGE2 может также выполнять протективные функции в хряще больных ОА, поскольку способен ингибировать экспрессию коллагеназы,

индуцируемую IL-ip и стромелизином в фибробластах синовия, а также стимулировать синтез коллагена и протеогликана и пролиферацию хондроцитов [Lowe et al., 1996].

Более того, выше приведены данные о том, что ростовой фактор TGFP2 способен подавлять гипертрофию хондроцитов, экспрессию коллагеназ, расщепление коллагена и экспрессию провоспалительных цитокинов в культуре эксплантатов суставных хрящей больных ОА. Это сопровождалось повышением экспрессии PGES-1 и секрецией PGE2. Поэтому мы решили проверить, может ли PGE2 ингибировать разрушение коллагена в суставном хряще больных ОА.

Ингибирование коллагеназной активности в эксплантатах суставных хрящей больных ОА посредством PGE2

Предварительные исследования культур эксплантатов суставных хрящей больных ОА показали, что в культуральной среде в присутствии TGFJ32 в течение 16 дней обнаруживался PGE2 в концентрации от 4 до 125 пг/мл. Мы использовали эту информацию для выяснения, будет ли добавление PGE2 в сходных концентрациях влиять на расщепление коллагена 2 типа коллагеназой в эксплантатах хрящей 4 больных ОА. Оказалось, что экзогенный PGE2 в низких концентрациях 0.1-1 пг/мл действительно подавлял расщепление коллагена у одного из 4 пациентов (Рис. 20).

Вместе с тем у 3 пациентов значительное подавление расщепления коллагена наблюдалось при 10пг/мл PGE2, а также в большинстве исследованных хрящей в когорте из 13 пациентов (Рис. 21).

В среднем ингибирование составляло 39.7% (вариабельность 33.549.8 %) при 10пг/мл PGE2, причем оно было также эффективно, как и ингибирование посредством TGFP2 (40.1%; вариабельность 26.9-

49.4 %). Интересно, что при более высоких концентрациях (0.1-10нг/мл) ингибирования не наблюдалось, более того в одном случае наблюдали стимулирование расщепления коллагена.

Контроль | Ш82 ^ № 10> Ю1

РСЕ2(пг/мл)

Рис. 20. Ингибирование активности расщепления коллагена РОЕ2 и Юрр2 в эксплантатах хрящей больных О А. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Контроль Югг/и РСЕ2

Рис. 21. Ингибирование активности расщепления коллагена РвЕ2 в эксплантатах хрящей больных ОА. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочкой.

Кроме того, мы наблюдали обратно-пропорциональную зависимость между концентрацией РвЕ2 в среде и активностью расщепления коллагена в контрольных культурах эксплантатов хряща больных ОА (г = - 0.507, Р = 0.044) (Рис. 22).

70 60 50

РОЕ2 40 (пг/мл) 30

20 10 О

•10

0 5 10 15 20 ?5

Активность расщепления коллагена (пмолъ/мг)

Рис. 22. Влияние концентрации РвЕ2 на активность расщепления коллагена в контрольных культурах эксплантатов хряща больных ОА.

Изменение экспрессии генов в эксплантатах хрящей больных ОА в присутствии Р6Е2

По сравнению с контролем эксплантаты хрящей пяти больных ОА, культивируемые в присутствии 10пг/мл РОЕ2, показали снижение экспрессии гена СОЫОА1, связанного с гипертрофией хондроцитов, а также ММР-13 (Рис. 23). Экспрессия коллагеназы ММР-1 была также значительно ниже у 4 из 5 пациентов. Наиболее сильно ингибировались простагландином Е2 цитокины, причем экспрессия 1Ь-13 и ТЫРа в эксплантатах в ряде случаев полностью подавлялась в его присутствии. Между тем, экспрессия циклинаВ2, каспазы 3,

ТОР(32, СОХ-2 и РОЕ8-1 в присутствии 10пг/мл РОЕ2 существенно не изменялась.

о

ф

и

1.0

М

1Л-

1,0

ол

1А

1.0

с

и

т »5 К

2 1-5

I

= 1.0

и

О

?

О

5.5

и

1.0

0,5

П

*.0

0,$

ГТ

I1-

Ж*$бЛ4Т

*}

6 Ж-5?л«т

й£

А

Ж-6?Л«Т

Ж‘£*0л*т

П1

?)х

п

л;

Ж-32лгт

Л

п

в Ср«ДК**+5.0. П*5

* I

к | ММРХ

1!

з

с»

в

О

и

О

а

х>

е;

о

2

с

о

Мой

ш

Ср«ДН««*$.Р.пг5

10 Н

Л

5'}

о-и-

х * : АI1,

п п д ■ п и ! '

11 ИГ! И •

Нздрокс«н{шг/мл)

. + + **. . . * 10 Ю * « »

СОЫОА1 1ЫР

ММР13 TNFа

Рис. 23 (слева). Влияние РОЕ2 на экспрессию генов в эксплантатах хряща больных ОА. К- контроль. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Рис. 24 (справа). Влияние напроксена на активность расщепления коллагена эксплантатами хряща больных ОА в присутствии или без ТСРР2. Статистически значимые различия по сравнению с контролем обозначены звездочками.

Способность ингибитора циклооксигеназы противодействовать влиянию ТОР(32 на расщепление коллагена

Как известно, напроксен способен ингибировать СОХ-1 и -2 [Ра1ге1 е1 а1., 1996]. Мы проверяли возможность того, что этот ингибитор может противодействовать влиянию ТОРр2 на расщепление коллагена. В 2-х из 3-х эксплантатов хряща при фармакологических [В1Ваи1эШ е! а!., 1995] концентрациях в 5мкг/мл и 10 мкг/мл напроксен противодействовал ингибированию расщепления коллагена, индуцированного ТСрр2 и только в одном случае этого эффекта не наблюдалось (Рис. 24). Между тем, в супер-фармакологических концентрациях (ЗОмкг/мл) этот ингибитор не был способен противодействовать ингибированию разрушения хряща посредством ТОРр2. Кроме того, в эксплантатах хряща, культивируемых исключительно с напроксеном, наблюдали значительное увеличение расщепления коллагена по сравнению с контролем у 2-х из 3-х пациентов при концентрации ингибитора 5 мкг/мл.

Следовательно, РОЕ2 в концентрации значительно меньшей, чем наблюдается при воспалительном процессе, обладает хондропротективными свойствами, селективно подавляя расщепление коллагена и функционально связанную с ним гипертрофию суставных хондроцитов в хряще больных ОА. Поэтому избыточное подавление РвЕ2 в терапевтических целях будет благоприятствовать поддержанию патологических изменений хряща при ОА. Следовательно, дозирование препаратов для контроля воспаления не должно полностью блокировать синтез РОЕ2, оставляя его в необходимой концентрации для защиты суставного хряща.

ВЫВОДЫ

1. При воздействии неблагоприятных факторов хондроциты суставного хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым у фетальных хондроцитов ростковой пластинки, одним из аспектов которой является резорбция хрящевого матрикса. При этом именно эти процессы постэмбриональной дифференцировки суставных хондроцитов лежат в основе начальных процессов разрушения суставного хряща при остеоартрозе.

2.В ходе дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке наблюдается экспрессия разных групп генов: в верхней

пролиферативной зоне усиливается экспрессия маркера пролиферации циклина В2, ростовых факторов, таких как трансформирующего ростового фактора бета 2 (TGFß2), белка, родственного паратироидному гормону (РТНгР), ростового фактора фибробластов 2 (FGF-2), а также протеиназ внеклеточного матрикса ММР-13, -3, МТ1-ММР, катепсина К и их тканевых ингибиторов TIMP-1, -2, -3; структурных компонентов матрикса коллагенов 2 и б типов, аггрекана, гиалуронана (о последнем судили по уровню экспрессии гиалуронан синтазы 2 (HAS-2), декорина, фибромодулина, каспазы 3 и специфического транскрипционного фактора коллагена 2 типа (Sox 9).

3.В нижней пролиферативной зоне возрастает уровень экспрессии специфического транскрипционного фактора остеобластов Cbfal, а также Sox 9, желатиназы ММР-9, тканевых ингибиторов металлопротеиназ - TIMP-1 и -2, структурных компонентов матрикса коллагена 2 и 6 типов и фибромодулина.

4. В гипертрофной зоне экспрессируются маркер гипертрофии -коллаген 10 типа (COLlOAl), каспаза 3 и ростовые факторы TGFßl и Ihh, которые не экспрессировались в пролиферативной зоне, а также происходит повышение экспрессии большинства ранее перечисленных генов протеиназ, их тканевых ингибиторов и структурных компонентов матрикса, за исключением РТНгР, FGF-2, коллагена 6 типа и декорина, наивысший уровень экспрессии которых наблюдался в верхней пролиферативной зоне ростковой пластинки.

5. Предикторами развития ОА-подобных изменений являются экспрессия факторов роста, связанных с зоной пролиферации хондроцитов ростковой пластинки, а именно РТНгР, FGF-2, TGFßl/2, а также макромолекул матрикса COL2A1 и аггрекана как на соседних с повреждениями участках, так и на значительном расстоянии от центра повреждения.

6. При ОА-подобных повреждениях хряща, происходит повышение активности расщепления коллагена 2 типа, сопровождающееся повышением экспрессии коллагеназ ММР-1, -14 (МТ1-ММР), аггреканазы ADAMTS-5; цитокинов интерлейкинов-l(IL-l) а /ß и фактора некроза опухолей (TNF) а; а также увеличением экспрессии генов, связанных с гипертрофией хондроцитов COLlOAl, ММР-13, ММР-9, Ihh и каспазы 3 в

непосредственной близости от повреждений. Каспаза 3 и АБАМТ8-5 экспрессируются исключительно в центре повреждения хрящевой ткани.

7. Усиление расщепления коллагена в локусах образования ранних повреждений хряща сопровождается не только усилением экспрессии генов, ответственных за разрушение матрикса, но и генов, связанных с конечной дифференцировкой хондроцитов в ростковой пластинке. Поэтому дифференцировка хондроцитов является ранним событием, связанным с повреждением хряща, которое происходит приОА.

8. На неповрежденных участках хряща не наблюдается ни усиленного расщепления коллагена, ни избыточной экспрессии генов, связанных с различными фазами дифференцировки хондроцитов ростковой пластинки.

9. Совместным воздействием ростовых факторов, а именно ТСРр2, РвР-2 и инсулином, активность разрушения коллагена значительно ингибируется в эксплантатах суставного хряща больных ОА. ТСР(32 наиболее эффективно предотвращает разрушение хряща. В суставных хондроцитах хрящей больных ОА подавление избыточного расщепления коллагена этими ростовыми факторами как в комбинации, так и исключительно ТСРр2 сопровождается уменьшением экспрессии генов, связанных с гипертрофией хондроцитов, а также увеличением экспрессии простагландин Е синтазы (РОЕ8-1) и освобождением в среду простагландина Е2 (РОЕ2).

10. РОЕ2 при низкой концентрации также способен значительно подавлять расщепление коллагена, уменьшая при этом экспрессию ММР-13, ММР-1, цитокинов и маркера гипертрофии хондроцитов СОЫОА1. Тот факт, что напроксен, неспецифический ингибитор циклооксигеназы (СОХ) -1 и -2, способен противодействовать влиянию ГСРр2 в подавлении расщепления коллагена, свидетельствует о том, что РОЕ2 опосредует действие этого ростового фактора. РОЕ2 в концентрации значительно меньшей, чем при воспалительном процессе, обладает хондропротективными свойствами, селективно подавляя расщепление коллагена и функционально связанную с ним гипертрофию суставных хондроцитов в хряще больных ОА.

11. Дифференцировка хондроцитов предшествует разрушению коллагена в нормальном хряще при воздействии агентов, способных стимулировать коллагеназную активность. Одним из таких агентов является обнаруженный нами пептид коллагена 2 типа - СВ 12-2. Пептид СВ 12-2 присутствует в значительных концентрациях в хряще больных ОА и обладает способностью увеличивать активность расщепления коллагена 2 типа коллагеназой.

12. В здоровом суставном хряще расщеплению коллагена в присутствии СВ 12-2 предшествует увеличение пролиферативной активности хондроцитов, с последующей экспрессией генов терминальной дифференцировки хондроцитов и увеличением числа апоптозных клеток. Подавление экспрессии гипертрофного фенотипа суставных хондроцитов ростовыми факторами в сочетании с СВ 12-2 предотвращает избыточное расщепление коллагена и ингибирует экспрессию протеиназ, цитокинов и белков, сопряженных с гипертрофией хондроцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Tchetina E.V., Wu W., Poole A.R. Collagens and collagenases expression in bovine growth plate // The Forth Annual Canadian Connective Tissue Conference (London, Canada): Abstracts, 1998.

P. #01.

2. Tchetina E.V., Yasuda Т., Poole A.R. Dual effects of type II collagen type П fragments on expression of chondrocyte genes associated with the synthesis and degradation of type II collagen // The Fifth Annual Canadian Connective Tissue Conference (Montreal, Canada): Abstracts, 1999. P. #64.

3. Kobayashi М., Yasuda Т., Kojima Т., Tchetina E.V., Feige U.,

Poole A.R. A peptide of type II collagen induces collagenase cleavage of type П collagen through interleukin-1 and tumour necrosis factor-dependent pathways in human articular cartilage // Annual Scientific Meeting of American College of Rheumatology (Philadelphia, USA): Arthritis and Rheumatism, 2000; Vol. 43. P. S91.

4. Kobayashi М., Kojima Т., Tchetina E.V., Poole A.R. A type II collagen fragment can induce type II collagen degradation through an

IL-1-mediated pathway in explant cultures of human articular cartilage I I The Sixth Annual Canadian Connective Tissue Conference (Quebec, Canada): Abstracts, 2000. P. #7.

5. Tchetina E.V., Kobayashi M., Yasuda T., Poole A.R. Collagen type

II fragments and chondrocyte differentiation // The Sixth Annual Canadian Connective Tissue Conference (Quebec, Canada): Abstracts, 2000. P. #37.

6. Wu W., Mwale F., Tchetina E., Kojima T., Yasuda T., Poole A.R. Cartilage matrix resorption in skeletogenesis. In: “The molecular basis of skeletogenesis” // Novartis Foundation Symposium. - John Wiley and Sons Ltd. (Chichester, UK), 2000. Vol. 232. P.158-170.

7. Mwale M., Tchetina E.V., Poole A.R. Upregulation of gene expression associated with chondrocyte differentiation and changes in matrix composition in the growth plate // The Sixth.Annual Canadian Connective Tissue Conference (Quebec, Canada): Abstracts, 2000. P. #2.

8. Kobayashi M., Yasuda T., Kojima T., Tchetina E.V., Sakai T., Feige U., Poole A.R. A synthetic peptide of type II collagen upregulates collagenase expression and induces type II collagen cleavage by collagenases via IL-1 and TNF-dependent pathways in human articular cartilage // Annual Scientific Meeting of American College of Rheumatology (San Francisco, USA): Abstracts. Arthritis and Rheumatism, 2001. Vol. 44. P. S108.

9. Kobayashi M, Yasuda T., Kojima T., Tchetina E., Feige U., Poole A.R. A synthetic peptide of type II collagen can cause type II collagen cleavage by collagenase through IL-1- and TNF-dependent pathways in human articular cartilage // 47th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (San Francisco, USA): Transactions,

2001. Vol. 26. P. #0580.

10. Kojima T., Tchetina E.V., Ionescue M., Reigner A., Poole A.R. Comparative study of sequential cleavage of molecules that form collagen fibrils in articular cartilage // 47th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (San Francisco, USA): Transactions, 2001. Vol. 26. P. #0453.

11. Kobayashi M., Tchetina E.V., Feige U., Poole A.R. Soluble TNF-R1 and IL-lra can inhibit resorption of collagen and proteoglycan in human osteoarthritic cartilage // The Seventh Annual

Canadian Connective Tissue Conference (Toronto, Canada): Abstracts, 2001. P. #11.

12. Kobayashi M., Tchetina E.V., Tanzer M., Zukor D J., Antoniou J., Feige U., Poole A.R. Tumor necrosis factor-a and interleukin-1 are required for matrix degradation in human osteoarthritic articular cartilage // Annual Scientific Meeting of American College of Rheumatology (San Francisco, USA): Abstracts. Arthritis and Rheumatism, 2001. Vol. 44. P. S62.

13. Tchetina E.V., Kobayashi M., Feige U., Poole A.R. A peptide of type II collagen induces chondrocyte hypertrophy and type II collagen cleavage by collagenase // Annual Scientific Meeting of American College of Rheumatology (New Orleans, USA): Abstracts. Arthritis and Rheumatism, 2002. Vol.46. Suppl. P. S80.

14. Kobayashi M., Yasuda T., Kojima T., Tchetina E.V,, Sakai T., Feige U., Poole A.R. A synthetic peptide of type II collagen induces upregulation of collagenase expression and type II collagen cleavage by collagenases through IL-1 and TNF pathways in human articular cartilage // 48th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (Dallas, USA):Transactions, 2002. Vol. 27. P. 422.

15. Tchetina E.V., Kobayashi M., Yasuda Y., Poole A.R.

Increased collagen degradation is associated with the upregulation of chondrocyte differentiation related genes in articular cartilage explants induced by a type II collagen peptide // 24™ Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research (San Antonio, USA): Abstracts. Journal of Bone and Mineral Research, 2002. Vol. 17. Suppl. 1. P. S404.

16. Tchetina E.V., Webb G., Poole A.R. Increased collagen degradation in association with the upregulation of chondrocyte differentiation related genes in age-related osteoarthritis-like focal human articular cartilage lesions // The Eighth Canadian Connective Tissue Conference (Sherbrooke, Canada): Abstracts, 2002. P. #2.

17. Wu C. W., Tchetina E.V., Mwale F., Hasty K., Pidoux I., Reiner A., Chen J., Van Wart H.E., Poole A.R. Proteolysis involving MMP-13 (Collagenase-3) is required for chondrocyte differentiation and matrix mineralization // Journal of Bone and Mineral Research, 2002. Vol. 17. P. 639-651.

18. Mwale F., Tchetina E., Wu W., Poole A.R. The assembly and remodelling of the extracellular matrix in the growth plate in

relationship to mineral deposition and cellular hypertrophy: an in situ study of collagens type II and IX and proteoglycan // J Bone Miner Res, 2002. Vol. 17. P. 275-283.

19. Poole A.R., Kobayashi M., Yasuda T., Laverty S., Mwale F., Kojima T., Sakai T., Wahl C., El-Maadawy S., Webb G., Tchetina E.V., Wu W. Type II collagen degradation and its regulation in articular cartilage in osteoarthritis // Annals of Rheumatic Diseases,

2002. Suppl. II. P. ii78-ii81.

20. Kobayashi M, Tchetina E.V., Tanzer M., Zukor D.J.,

Antoniou J., Feige U., Poole A.R. Tumour necrosis factor and interleukin-1 are involved in matrix degradation of human osteoathritic articular cartilage // 48th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (Dallas, USA):Transactions, 2002. Vol. 27. P. 155.

21. Tchetina E.V., Poole A.R. A peptide of type II collagen accelerates differentiation of bovine growth plate chondrocytes: implication to osteoarthritis // Canadian Arthritis Network Annual Conference (Montreal, Canada): Abstracts, 2003. P. 15.

22. Tchetina E.V., Mwale F., Poole A.R. Distinct phases of coordinated early and late gene expression in growth plate chondrocytes in relationship to cell proliferation, matrix assembly, remodelling and cell differentiation // Journal of Bone and Mineral Research, 2003. Vol. 18. P. 844-851.

23. Tchetina E.V., Poole A.R. Growth factors capable of suppressing chondrocyte hypertrophy arrest collagen cleavage in human osteoarthritic cartilage //The IXth Annual Canadian Connective Tissue Conference and 1st CIHR Skeletal Health training Conference: Montreal, Canada, 2003. P. 6.

24. Tchetina E.V., Webb G., Poole A.R. Increased collagen degradation is associated with the upregulation of chondrocyte differentiation in age-related osteoarthritis-like focal human articular cartilage lesions // OARSI, World Congress on Osteoarthritis (Berlin, Germany). Osteoarthritis and Cartilage, 2003. Suppl. A. P. S13.

25. Poole A.R., Nelson F., Dahlberg L., Tchetina E.V., Kobayashi M., Yasuda T., Laverty S., Squires G., Kojima T., Wu W., Billinghurst R.C. Proteolysis of the collagen fibril in osteoarthritis. Invited review article: Biochemical Society Annual Symposium:

Proteases and the Regulation of Biological Processes. Biochemical Society Symposia, 2003. Vol. 70. P. 115-123.

26. Tchetina E.V., Poole A.R. Growth factors capable of suppressing chondrocyte hypertrophy arrest collagen cleavage in human osteoarthritic cartilage// 26T Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research, (Seattle, USA): Abstracts. Journal of Bone and Mineral Research, 2004. Vol. 19. Suppl. 1. P. S348.

27. Tchetina E.V., Webb G., Poole A.R. Increased type II collagen degradation and very early focal cartilage degeneration is associated with upregulation of chondrocyte differentiation related genes in early human articular cartilage lesions // Journal of Rheumatology, 2005. Vol. 38. P. 876-886.

28. Yasuda T., Tchetina E.V. (joint first author), Ohsawa K., Roughley P., Wu W., Mousa A., Ionescu М., Poole A.R. Peptides of type II collagen can induce the cleavage of type II collagen and aggrecan in articular cartilage // Matrix Biology, 2006. Vol. 25. P. 419-429.

29. Tchetina E.V., Antoniou J., Tanzer М., Zukor D.J., Poole A.R.

TGFbeta2 suppresses collagen cleavage in cultured human osteoarthritic cartilage, reduces expression of genes associated with chondrocyte hypertrophy and degradation, and increases prostaglandin E2 production // American Journal of Pathology, 2006. Vol. 168. P.131-140. .

30. Tchetina E.V., Kobayashi М., Yasuda T., Meijers T., Pidoux

I., Poole A.R. Chondrocyte hypertrophy can be induced by a cryptic sequence of type II collagen and is accompanied by the induction of MMP-13 and collagenase activity: implications for development and arthritis // Matrix Biology, 2007. Vol. 26. P. 247-258.

31. Tchetina E.V., Di Battista J.A., Zukor D.L., Poole A.R. Prostaglandin E2 suppresses collagen cleavage in cultured human osteoarthritic cartilage, involves a reduction in expression of proinflammatory cytokines and those associated with chondrocyte hypertrophy // Arthritis Research and Therapy, 2007. Vol. 9. P. R75.

32. Четина E.B., Пул A.P. Пул Роль ростовых факторов в подавлении разрушения коллагена и дифференциации хондроцитов при остеоартрозе // Вестник РАМН, 2008. №5. С. 15-21.

33. Четина Е.В., Пул А.Р. Способность фрагмента коллагена 2 типа индуцировать расщепление коллагена и гипертрофию суставных хондроцитов // Вестник РАМН, 2008. №9. С.40-45.

34. Четина Е.В., Пул А.Р. Признаки дифференциации хондроцитов при формировании ранних повреждений хряща у пожилых людей // VIII конгресс Российского Артроскопического Общества: Тезисы докладов. Москва, 2009. С. 87-88.

35. Четина Е.В., ДиБатиста Д., Пул А.Р. Простагландин Е2 в малых дозах способен подавить разрушение коллагена в эксплантатах ОА суставного хряща человека // VIII конгресс Российского Артроскопического Общества: Тезисы докладов. Москва, 2009. С. 87.

36. Четина Е.В.Роль эмбриональных механизмов в разрушении суставного хряща при остеоартрозе // Российский конгресс ASAMI: Тезисы докладов. Курган, 2009. С. 157.

37. Четина Е.В., Пул А.Р. Роль ростовых факторов в подавлении разрушения коллагена суставного хряща и дифференциации хондроцитов при остеоартрозе // VIII конгресс Российского Артроскопического Общества: Тезисы докладов. Москва, 2009. С. 88-89.

38. Четина Е.В., ДиБатиста Д., Пул А.Р. Роль простагландина Е2 в ингибировании разрушения коллагена суставного хряща больных остеоартрозом // Научно-практическая ревматология, 2009. №3. С. 18-24.

39. Четина Е.В. Роль дифференциации хондроцитов в разрушении коллагенового матрикса суставного хряща при остеоартрозе // VIII конгресс Российского Артроскопического Общества: Тезисы докладов. Москва, 2009. С, 86.

40. Четина Е.В. Механизмы эмбриогенеза при остеоартрозе: роль дифференцировки хондроцитов в резорбции суставного хряща // Научно-практическая ревматология, 2010. № 3. С. 6577.

41. Четина Е.В., Семенова JI.А. Пептид коллагена 2 типа способен ускорять дифференцировку эмбриональных хондроцитов быка // Материалы X Конгресса Международной ассоциации морфологов «Функциональная морфология человека и животных». Ярославль. Морфология, 2010. № 4. С. 211-212.

42. Четина Е.В. Индукция расщепления коллагена под действием коллагенового пептида в хряще здоровых людей сопровождается активацией металлопротеиназ матрикса и дифференцировкой хондроцитов // Научно-практическая ревматология, 2010. № 5. С. 47-53.

43. Четина Е.В. Формировании ранних повреждений хряща у пожилых людей сопровождается дифференцировкой суставных хондроцитов // Материалы III Российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека». - Санкт-Петербург. - Профилактическая и клиническая медицина, 2010. Специальный выпуск. С. 401-402.

44. Четина Е.В. Участие дифференцировки хондроцитов в разрушении коллагена суставного хряща при остеоартрозе // Материалы Ш Российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека». Санкт-Петербург. Профилактическая и клиническая медицина, 2010. Специальный выпуск. С. 401.

45. Четина Е.В. Пептид коллагена 2 типа способен ускорять дифференцировку эмбриональных хондроцитов: взаимосвязь с резорбцией матрикса суставного хряща при остеоартрозе // Научно-практическая ревматология, 2010. № 6. С. 33-39.

46. Четина Е.В. Признаки дифференцировки хондроцитов при формировании ранних повреждений хряща у пожилых людей // Научно-практическая ревматология, 2011. № 1. С. 35-44.

47. Tchetina E.V. Developmental mechanisms in articular cartilage degradation in osteoarthritis // Arthritis (Hindawi), 2011. V. 2011. P.l-16.

URL: http://www.hindawi.com/joumals/arth/201 l/683970.cta.html

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВКМ внеклеточный матрикс

ОА остеоартроз

РП ростковая пластинка

ADAMTS-TS дезинтегрин и металлопротеиназа-1 с тромбоспондиновым

мотивом

С2С (COL2-3/4Clong) первичный неоэпитоп, генерируемый только в

коллагене 2 типа при расщеплении коллагеназой С1,2С (COL2-3/4C) карбокси-терминальный нео-эпитоп, образуемый при расщеплении коллагена 1 и 2 типов коллагеназой

COL2-3/4m эпитоп, расположенный внутри цепи в домене

тройной спирали коллагена СВ 12 один из фрагментов коллагена 2 типа, образующийся в

результате его расщепления бромистым цианидом СВ12-1,2,3,4 пептиды, синтезированные на основе нуклеотидной

последовательности фрагмента СВ 12 коллагена 2 типа CNBr цианистый бромид

COLlOAl альфа 1 цепь коллагена 10 (X) типа

COL2A1 альфа 1 цепь коллагена 2 типа

СОХ циклооксигеназа

FGF-2 (bFGF) основной ростовой фактор фибробластов

GAG гликозаминогликаны

GAPDH глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа

GF смесь ростовых факторов TGFß2 (Юнг/мл), FGF-2

(Юнг/мл) и инсулин (100нг/мл)

IGF инсулиновый ростовой фактора •

IL-lct/ß интерлейкин-1 a/ß

Ihh Indian hedgehog

Ki67 антиген, который узнает циклин-зависимую киназу

ММР металлопротеиназы матрикса

PCNA ядерный антиген пролиферирующих клеток

PGE2 простагландин Е2

PGES-1 простагландин синтаза 1

РТНгР белок, родственный паратироидному гормону

Runx2/Cbfal транскрипционный фактор, ответственный за

дифференцировку остеобластов Sox9 транскрипционный фактор, ответственный за

дифференцировку эмбриональных хондроцитов TGFß трансформирующий ростовой фактор бета

TIMP тканевый ингибитор металлопротеиназ

TNF фактор некроза опухолей

ЧЕТИНА Елена Васильевна

КЛЕТОЧНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗРУШЕНИЯ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Отпечатано в ООО «Компания Спутник*»

ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 02.02.2011 Тираж 100 экз. Уел. п.л. 3,0 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Четина, Елена Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. РОСТКОВАЯ ПЛАСТИНКА: КЛЕТОЧНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ, ФОРМИРОВАНИЕ ХРЯЩА И МИНЕРАЛИЗАЦИЯ

1.1 .Структура и организация ростковой пластинки.

1.2. Особенности хондроцитов ростковой пластинки на клеточном уровне.

1.3.Зональная экспрессия генов и соответствующих им белков в ростковой пластинке.

1 АРегуляция дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке.

Глава 2. СУСТАВНОЙ ХРЯЩ И ЕГО ОРГАНИЗАЦИЯ

2.1.Строение и зональная структура хряща.

2.2. Функциональная характеристика здорового хряща.

Глава 3. ВОЗРАСТНЫЕ И ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ХРЯЩА

3.1. Изменения суставного хряща при старении.

3.2. Патологические изменения хряща при остеоартрозе (ОА).

3.3. Специфика молекулярных изменений в суставном хряще в зависимости от степени тяжести ОА.

3.4. Ингибирование разрушения хряща при ОА ростовыми факторами.

3.5. Роль медиаторов воспаления при остеоартрозе.

Глава 4. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Структура и объем выборки.

4.2. Подготовка фетальных тканей теленка.

4.3. Подготовка суставного хряща, имеющего фокальные повреждения.

4.4. Подготовка суставного хряща больных остеоартрозом.

4.5. Подготовка суставного хряща взрослого быка.

4.6. Культивирование хрящевых эксплантатов.

4.7. Культивирование суставных хондроцитов в виде осадочных культур.

4.8. Фракционирование и культивирование фетальных хондроцитов.

4.9. Определение активности расщепление коллагена II типа коллагеназой с использованием фермент-зависимого иммуносорбентного метода.

4.10. Определение коллагеназной активности.

4.11. Определение минерализации матрикса, используя включение кальция (45Са2+).

4.12. Биосинтез коллагена и общий оборот белка.

4.13. Определение содержания общего количества коллагена 2 типа или степени его денатурации.

4.14. Определение содержания и свободных протеогликанов.

4.15. Определение содержания общего кальция и фосфата.

4.16. Количественное определение секреции простагландина Е2.

4.17. Очистка коллагена 2 типа и синтез его производных пептидов.

4.18. Электрофорез и иммуноблоттинг.

4.19. Иммуногистохимические методы.

4.20. Выделение общей РНК.

4.21. Обратная транскрипция.

4.22. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

4.23. Количественный анализ экспрессии генов посредством ПЦР в режиме реального времени.

4.24. Статистический анализ.

Глава 5. КООРДИНАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И БЕЖОВ В

ХОНДРОЦИТАХ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ И ГИПЕРТРОФНОЙ ЗОН РОСТКОВОЙ ПЛАСТИНКИ

5.1. Молекулярно-биологические исследования ростковой пластинки быка.

5.2. Исследования экспрессии генов; связанных с дифференцировкой хондроцитов и соответствующих им белков в культурах фетальных хондроцитов быка.

Глава 6. ПРИЗНАКИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ/ГИПЕРТРОФИИ

СУСТАВНЫХ ХОНДРОЦИТОВ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ РАННИХ

ПОВРЕЖДЕНИЙ ХРЯЩА У ПОЖИЛЫХ ЛЮДЕЙ.

Глава 7. СПОСОБНОСТЬ ФРАГМЕНТА КОЛЛАГЕНА 2 ТИПА ИНДУЦИРОВАТЬ РАСЩЕПЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА И ГИПЕРТРОФИЮ СУСТАВНЫХ ХОНДРОЦИТОВ В ЗДОРОВОМ ХРЯЩЕ БЫКА И ЧЕЛОВЕКА

7.1. Индуция расщепления коллагена 2 типа под действием пептида СВ12-2.

7.2.Индуция экспрессии коллагеназ ММР-13 и ММР-1 действием пептида СВ12-2.

7.3. Денатурация коллагена 2 типа и экспозиция пептида СВ12-2 во внеклеточном матриксе суставного хряща больного OA.

7.4. Активация металлопротеиназ матрикса и процесса дифференцировки хондроцитов в здоровом хряще быка при индукции повышенного расщепления коллагена.

7.5.Индукция повышенного расщепления коллагена посредством коллагеназы под действием пептида СВ12-2 сопровождается активацией металлопротеиназ матрикса и дифференцировкой хондроцитов в здоровом хряще человека.

Глава 8. РОЛЬ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ В ПОДАВЛЕНИИ РАЗРУШЕНИЯ КОЛЛАГЕНА И ГИПЕРТРОФИИ ХОНДРОЦИТОВ ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ

8.1.Ингибирование коллагеназной активности ростовыми факторами.

8.2.Влияние ростовых факторов на освобождение протеогликанов.

8.3.Изменения экспрессии генов в эксплантатах хряща больных ОА под действием ростовых факторов.

8.4.Увеличение образования PGE2 под действием TGFß2.

8.5. Ингибирование усиленного расщепления коллагена под действием пептида СВ12-2 и подавление экспрессии генов, сопряженных с гипертрофией хондроцитов смесью ростовых факторов.

Глава 9. СПОСОБНОСТЬ МАЛЫХ ДОЗ ПРОСТАГЛАНДИНА Е

ПОДАВЛЯТЬ РАЗРУШЕНИЕ КОЛЛАГЕНА В ЭКСПЛАНТАТАХ

СУСТАВНОГО ХРЯЩА БОЛЬНЫХ ОА

9.1.Ингибирование коллагеназной активности в эксплантатах суставных хрящей больных ОА посредством PGE2.

9.2,Освобождение протеогликанов в эксплантатах хряща, культивируемых в присутствии PGE2.

9.3.Изменения экспрессии генов в эксплантатах хрящей больных ОА в присутствии PGE2.

9.4.Способность ингибитора циклооксигеназы влиянию TGFß2 на расщепление коллагена.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточные и молекулярные механизмы разрушения суставного хряща при остеоартрозе"

Актуальность проблемы

Остеоартроз (ОА) - это наиболее распространенное заболевание лиц пожилого возраста. Основным проявлением этого заболевания является эрозия суставного.хряща, ктороая развивается вследствие повреждения и резорбции внеклеточного матрикса (ВКМ), окружающего хондроциты. ВКМ преимущественно состоит из коллагена второго типа и протеогликана аггрекана [325]. В разрушении ВКМ принимают участие коллагеназы, в частности, коллагеназа 3 (ММР-13) и металлопротеиназы матрикса (ММР). Разрушение хряща при ОА сопровождается воспалительным процессом и характеризуется повышением экспрессии цитокинов, таких как интерлейкины (1Ь)-1 а /(3 и фактор некроза опухолей (ТМ^а, которые, как предполагается, активируют металлопротеиназы [347]. В настоящее время считается, что разрушение хряща при ОА инициируется повышенной активностью цитокинов [311].

Вместе с тем при ОА в хряще также активируются анаболические процессы, которые могут быть причиной фенотипических изменений хондроцитов. В частности, такие фенотипические изменения могут включать элементы терминальной дифференцировки хондроцитов, характеризующейся повышением экспрессии коллагена 10 типа, признаки ранних фаз дифференцировки хондроцитов, о чем свидетельствует появление в матриксе коллагена 2А типа и де-дифференцировки клеток хрящевой ткани, что сопровождается экспрессией коллагенов 1 и 3 типов [38].

Следует отметить, что изменения в клетках суставного хряща при ОА, в частности, очаги пролиферации хондроцитов с образованием клонов отдельных клеток, а также экспрессия генов коллагена 10 типа, аннексинов, щелочной фосфатазы и белка, родственного паратироидному гормону (РТНгР), кальцификация матрикса и гибель клеток посредством апоптоза, включая ускоренное расщепление коллагена 2 типа посредством ММР-13, также наблюдаются в гипертрофных хондроцитах ростковой пластинки при эмбриональном развитии [383].

В настоящее время не существует эффективных лекарственных препаратов, способных восстановить хрящевую ткань. Лечение заболевания проводится противовоспалительными и болеутоляющими средствами, которые могут вызвать осложнения [325].

В связи с этим существует настоятельная необходимость поиска других подходов к лечению ОА, основанных на понимании клеточных и молекулярных механизмов этого заболевания.

Гипотеза: Поскольку в онтогенезе происходит резорбция хряща при замене его костью, мы предположили, что разрушение коллагенового матрикса при остеоартрозе может регулироваться механизмами, сходными с теми, которые ответственны за терминальную дифференцировку хондроцитов и резорбцию внеклеточного матрикса при развитии скелета.

Цель настоящей работы: Исследовать роль клеточных и молекулярных механизмов в разрушении коллагенового матрикса суставного хряща при остеоартрозе.

Задачи исследования:

1. Определить маркерные гены, ответственные за процессы пролиферации и гипертрофии хондроцитов ростковой пластинки.

2. Сопоставить уровень активности расщепления коллагена 2 типа и характер экспрессии генов, отвечающих за дифференцировку хондроцитов, при развитии ранних фокальных повреждений хряща, подобных наблюдаемым при ОА у лиц пожилого возраста.

3. Изучить особенности экспрессии генов при дифференцировке хондроцитов здорового зрелого суставного хряща, при стимуляции расщепления коллагена.

4. Разработать способы подавления разрушение хряща путем подавления расщепления коллагена 2 типа агентами, используя факторы, замедляющие процессы перехода хондроцитов к гипертрофии.

Научная новизна

Обосновано новое понимание механизма развития остеоартроза, дополняющее общепринятое представление о разрушении хряща при развитии заболевания вследствие повышенной активности коллагеназ, индуцированных цитокинами.

Разрушение хряща при OA происходит в результате изменений метаболизма суставных хондроцитов, сходных с теми, что наблюдаются при гипертрофии хондроцитов ростковой пластинки при морфогенезе и сопровождаются разрушением ВКМ. Наряду с процессом пролиферации, ранее описанным как клонирование хондроцитов в хряще больных OA, они переходят в состояние сходное с состоянием фетальных хондроцитов из зоны гипертрофии, а именно экспрессируют коллаген 10 типа, ростовые факторы TGF|31 и Indian hedgehog (Ihh), и металлопротеиназы, включая коллагеназы. Именно коллагеназы, индуцированные гипертрофными изменениями суставных хондроцитов, разрушают коллаген внеклеточного матрикса, что приводит к деградации хрящевой ткани. На начальном этапе этот процесс может проходить при отсутствии воспаления.

1. В связи с этим впервые показано, что в относительно здоровых хрящах пожилых людей образование ранних OA-подобных повреждений связано с усилением расщепления коллагена, что сопровождается повышением экспрессии генов гипертрофной фазы дифференцировки хондроцитов ростковой пластинки.

2. Впервые показано, что в случае искусственной стимуляции расщепления коллагена 2 типа в здоровом хряще также происходит усиление экспрессии генов и синтеза белков, свойственных гипертрофной фазе дифференцировки хондроцитов.

3. Впервые показано, что в культурах эксплантатов хрящей больных ОА на поздней стадии заболевания можно подавить расщепление коллагена 2 типа с одновременным ингибированием экспрессии генов, ответственных за гипертрофию фетальных хондроцитов, а.также индукторов воспаления - цитокинов, в присутствии ТОБр2 или при низких концентрациях простагландина Е2 (РОЕ2).

4. Впервые установлено, что в зрелых хондроцитах суставного хряща при ОА процессы расщепления коллагена 2 типа и экспрессия гипертрофного фенотипа взаимообуславливают друг друга и механизм деградации ВКМ в суставном хряще при ОА идентичен процессу разрушения внеклеточного матрикса хондроцитов ростковой пластинки при морфогенезе.

Научно-практическая значимость работы Поскольку в основе повреждения коллагена 2 типа, а следовательно, разрушения хрящевой ткани при ОА лежат механизмы, сходные с теми, что наблюдаются при гипертрофии хондроцитов в морфогенезе, регуляция гипертрофии может быть одним из перспективных направлений в терапии разрушения суставного хряща при ОА.

В частности повышение уровня ТОБр2 и поддержание низких уровней РвЕ2 в суставной сумке будет способствовать подавлению расщепления коллагена и разрушению хрящевой ткани при ОА.

Предложенная в данной работе новая интерпретация механизма возникновения ОА позволит определить новые фармакологические мишени для лечения заболевания или предотвращения его развития на самой ранней стадии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хондроциты суставного хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым у фетальных хондроцитов ростковой пластинки, и этот процесс лежит в основе резорбции хряща, при, остеоартрозе.

2. Дифференцировку хондроцитов суставного хряща можно инициировать in vitro агентами^ стимулирующими первичное расщепление коллагена коллагеназой.

3. Дифференцировка хондроцитов лежит в основе разрушения хряща при возрастных изменениях, сходных с остеоартрозными, причем начинается она до макроскопических изменений хряща, регистрируемых гистологически, и проявляется в повышении экспрессии генов, которые активны в зонах пролиферации и гипертрофии ростковой пластинки.

4. Разрушение матрикса суставного хряща больных остеоартрозом можно остановить действием ростовых факторов, которые способны блокировать дифференцировку хондроцитов ростковой пластинки. Это сопровождается ингибированием маркерных генов дифференцировки хондроцитов и подавлением активности расщепления коллагена коллагеназой.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на ТТТТТТТТТ Российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека» (Санкт-Петербург, 2010); X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); VIII конгрессе Российского Артроскопического Общества (Москва, 2009); на Российском конгрессе ASAMI (Курган, 2009); на Всемирном конгрессе общества по исследованю кости и минерала (American Society for Bone and Mineral Research) (Сиэтл, 2004; Сан Антонио, 2002); Всемирном конгрессе Американского общества ревматологов (American College of Rheumatology) (Новый Орлеан, 2002; Сан Франциско, 2001; Филадельфия, 2000); Всемирном конгрессе общества ортопедов (Orthopaedic Research Society) (Сан-Франциско, 2001; Даллас, 2002); Всемирном конгрессе по остеоартрозу (OARSI) (Берлин, 2003); Конференции Канадской лиги по исследованию артрита (Canadian Arthritis Network) (Монреаль, 2003); Канадской конференции по соединительной ткани (Canadian Connective Tissue Conference) (Монреаль, 2003; 1999; Шербрук, 2002; Торонто, 2001; Квебек, 2000; Лондон, 1998).

Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института ревматологии РАМН 16 марта 2010 г.

Публикации

По теме диссертации опубликована 47 печатных работ: 19 журнальных статей (из них 12 статей в зарубежных журналах) и 28 тезисов (в том числе 23 - на зарубежных симпозиумах).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, основных результатов исследования ростковой пластинки, здорового суставного хряща быка и человека и поврежденного суставного хряща больных остеоартрозом, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 55 рисунками и 5 таблицами. Библиография включает 465 публикации, в том числе 27 отечественных и 43 8,зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Четина, Елена Васильевна

выводы

1. При воздействии неблагоприятных факторов хондроциты суставного-хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым у фетальных хондроцитов ростковой пластинки, одним из аспектов которой является резорбция хрящевого матрикса. При этом именно эти процессы. постэмбриональной дифференцировки суставных хондроцитов' лежат в основе начальных процессов разрушения, суставного хряща при остеоартрозе.

2. В ходе дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке наблюдается экспрессия разных групп генов: в верхней пролиферативной зоне усиливается экспрессия маркера пролиферации циклина В2, ростовых факторов, таких как трансформирующего ростового фактора бета 2 (TGFP2), белка, родственного паратироидному гормону (РТНгР), ростового фактора фибробластов 2 (FGF-2), а также протеиназ внеклеточного матрикса ММР-13,-3, МТ1-ММР, катепсина К и их тканевых ингибиторов TIMP-1, -2, -3; структурных компонентов матрикса коллагенов 2 и б типов, аггрекана, гиалуронана (о последнем судили по уровню экспрессии гиалуронан синтазы 2 (HAS-2), декорина, фибромодулина, каспазы 3 и специфического транскрипционного фактора (Sox 9) коллагена 2 типа.

3. В нижней пролиферативной зоне возрастает уровень экспрессии специфического транскрипционного фактора остеобластов Cbfal, а также Sox 9, желатиназы ММР-9, тканевых ингибиторов металлопрот'еиназ - TIMP-1 и -2, структурных компонентов матрикса коллагена 2 и б типов и фибромодулина.

4. В гипертрофной зоне экспрессируются маркер гипертрофии -коллаген 10 типа (COLlOAl), каспаза 3 и ростовые факторы TGF01 и Ihh, которые не экспрессировались в пролиферативной зоне, а также происходит повышение экспрессии большинства ранее перечисленных генов протеиназ, • их тканевых ингибиторов и структурных компонентов матрикса, за исключением РТНгР; РОР-2, коллагена 6 типа и декорина, наивысший уровень экспрессии которых наблюдался в верхней пролиферативной зоне ростковой пластинки.

5. Предикторами развития ОА-подобных изменений являются экспрессия факторов роста, связанных с зоной пролиферации хондроцитов ростковой пластинки, а именно РТНгР, РСБ-2, ТОБрШ, а также макромолекул матрикса СОЬ2А1 и аггрекана как на соседних с повреждениями участках, так и на значительном расстоянии от центра повреждения.

6. При ОА-подобных повреждениях хряща, происходит повышение активности расщепления коллагена 2 типа, сопровождающееся повышением экспрессии коллагеназ ММР-1, -14 (МТ1-ММР), аггреканазы АОАМТ8-5; цитокинов интерлейкинов-1 (1Ь-1) а /|3 и фактора некроза опухолей а (Т№а); а также увеличением экспрессии генов, связанных с гипертрофией хондроцитов СОЫОА1, ММР-13, ММР-9, ШЬ и каспазы 3 в непосредственной близости от повреждений. Каспаза 3 и АХ)АМТ8-5 экспрессируются исключительно в центре повреждения хрящевой ткани.

7. Усиление расщепления коллагена в локусах образования ранних повреждений хряща сопровождается не только усилением экспрессии генов, ответственных за разрушение матрикса, но и генов, связанных с конечной дифференцировкой хондроцитов в ростковой пластинке. Поэтому дифференцировка хондроцитов является ранним событием, связанным с повреждением хряща, которое происходит при ОА.

8. На неповрежденных участках хряща не наблюдается ни усиленного расщепления* коллагена, ни избыточной экспрессии генов; связанных с различными фазами, дифференцировки хондроцитов ростковой пластинки.

9. Совместным воздействием ростовых факторов; а именно ТОБр2, РОР-2 и инсулином, активность разрушения коллагена значительно ингибируется в эксплантатах суставного хряща больных ОА. ТОБр2 наиболее эффективно предотвращает разрушение хряща: В суставных хондроцитах хрящей больных ОА подавление избыточного расщепления' коллагена этими ростовыми факторами как в комбинации, так и исключительно ТОБр2 сопровождается уменьшением экспрессии генов, связанных с гипертрофией хондроцитов, а также увеличением экспрессии простагландин Е синтазы (РОЕ8-1) и освобождением в среду простагландина Е2 (ТСЕ2).

10. РвЕ2 при низкой концентрации также способен значительно подавлять расщепление коллагена, уменьшая при этом экспрессию ММР-13, ММР-1, цитокинов и маркера гипертрофии хондроцитов СОЫОА1. Тот факт, что напроксен, неспецифический ингибитор циклооксигеназы (СОХ) -1 и -2, способен противодействовать влиянию ТОБр2 в подавлении расщепления коллагена, свидетельствует о том, что РОЕ2'опосредует действие этого ростового фактора. РвЕ2 в концентрации значительно меньшей, чем при воспалительном процессе, обладает хондропротективными свойствами, селективно подавляя расщепление коллагена и функционально связанную с ним гипертрофию суставных хондроцитов в хряще больных ОА.

11. Дифференцировка хондроцитов предшествует разрушению коллагена в нормальном хряще при воздействии агентов, способных стимулировать коллагеназную активность. Одним из таких агентов является обнаруженный нами пептид коллагена 2 типа - СВ12-2. Пептид коллагена 2 типа - СВ12-2. Пептид СВ12-2 присутствует в значительных концентрациях в хряще больных ОА и обладает способностью увеличивать активность расщепления коллагена 2 типа коллагеназой.

12. В здоровом суставном хряще расщеплению коллагена в присутствии СВ12-2 предшествует увеличение пролиферативной активности хондроцитов,с последующей экспрессией генов терминальной дифференцировки хондроцитов и увеличением числа апоптозных клеток. Подавление экспрессии гипертрофного фенотипа суставных хондроцитов ростовыми факторами в сочетании с СВ12-2 предотвращает избыточное расщепление коллагена и ингибирует экспрессию протеиназ, цитокинов и белков, сопряженных с гипертрофией хондроцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Здоровье суставного хряща определяется целостностью внеклеточного-матрикса и жизнеспособностью хондроцитов, продуцирующих этот матрикс в результате своей жизнедеятельности. Основу поддержания целостности" суставного хряща составляет ремоделирование ВКМ хондроцитами. С точки зрения молекулярной биологии здоровый хрящ характеризуется очень низким уровнем экспрессии коллагена 2 типа, отсутствием экспрессии коллагенов 1, 3 или 10 типов, относительно высоким кругооборотом аггрекана и очень ограниченной репликацией хондроцитов [34, 36-38, 326, 175, 409]. Он также характеризуется ограниченной экспрессией TGFßl и полным отсутствием экспрессии TGFß2, FGF-2, инсулинового ростового фактора (IGF)-l и Ihh, а также очень малой скоростью апоптоза хондроцитов [350, 82, 246, 227]. В целом взрослый суставной хрящ обычно классифицируется как пост-митотическая ткань с незначительной активностью обменных процессов [35]. Более того; усиление митотической активности клеток в хряще больных ОА [339, 257, 36] может быть более разрушительным, чем созидательным для ткани, поскольку образующиеся кластеры не способствуют анаболическим процессам в матриксе [34] и не компенсируют потерю клеток на других участках хряща.

С возрастом и/или при дегенеративных заболеваниях хряща, таких как остеоартроз, нарушается целостность ВКМ вследствие нарушения функционирования хондроцитов, продуцирующих матрикс. Существуют две основные теории патогенеза ОА. Наиболее ранней является теория патогенеза первичного ОА в результате кумулятивного эффекта длительного механического изнашивания хряща с аккумулированием циклов нагрузки [40]. Эта гипотеза предусматривает непрерывную микротравматизацию хряща в процессе физиологической нагрузки и перегрузках, которые приводят к повторяющемуся повреждению ВКМ и завершаются полным разрушением ткани. В этом случае любая терапия в значительной степени бесполезна.

Другая теория рассматривает разрушение хряща при развитии ОА, как результат прогрессирования возрастных повреждений хрящевого матрикса в результате механической нагрузки, а также ферментативной активности разрушающих ферментов (коллагеназ, аггреканаз итд.). При этом механизм разрушения хряща при ОА заключается в нарушении баланса анаболических и катаболических процессов с преобладанием последних. Поэтому, если поврежденные молекулы не замещаются вновь синтезированными, создается угроза нарушения функциональной целостности ВКМ. В суставном хряще это прежде всего относится к коллагену и протеогликану, а также другим молекулам матрикса - фибронектину, декорину, бигликану и т. д., хотя изменения их кругооборота мало изучены. В этом случае восстановление хряща возможно при условии восстановления его активных репаративных функций.

При повреждении хряща активируются протеиназы матрикса вследствие усиленной продукции цитокинов, таких как 1Ь-1р и Т№а, а также нарушается баланс соотношения уровней протеаза/ингибитор, которые приводят к усилению активности металлопротеиназ (ММР) [116]. В связи с этим, как было изложено ранее, для лечения ОА используются противовоспалительные препараты или препараты, основой действия которых является подавление ферментов, вызывающих деструкцию хряща, в частности коллагеназ и других ММР, а также провоспалительных цитокинов.

Однако, учитывая сложную систему регуляции всех внутриклеточных процессов, представляется маловероятным, что нарушение лишь одного звена, а именно усиление активности ММР цитокинами, может привести к полному необратимому разрушению ткани. В связи с этим поиску глубинных причин процесса, лежащего в основе разрушения суставного хряща при ОА было посвящено данное исследование.

Мы предположили, что в основе разрушения суставного хряща при ОА могут лежать те же механизмы деградации ВКМ, которые включаются в гипертрофных хондроцитах ростковой пластинки при эмбриональном и раннем постэмбриональном развитии. Это предположение базируется на факте о том, что при нормальной эндохондральной оссификации гипертрофные хондроциты резорбируют ВКМ посредством активации коллагеназ и других ферментов, расщепляющих компоненты матрикса, а затем погибают в результате клеточного апоптоза, освобождая место для остеобластов, формирующих кость.

Для проверки этого предположения нами были проведены исследования, тестирующие адекватность нашей гипотезы на уровне, как экспрессии генов, так и продукции соответствующих белков и их активности. В частности, мы определили круг генов, экспрессия которых преимущественно связана со взаимоисключающими процессами пролиферации и терминальной дифференцровки (гипертрофии) хондроцитов ростковой пластинки. В дальнейшем мы показали, что усиление экспрессии генов терминальной дифференцировки/гипертрофии хондроцитов ассоциировалась с повышенной активностью расщепления коллагена при фокальных повреждениях хряща при возрастных повреждениях суставного хряща, которая имеет сходство с ранней стадией заболевания ОА. С другой стороны, ингибирование тех же генов терминальной дифференцировки/гипертрофии хондроцитов происходило при подавлении активности расщепления коллагена как посредством ростовых факторов, в том числе как ТОР|32, так и РОЕ2. Наконец, индукция активности расщепления коллагена в здоровом хряще животных и человека также сопровождалась усилением экспрессии генов терминальной дифференцировки/гипертрофии хондроцитов и продукцией соответствующих белков.

В частности, наши исследования уровня экспрессии генов хондроцитами ростковой пластинки выявили 2 группы генов. Эти гены активируются либо при пролиферации, либо при терминальной дифференцировке (гипертрофии) хондроцитов. При этом экспрессия РТНгР и FGF-2 наблюдается только при пролиферации. Напротив, на этапе дифференцировки в гипертрофной зоне экспрессировалась другая группа генов, а именно СОЫОА1, Gbfal, ММР-9, Ihh и TGFpl. Такие гены, как, TGFP2, ММР-13, циклин В2 и Sox-9 имели максимумы экспрессии как в пролиферативной зоне, так и в более мощный в гипертрофной зоне ростковой пластинки.

Хотя здоровый суставной хрящ состоит из одного типа клеток — хондроцитов, эти клетки неоднородны и находятся на разных уровнях дифференцировки, которые выделяют в морфотипы. Их формирование происходит в эмбриогенезе при эндохондральной оссификации: хрящевой рудимент активно замещается костью, а когда необходимо сформировать суставной хрящ из остатков рудимента, процессы в ростковой пластинке резко замедляются. Именно поэтому строение хряща напоминает строение ростковой пластинки. При этом хондроциты фиксируются на определенной фазе дифференцировки. При OA, когда процесс дифференцировки возобновляется, каждый хондроцит продолжает свою программу в зависимости от того, на какой стадии он был остановлен. Поэтому в образцах хряща, содержащего все его зоны, наблюдается экспрессия генов, связанных как с пролиферацией, так и с гипертрофией эмбриональных хондроцитов. Однако на участках повышенной активности коллагеназы и резорбции матрикса преобладает экспрессия генов, ассоциированных с гипертрофной зоной ростковой пластинки.

Поскольку OA развивается преимущественно у пожилых людей и тесно связан со старением организма [35], в деградации хрящевой ткани следует различать процессы, связанные со старением (aging) или дряхлением (senescence). Клеточным дряхлением является состояние митотического ареста, который усиливается активностью опухолевых генов- супрессоров р!6 и р21. Митотический арест в дряхлеющих клетках необратим и поэтому отличается от форм временного ареста роста, характерного для большинства пост-митотических тканей. Дряхление может наступать при достижении предельного числа делений (число Хайфлика) или в результате эрозии теломеры (репликативное дряхление), а также при окислительном повреждении ДНК или других компонентов, клетки (дряхление, индуцированное стрессом) [35]. Фенотипические изменения в дряхлеющих клетках включают низкий митотический индекс, ослабление реакции на ростовые факторы и цитокины, суперпродукцию р16 и р-галактозидазной активности [166, 225, 273]. Остеоартрозные хондроциты, вероятно, обладают фенотипом старения, поскольку частично возможна его реверсия блокированием экспрессии р16 [464].

Кроме того, ОА-подобные повреждения хряща часто наблюдаются в процессе старения организма. Ранние макроскопические фокальные повреждения, которые значительно более выражены, чем изученные нами в данном исследовании, характеризовались усиленным расщеплением коллагена посредством коллагеназ, приводящим к потере коллагена и протеогликанов [374]. Это сопровождалось усилением синтеза и кругооборота матрикса. В данной работе мы также наблюдали градиент гистологического и молекулярного повреждения, который распространялся из центра повреждения,и в дальнейшем мог распространяться на здоровый хрящ. Поэтому мы предположили, что если разрушение хряща является, результатом терминальной дифференцировки хондроцитов, начало этого процесса является очень ранним событием в процессе формирования повреждения.

Ранний ОА характеризуется фокальными повреждениями хряща с потерей матрикса по механизму, который включает усиление протеолиза и синтеза матрикса одновременно [373]. На ранних этапах локальное увеличение активности ММР, которое происходит в результате повышения, экспрессии коллагеназ ММР-13 и ММР-1, а также АХ)АМТ8-5,1Ь-1а/р, но не ТЫРа связано с очень ранними дегенеративными изменениями хряща регистрируемыми гистологически) и с терминальной дифференцировкой хондроцитов, экспрессирующих COLlOAl и каспазу 3. Это означает, что резорбция ВКМ-при участии этих протеиназ и цитокинов является ранним событием в патологии разрушения гиалинового хряща и тесно связана с изменениями фенотипа хондроцитов.

Наше исследование также показало; что гены, которые участвуют в дифференцировке хондроцитов при морфогенезе, экспрессируются в зонах очень ранних фокальных повреждений, выявляемых как зона повышенной активности расщепления коллагена 2 типа (по сравнению с фоновым уровнем) совместно с ранней дегенерацией ткани (степень 3 и выше по Манкину). Детальный анализ локальных повреждений на ранней фазе их формирования, приведенный для трех пациентов, показал, что расщепление коллагена часто связано с зоной повреждения или усиливается вблизи нее и сопровождается экспрессией генов, связанных с дифференцировкой хондроцитов, а именно COLlOAl, TGFpl, Ihh, ММР-9, каспазы 3, РТНгР и FGF-2. В менее поврежденных зонах и вдали от повреждения (более 2 срезов от центра) гены поздней дифференцировки обычно не экспрессируются, включая каспазу 3, тогда как экспрессия TGFp2, РТНгР и циклин В2 обычно наблюдаются. Коллагеназы ММР-1 и МТ1-ММР обычно экспрессировались в связи с повреждением и/или вблизи него, как и ADAMTS-5 - аггреканаза, способная расщеплять аггрекан [98]. Экспрессия ММР-13 наблюдалась в 1/3 повреждений и в 1/3 неповрежденного хряща. Цитокины IL-1|3 и TNFa экспрессировались в зоне повреждения или вблизи него. IL-la в большинстве случаев не экспрессировался. Следовательно, экспрессия коллагеназ, аггреканаз и про-воспалительных цитокинов часто была связана с разрушенными частями хряща, но наблюдалась также и не только в зонах повышенной активности расщепления коллагена. Экспрессия аггрекана и COL2A1 обнаружена как в зоне повреждений, так и вдали от них.

Экспрессия каспазы 3, которая наблюдается в гипертрофной и в ранней пролиферативной зонах в бычьей ростковой пластинке, где она коэкспресировалась с ММР-13 (ЧетинаЕ.В. и Пул А.Р., неопубликованнные данные) была всегда связана с повышенной коллагеназной активностью на ранней стадии повреждения. Как и экспрессия ADAMTS-5, экспрессия каспазы 3 никогда не наблюдалась вдали от зоны повреждения. В целом наличие в. области ранних повреждений хряща экспрессии генов, которые обычно не детектируются к здоровом хряще, позволяют заключить, что на этих участках хрящ уже более нельзя считать здоровым.

Увеличенная активность расщепления коллагена на очень ранних стадиях повреждения хряща сопровождается выраженной экспрессией генов, связанных с дифференцировкой хондроцитов, тех же что и в фетальной ростковой пластинке. Следовательно, с суставными хондроцитами могут происходить фенотипические изменения, сходные с таковыми у хондроцитов ростковой пластинки в гипертрофной зоне при их терминальной дифференцировке.

Экспрессия генов, связанных с дифференцировкой хондроцитов, которая не сопровождалась расщеплением коллагена и деградацией матрикса (степень 1 по Манкину), может происходить в результате изменения нагрузки и/или ремоделирования матрикса, которые могут предшествовать проявлению фенотипа заболевания, характеризующегося повышением коллагеназной активности. Превратятся ли эти предшествующие заболеванию изменениям постоянную патологию - ОА, зависит от того, смогут ли клетки вернуться к «здоровому» состоянию или будут продолжать свою дифференцировку к гипертрофии, приводящей к разрушению матрикса и заболеванию. Те участки, в которых наблюдается увеличенная коллагеназная активность, разрушение хряща, а также увеличение экспрессии COLlOAl, каспазы 3, ADAMTS-5 и IL-la/p и уменьшение экспрессии аггрекана могут представлять ранний этап заболевания.

В целом наши результаты исследования возрастных, сходных с ОА, повреждений на ранней стадии их формирования свидетельствуют о сходстве процессов, происходящих в ростковой пластинке в процессе дифференцировки хондроцитов при эндохондралыюй оссификации и теми, что наблюдаются при формировании возрастных фокальных повреждений хряща, подобных ОА. В обоих случаях разрушению хрящевого матрикса предшествует увеличение экспрессии генов, связанных с фазой пролиферации хондроцитов, а именно PTHrP, FGF-2, TGFpi/2, а также макромолекул матрикса COL2A1 и аггрекана, которые наблюдались, как в пролиферативной зоне ростковой пластинки, так и на соседних с повреждениями участках или на значительном расстоянии от центра фокального повреждения на ранней стадии. Напротив, в зонах активного разрушения матрикса, как в гипертрофной зоне ростковой пластинки, так и вблизи центра фокального повреждения на раннем этапе его формирования наблюдался высокий уровень экспрессии коллагеназ ММР-1, -14 (МТ1-ММР), аггреканазы ADAMTS-5, цитокинов IL-la /|3 и TNFa, а также генов, связанных с гипертрофией хондроцитов COLlOAl, ММР-13, ММР-9, Ihh и каспазы 3.

Результаты, представленные здесь, показывают, что на ранней стадии повреждения суставного хряща его разрушение включает в себя увеличение активности расщепления коллагена и сопровождается экспрессией генов, тесно связанных с дифференцировкой хондроцитов. Обратимо ли это изменение - пока неясно. Следовательно, дифференцировка хондроцитов может представлять раннее событие в процессе разрушения хряща, приводящее к резорбции матрикса.

На следующем этапе наше предположение о том, что в основе разрушения хрящевой ткани при ОА лежит процесс дифференцировки хондроцитов, нашло подтверждение в опытах по искусственной индукции разрушения коллагена здорового суставного хряща пептидом коллагена 2 типа. Пептид, который мы исследовали в данной работе, экспонируется в больших количествах в хряще больных ОА [454]. Расчеты количества этого пептида на основе анализа денатурации коллагена 2 типа в хряще больных

OA [180] показали его содержание в пределах 10-25 мкМ, т.е. в той концентрации, при которой наблюдалась его активность in vitro.

В здоровом суставном хряще взрослого человека дифференцировка хондроцитов не наблюдается в некальцифицированной зоне хряща [62], хотя она отмечена в кальцифицированном хряще вблизи субхондральной кости. Однако как описано выше, усиленная резорбция коллагена матрикса, связанная с пролиферацией клеток и гипертрофией хондроцитов и приводящая к опосредованному коллагеназой расщеплению коллагена 2 типа, сопровождается увеличением содержания денатурированного коллагена 2 типа, что также происходит в ростковой пластинке [292]. Более того, ингибирование ММР-13, коллагеназы, ответственной за большую часть активности расщепления коллагена в суставном хряще [111] и ростковой пластинке, также приводит к подавлению гипертрофии хондроцитов в ростковой пластинке [441]. В случае здоровых хрящей быка и человека оказалось, что похожая цепочка-клеточных превращений происходит при культивировании хряща в присутствии коллагеного пептида и проявляется в способности пептида СВ12-2 индуцировать сначала пролиферацию хондроцитов, затем терминальную дифференцировку, которая сопровождается усиленной резорбцией и экспрессией генов COLlOAl и ММР-13 с последующим апоптозом.

В целом, хондроциты бычьего суставного хряща вначале отвечают на действие СВ12-2 появлением пролиферативных антигенов, о наличии которых свидетельствует усиление окрашивания анти-PCNA и анти-Кл67 на 1-е сутки в средней и глубокой зонах, которое сопровождается повышенной экспрессией ММР-13. Далее, на 4-е сутки хондроциты экспрессируют характерный маркер гипертрофии - COLlOAl, что сопровождается появлением коллагена 10 типа в средней зоне и поддержанием повышенного уровня экспрессии ММР-13. В то же время и в тех же участках мы наблюдали, начиная с 4-х суток и далее, повышение активности расщепления коллагена 2 типа, на что указывает окрашивание с использованием антител к коллагену 2 типа и усиление коллагеназной активности, измеряемой С2С методом. К 4-6 суткам эти изменения распространяются на поверхностную зону, где происходит смерть клеток посредством апоптоза - маркера терминальной дифференцировки хондроцитов. Причиной того, что апоптоз наблюдается только в поверхностной зоне в связи с усиленным расщеплением коллагена, может быть следствием того, что в этой области коллаген является наиболее восприимчивым к деградации и является наиболее денатурированным при ОА [181].

Изменения, выявленные в эксплантатах бычьего суставного хряща в присутствии пептида СВ12-2, напоминают связанные с гипертрофией изменения, наблюдаемые в суставном хряще при его деградации у человека при ОА и в модельных опытах на животных [325]. Эти изменения в основном происходят в поверхностной и средней зонах. Они включают увеличение объема хондроцита [94], что свойственно гипертрофным хондроцитам ростковой пластинки, что, однако, в наших эксплантатах не наблюдалось. Кроме того, появляется большое количество денатурированного коллагена 2 типа [181] вследствие усиленного расщепления тройной спирали этого коллагена [74]. Также происходит продукция коллагена 10 типа [421], аннексинов 2, 5, 6, и 8 [215, 312], кластерина [108], РСИА, синдекана-3, и щелочной фосфатазы [312]. Напротив, апоптоз, наблюдаемый в глубокой зоне, по-видимому, не относится к гипертрофии хондроцитов, индуцированной пептидом, поскольку он наблюдается и в контрольных культурах.

Таким образом, полученные нами результаты показывают, что достаточная деградация и денатурация коллагена 2 типа с экспозицией скрытых последовательностей, которые могут встречаться как при эндохондральноой оссификации, так и при ОА, возможно, оказывают существенное влияние на фенотипическую экспрессию хондроцитов. Прежде сообщалось, что обработка хряща коллагеназой также приводит к индукции апоптоза [210]. Этому может также предшествовать гипертрофия хондроцитов. Эти данные вместе с недавно продемонстрированной нами функциональной связью между гипертрофией и усиленным расщеплением коллагена 2 типа в хряще больных ОА проясняет молекулярные и клеточные связи между гипертрофией и усиленным расщеплением коллагена в здоровом хряще и при заболевании.

Ингибирование разрушения суставного хряща является наиболее важным показателем эффективности лечения ОА, поскольку в настоящее время выбор лечебных средств очень ограничен. Так как в отличие от потери протеогликана, разрушение коллагена 2 типа считается необратимой стадией разрушения хряща при ОА [325], ингибирование этого процесса является важным этапом прекращения деградации хрящевой ткани. В настоящее время частично противодействовать разрушению ВКМ удавалось путем прямого ингибирования ММР и аггреканаз синтетическими молекулами или доксициклином [335, 443, 138, 85]. Вместе с тем отмечалось, что такие ингибиторы могут быть причиной побочных эффектов в скелетных мышцах и приводят к скованности в суставе, его фиброплазии, а также аккумуляцию коллагена 1 типа [335]. С другой стороны, учитывая возможное вовлечения ремоделирования субхондальной кости, были сделаны попытки анти-резорптивной терапии субхондральной кости кальцитонином или бисфосфанатами [84,143,144,256, 293, 186], а в настоящее время проверяется влияние остеопротегерина и антител к КАМСЬ [310]. Однако эти попытки не дали однозначных результатов в отношении протекции хряща, хотя отмечался анти-резорбтивный эффект на уровне субхондральной кости [96, 371].

Поскольку в результате наших исследований обнаружены сходства между разрушением коллагена 2 типа при ОА и в гипертрофной зоне первичной ростковой пластинки, как например, повышение активности расщепления коллагена 2 типа коллагеназами, и экспрессия генов, связанных с гипертрофией хондроцитов, противодействовать разрушению матрикса оказалось возможным посредством ингибирования гипертрофии. При этом гипертрофия хондроцитов является процессом, который может быть остановлен в нескольких критических точках. Такими ключевыми пунктами является верхне-пролиферативная зона, дальнейшее продвижение по которой может быть заблокировано смесью ростовых факторов ТСБР2, БОР-2 и инсулина или каждым по отдельности, а также верхняя гипертрофная зона;, блокируемая РТНгР и ШЬ [383]. Использование механизма ингибирования гипертрофии является, стратегией, стимулирующей анаболические процессы в хряще. Преимущество ее состоит в том, что ингибирование патологического процесса потери коллагена матрикса происходит не под непосредственным воздействием агента на активность протеиназ, а в результате изменения фенотипа хондроцитов больных ОА на более здоровый.

В связи с этим интересно было наблюдать, что снижение активности расщепления коллагена 2 типа индуцируется теми же ростовыми факторами, которые подавляют гипертрофию хондроцитов ростковой пластинки в культуре клеток [80, 383]. Из трех исследованных ростовых факторов ТОБр2 оказался наиболее эффективен в подавлении расщепления коллагена 2 типа. Он также подавлял экспрессию генов, связанных с гипертрофией хондроцитов, таких как СОЫОА1, ММР-9 и РТНгР, а также ММР-13 -коллагеназы, которая основным ферментом, разрушающим ВКМ в хряще при ОА [75, 111]. Поэтому ингибирование расщепления коллагена посредством ТОБР2 включает подавление терминальной дифференцровки хондроцитов.

В случае РТНгР в некоторых случаях наблюдалось слабое увеличение его экспрессии. В целом это благоприятно для подавления любого прогрессирования гипертрофии, поскольку РТНгР сам является маркером пролиферации хондроцитов й ингибирует их терминальную дифференцировку [431].

Об особом значении Тврр в поддержании гомеостаза здорового суставного хряща свидетельствовали генетические эксперименты на мышах, в которых использовались мутации, приводящие к гиперпродукции дефектного рецептора 2 типа TGFP [358] или к делетированию компонента» сигнального пути SMAD — 8 экзона Smad3 [452]. В обоих случаях одним из проявлений генетических изменений была деградация и потеря суставного хряща у стареющих животных, сходная с таковой при ОА у человека. Это сопровождалось развитием обширных зон гипертрофии хондроцитов и образованиемболыних остеофитов. Более того, мыши, нокаутированные по TGEP2, имели множественные скелетные дефекты, которые приводили к уменьшению размеров нормальных тканей в процессе эндохондрального образования костей [349]. Эти мыши отличались от мышей, нокаутированных по TGFpl, у которых развивалось ауто-иммунное воспалительное заболевание [366].

Хотя трудно предсказать насколько соответствуют результаты исследований in vitro тому, что происходит in vivo, имеющиеся данные позволяют предположить, что наличие TGF|32 также благоприятно для формирования и поддержания суставного хряща in vivo. Это подтверждается тем, что TGFP2 наиболее высоко экспрессирутся по сравнению с другими изоформами TGFp во всех зонах развивающихся костей человека и его экспрессия уменьшается во взрослом суставном хряще у крыс, когда происходят его дегенеративные изменения [150]. Поскольку ОА встречается, главным образом, у лиц пожилого возраста, дефицит TGFP2 может также способствовать деградации хряща. Это подтверждается тем, что TGFP2 значительно снижается на последней стадии ОА, как у человека [417,418], так и при экспериментальном ОА у животных [74].

Мы не наблюдали катаболического действия TGFp2 в суставном хряще при ОА. Между тем этот ростовой фактор может оказывать деструктивное действие в нормальном суставном хряще, поскольку при внутрисуставной иньекции TGFP2 в высокой концентрации (1мкг) наблюдались' катаболические изменениям в здоровых суставах кроликов, вызывая их припухание, пролиферацию фибробластов синовиальной мембраны и значительную потерю протеогликана хряща [136].

Наблюдаемое подавление экспрессии* ММР-13 и сокращение расщепления коллагена посредством TGF(32 также согласуется с наблюдением, о том, что семейство TGFP может ингибировать экспрессию ММР-13 [365]. Напротив, другие авторы сообщали, что TGFp-1 и-2 могут индуцировать экспрессию коллагеназы [281].

Хотя сам TGFp2 более эффективен в регуляции разрушения коллагена, чем другие ростовые факторы, комбинация нескольких ростовых факторов может производить более благоприятное действие in vivo, когда необходимо совместить ингибирование расщепления коллагена со стимулированием восстановления ВКМ. Так, например, у чувствительных пациентов инсулин может стимулировать восстановление ткани, поскольку он является главным анаболическим агентом суставного хряща [401]. FGF-2 также может способствовать восстановлению хряща [432, 448]. Кроме того, комбинации этих или других ростовых факторов оказывают синергическое действие в поддержании синтеза компонентов ВКМ в суставном хряще или ростковой пластинке [446]. Напротив, сам TGFP2 может не обладать способностью восстановления анаболических функций, поскольку сообщалось, что он подавляет синтез коллагена 2 типа и аггрекана [80, 136].

В нашем исследовании in vitro TGFP2 ингибирует экспрессию IL-ip и

TNFa, которые как и остальные исследованные гены, а именно COLlOAl,

ММР-13, -9, РТНгР, обычно не экспрессируются в нормальном суставном, хряще [37]. При этом подавление экспрессии цитокинов IL-lp и TNFa важно, поскольку они являются катаболическими факторами при OA и ингибирование этих цитокинов также способно подавлять коллагеназную активность и разрушение протеогликанов в хряще при OA [221]. Кроме того, показана способность TGFpi противодействовать катаболическому действию

1Ь-1р паракринового происхождения в суставных хондроцитах грызунов [350, 351,369, 408].

Повышение*экспрессии простагландин Е синтазы 1 (РСЕ8-1), а также освобождение в среду РОЕ2 под действием ТОРР2, наблюдаемое нами, согласуется с сообщением об^увеличении содержания РОЕ2 в здоровом суставе кролика после внутри-артикулярного введения трансформирующего^ фактора роста Р2 [135]. Ингибирование терминальной дифференцировки, хондроцитов посредством РОЕ2 отмечалось также в опытах на животных [238, 462]. Наши результаты показывают, что увеличение экспрессии РОЕ8-1 и образование РОЕ2 происходит в связи с ингибированием расщепления коллагена.

Следовательно, результаты проведенных исследований показывают, что активное расщепление коллагена в эксплантатах суставного хряща при ОА может быть подавлено ТОрр2. С этим процессом связаны такие клеточные механизмы, как ингибирование гипертрофии и экспрессии 1Ь-1р и ЮТа и увеличение продукции РОЕ2. Поскольку ТОБр2 может благоприятствовать формированию прегипертрофного фенотипа, лекарственные препараты, способные регулировать дифференцировку хондроцитов могут быть эффективны для лечения разрушения хряща у больных ОА.

РОЕ2 может оказывать на суставные хондроциты, как катаболическое, так и анаболическое действие. Циклооксигеназа-зависимые простагландины участвуют в различных физиологических процессах, включая мужскую плодуктивность, менструации, овуляцию, беременность, имплантацию, а также и в патологических процессах при различных воспалительных заболеваниях и неоплазиях, таких как артриты и рак [249]. О потенциальном патологическом действии РОЕ2 на суставной хрящ также сообщалось.ранее [56].

В наших исследованиях при низких концентрациях 10пг/мл РвЕ2 оказался способен селективно ингибировать повышенную активность расщепления коллагена, которая наблюдается при культивировании хрящей больных ОА. Это сопровождалось подавлением экспрессии коллагеназ ММР-1 и ММР-13; цитокинов IL-1J3, TNFa и маркера гипертрофии COLIOAI.

Ранее сообщалось,.4TO PGE2 подавляет дифференцировку/гипертрофию хондроцитов в онтогенезе [238, 462]. Нам удалось показать, что это ингибирующее действие распространяется на патологию, включающую усиленное расщепление коллагена в суставном хряще человека при ОА. Ингибирующее действие PGE2 в эксплантатах хрящей больных ОА, вероятно, связано с ингибирующим действием TGFJ32, которое сопровождается увеличением синтеза PGE2 [249].

Эти данные, а также ингибирующее действие напроксена - ингибитора циклооксигеназы, который снимает хондропротективное действие TGF(32 на деградацию коллагена в хрящах больных ОА, указывают на то, что PGE2 является медиатором хондропротективного действия TGF(32 в хряще больных ОА. Поэтому наши исследования подтверждают предположение, что PGE2 может опосредовать ингибирующее действие TGF02 .на деградацию коллагена в хряще больных ОА.

Ингибирующее действие PGE2 наблюдалось только при концентрациях значительно ниже тех, что зарегистрированы при воспалительном процессе [268]. Как сообщалось, PGE2 ответствен, как за катаболические, так и за анаболические изменения в суставном хряще [53, 268]. Он способен ингибировать синтез коллагена хондроцитами ростковой пластинки [305], опосредовать производство ММР в суставных хондроцитах и хряще [53, 305], ингибировать пролиферацию хондроцитов [78], усиливать экспрессию IL-1J3 [245] и индуцировать апоптоз [280]. С другой стороны, он также может ингибировать экспрессию коллагеназы и стромелизина [122, 345, 403], IL-lp и TNFa [93,403], стимулировать синтез коллагена и протеогликана [248, 263, 120], пролиферацию хондроцитов [248], ингибировать терминальную дифференцировку/гипертрофию хондроцитов [238, 462] и апоптоз в клетках эндотелия [140].

Взаимоисключающие последствия действия PGE2 на хондроциты могут зависеть от дозы агента [122, 158]. Наша экспериментальная система, содержащаяЛОпг/мл PGE2, оказывала хондропротекторное действие на эксплантаты суставного хряща больных ОА: подавляла расщепление коллагена и экспрессию генов, связанных с расщеплением коллагена, про-воспалительных цитокинов и гипертрофии. Она не усиливала пролиферацию хондроцитов, апоптоз, синтез коллагена 2 типа и простагландинов, как показывает отсутствие значительных изменений экспрессии циклина В2, каспазы 3, COL2A1, СОХ-2 и PGES-1, соответственно. В настоящее время неясно, почему такие низкие дозы являются хондропротекторными. Для этого необходимо провести исследования по анализу рецепторов, которые позволят объяснить это наблюдение.

Наконец важно отметить, что в присутствии физиологических доз TGF02 [321] или PGE2 не только хондроциты больных ОА способны возвращаться к более здоровому фенотипу, сопряженному с ослаблением деградации коллагенового матрикса, но и остеобласты, поскольку те же концентрации PGE2 увеличивали активность щелочной фосфатазы, ключевого медиатора формирования кости [158, 354]. Поэтому наши результаты ставят под сомнение целесообразность полного ингибирования циклооксигеназы ввиду протективной роли очень низких концентраций PGE2. Несомненно, низкие концентрации должны поддерживаться in vivo для защиты скелета, а не элиминироваться большими дозами ингибиторов.

Таким образом, хондроциты суставного хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым в фетальных хондроцитах. При этом происходит повышение экспрессии аналогичных генов, связанных с пролиферацией и гипертрофией хондроцитов, как в ростковой пластинке. Дифференцировка хондроцитов, вероятно, лежит в основе развития остеоартроза. Ее можно инициировать агентами, индуцирующими первичное расщепление коллагена коллагеназой. Разрушение матрикса суставного хряща больных ОА, как и дифференцировку хондроцитов ростковой пластинки, можно остановить действием ростовых факторов, в особенности ТОрр2, или РОЕ2. Это сопровождается ингибированием маркерных генов дифференцировки и подавлением активности расщепления коллагена коллагеназой.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Четина, Елена Васильевна, Москва

1. Алексеева JIM., Зайцева ЕМ Остеоартроз и остеопороз. // Медицина 2006. - Т. 16.-С. 2-7.

2. Жилкин Б.А., Докторов A.A., Денисов-Никольский Ю.И. Минеральный компонент гиалинового хряща.//Биомедицинские технологии М. - 2002. - С. 140-146.

3. Каменев Ю.Ф., Башенов НД. Теория и практика лечения болевого синдрома при деформирующем артрозе крупных суставов.// Конспект практического врача.-М 1997.-16 с.

4. Ким Зон Чхол, Быков В.А., Николаева С.С. и др. Изменения биохимических характеристик коллагена и состояния воды хряща при остеоартрозе.// Вопр. мед. химии.- 2001. Т. 47, №5. - С. 498-505.

5. Ким Зон Чхол., Быков В А, Николаева С.С. Состояние воды в гиалиновом хряще и его основных компонентах.// Биомедицинские технологии. — М. — 2000. Т. 14. - С. 85-90.

6. Клионер М.Л. Старческие и дегенеративные изменения в суставах и позвоночнике.// М. 1962. - 151 с.

7. Копьева Т.Н., Бельская О.Б., Остаренко М.Г. и др. Морфология суставного хряща при остеоартрозе.// Архивы патологии.- 1986.- Т. 48.- С. 40-46.

8. Копьева Т.Н., Мульдияров П.Я., Бельская О.Б. и др. Структура суставного хряща в пожилом возрасте.//Архивы анатомии, гистологии и эмбриологии.- 1983,- Т. 85. -С. 60-67.

9. Коршунов Н.И., Марасаев В.В., Баранова Э.Я. и др. Роль воспаления и оценка хондропротективного действия Афлутопа у больных остеоартрозом по данным магнитно-резонансной томографии коленного сустава.//Ревматология. М. - 2003. - № 23. - С. 13201323.

10. Лила A.M. Современные* аспекты диагностики илечения остеоартроза.// Русский медицинский журнал. 2007. - №-5, -Т. 15. — С. 331-334.11". Маколкин В.И., Пак Ю.В., Меньшикова И.В.

11. Коксартроз: этиология, эпидемиология, клинические проявления и новые подходы к терапии.// Терапевтический Архив.- 2007, Т.- 79. -С. 81-85.

12. Мажуга П.М. Клеточные механизмы дифференцировки суставного хряща. // Цитология и генетика. -1996.- Т.- 30. С. -3-10.

13. З.Миронов С.П., Омельяненко Н.П, Семенова Л.А. и др. Структурные изменения суставного хряща при остеоартрозе.// Биомедицинские технологии. -2004.- Т.23.-С.91-105.

14. Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Семенова Л.А., и др. Остеоартроз. Структурная характеристика и клинические проявления.// Актуальные проблемы теоретической и клинической остеоартрологии М. -2005. — С. 301-335.

15. Миронов СП., Омельяненко Н.П., Орлецкий А.К. и др. Остеоартроз: современное состояние проблемы (аналитический обзор).// Вестн. травматол. ортопед. — 2001. № 2. — С. 96- 99.

16. Насонов Е.Л. Остеопороз и остеоартроз: взаимодействующие или взаимоисключающие болезни?// Консилиум.- 2000.- № 2- С. 248-250.

17. Насонова В.А. Проблемы остеоартроза в начале XXI века.// Consilium medicum. 2000. - № 6.- Т. 2. - С. 244-248.

18. Николаева С.С, Ким Зон Чхол, Быков В.А., и др. Влагообменные процессы в гиалиновом хряще и его основных компонентах в норме и остеоартрозе// Вопр. мед. химии. 2000. - Т. 46, № 6. — С. 581— 590.

19. Николаева С.С., Ким Зон Чхсш, Быков В А и др. Биохимические и влагообменные характеристики поверхностного слоя суставного хряща человекаУ/ Бюллетень эсперем. биолопш и медицины. 2002.-Т. 134.- № 10.-С. 390-392.

20. Оганесян 0:В., Семенова JI.A., Хапилин А.П., и др. Применение препаратов гиалуроновой кислоты для лечения остеоартроза.// Вестник травматологии и ортопедии. 2007. - №* 2. — С. 41-46.

21. Омельяненко HXL, Селезнев НВ., Семенова JI.А Формирование гиалиновой' хрящевой ткани* на поврежденных суставных концах сочленяющихся костей при пассивных движениях в суставе //Морфология. 2004.— № 4.- С. 95:

22. Омельяненко НИ, Семенова J1A. Возрастная динамика пограничных слоев суставного хряща человека//Морфология. —2004.—№ 4.—С. 96.

23. Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Шерепо КМ и др. Морфология тканевых компонентов тазобедренного сустава у экспериментальных животных при моделировании остеоартроза.//Вестник травматологии и ортопедии 2006-№ 1-С-57-63.

24. Павлова В.Н., Копьева Т.Н., Слуцкий Л.И. др. Хрящ.// М. - 1988. - 320 с.

25. Подрушняк Е.П. Возрастные изменения суставов человека.//-Киев. -1972.-212 с.

26. Раденска-Лоповок С.Г. Остеоартроз: возможности морфологической диагностики.//Клиническая геронтология.- 2004.- Т. 10.- С. 46-47.

27. Слюсаренко Н.А., Капустин Л.Ф., Торба А.И. Функциональная морфология-коленного сустава у собак в норме и в условиях действия глюкозаминаУ/ Биомедицинские технологии. -1998. Вып. 9. - С. 44-48.

28. Goldring SR, Goldring MB.The role of cytokines in cartilage matrix degeneration in osteoarthritis.// Clinical Orthopaedics. — 2004/-V. 427 (Suppl).- P. S27-S36.

29. Benito MJ, Veale DJ, FitzGerald O. et al. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis.// Annals Rheum Dis. 2005.- V. 64.- P. 12631267.

30. Goldring MB. Update on the biology of the chondrocyte and new approaches to teating cartilage diseases.// Best Practice Res Clin Rheumatol.-2006.- V. 20.- C.-1003-1025.

31. Aigner T. Osteoarthritis.// Current Opin Rheumatol*.-2007.-V. 19.-P.427-428.

32. Aigner T, Gluckert K, von der Mark K. Activation of flbrillarcollagen synthesis and phenotypic modulation of chondrocytes in early human osteoarthritic cartilage lesions.// Osteoarthritis Cartilage.- 1997.- V. 5.-P. 183-189.

33. Aigner T, Haag J, Martin J et al. Osteoarthritis: Aging of matrix and cells -going for a remedy.// Curr Drug Targets.- 2007.- V. 8.- P. 325-331.

34. Aigner T, McKenna L. Molecular pathology and pathobiology of osteoarthritic cartilage.// Cell Mol Life Sei.- 2002.- V. 59.- P. 5-18.

35. Aigner T, Stoss Hj Weseloh G; Zeiler G, von der Mark K. Activation of collagen type ir expression in osteoarthritic and rheumatoid cartilage:// Virchows Arch.- 1992.- V.B62.-P. 337-345.

36. Aigner T, Zien A, Hanisch D, et al. Gene expression in chondrocytes-assessed with use of microarrays.// J Bone Joint Surg Am.- 2003.- V. 85-A.-Suppl2-P. 117-123.

37. EndbcftMetab.'Iimn^ 2006.-Y. 383-3941

38. Alini M, Roughley PJ. Changes in leucine-rich repeat proteoglycans duringf maturation of the bovine growth plate.// Matrix Biol.r 2001.- V. 19.-P.8051.813.i

39. Alini M, Kofsky Y, Wu W et al. In serum free thyroid hormones can inducefull expression of chondrocyte hypertrophy leading to matrix calcification.//f J Bone Miner Res.- 1996.- V. 11.-P. 105-113.

40. Altman R, Asch E, Bloch D, et al. Development of criteria for the classification and reporting of osteoarthritis: classification of osteoarthritis of the knee.// Arthritis Rheum.- 1986.- V. 29.-P.1039-1149.

41. Alvarez J, Costales L, Serra R, et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and vascular endothelial growth factor during epiphyseal ossification.// J Bone Miner Res.- 2005.- V. 20.-P.1011-1021.

42. Alvarez J; Balbin M, Santos F, et al. Different bone growth rates are associated with changes in the expression pattern of types II and X collagens and collagenase 3 in proximal growth plates of the rat tibia.// J Bone Miner Res.- 2000.-V. 15.-P.82-94.

43. Ames BN. Assay of inorganic phosphate, total phosphate, and phosphatases.// Methods Enzymol.- 1966.- V. 8.-P.115-118.

44. Amin AR, Attur M, Patel RN, et al. Superinduction of cyclooxygenase-2 activity in human osteoarthritis-affected cartilage. Influence of nitric oxide.// J Clin Invest.- 1997.- V. 99.-P.1231-1237.

45. Amizuka N, Warshavsky H, Henderson JD et al. Parathyroid hormone-related peptide-depleted mice show abnormal epiphyseal cartilage development and altered endochondral bone formation.// J Cell Biol.- 1994.-V. 126.-P.1611-1623.

46. Anderson HC, Hodges PT, Aguilera XM, et al. Bone morphogenetic protein (BMP) localization in developing human and rat growth plate, metaphysis, epiphysis, and articular cartilage.// J Histochem Cytochem.- 2000.-V. 48-P. 1493-1502.

47. Aoyama T, Liang B, Okamoto T, et al. PGE2 signal through EP2 promotes the growth of articular chondrocytes.// J Bone Miner Res.- 2005.- V. 20.-P.377-389.

48. Appleton CT, Usmani SE, Bernier SM et al. Transforming growth factor alpha suppression of articular chondrocyte phenotype and Sox9 expression in a rat model of osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2007.- V. 56.-P.3693-3705.

49. Appleton CT, Pitelka V, Henry J, et al. Global analyses of gene expression in early experimental osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2007.- V. 56.-P.1854-68.

50. Armstrong CG, Mow VC. Variations in the intrinsic mechanical properties of human articular cartilage with-age, degeneration and water content:// J' bone Joint Surg Am.- 1982.- V. 64.-P. 88-94.

51. Attur MG, Dave MN, Stuchin S et al. Osteopontin: an intrinsic inhibitor in cartilage.// Arthritis Rheum.- 2001.- V. 44.-P.578-584.

52. Aurich M, Poole AR, Reiner A et al. Matrix homeostasis in aging normal ankle cartilage.// Arthritis Rheum.- 2002.- V. 46-P. 2903-2910.

53. Babarina AV, Mollers U, Bittner K, et al. Role of subchondral vascular system in endochondral ossification: endothelial cell-derived proteinases derepress late cartilage differentiation in vitro.// Matrix Biol.- 2001.- V. 20.-P.205-213.

54. Baginsky ES, Marie SS, Clark WL, et al. Direct microdetermination of serum calcium.// Chim Acta .- 1973.- V. 46.-P.46-54.

55. Ballock RT, Heydemann A, Wakefield LM, et al. TGF-beta 1 prevents hypertrophy of epiphyseal chondrocytes: regulation of gene expression for cartilage matrix proteins and metalloproteases.// Dev Biol.- 1993.- V. 158.-P.414-429.

56. Bank RA, Soudry M, Maroudas A et al. The increased swelling and instantaneous deformation of osteoarthritic cartilage ias highly correlated -with collagen degradation.// Arthritis Rheum.- 2000.- V. 43.-P.2202-2210.

57. Barakat AF, Elson CJ, Westacott CI. Susceptibility to physiological concentrations of IL-lß varies in cartilage at different anatomical locations on human osteoarthritic knee joints.// Osteoarthritis Cartilage.- 2002.- V. 10.-P. 264-269.

58. Barbero A-, Grogan S, Schafer D, et al. Age related changes in human articular chondrocyte yield, proliferation and post-expansion chondrogenic capacity.// Osteoarthritis Cartilage.- 2004.- V.12.-P. 476-484.

59. Bayliss MT, Ali SY. Age-related changes in the composition and structure of human articular cartilage proteoglycans.// Biochem J.- 1978.- V. 176.-P. 683-693:

60. Beier F, Ali Z, Mok D, Taylor, AC et al. TGFbetaand PTHrP control chondrocyte proliferation'by activating cyclin D1 expression.// Mol Biol Cell.- 2001.- V. 12.-P.3 852-3 859.

61. Bernstein B, Forrester D, Singsen B et al. Hip joint restoration in juvenile rheumatoid arthritis.// Arthritis Rheum.- 1977.- V. 20.-P. 1099-1104.

62. Bi W, Huang W, Whitworth DJ, et al. Haploinsufficiency of Sox9 results in defective cartilage primarodia and premature skeletal mineralization.// Proc Natl Acad Sci USA.- 2001.- V. 98.- P. 6698-6703.

63. Billinghurst RC, Dahlberg L, Ionescu M et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartuilage.// J Clin Invest.- 1997.- V. 99.-P.1534-1545.

64. Blanco FJ Guitan R, Vazquez-Martel E et al. Osteoarthritic chondrocytes die by apoptosis: a passible pathway for osteoarthritis pathology.// Arthritis Rheum.- 1998.- V. 41.-P.284-289.

65. Blanco FJ, Lötz M. IL-l-induced nitric oxide inhibits chondrocyte proliferation via PGE2.// Exp Cell Res.- 1995,- V. 218.- P.319-325.

66. Blaney Davidson EN, Vitters EL, van den Berg WB et al. TGF beta-induced cartilage repair is maintained but fibrosis is blocked in the presence of Smad7.// Arthritis Res Ther.- 2006.- V. 8.-P. R65.

67. Böhme K, Winterhalter ICH, Bruckner P. Terminal differentiation of chondrocytes is a spontaneous process and is arrested by transforming growth factor-beta-2 and basic fibroblast growth factor in synergy.// Exp Cell Res.- 1995.-V.216.-P. 191-198.

68. Borden P, Solymar D, Sucharczuk A, et al. Cytokine control of interstitial collagenase and collagenase-3 gene expression in human chondrocytes.// J Biol Chem.- 1996.- V. 271-P.23577-23581.

69. Bos PK, van Osch JVM, Frenz DA, et al: Growth factor expression in cartilage wound healing: temporal and spatial immunolocalization in a rabbit auricular cartilage wound model.// Osteoarthritis Cartilage.- 2001,- V. 9.-P. 382-389.

70. Boskey AL, Posner AS, Lane JM, et al. Distribution of lipids associated with mineralzation in the bovine epiphyseal growth plate.// Arch Biochem Biophys.- 1980.- V. 199.-P. 305-311.

71. Brandt KD,' Smith G, Kang SY, et al. Effects of diacerhein in an accelerated canine model of osteoarthritis.// Osteoarthritis Cartilage.- 1997.- V. 5.-P.438-439.

72. Brandt KD, Mazzuca SA, Katz BP, et al. Effects of doxycycline on progression of osteoarthritis: results of a randomized, placebo-controlled, double-blind trial.// Arthritis Rheum.- 2005.- V. 52.-P. 2015-2025.

73. Brenner DA, 0"Hara M, Angel P et al. Prolonged activation of jun and collagenase genes by tumor necrosis factor a.// Nature.- 1989.- V. 337.-P.661-663.

74. Brocklehurst R, Bayliss M, Maurodas A, et al.- 117- The composition of normal and osteoarthritic articular cartilage from human knee joints.// Bone Joint Surg Am.- 1984.- V. 66.-P. 95-106.

75. Buckwalter JA, Mankin HJ. Articular cartilage repair and transplantation.// Arthritis Rheum.- 1998.- V. 41.-P.1331-1342.

76. Buckwalter JA, Mower D, Ungar R et al. Morphometric analysis of chondrocyte hypertrophy.// J Bone Joint Surg Am.- 1986.- V. 68.-P. 243255.

77. Bunning RA, Russell RG: The effect of tumor necrosis factor a and y-interferon production of prostaglandin E and of caseinase activity by human articular chondrocytes.// Arthritis Rheum.- 1989.- V. 32.-P.780-784.

78. Bush PG, Hall AC. The volume and morphology of chondrocytes within non-degenerate and degenerate human articular cartilage.// Osteoarthritis Cartilage.- 2003.- V. 11.-P.242-251.

79. Campo RD. Effects of cations on cartilage structure: swelling of growth plate and degradation of proteoglycans induced by chelators of divalent cations.//Calcif Tissue Int.- 1988.- V.43.-P. 108-121.

80. Carbone LD, Nevitt MC, Wildy K, et al. The relationship of antiresorptive drug use to structural findings and symptoms of knee osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2004.- V. 50.- P. 3516-3525.

81. Caterson B, Flannery CR, Hughes CE, et al. Mechanisms involved in cartilage proteoglycan catabolism.// Matrix Biol.- 2000.- Y. 19.-P.333-344'.

82. Cawston TE, Ellis AJ, Lean E et al: Interleukin-1 and oncostatin M in combination promote the release of collagen fragments from bovine nasal cartilage in culture.// Biochem Biophys Res Comun.- 1995.- V. 215.-P.377-385.

83. Chen Q, Johnson DM, Haudenschild DR, et al. Cartilage matrix protein forms a type II collagen-independent filamentous network: analysis in primary cell cultures with a retrovirus expression system.// Mol Biol Cell.- 1995.- V. 6.-P.1743-1753.

84. Chen Q, Johnson DM, Haudenschild DR, et al. Progression and recapitulation of the chondrocyte differentiation program: cartilage matrix protein is a marker for cartilage maturation.// Dev Biol.- 1995.- V. 172-P. 293-306.

85. Cheung WH, Lee KM, Fung KP, et al. Growth plate chondrocytes inhibit neo-angiogenesis ~ a possible mechanism for tumor control.// Cancer Lett.- 2001.- V. 163.-P.25-32.

86. Cheung WH, Lee KM, Fung KP, et al. TGF-betal is the factor secreted by proliferative chondrocytes to inhibit neo-angiogenesis.// J Cell Biochem Suppl.- 2001.- Suppl 36.-P.79-88.

87. Cheung HS, Ryan LM, Kozin F et al. Identification of collagen subtypes in synovial fluid sediments from arthritic patients.// Am J Med.-1980.- V. 68.-P.73-79.

88. Chrysis D, Nilsson O, Ritzen EM et al. Apoptosis is developmentally regulated in rat growth plate.// Endocrine.- 2002.- V. 18.-P. 271-278.

89. Cole AA, Chubinskaya S, Luchene LJ, et al. Doxycycline disrupts chondrocyte differentiation and inhibits, cartilage matrix degradation:// Arthritis Rheum.-1994.- V. 37.-P. 1727-rl734.

90. Connor JR, Kumar S, Sathe G, et al. Glusterin expression in adult human normal and osteoarthritic articular cartilage.// Osteoarthritis Cartilage.- 2001,- V. 9.-P. 727-737.

91. Damron TA, Mathur S, Horton JA et al. Temporal changes in PTHrP, Bcl-2, Bax, caspase, TGF-beta, and FGF-2 expression following growth plate irradiation with or without radioprotectant.// J Histochem Cytochem.-2004.-V. 52.-P. 157-167.

92. Miller EJ. Isolation and characterization of a collagen from chick cartilage containing three identical a-chains.// Biochem J.- 1971.- V. 10-P.1652-1659.

93. Dean DD, Martel-Pelletier J, Pelletier JP et al. Evidence for metalloproteinase and metalloproteinase inhibitor imbalance in human osteoarthritic cartilage.//J Clin Invest.- 1989.- V. 84.-P.678-685.

94. Dean DD, Muniz OE, Woessner JF et al. Production of collagenase and tissue inhibitor of metalloproteinase by rat growth plates in culture.// Matrix.- 1990.- V. 10.-P.320-330.

95. Dean DD, Woessner Jr JF. A sensitive, specific assay for tissue collagenase using telopeptide-free 3H. acetylated collagen.// Anal Biochem.- 1985.-Y. 148.-P. 174-181.

96. DiBattista JA, Martel-Pelletier J, Cloutier JM, Pelletier JP: Modulation of glucocorticoid receptor expression in human articular chondrocytes by cAMP and prostaglandins.// J Rheumatol.- 1991.- V. 27.- P. 102-105.

97. Dieppe P, Cushnaghan J, Jasani MK et al. A two year, placebo-control trial of non-steroidal antiinflammatory therapy in osteoarthritis of the knee joint.// Brit J Rheumatol.- 1993.- V. 32.-P.595-600.

98. Dieppe PA, Sathapatayavongs B, Jones HE et al. Intraarticular steroids in osteoarthritis.//Rheum Rehabil.- 1980.- V. 19.-P.212-217.

99. Dingle JT, Horsfield P, Fell HB et al. Breakdown of proteoglycan and' collagen induced in pig articular cartilage in organ culture.// Ann Rheum Dis.- 1975.- V. 34.-P.303-311.

100. Distel M, Mueleer C, Bluhmki E et al. Safety of meloxicam: a global analysis of clinical trials.// Brit J Rheumatol.- 1996.- V. 35.- Suppl 1-P.68-77.

101. Dong Y, Drissi H, Chen M, et al. Wnt-mediated regulation of chondrocyte maturation: modulation by TGF-beta.// J Cell Biochem.- 2005.-V. 95.-P. 1057-1068.

102. Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, et al. 1997 Osf2/Cbfal : A transcriptional activator of osteoblast differentiation.// Cell.- 1997.- V. 80.-P.371-378.

103. Dumond H, Presle N, Pottie P, et al. Site specific changes in gene expression and cartilage metabolism during early experimental osteoarthritis.// Osteoarthritis Cartilage.- 2004.- V. 12.-P. 284-295.

104. Eeckhout Y, Vaes G. Further studies on the activation of procollagenase, the latent precursor of bone collagenase: effects of lysosomal cathepsin B, plasmin and kallilrein and spontaneous activation.// Biochem J.- 1977.-V. 166.-P.21-31.

105. Elford PR, Graeber M, Ohtsu H, et al. Induction of swelling, synovial hyperplasia and cartilage proteoglycan loss upon intra-articular injection of transforming growth factor-f32 in the rabbit.// Cytokine.- 1992.- V. 4.-P. 232-238.

106. Ellis A J, Curry VA, Powell EK et al. The prevention of collagenbreakdown in bovine nasal cartilage by TIMP, TIMP-2 and a low molecular weight synthetic inhibitor.// Biochem Biophys Commun.- 1994.- V. 202.-P. 94-101.

107. Engel CK, Pirard B, Schimanski S, et al. Structural basis for the highly selective inhibition of MMP-13.// Chem Biol.- 2005.- V. 12.-P.' 181189.

108. Evans C. An inverse relationship between mammalian lifespan and cartilage cellularity.// Exp Gerontol.- 1983.- V. 18.-P.137-138.

109. Farquharson C, Jeffries D, Seawright T, et al. The role of the PTHrP-Indian hedgehog axis.//Endocrinology.- 2001.- V. 142.-P.4131-4040.

110. Felisaz N, Boumediene K, Ghayor C et al. Stimulating effect of diacerein on TGF-betal and beta2 expression in articular chondrocytes cultured with and without interleukin-1.// Osteoarthritis Cartilage.- 1999.- V. 7.-P. 255-264.

111. Fenton JI, Chlebek-Brown KA, Peters TL, et al. Glucosamine HCl reduces equine articular cartilage degradation in expiants culture.// Osteoarthritis Cartilage.- 2000.- V. 8.-P. 258-265.

112. Fenwick SA, Gregg PJ, Rooney P. Osteoarthritic cartilage loses its ability to remain avascular.// Osteoarthritis Cartilage.- 1999.- V. 7.-P.441-452.

113. Feraandes JC, Martel-Pelletier J, Lascau-Coman V, et al. Collagenase-1 and collagenase-3 synthesis in normal and early experimental osteoarthritic canine cartilage: an immunohistochemical study.// J Rheumatol.- 1998 .- V. 25.-P.1585-1594.

114. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis.// Kidney Int.- 1999.- V. 56.-P.794-814.

115. Flannery CR, Lark MW, Sandy JD. Identification of a stromelysin cleavage site within the interglobular domain of human aggrecan: evidence for proteolysis at this site in vivo in human articular cartilage.// J Biol Chem.-1992.- V. 267.-P.1998-1014.

116. Franzen A, Inerot S, Hejderup S-O et al. Variations in the composition^ ofbovine hip articular cartilage with distance from the articular surface.// BiochemJ.- 1981'.- V. 195.-P.535-543.

117. Fukumura K, Matsunaga S, Yamamoto T, et al. Immunolocalization of transforming growth factor-ps and type I andtype Ilreceptorsin rat articular cartilage.//Anticancer Res:- 1998.-V. 18.- P. 4189-41941.

118. Fukunaga T, Yamashiro T, Oya S, et al. Connective tissue growth factor mRNA expression pattern in cartilages is associated with their type I collagen expression.// Bone.- 2003.- V. 33.-P. 911-918.

119. Gabay C: IL-1 trap. Regeneron/Novartis.// Curr Opin Investig Drugs.-2003.- V. 4.- P.593-597.

120. Gack S, Vallon R, Schmidt J, et al. Expression of interstitial collagenase during skeletal development of the mouse is restricted to osteoblast-like cells and hypertrophic chondrocytes.// Cell Growth Differ.-1995.- V. 6.-P.759-767.

121. Gallyas F, Merchenthaler I. Copper-H202 oxidation strikingly improves silver intensification of the nickel-diaminobenzidine (Ni-DAB) end-product of the peroxidase reaction.// J Histochem Cytochem.- 1988.- V. 36.-P.807-810

122. Garcia-Moteo O, Babini JC, Maldonado-Cocco JA et al. Remodelling of the hip joint in juvenile rheumatoid arthritis.// Arthritis Rheum.- 1981.- V. 24.-P.1570-1574.

123. Garcia-Ramirez M, Toran Nj Andaluz P, et al. Vascular endothelial growth factor is expressed in human fetal growth cartilage.// J Bone Miner Res.- 2000.- V. 15.-P. 534-540.

124. Garnero P, Ayral X, Rousseau JC, et al. Uncoupling of type II collagen synthesis and degradation predicts progression of joint damage in patients with knee osteoarthritis.//Arthritis Rheum.- 2002,- V. 46.-P. 26132624.

125. Gately S: The contributions of cyclooxygenase-2 to tumor angiogenesis.// Cancer Metastasis Rev.- 2000.- V. 19.- P. 19-27.

126. Gebauer M, Saas J, Haag J, et al. Repression of anti-proliferative factor,Tob 1 in osteoarthritic cartilage.// Arthritis Res Ther.- 2005.- V. 7.-P. R274-284.

127. Gerber HP, Vu TH, Ryan AM, et al: VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral' bone formation.//Nat Med.- 1999.- V. 5.-P. 623-628.

128. Gilroy DW, Colville-Nash PR, Willis D, et al. Inducible cyclooxygenase may have anti-inflammatory properties.// Nat Med.- 1999.-V. 5.-P. 698-701.

129. Girkontaite I, Frischholz S, Lammi P, et al. Immunolocalization of type X collagen in normal fetal and adult osteoarthritic cartiláge with monoclonal antibodies.//Matrix Biol.- 1996.- V. 15.- P. 231-238.

130. Glansbeek HL, van Beuningen HM, Vitters EL, et al. Stimulation of articular cartilage repair in established arthritis by local administration of transforming growth factor-ß into murine knee joint.// Lab Invest.- 1998.- V. 78.-P. 133-142.

131. Glasson SS, Askew R, Sheppard B, et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis.//Nature.- 2005.-V. 434.-P. 644-648.

132. Glimcher MJ. The nature of the mineral component of bone and themechanism of calcification./ In: Coe FL, Favus MJ (eds.) Disorders of Bone Mineral Metabolism.Raven Press, Ltd., New York, NY USA 1992-P. 265286.

133. Golden TR, Melov S. Mitochondrial DNA mutations, oxidative stress, and aging.// Mech Ageing Dev.- 2001.- V. 122.-P.1577-1589:

134. Gómez-Barrena E, Sánchez-Pernaute O, Largo R, et al. Sequential changes of parathyroid hormone related protein (PTHrP) in articularcartilage during progression of inflammatory and degenerative arthritis.// Ann Rheum Dis.- 2004.- V. 63-P. 917-922.

135. Gordan GV, Villanueva T, Schumacher HR et al. Autopsy study correlating degree of osteoarthritis, synovitis and evidence of articular calcification:// J Rheumatol:- 1984.- V. 11.-P.681-686.

136. Grimsrud GD, Romano PR, D'Souza M, et al: BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation.// J-Bone Miner Res.- 1999.- V. 14-P.475-482.

137. Guerne P-A, Blanco F, Kadin A et al. Growth factors responsiveness of human articular chondrocytes in aging and development.// Arthritis Rheum.- 1995.- V. 38.-P: 960-968.

138. Guilak F, Ratcliffe A, Lane N et al. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis.// J Orthop Res.- 1994.- V. 12.-P.474-484.

139. Gunther M, Haubeck H-D, Van de Leur E et al. Transforming growth factor pi regulates tissue inhibitor of metalloproteinases-1 expression in differentiated human articular chondrocytes.// Arthritis Rheum.- 1994.- V. 37.-P. 395-405.

140. Hardest TE, Gay CV, Schraer H et al. Vertical distribution of elements in cells and matrix of epiphyseal growth plate cartilage determined by quantitative electron probe analysis.// J Histochem Cytochem.- 1985,- V. 33. -P. 275-286.

141. Hardingham TE, Bayliss MT, Rayan V, et al. Effects of growth factors and cytokines on proteoglycan turnover in articular cartilage.// Br J Rheumatol.- 1992.- V. 31.- Suppl 1.-P.1-6.

142. HensonFM, DaviesME, Skepper JN et al'. Localisation of alkaline phosphatase in equine growth cartilage.// J Anat.- 1995.- V. 187.- (Pt 1).-P.151-159.

143. Ho ML, Chang JK, Wu SC, et al. A novel terminal differentiation model of human articular chondrocytes in three-dimensional cultures mimicking chondrocytic changes in osteoarthritis.// Cell Biol Int.- 2006.- V. 30:-P. 288-294.

144. Hollander AP, Heathfield TF, Webber C, et al: Increased damage to type II collagen in osteoarthritic articular cartilage detected by a new immunoassay.// J Clin Invest.- 1994.- V. 93.- P. 1722-1732.

145. Homandberg GA. Cartilage damage by matrix degradation products: fibronectin fragments.// Clin Orthop Relat Res.- 2001.- V. 391.- Suppl-P.-P. S100-107.

146. Horner A, Kemp P, Summers C, et al. Expression and distribution of transforming growth factor-P isoforms and their signalling receptors in growing human bone.// Bone.- 1998.- V. 23.-P.95-102.

147. Hoshi K, Komori T, Ozawa H. Morphological characterization of skeletal cells in Cbfal-deficient mice.// Bone.- 1999.- V. 25-P.639-651.

148. Howell DS, Dean DD, Muniz OE et al. Hypertrophic cell zone growth cartilage contains heparin-binding growth factors.// Trans Orthop Res Soc.-1989.- V. 14-P. 525-531.

149. Hui W, Rowan AD, Cawston TE. Transforming growth factor ß 1 blocks the release of collagen fragments from bovine nasal cartilage stimulated by oncostatin M in combination with interleukin-1.// Cytokine.-2000.-V. 12.-P. 765-769.

150. Hunter GK, Wong KS, Kim JJ. Binding of calcium to glycosaminoglycans: an equilibrium dialysis study.// Arch Biochem Biophys.- 1988.- V. 260. -P.161-167.

151. Hunter DJ, Felson DT. Osteoarthritis.// BMJ.- 2006.- V. 332.-P. 639642.

152. Hunziker EB, Schenk RK. Cruz-Orive LM. Quantitation of chondrocyte performance in growth plate cartilage during longitudinal bone growth.// J Bone Joint Surg Am.- 1987.- V. 69.-P.162-173.

153. Huskinsson EG, Berry H, Gishen P et al. On behalf of the LINK study group.effects of anti-inflammatory drugs on the progression of osteoarthritis of the knee.// J Rheumatol.- 1995.- V. 22.-P. 1941-1946.

154. Jiang J, Leong NL, Mung JC, et al. Interaction between zonal populations of articular chondrocytes suppresses chondrocyte mineralization and this process is mediated by PTHrP.// Osteoarthritis Cartilage.- 2008.- V. 16.-P.70-82.

155. Jimenez MJG, Balbin M, Lopez JM et al. Collagenase-3 is a target of Cbfal, a transcription factor of the runt gene family involved in bone formation://Mol Cell Biol:-1999.- V. 19.-P. 4431-4442.

156. Johansson N, Saarialho-Kere Y, Airiola C, et al. Collagenase-3 (MMP-13) is expressed by hypertrophic chondrocytes, periosteal cells, and osteoblast during human fetal bone development.// Dev Dyn.- 1997.- V. 208.-P. 387-397.

157. Johnson K, Goding J, Van Etten D et al. Linked deficiencies inextracellular PPi and osteopontin mediate pathologic calcification associated with defective PC-1 and ANK expression.// J Bone Miner Res.- 2003;- V. 18.-P. 994-1004.

158. Jubb RW, Piva S, Beinat L, et al. A one-year, randomised, placebo^ (saline) controlled clinical trial of 500-730 kDa sodium hyaluronate (Hyalgan) on the radiological change in osteoarthritis of the knee.// Int J Clin Pract.- 2003.- V. 57.- P. 467-474.

159. Kafienah W, Mistry S, Dickinson SC, et al. Three-dimensional:: cartilage tissue engineering using adult stem cells from.osteoarthritis patients.// Arthritis Rheum.- 2007.- V. 56.-P. 177-187.

160. Kamekura S, Kawasaki Y, Hoshi K, et al. Contribution of runt-related transcription factor 2 to the pathogenesis of osteoarthritis in mice afterinduction of knee joint instability.// Arthritis Rheum.- 2006.- V. 54.-P. 24622470.

161. Karaplis AC, Luz J, Gowacki J et al. Lethal skeletal dysplasia from targeted disruption of the parathyroid hormone-related peptide gene.// Genes, Dev.- 1994.-V. 8.-P. 277-289.

162. Karpousas GA, Terkeltaub RA. New developments in the pathogenesis of articular cartilage calcification.// Curr Rheumatol Reps.-1999.-V. 1.-P.212-217.

163. Kato Y, Iwamoto M. Fibroblast growth factor is an inhibitor of terminal differentiation.// J Biol Chem.- 1990.-V. 110.-P. 1417-1426.

164. Kawashima-Ohya Y, Satakeda H, Kuruta Y, et al. Effects of parathyroid hormone (PTH) and PTH-related peptide on expressions of matrix metalloproteinase-2, -3, and -9 in growth plate chondrocyte cultures.//Endocrinology.- 1998.-V. 139-P. 2120-2127.

165. Kember NF. Cell division in endochondral ossification: a study of cell proliferation in rat bones by the method of tritiated thymidine autoradiography.// J Bone Joint Surg Br.- I960,- V. 42.-P. 824-839.

166. Kempson GE, Muir H, Pollard C, et al. The tensile properties of the cartilage of humanfemoral condyles related to the content of collagen and glycosaminoglycans.//Biochim Biophys Acta.- 1973.- V. 297.-P.465-472.

167. Kempson GE. Age-related changes in the tensile properties of human articular cartilage: a comparative study between the femoral head of the hip joint and the talus of the ankle joint.// Biochim Biophys Acta.- 1991,- V. 1075.-P. 223-230.

168. Kim HA, Suh DI, Song YW. Relationship between chondrocyte apoptosis and matrix depletion in human articular cartilage.// J Rheumatol.-2001.- V. 28.-P. 2038-2045.

169. Kim HA, Song YW. Apoptotic chondrocyte death in rheumatoid arthritis.// Arthritis Rheum.- 1999.-V. 42.-P. 1528-1537.

170. Kirsch T, Swoboda B, Nah H. Activation of annexin II and Vexpression- terminal differentiation, mineralization and apoptosis in human osteoarthritic cartilage.// Osteoarthritis,Cartilage.- 2000.- V. 8.-P. 294-302:

171. Kitahara H, Hayami T, Tokunaga K, et al: Chondromodulin-I expression in rat articular cartilage.// Arch Histol Cytol.- 2003.- V. 66.-P. 221-228.

172. Klatt ARj.Klinger G, Neumiiller O, et al. TAK1 downregulation reduces IL-lbeta induced expression of MMP13, MMP1 and TNF-alpha.// Biomed Pharmacother.- 2006.- V. 60.-P.55-61.

173. Knauper V, Lopez-Otin C, Smith B et al. Biochemical characterizatrion of human collagenase-3.//J BioLChem.- 1996.- V. 271.-P.1544-1550.

174. Knauper V, Will H, Lopez-Otin C et al. Cellular mechanisms for human procollagenase-3 (MMP-13) activation: evidence that MT1-MMP (MMP-14) and gelatinase A (MMP-2) are able to generate active enzyme.// J Biol Chem.- 1996.- V. 271.-P. 17124-17131.

175. Knott I, Dieu M^ Burton M, et al. Induction of cyclooxygenase by interleukin 1: Comparative study between human synovial cells and chondrocytes.// J Rheumatol.- 1994.- V. 21 .-P. 462-466.

176. Kobayashi Mj Squires GR^ Mousa A, et al. Role of interleukin 1 and tumor necrosis factor alpha in matrix degradation of human osteoarthritic cartilage.// Arthritis Rheum.- 2005.- V. 52.-P. 128-135.

177. Komori T, Yagi H, Nomura S, et al. Targeted disruption of Cbfal results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts.// Cell.- 1997.- V. 89.-P. 755-764.

178. Komori T. A fundamental transcription factor for bone and cartilage.// Biochem Biophys Res Commun.- 2000.- V. 276.-P.813-816.

179. Konttinen YT, MordelinJ, Li T-F et al. Acidic endoproteinase cathepsin K in the degeneration of the superficial articular hyaline cartilage in osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2002.- V. 46.-P.953-960.

180. Kopsidas G Kovalenko SA, Kelso JM et al. An age-associated correlation between cellular bioenergy decline and mtDNA rearrangements in human skeletal muscle.// Mutat Res.- 1998.- V. 421-P.27-36.

181. Kronenberg HM. PTHrP and skeletal development.// Ann N Y Acad Sci.- 2006.-V. 1068-P.1-13.

182. Kuhn K, D'Lima DD, Hashimoto S, Lotz M. Cell death in cartilage.// Osteoarthritis Cartilage.- 2004.- V.12.-P. 1-16.

183. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.//Nature.- 1970.- v. 227.-P.680-685.

184. Lafyatis R, Kim S-J, Angel P et al. Interleukin-1 stimulates and all-trans-retinoic acid inghibits collagenasegene expression through its 58 activator protein-1-binding site.// Mol Endocrinol.- 1990.- V. 4.-P. 873-980.

185. Lanske B, Karaplis AC, Lee K et al. PTH/PTHrP receptor in early development and Indian hedgehog-regulated bone growth.// Science.- 1996.-V. 273.-P.663-666.

186. Lark MW, Bayne EK, Flanagan J et al. Aggrecan degradation in human cartilage: evidence for both matrix metalloproteinase and aggrecanase activity in normal osteoarthritic and rheumatoid joints.// J Clin Invest.-1997.-V. 100.-P. 93-106.

187. Lee ER, Smith CE, Poole AR. Ultrastructural localization of the C-propeptide released from type II procollagen in fetal bovine growth plate cartilage.// J Histochem Cytochem.- 1996.- V. 44.- P. 433-443.

188. Lee ER, Matsui Y, Poole AR. Immunochemical and immunocytochemical studies of the c-propeptide of type II procollagen in chondrocytes of the growth plate.// J Histochem Cytochem.- 1990.- V. 38.-P. 659-673.

189. Li- C, Chen L, Iwata T, et al: A Lys644Glu substitution in fibroblast, growth factor receptor 3 (FGFR3) causes dwarfism in mice by activation of STATs and ink4 cell cycle inhibitors.// Hum Mol Genet.- 1999.- V. 8.-P.35-44.

190. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.//Nature.- 1970.- V. 227.-P. 680-685.

191. Li TF, Dong Y, Ionescu AM, et al. Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) inhibits Runx2 expression through the PKA signaling pathway.// Exp Cell Res.- 2004.- V. 299.-P. 128-136.

192. Li TF, Darowish M, Zuscik MJ, et al. Smad3-deficient chondrocytes have enhanced BMP signaling and accelerated differentiation.// J Bone Miner Res.- 2006.- V. 21.-P. 4-16.

193. Li T-F, Zuscik MJ, Ionescu AM, et al. PGE2 inhibits chondrocyte differentiation through PKA and PKC signaling.// Exp Cell Res.- 2004.- V. 300.-P. 159-169.

194. Liacini A, Sylvester J, Li WQ et al. Induction of matrix metalloproteinase-13 gene expression by TNFa is mediated by MAP kinases, AP-1, and NFkB transcription factors in articulr chondrocytes.- Exp Cell Res.- 2003.- V. 288.-P. 208-217.

195. Lingetti M, D'Ambrosio, Grezia F, et al. A controlled study in the treatment of osteoarthritis with diacerein (Artrodar).// Curr Therp Res.-1982.- V.31.-P. 408-412.

196. Lo YYC, Cruz TF. Reactive oxygen species mediate cytokine activation of c-Jun NH2-terminal kinases.// J Biol Chem.- 1996,- V. 271.-P. 15703-15707.

197. Lo YYC, Cruz TF. Involvement of reactive oxygen speciaes in cytokine and growth factor induction of c-fos expression in chondrocytes.// J Biol Chem.- 1995.- V. 270.-P. 11727-11730.

198. Lorenz JJ, Furdon PJ, Taylor JD, et al. A cyclic adenosine 3',5'-monophosphate signal is required for the induction of IL-ip by TNF-a in human monocytes.//J Immunol.- 1995.-V. 155.-P. 836-844.

199. Lorenz H, Richter W. Osteoarthritis: cellular and molecular changes in degenerating cartilage.// Prog Histochem Cytochem.- 2006,- V. 40.-P. 135-163.

200. Lotz M, Guerne P-A. Interleukin-6 induces the synthesis of tissue inhibitor of metalloproteinases-l/erythroid potentiating activity (TIMP-1/EPA).// J Biol Chem.- 1991.- V. 266-P. 2017-2020.

201. Lowe GN, Fu YH, McDougall S, et al. Effects of prostaglandins on deoxyribonucleic acid and aggrecan synthesis in the RCJ 3.1C5.18 chondrocyte cell line: role of second messengers.// Endocrinology.- 1996.-V. 137.-P. 2208-2216.

202. Luo C, He M-L, Bohlin L. Is COX-2 a perpetrator or a protector?' Selective COX-2 inhibitors remain controversial.// Acta Pharmacol Sin.-2005.- V. 26.-P. 926-933.

203. Ma Q, Li X, Vale-Cruz D, Brown ML, et al. Activating transcription factor 2 controls Bcl-2 promoter activity in growth plate chondrocytes.// J Cell Biochem.- 2007.- V. 101.-P.477-487.

204. Mankin HJ, Dorfman H, Lipiello L et al. Biochemical and metabolic abnormalities'in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data.// J Bone Joint Surg.- 1971.- V. 53A.-P. 523-537.

205. Marcolonge R, Fioravanti A, Adami S, et al. Efficacy and tolerability of diacerein in the treament of osteoarthrosis.// Gurr Therp Res.- 1988.- V. 37.-P. 529-536.

206. Martin I, Jakob M, Schafer D, et al. Quantitative analysis of gene, expression in human articular cartilage from normal and osteoarthritic joints.// Osteoarthritis Cartilage.- 2000.- V. 9. -P. 112-118.

207. Martin JA &Buckwalter JA. Telomere erosion and senescence in human articular cartlage chondrocytes.// J Gerontol A Biol Sei Med Sci.-2001.- V. 56.-P. 172-179.

208. Mastbergen SC, Jansen NWD, Bijisma JWJ, et al. Differential direct effects of cyclo-oxygenase-1/2 inhibition on proteoglycan turnover of human osteoarthritic cartilage: an in vitro study.// Arthritis Res Ther.-2006.- V. 8-P. R2.

209. Matsui Y, Alini M, Webber C et al. Characterization of aggregating proteoglycans from the proliferative, meturing, hypertrophic and calcifying zones of the cartilaginous physis.// J Bone Joint Surg Am.- 1991.- V. 73.-P. 1064-1074.

210. Mätsumoto T, Tsukazaki T, Enomoto H et al. Effects of interleukin-lß on insulin-like growth factor-1 autocrine/paracrine axis in culture rat articular chondrocytes.// Ann Rheum Dis.- 1994.- V. 53.-P.128-133.

211. Matsunaga S, Yamamoto T, Fukumura K. Temporal and spatial expressions of transforming growth factor-betas and their receptors in epiphyseal growth plate.// Int J Oncol.- 1999.- V. 14.- P. 1063-1067.

212. Mattews JL, Martin HW, Sampson AS. Et al. Mitochondrial granules in the normal and rachitic rat epyphysis.// Calcified Tissue Res.- 1970.- V. 5.-P. 91-99.

213. Matyas JR, Huang D, Chung M, et al. Regional quantification of cartilage type II collagen and aggrecan messenger RNA in joints with early experimental osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2002.- V. 46.-P. 1536-1543.

214. Mazieres B, Berda L. Effect of diacerein (ART 50) on an experimental post-contusive model of OA.// Osteoarthritis Cart.- 1993.- V. 1-P. 47.

215. Melchiorri C, Meliconi R, Frizzizro L et al. Enhanced and coordinated in vivo expression of inflammatory cytokines and nitric oxide suynthase by chondrocytes from patients with osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 1998.-V. 41-P.2165-2174.

216. Melov S. Mitochondrial oxidative stress. Physiologic consequences and potential for a role in aging.// Ann NY Acad Sei.- 2000.- V. 908-P. 219225.

217. Mengshol JA, Vincenti MP, Coon CI et al. Interleukin-1 induction of collagenase 3 (matrix metalloproteinase 13) gene expression in chondrocytes requires p38, C-JUN N-terminal kinase and nuclear factor Kß.// Arthritis Rheum.- 2000.- V. 43 .-P.801-811.

218. Middleton JFS, Tyler JA. Upregulation of insulin-like growth factor 1 gene expression in the lesions of osteoarthritic human articular cartilage.// Ann Rheum Dis.- 1992.- V. 51.-P.440-447.

219. Milner JM, Elliot S-F, Cawston TE. Activation of procollagenases is a key control point in cartilage collagen degradation. Interaction of serine and metalloproteinase pathways.// Arthritis Rheum,- 2001,- V. 44. -P.2084-2096.

220. Miosge N, Hartmann M, Maelicke C, et al. Expression of collagen type I and type II in consecutive stages of human osteoarthritis.// Histochem Cell Biol.- 2004.- V. 122.-P. 229-236.

221. Mitchel PH, Magna HA, Reeves LM et al. Cloning, expression and type I collagenolytic activity of matrix metalloproteinase-13 from human osteoarthritic cartilage.// J Clin Invest.- 1996.- V. 97.-P. 761-768.

222. Mitrovic D, Quintero M, Stankovic A, et al. Cell density of adult human femoral condylar articular cartilage: joints with normal and fibrillated surfaces.// Lab Invest.- 1983.- V. 49.-P. 309-316.

223. Miwa M, Saura R, Hirata S, et al. Induction of apoptosis in bovine articular chondrocyte by prostaglandin E2 through cAMP-dependent pathway.// Osteoarthritis Cartilage.- 2000.- V. 8.- P. 17-24.

224. Moldovan F, Pelletier JP, Mineau F, et al. Modulation of collagenase 3 in human osteoarthritic cartilage by activation of extracellular transforming growth factor beta: role of furin convertase.// Arthritis Rlieum.-2000.- V. 43.-P. 2100-2109.

225. Morales TI, Wahl LM, Hascall VC. The effect of bacterial lipopolysaccharides on the biosynthesis and release of proteoglycans from calf articular cartilage cultures.// J Biol Chem.- 1984.- V. 259.-P. 67206729.

226. Morales TI. Transforming growth factor-beta and insulin-like growth factor-1 restore proteoglycan metabolism of bovine articular cartilage after depletion by retinoic acid.//Arch Biochem Biophys.- 1994.-V. 315.-P. 190198.

227. Morales TI. The insulin growth factor binding proteins in uncultured human cartilage. Increases in insulin-like growth factor binding proteins during osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2001.- V. 44.-P. 578-584.

228. Morreale P, Manopulo R, Galati Met al. Comparison of the antiinflammatory efficacy of chondroitin sulphate and diclofenac sodium in patients with knee osteoarthritis.// J Rheumatol.- 1996.- V. 23.-P.1385-1391.

229. Mort JS, Magny M-C, Lee ER. Cathepsin B an alternative protease for generation of an aggrecan "metalloproteinase"cleavage neoepitope.// Biochem J.- 1998 .- V. 335.-P. 491-494.

230. Mort JS, Poole AR. Mediators of inflammation, tissue destruction and repair. Protease and their inhibitors./ In: Klippel JH, ed. Primer in the rheumatic diseases. 12th ed. Atlanta:Arthritis Foundation.- 2001.-P.72-81.

231. Muir IHM. Biochemistry./ In: Freeman MAR, ed. Adult articular cartilage, 2nd ed. Tunbridge Wells, UK:Pitman Medical.- 1979.-P. 145214.

232. Murphy G, Cockett MI, Stephens PE et al. Stromelysin is an activator of procollagenase: a study with natural and recombinant enzymes.// Biochem J.- 1987.- V. 248.-P. 265-268.

233. Mwale F, Demers CN, Petit A, et al. A synthetic peptide of link protein stimulates the biosynthesis of collagens II, IX and proteoglycan by cells of the intervertebral disc.//J Cell Biochem.- 2003.- V. 88.-P. 12021213.

234. Mwale F, Billinghurst C, Wu W, et al. The assembly and degradation of types II and IX collagens associated with expression of the hypertrophic phenotype.// Dev Dyn.- 2000.- V. 218.-P. 648-662.

235. Myers SL, Brandt KD, Burr DB, et al. Effects of a bisphosphonate on bone histomorphometry and dynamics in the canine cruciate deficiency model of osteoarthritis.// J Rheumatol.- 1999.- V. 26.- P. 2645-2653.

236. Nagai H, Aoki M. Inhibition of growth plate angiogenesis and endochondral ossification with diminished expression of MMP-13 in hypertrophic chondrocytes in FGF-2-treated rats.// J Bone Miner Metab.-2002.- V. 20.-P. 142-147.

237. Nemoto О, Yamada H, Mukaida M et al. Stimulation of TIMP-1 production by oncostatin M in human articular cartilage.// Arthritis Rheum.-1996.- V. 39.-P.560-566.

238. Neriich AG, Wiest I, von der Mark K. Immunohistochemical analysis of interstitial collagens in cartilage of different"stages of osteoarthrosis.// Virchows Arch.- 1993.- V. B63.- P. 249-255.

239. Neuhold LA, Killar L, Zhao W, et al. Postnatal expression in hyaline cartilage of constitutively active human collagenase-3 (MMP-13) induces osteoarthritis in mice.// J Clin Invest.- 2001.- V. 107.-P. 35-44.

240. Ng LJ, Wheatley S, Muscat GEO, et al. Sox9 binds DNA, activates transcription, and coexpresses with type II collagen during chondrogenesis in the mouse.//Dev Biol.- 1997.-V. 183.-P. 108-121.

241. Nicolae C, Ko YP, Miosge N et al. Abnormal collagen fibrils in cartilage of matrilin-l/matrilin-3-deficient mice.//J Biol Chem.- 2007.- V. 282.-P. 22163-22175.

242. Nilsson O, Parker EA, Hegde A, et al. Gradients in bone morphogenetic protein-related gene expression across the growth plate.// J Endocrinol.- 2007.- V. 193.-P. 75-84.

243. Ohlsson C, Isgaard J, Törnell J, et al. Endocrine regulation of longitudinal bone growth.//ActaPaediatr Suppl.- 1993.- V. 82.- Suppl 391.-P.33-40.

244. Ohuchi E, Imai K, Fuji Y, et al. Membrane type 1 matrix metalloproteinase digests interstitial collagens and.other extracellular matrix macromolecules.// J Biol Chem.- 1997.- V. 272.-P. 2446-2451.

245. O'Keefe RJ, Crabb ID, Puzas JE, et al. Influence of prostaglandins on DNA and matrix synthesis in growth plate chondrocytes.// J Bone Miner Res.- 1992.- V. 7.-P.397-404.

246. Pacific! M; Shimo T, Gentiii C, et al. Syndecan-3: a cell-surface heparan sulfate proteoglycan important for chondrocyte proliferation and* function during limb skeletogenesis.// J-Bone Miner Metab.- 2005.- V. 23.-P.191-199.

247. Pavelka KJ, Sedlackova M, Gatterova J et al. GAGPS (Arteparona) in osteoarthritis of the knee.// Osteoarthritis .- 1995,-V. 3.-P; 15-23.

248. Pelletier J-P, Martel-Pelletier J, Raynauld J-P. Most recent developments in strategies to reduce the progression of structural changes in osteoarthritis: today and tomorrow.// Arthritis Res Ther.- 2006.- V. 8.-P. 206-220.

249. Pfander D, Rahmanzadeh R, Scheller EE. Presence and distribution of collagen II, collagen I, fibronectin, and tenascin in rabbit normal and osteoarthritic cartilage.// J Rheumatol.- 1999.- V. 26.-P. 386-394.

250. Pickvance EA, Oegema J-R, Thompson RC. Immunolocalization of selected cytokines and proteases in canine articular cartilage transarticular loading.//J Orthop Res.- 1993.-V. 11.-P. 313-323.

251. Poole AR, Ionescu M; Fitzcharles MA, et al. The assessment of cartilage degradationin vivo: development of an immunoassay for the measurement in body fluids of typeiP collagen-cleaved by collagenases.// Ji Immunol'Methods.- 2004.- 294.-P.145-153.

252. Poole AR, Ionescu M, Swan A, et al. Changes in cartilage metabolism in arthritis are reflected by altered serum and synovial fluid levels of the cartilage proteoglycan aggrecan. Implications for pathogenesis.// JClin Invest.- 1994.- V. 94.-P. 25-33.

253. Poole AR, Nelson F, Tchetina E, et al. Proteolysis of the collagen fibril in osteoarthritis.// Biochem Soc Symp.- 2003.- V. 70.-P.115-123.

254. Poole AR. The growth plate: Cellular physiology, cartilage assembly and mineralization./ In: Hall B, Newman S (eds.) Cartilage: Molecular Aspects. CRC Press, Boca Raton, FL, USA.- 1991.- P. 179-211.

255. Poole AR, Pidoux I, Reiner A, et al. Association of an extracellular protein (chondrocalcin) with the calcification of cartilage in endochondral bone fromation.// J Cell Biol.- 1984.- V. 98-P.54-65.

256. Poole AR, Alini M, Hollander AP. Cellular biology of cartilage degradation./ In: Henderson B, Pettifer R, Edwards J, eds. Mechanisms and models in rheumatoid »arthritis. London:Academic.- 1995.- P.163-204.

257. Poole AR, Howell DS. Etiopathogenesis of osteoarthritis. /In: Osteoarthritis: Diagnosis and Medical/Surgical Management, ed 3. Edited by RW Moskowitz, Howell DS, Altman RD, Buckwalter JA, Goldberg VM. Philadelphia, WB Saunders Co.- 2001.-P. 29-47.

258. Poole AR, Pidoux I, Reiner A et al. An immunoelectron microscope study of the organization of proteoglycan monomer, link protein and collagen in the matrix of articular cartilage.// J Cell Biol.- 1982.- V. 93 .-P. 921-937.

259. Poole AR, Rosenberg LC, Reiner A, et al. Contents and distribution of the proteoglycans decorin and biglycan in normal and osteoarthritic human articular cartilage.// J Orthop Res.- 1996.- V. 14.-P. 681-689.

260. Poole AR, Webber C, Pidoux I, et aK Localization of a dermatan sulphate proteoglycan in cartilage and the presence of an immunologically related species in other tissues.// J Histochem Cytochem.- 1986.- V.34.-P. 619-625.

261. Poole AR: Cartilage in health and disease./ In: Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, ed 15. Edited by Koopman W. Philadelphia, Lippincott, Williams, and Wilkins.- 2005.-P. 223-269.

262. Poole AR: What type of cartilage repair are we attempting to attain?// J Bone Joint Surg.- 2003.- V. 85A.-(Suppl 2).-P. 40-44.

263. Porte D, Tuckermann J, Becker M, et al. Both AP-1 and Cbfal-like factors are required for the induction of interstitial collagenase by parathyroid hormone.// Oncogene.- 1999.-V. 18.-P. 667-678.

264. Price JS, Bickerstaff DR, Bayliss MT et al. Degradation of cartilage type II collagen precedes the onset of osteoarthritis following anterior cruciate ligament rupture.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 2390-2398.

265. Pringle GA, Dodd CM. Immunoelectron microscopic localization of the core protein of decorin near the d- and e-bonds of tendon collagen fibrils by use of monoclonal antibodies.// J Histochem Cytochem.- 1990.- V. 38.-P. 1504-1411.

266. Pullig O, Weseloh G, Ronneberger D, et al. Chondrocyte differentiation in human osteoarthritis: expression of osteocalcin in normal and osteoarthritic cartilage and bone.// Calcif Tissue Int.- 2000 .- V. 67.-P.23 0-240.

267. Quintavaila J, Kumar C, Daouti S, et al. Chondrocyte cluster formation in agarose cultures as a functional assay to identify genes expressed in osteoarthritis.// J Cell Physiol.- 2005.- V. 204.-P. 560-566.

268. Rantakokko J, Aro-HT, Savontaus M, et al. Mouse cathepsin K: cDNA cloning and predominant! expression of the gene in osteoclasts, and in some hypertrophy ingchondrocytes during mouse development;// FEBS Lett.- 1996.- V. 393.-P.307-313.

269. RayiA, KwokoK, GookJE et al. Induction of matrix metalloproteinase geneexpressionisregulatedby inflammation-responsivetranscription factor SAF-1 in osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2003.-V. 48-P. 134-145:

270. Reginato AM, Lash JW, Jimenez SA. Expression of type X collagen mRNA levels in embryonic chick sternum during development.// Biochem Biophys Res Commun.- 1986.- V. 137.-P.1125-1132.

271. Renkiewicz R, Qiu L, Lesch C, et al. Broad-spectrum matrix metalloproteinase inhibitor marimastat-induced musculoskeletal side effects in rats.// Arthritis Rheum.- 2003.- V. 48.- P. 1742-1749.

272. Rothwell AG, & Bentley G. Chondrocyte multiplication in osteoarthritic articular cartilage.// J Bone Joint Surg.- 1973.- V. 55B.-P. 588594.

273. Roughley PJ, White RJ, Poole AR. Identification of a hyaluronic acid-binding protein that interferes with the preparation of high buoyant density proteoglycan,aggregates from adult human articular cartilage.// Biochem'J.-1985.-V. 231.-P.129-138.

274. Rudolphi K, Gerwin N, Verzijl N, et al. Pralnacasan, an inhibitor of. interleukin-lbeta converting enzyme, reduces joint damage in two murine models of osteoarthritis.// Osteoarthritis Cartilage.- 2003.- V. 11.- P. 738746.

275. Sakou T, Onishi T, Yamamoto T, et al. Localization of Smads, the TGF-beta family intracellular signaling components during endochondral ossification.//J Bone Miner Res.- 1999.-V. 14.-P. 1145-1152.

276. Saha N, Moldovan F, Tardif G, et al. Interleukin-1 ß-converting enzyme/Caspase-1 in human osteoartliritic tissues: Localization and role in the maturation of IL-lß and IL-18.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 1577-1587.

277. Sakiyama H, Inaba N, Toyoguchi T, et al. Immunolocalization of complement Cls and matrix metalloproteinase 9 (92kDa gelatinase/type IV collagenase) in the primary ossification center of the human femur.// Cell Tissue Res.- 1994.- V. 277.-P. 239-245.

278. Salvatory R, Guidon PT, Rapuano BE, et al. Prostaglandin El inhibits collagenase gene expression in,rabbit synoviocytes and human fibroblasts.// Endocrinology.- 1992.- V.131.-P. 21-28.

279. Sandberg M, Vuorio E. Localization of types I. II and III collagen mRNAs in developing human skeletal tissue by in situ hybridization.// J Cell Biol.- 1987.-V. 104.-P. 1077-1084.

280. Sandel LJ, Aigner T. Articular cartilage and changes in arthritis. An introduction: cell biology of osteoarthritis.// Arthritis Res.- 2001.- V. 3.-P. 107-113.

281. Sandy JD, Neame PJ, Boyton RE et al. Catabolism of aggrecan in cartilage expiants: identification of a major cleavage site within the interglobular domain.// J Biol Chem.- 1991.- V. 266.-P. 8683-8685.

282. Sanford LP, Ormsby I, Gittenberger-de Groot AC, et al. TGFß2 knockout mice have multiple developmental defects that are nonoverlapping with other TGFß knockout phenotypes.// Development.- 1997.-V. 124.-P. 2659-2670.

283. Scharstuhl A, Glansbeek HL, van Beuningen HM; et al. Inhibition of endogenous TGFbeta during experimental osteoarthritis prevents osteophyte formation and impairs.cartilage repair.// J Immunol 2002.- V. 169.-P.507-514.

284. Scharstuhr A, van Beuningen HM, Vitters EL et al. Loss of Transforming growth factor counteraction on interleukin-1 mediated effects in cartlage of old mice.// Ann Rheum Dis.- 2002.- V. 61.-P. 1095-1098.

285. Schenk RK, Wiener J, Spiro D. Fine structural aspects of vascular invasion of the tibial epiphyseal plate of growing rats.// Acta Anat .-1968.-V. 69.-P.1-17.

286. Schneiderman R, Rosenberg N, Hiss J et al. Concentration and distribution of insulin-like growth factor-2 in human normal and osteoarthritic synovial fluid and cartilage.// Arch Biochem Biohys.- 1995.- V. 324.-P. 173-188.

287. Schwartz Z, Gilley RM, Sylvia VL, et al. The effect of prostaglandin E2 on costochondral chondrocyte differentiation is mediated by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and protein kinase C.// Endocrinology .-1998.-V. 139.-P. 1825-1834.

288. Semevolos SA, Strassheim ML, Haupt JL, et al. Expression patterns of hedgehog signaling peptides in naturally acquired equine osteochondrosis.// J Orthop Res.- 2005.- V. 23.-P. 1152-1159.

289. Serra R, Karaplis A, Sohn P. Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP)-dependent and -independent effects of transforming growth factorbeta (TGF-beta) on endochondral boneformation.// J'Cell Biol.- 1999:- V. 145.-P. 783-794.

290. Serra R, Johnson M, Filvaroff EH, et al. Expression of a truncated!, kinase-defective TGF(3 type II receptor in mouse skeletal tissue promotes terminal, chondrocyte differentiation and osteoarthritis.// J Cell Biol.- 1997.-V. 139.-P.541-552.

291. Setton LA, Mow VC, Muller FJ et al. Mechanical properties of canine articular cartilage are significantly altered following transaction of the anterior cruciate ligament.//J Orthop Res.- 1994.- V. 12.-P.451-463.

292. Schiff MH, DiVittorio G, Tesser J, et al. The safety of anakinra in high risk patients with active rheumatoid arthritis: six-month observations of patients with comorbid conditions.// Arthritis Rheum.- 2004.- V. 50.- P. 1752-1760.

293. Shapiro IM, Adams CS, Freeman T, et al. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate.// Birth Defects Res C Embryo Today.- 2005.-V. 75.-P. 330-339:

294. Shida J-I, Jingushi S, Izumi T, et al Basic fibroblast growth factor regulates expression of growth factors in rat epiphyseal chondrocytes.// J Orthop Res.- 2001.- V. 19.-P. 259-264.

295. Shinar DM, Endo N, Halperin D, et al. Differential expression of insulin-like growth factor-I (IGF-I) and IGF-II messenger ribonucleic acid in growing rat bone.// Endocrinology.- 1993.- V. 132.-P. 1158-1167.

296. Shull MM, Ormsby I, Kier AB, et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease.// Nature.- 1992.- V. 359.-P. 693-699:

297. Smith GN, Jr., Myers SL, Brandt KD, et al. Diacerhein treatment reduces the severity of osteoarthritis in the canine cruciate-deficiency model of osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 545-554.

298. Smith P, Shuler FD, Georgescu HI, et al. Genetic enhancement of matrix synthesis by articular chondrocytes.// Arthritis Rheum.- 2000.- V. 43.-P. 156-164.

299. Söderström M, Salminen H, Glumoff V, et al. Cathepsin expression during skeletal development.//Biochim Biophys Acta.- 1999.- V. 1446.-P. 35-46.

300. Spector TD, Conaghan PG, Buckland-Wright JC, et al. Effect of risedronate on joint structure and symptoms of knee osteoarthritis: results of the BRISK randomized, controlled trial.// Arthritis Res Ther.- 2005.- V. 7.-P. R625-633.

301. Squires G, Okouneff S, Ionesku M et al. Pathobiology of focal lesion development in aging human articular cartilage reveals molecular matrixchanges characteristic of osteoarthritis. //Arthritis Rheum.- 2003.- V. 48.-P. 1261-1270.

302. Squires GR, Pidoux I, Okouneff S, et al. The development of focal lesions in aging human articular cartilage involves molecular changes in type II collagen and aggrecan characteristic of osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2002:- V. 48.-P. 1261-1270:

303. Stewart MC, Kadlcek RM; Robbins PD, et al. Expression and activity of the CDK inhibitor p57Kip2 in chondrocytes undergoing hypertrophic differentiation.// J Bone Miner Res.- 2004.- V. 19.-P.123-132.

304. St-Jacques B, Hammerschmidt M, McMahon AP. Indian hedgehog signaling regulates proliferation and differentiation of chondrocytes and is essential for bone formation.// Genes Dev.- 1999.- V. 13.-P. 2072-2086.

305. Stockwell R. The interrelationship of cell density and cartilage thickness in mammalian articular cartilage.// J Anat.- 1971.- V. 109.-P. 411421

306. Stockwell RA, Meachin G. The chondrocytes./ In: Freeman MAR, ed. Adult articular cartilage, 2nd ed. Tunbrige Wells, UK:Pitman Medical.-1979.-P. 69-144.

307. Stocum DL, Davis RM, Leger M, et al. Development of the tibiotarsus in the chick embryo: biosynthetic activities of histologically distinct regions.// J Embryol Exp Morphol.- 1979.- V. 54-P. 155-170.

308. Stoop R, van der Kraan PM, Buma P et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57/B1/6 and BALB/c mice.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 2381-2389.

309. Sweet M, Thonar E, Immelman A et al. Biochemical changes inprogressive osteoarthritis.// Ann Rheum Dis.- 1977.- V. 36.-P. 387-398.

310. Sztrolovics R, White RJ, Poole ART et al. Resistance of small leucine rich repeat proteolycans to proteolytic during interleukin-1 stimulated cartilage.// Biochem J.- 1999.- V. 339.-P. 571-577.

311. Szuts V, Mollers U, Bittner K, et al. Terminal differentiation of chondrocytes is arrested at distinct stages identified by their expression repertoire of marker genes.// Matrix Biol.- 1998.- V. 17.-P. 435-4481

312. Takahashi T, Morris EA, Trippel SB. Bone morphogenetic protein-2 and -9 regulate the interaction of insulin-like growth factor-I with growth plate chondrocytes.// Int J Mol Med.- 2007.-V. 20.-P. 53-57. •

313. Takahashi T, Ogasawara T, Asawa Y, et al. Three-dimensional microenvironments retain chondrocyte phenotypes during proliferation culture.// Tissue Eng.- 2007.- V. 13.-P.1583-1592.

314. Fernandes JC, Martel-Pelletier J, Pelletier JP. The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology.// Biorheology. 2002.- V.- 39.- P.- 237-246.

315. Teree TM, Klein L. Hypophosphatasia, clinical and metabolic studies.//J:Pediatr.- 1986.- V.- 72.-P.50-57.

316. Tetlow LC, Adlàm D J~ Woolley DE. Matrix metalloproteinase and5 proinflammatory cytokine production by chondrocytes of human osteoarthritic cartilage: associations with degenerative changes.// Arthritis Rheum.- 2001.- V. 44.-P. 585-5941

317. Thomas JT, Grant ME. Cartilage proteoglycan aggregate and fibronectin can modulate the expression of type X collagen by embryonic chick chondrocytes cultured in collagen gels.//Biosci Rep.- 1988;-V. 8i-P. 163-171.

318. Thomas CM, Fuller CJ, Whittles CE, Sharif M. Chondrocyte death by apoptosis is associated with cartilage matrix degradation.// Osteoarthritis Cartilage.- 2007.- V. 15.-P. 27-34.

319. Tiku ML, Liesch JB, Robertson FM. Production of hydrogen peroxide by rabbit articular chondrocytes : enhancement by cytokines.// J Immunol.-1990.- V. 145.-P. 690-696.

320. Tortorella MD, Burn TC, Pratta MA et al. Purification and*cloning of aggrecanase-1: a member fámily of proteins.// Science.- 1999.- V. 284.-P. 1664-1666.

321. Trippel SB. Growth factor inhibition. Potential role in the etiopathogenesis of osteoarthritis.// Clin Orthop Rel Res.- 2004.- V. 427.- P. S47-S52.

322. Ueta C, Iwamoto M, Kanatani N, et al. Skeletal malformations caused by overexpression of Cbfal or its dominant negative form in chondrocytes.// J Cell Biol.- 2001.-V. 153.-P. 87-100.

323. Uría JA, Balbín M, López JM, et al. Collagenase-3 (MMP-13) expression in chondrosarcoma cells and its regulation by basic fibroblast growth factor.//Am J Pathol.- 1998.-V. 153.-P. 91-101.

324. Uría JA, Jiménez MG, Balbín M, et al. Differential effects of transforming growth factor-beta on the expression of collagenase-1 and' collagenase-3 in human fibroblasts.// J Biol Chem.- 1998.- V. 273 .-P. 97699777.

325. Van Meurs J, van Lent P, Stoop R et al. Cleavage of aggrecan at the ASN341-PHE342 site coincides with the initiation of collagen damage in murine antigen-induced arthritis.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 20742084.

326. Van Meurs JB, van Lent PL, Holthuysen AE et al. Kinetics of aggrecanase-and metalloproteinase-induced neoepitopes in various stages of cartilagedestruction in murine arthritis.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P.1128-1139.

327. Van Wart HE, Birkedl-Hansen H. The cystein switch: a principal of regulätion of metalloproteinases activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family.// Proc Natl Acad1 Sei USA> 1990.- V. 87.-P. 364-3681

328. Veje K, Hyllested-Winge JL, Ostergaard K. Topographic and zonal distribution of tenascin in human articular cartilage from femoral heads: normal versus mild and severe osteoarthritis.// Osteoarthritis Cartilage.-2003.- V. 11-PJ 217-227.

329. Venn MF. Variation of chemical composition with age in human femoral head cartilage.// Ann Rheum Dis.- 1978.- V. 37-P.168-174.

330. Verdier M-P, Seite S, Guntzer K, et al. Immunohistochemical analysis of transforming growth factor beta isoforms and their receptors in human cartilage from normal and osteoarthritic femoral heads.// RheumatoLInt.-2005.- V. 25.-P. 118-124.

331. Vortkamp A, Lee K, Lanske B; Segre GV, et al. Regulation of rate of cartilage differentiation by Indian hedgehog and PTH-related protein.// Science.- 1996.- V. 273.-P. 613-22.

332. Wang W, Kirsch T. Annexin V/beta5 integrin interactions regulate apoptosis of growth plate chondrocytes.// J Biol Chem. -2006.- V. 281.-P. 30848-30856.

333. Wang X, Manner PA, Horner A, et al. Regulation of MMP-13 expression by RUNX2 and FGF2 in osteoarthritic cartilage.// Osteoarthritis Cartilage.- 2004.- V. 12.-P. 963-973.

334. Wang Y, Middleton F, Horton JA, et al. Microarray analysis of proliferative and hypertrophic growth plate zones identifies differentiation markers and signal pathways. //Bone.- 2004.- V. 35.-P. 1273-1293.

335. Wang W, Xu J, Kirsch T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes.// Exp Cell Res.- 2005.- V. 305.-P. 156-165.

336. Wang W, Xu J, Du B, Kirsch T. Role of the progressive ankylosis gene (ank) in cartilage mineralization.// Mol Cell Biol.- 2005.- V. 25.-P. 312-323.

337. O.Wang J, Elefant D, Veys EM et al. Insulin-like growth factor-1 rides the activity of interleukin-1 receptor II over and controls the homeostasis of the extracellular matrix of cartilage.// Arthritis Rheum.- 2003.- V. 48.-P. 12811291.

338. Weir EC, Philbrick WM, Amling LA, et al .Targeted overexpression of parathyroid hormone-related peptide in chondrocytes causes chondrodysplasia and delayed endocondral bone formation.// Proc Natl Acad Sei USA.- 1996.- V. 93.-P. 10240-10245.

339. White AH; Watson RE, Newman B, et al. Annexin.VIII is differentially expressed by chondrocytes in the mammalian growth plate' during endochondral ossification and in osteoarthritic cartilage.// J Bone Miner Res.- 2002.- V. 17.-P. 1851-1858.

340. Witter J Roughley PJ, Webber C et al. The immunological detection and characterization of cartilage proteoglican degradation products in synovial fluids of patients with arthritis.//Arthritis Rheum.- 1987.- V. 30.-P. 519-526.

341. Wright MO, Nishida K, Bavington C et al. Hyperpolarization of cultured human chondrocytes follows cyclical pressure-induced- strain: evidence of a role for a5pi integrin as a chondrocyte mechanoreceptor.// J Orthop Res.-1997.-V. 15.-P. 742-747.

342. Wroblewski J, Edwall-Arvidsson C. Inhibitory effects of basic fibroblast growth factor on chondrocyte differentiation.// J Bone Miner Res.- 1995,- V. 10.-P. 735-742.

343. Wu J-J, Lark M, Chum LE Eyre DR. Sites of stromelysin cleavage in collagen types II, IX, X, and XI of cartilage.// J Biol Chem.- 1991.- V. 266.-P. 5625-5628.

344. Wu W, Tchetina E, Mwale F et al'. Proteolysis involving MMP-13 (collagenase-3) and the expression of the chondrocyte hypertrophic phenotype.// J Bone Miner Res.- 2002.- V.17-P. 639-651.

345. Wu J, Rush TS 3rd, Hotchandani R, et al. Identification of potent and selective MMP-13 inhibitors.// Bioorg Med Chem Lett.- 2005.- V. 15.-P. 4105-4109.

346. Wuthier RE, Register TC. Role of alkaline phosphatase, a polyfunctional enzyme in mineralizing tissues./ In: The Chemistry and Biology of Mineralized Tissues Ed Butler WT. Ebso Media, Birmingham, AL.- 1984.-P. 113-124.

347. Wuthier RE. A review of the primary mechanism of endochondral calcification with special emphasis on the role of cells, mitochondria and matrix vesicles.// Clin Orthop.- 1982.- V. 169. -P. 219-242.

348. Yamada H, Nakagawa T, Stephens RW et al. Proteinases and their inhibitors in normal and osteoarthritic articular cartilage.// Biomed Res.-1987.- V. 8.-P. 289-300.

349. Yamane S, Reddi AH. Induction of chondrogenesis and superficial' zone protein accumulation in synovial«side population cells by BMP-7 and; TGE-betal.// J Orthop Res.- 2008.- V. 26.-P.485-92.

350. Yamashita F, Sakakida K, KusuzaldK, et al. Immunohistochemical localization of interleukin 1 in human growth cartilage.// Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi. -1989.- V. 63-P. 562-568.

351. Yang X, Chen L, Xu X, et al. TGF(32/Smad signals repress chondrocyte hypertrophic differentiation and are required for maintaining articular cartilage.// J Cell Biol.- 2001.V. 153.-P. 35-46.

352. Yasuda T, Poole AR. A flbronectin fragment induces type II collagen degradation by collagenase through an interleukin-1-mediated pathway.// Arthritis Rheum.- 2002.- V. 46-P. 138-148.

353. Yasuda T, Tchetina E, Ohsawa K, et al. Peptides of type II collagen can induce the cleavage of typeil collagen and aggrecan in articular cartilage.//Matrix Bioh -2006 .-V. 25.-P. 419-429.

354. Yoon HS, Kim HA, Song YW. Inhibition of NF-kappaB renders human juvenile costal chondrocyte cell lines sensitive to TNF-alpha-mediated cell death.// Rheumatol Int.- 2006.- V. 26.-P. 201-208.

355. Zhang D, Schwarz EM, Rosier RN, et al. ALK2 functions as a BMP type Preceptor and induces Indian hedgehog in chondrocytes during skeletal development.// J Bone Miner Res.- 2003.- V. 18.-P. 1593-1604.

356. Zhang R, Simmon DJ. Transforming growth factor-J32 mRNA level in unloaded bone analyzed by quantitative in situ hybridization.// J Bone Miner Res.- 1996.-V. 11.-P. S322.

357. Zhang X, Ziran N, Goater JJ, et al. Primary murine limb bud mesenchimal cells in long-term culture complete chondrocyte differentiation: TGF-p delays hypertrophy andJPGE2 inhibits terminal differentiation.// Bone .-2004.- V. 34.-P. 809-817.

358. Zhao Q, Eberspaecher H, Lefebvre V, et al. Parallel expression of Sox9 and GOL2A1 in cells undergoing chondrogenesis.// Dev Dyn.- 1997.-V. 209:-P. 377-386.

359. Zhou HW, Lou SQ, Zhang R. Recovery of function in osteoarthritic chondrocytes induced by pi6INK4a-specific siRNA in vitro.// Rheumatology (Oxford).- 2004.-V. 43.-P. 555-568.

360. Zuscik MJ, Baden JF, Wu Q, et al. 5-azacytidine alters TGF-beta and BMP signaling and induces maturation in articular chondrocytes.// J Cell Biochem.-2004.-V. 92.-P. 316-331.