Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточно-молекулярные механизмы развития эпилептиформной активности в поле САI срезов гиппокампа

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Клеточно-молекулярные механизмы развития эпилептиформной активности в поле САI срезов гиппокампа"

На правах рукописи

Семьянов Алексей Васильевич

КЛЕТОЧНО-МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ЭПИЛЕПТИФОРМНОЙ АКТИВНОСТИ В ПОЛЕ CAI СРЕЗОВ ГИППОКАМПА.

03.00Л 3 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО -1998

Работа выполнена в Научной группе Механизмов статической передачи Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Годухин О.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Семенова Т.П.

кандидат биологических наук, Кичигина В.Ф.

Ведущая организация: Институт мозга РАМН (Москва)

Защита состоится " " 1998 г. в {6 час. ОО мин.

на заседании диссертационного совета Д 200.22.01. в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142292 г. Пущи-но Московской области, проспект Науки, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан" гг» [уСс&лЯ 1998 г.

Ученый секретарь 7

/I

диссертационного совета, I • <

кандидат биологических наук / / ' ^^^Шл-Си^ р д. Нелипович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темь;: Эпилепсия представляет большую группу клинических заболеваний, которым подвергаются люди различных возрастов. По данным экспертов ВОЗ эпилепсия относится к числу наиболее распространенных заболеваний центральной нервной системы - эпилепсией страдает около 2% населения Земного шара (Hopkins, 1987).

Исследование механизмов развития эпилептиформной активность (ЭФА) в мозге преследует две цели: (1) выяснение фундаментальных механизмов функционирования нейронов и их сетей; (2) понимание механизмов развития эпилепсии.

Данные последних лег заставляют обратить особое внимание на важную роль глутаматных синапсов не только в нормальной функциональной активности нейронов мозга, но и в эпилептогенезе (Bradford, 1995; Bernard and Wheal, 1995; Че-пурнов и Чепурнова, 1997). Особый интерес к этим синапсам объясняется тем, что они обладают способностью длительно изменять эффективность проведения синаптического сигнала в зависимости от характера их предшествующей активации. Примером такого изменения является феномен долговременной потенциа-ции синаптической передачи (ДПСП). Однако, вопрос об участии ДПСП в клеточных механизмах эгашеггтогенеза до настоящего времени остается открытым (Cain, 1989; McEächem and Shaw, 1996). Кроме того, несмотря на интенсивные исследования последних лет, роль мембранных и внутриклеточных молекулярных механизмов, трансформирующих нормальный паттерн активности нейронов в эпилептиформный, во многом остается до сих пор неизвестной.

Так, несмотря на то, что существующие экспериментальные данные указывают на важную роль Ca2t как внутриклеточного регулятора нейронаяыюй возбудимости (Schwartkroin and Slawsky, 1977; Kennedy, 1989; Vreugdenhil and Wad-man, 1994), его роль в клеточно-молекулярных механизмах инициации, поддержания и термииации эпилептиформных пачечных спайковых разрядов остается не понятной. Не ясна прежде всего роль различных путей поступления Са2+ в клетку и участие регулируемого кальцием фосфорилирования нейрональных белков в клеточных механизмах эпилептогенеза.

Поиск ответов на эти вопросы может пролить свет не только на механизмы, лежащие в основе перестройки нормального паттерна активности нейронов в эпилептиформный, но и способствовать созданию новых терапевтических подходов к лечению эпилепсии, корректирующих нарушения гомеостаза Са2+ в кейро-

нах.

Цель и задачи исследования: Основной целью диссертационной работы являет« исследование клеггочно-молекулярных механизмов развития эпилептиформно£ активности в поле CAI срезов гиппокампа.

В конкретные задачи исследования входило следующее:

1. Показать возможность создания моделей эпилептогенеза in vitro с использованием изолированных срезов поля CAI гиппокампа, которые напоминали бы развитие киндлинга in vivo и подходили бы дня селективного изучения роли различных путей поступления Са2+ в клетку в долговременном снижении порога развитая ЭФА.

2. Изучить связь развития такого in vitro киндлинг-подобного состояния (КПС) в поле CAI срезов гиппокампа крыс с долговременной потенциацией глутаматср-гической синаптической передачи и увеличением возбудимости внесинаптиче-ской мембраны пирамидных нейронов.

3. Оценить роль NMDA-зависимых рецепторов глутамата и L-тша потенциал-зависимых Са2+ каналов (L-ПЗКК) в инициации этого состояния.

4. Исследовать возможное участие Са2+/кальмодулип-зависимой протеннктшзы П (КаМК П) в инициации и поддержании in vitro киндлинг-подобного состоя мя.

5. Изучить особенности развития КПС в поле CAI срезов гиппокампа крыс после традиционного киндлинга in vivo.

6. Сравнить развитие такого состояния у нормальных крыс Вистар и крыс, генетически предрасположенных к аудиогенным судорогам.

Научная новизна:

1. В представленной работе впервые была продемонстрирована возможность создания долговременного снижения порога развигия ЭФА в нейронах срезов поля CAI гиппокампа крыс, не зависящего от активности нейронов поля САЗ, путем кратковременных периодических эпизодов повышения внеклеточной концентрации К+ (К+0) или удаления внеклеточного Mg2+ (Mg2+0). Это состояние по своим характеристикам во многом напоминало развитие традиционного электрического киндлинга in vivo и было определено как in vitro киндлинг-подобное состояние (КПС).

2. Впервые было показано, что развитие КПС, вызываемое эпизодами повышения К+о, сопровождается увеличением возбудимости пирамидных нейронов поля CAI, тогда как развитие КПС, вызываемое эпизодами удаления Mg2+0, сопровождается увеличением эффективности глутаматергической синаптической

ередачи.

3. Впервые была проанализирована роль различных путей поступления Са2+ в летку в развитии КПС. Показано, что ключевую роль в этом процессе играет ход Са2+, опосредованный L-типом потенциал-зависимых Са2+ каналов, тогда ак Са2+ каналы, регулируемые М-метил-О-аспартатным подтипом (NMDA) ре-;епторов глутамата, оказывают модулирующее (облегчающее) действие. Эпилеп-огенные эффекты, связанные с поступлением Са2+ в пирамидные нейроны поля 'Al гиппокампа, по крайней мере частично, опосредуются активацией !а2+/кальмодулин-зависимой протеинхиназы П.

4. Получены доказательства в пользу сходства механизмов развития электри-еского (традиционного), а также аудиогешюго, ю-шдлшпа in vivo и развития ЭТС.

5. Показано, что нейроны поля CAI срезов гиппокампа крыс, генетически гредрасположенных к развитию аудиогенной судорожной активности, не обла-;ают исходно более низким порогом генерации ЭФА, но являются менее чувст-ительными к развитию КПС по сравнению с нейронами этого поля нормальных рыс.

6. Был предложен новый метод оценки развития синхронизированной пачеч-;ой активности пирамидных нейронов поля CAI, позволяющий измерить не-ольшое снижение порога развития паче:-; популяционных спайков и дающий озможность его количественного анализа.

Научно-практическая ценность работы: Результаты, полученпые в данной ра-оте, имеют как теоретическое значение для объяснения клеточных механизмов пилептогенеза, так и практическое для скрининга препаратов, обладающих эпи-ептогенным или противосудорожным действием. Данные о роли кальциевых аналов в развитии эпилептогенеза могут быть применены для разработки нового ласса противосудорожных препаратов, влияющих на гомеостаз Са2+ в клетках оловного мозга. Полученный материал вошел в курс лекций по "Основам нейро-иологии", читаемый в Пущинском государственном университете.

Апробация работы: Результаты работы доложены на Научной конференции о функциональной нейрохимии (Россия, Пущино, 18-20 сентября 1996), на Го-одской конференции молодых ученых (Россия, Пущино, 23-25 апреля 1997), на [ХХ1П International Congress of Physiological Sciences (St.Petersburg, Russia, June 0 - July 5, 1997), на Общеинститутской конференции ИТЭБ РАН (Россия, Пу-дино, 3-4 декабря 1997), на заседании Путинского отделения Физиологического

общества РФ (Россия, Пущино, 15 апреля 1998).

Публикации: По теме диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из "Введения", "Обзора литературы", "Материалов и методов", "Результатов и их обсуждения", "Заключения4 и "Выводов", изложена на 118 страницах и иллюстрирована 29 рисунками. В библиографическом списке указан 201 источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Регистрация вызванных популяционных ответов и оценка развития ЭФА в срезах гиппокампа

Работа выполнялась на срезах гиппокампа крыс Вистар (п=77) и крыс лилии Крушинского-Молодкиной (КМ, п=22). Для предотвращения влияния активности нейронов поля САЗ на развитие ЭФА в поле CAI проводилась перерезка связей САЗ-СА1. Расположение стимулирующего и регистрирующих электродов показано на рисунке 1. Возбудимость пресинаппнеских терминален, эффективность глутаматергической синаптической передачи и возбудимость внесинапгической мембраны нейронов оценивалась по зависимостям ("передаточные функции"): (1) амплитуда пресинаптического спайка (ПрС, мВ) от силы тестирующего стимула (цА), (2) наклон полевого ВПСП (пВПСП, мВ/мс) от амплитуды ПрС и (3) а^тлитуда популяционного спайка (ПС, мВ) от наклона пВПСП, соответственно.

В качестве эпилептогенной стимуляции использовались периодические кратковременные эпизоды повышения К+0 или удаления Mg2+0 (1-6 эпизодов по 30 сек с интервалом 10 мин.). Количественным критерием развития ЭФА служило число ПС в пачечном разряде (ЧСП) пирамидных нейронов при силе тестирующего стимула, равной 50 % от вызывающей тксималышй ПС. Кроме того, за критерий развития ЭФА был взят также порог (цА) генерации второго (дополнительного) ПС в пачечном разряде (ПГДС).

Для оценки роли NMDA рецепторов и L-типа потенциал-зависимых Са?+ каналов (L-II3KK) на фоне эпилептогенного воздействия давали APV (50 цМ, антагонист NMDA рецепторов) и шшодипин (10 цМ, блокатор L-ПЗКК), соответственно. Для'оценки роли КаМК II срезы пренкубировали в течении часа до начала регистрации с KN62 (3 рМ, ингибитор КаМК П).

пВПСП

5мс

П

Рис.1 Схема регистрации вызванных ответов в пирамидных нейронах поля CAI срезов гиппокампа.

А. Расположение электродов для регистрации популяционных ответов нейронов в поле CAI. 1 и 2 - регистрирующие внеклеточные микроэлектроды и соответствующие формы ответов; stim - биполярный стимулирующий электрод; sch - колдатсрали Щаффе-ра/комиссуральные волокна; ПрС - пресинапшческий популяционный спайк; пВПСП -полевой ВПСП; ПС - постсинаптнческий популяционный спайк. Слои гиппокампа: pir.-stratum pyramidale, rad.-stratum radiatum. Наклон пВПСП измерялся как тангенс угла а. Амплитуда ПС равна А. Амплитуда' ПрС вычислялась как амплитуда ПС. Б. Популяционные спайки, регистрируемые в stratum pyramidale поля GAI до (I) и после (II) воздействий, вызывающих развитие эпилептиформных разрядов. Регистрации расположены снизу в верх по мере увеличения силы тестирующего стимула. Стрелкой обозначен "дополнительный спайк", порог которого (ПГДС) взят за критерий оценки развития эпилептиформных разрядов.

Традиционный электрический киндлинг in vivo

Традиционный киндлинг in vivo создавался с использованием протокола (rapid alternate kindling), предложенного ранее Лотманом и Вильямсоном (Lothman and Williamson, 1994). Стимуляция гиппокампа проводилась сериями прямоугольных импульсов тока длительностью 0,2 мсек. (частота импульсов в серии 50 Гц, длительность серии - 10 сек.). Использовалась интенсивность стимулов, вызывающая электрические послеразряды (группу популяционных спайков длительностью не менее 10 секунд после окончания стимуляции), которая обычно варьировала в пределах 25СМ00 цА. Эти серии стимулов давались через 1 сутки (12 серий в день с интервалом 30 мин.) в течение 8 суток (всего 48 стимулов).

Аудиогенная судорожная активность

В работе были использованы 3 группы крыс линии Крупхинского-Молодкиной (КМ) с генетической предрасположенностью к развитию аудиоген-ной судорожной активности: (1) натавные, (2) подвергнутые однократной звуковой стимуляции, (3) подвергнутые хронической звуковой стимуляции (аудиоген-ный киндлинг).

В экспериментах с однократным звуковым воздействием параметры стимуляции были 107 дБ, 12-16 кГц 90 сек.. За 1 минуту до окончания судорог крыс де-хапитировали и выделяли срезы гиппокампа.

Хроническая стимуляция (аудиогенный киндлинг) проводилась в течении 40 дней звуковыми стимулами (75 дБ, 12-16 кГц, 90 сек., 1 раз в день), что приводило к постепенному увеличению продолжительности и интенсивности аудиоген-ных судорог.

Статистический анализ

Данные представлены как средняя ± стандартная ошибка средней. Для анализа достоверности отличия значений сравниваемых параметров использовался однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA, при Р<0,05 различия считались достоверными).

Результаты исследований и их обсуждение

In vitro киндлинг-подобное состояние (КПС)

На рисунке 2 показано, что однократное 30-сек. повышение К+0 приводило лишь к кратковременному следовому снижению ПГДС и увеличению ЧСП. Два эпизода приводили к более длительному снижению порога генерации ЭФА. В этом случае достоверное увеличение ЧСП наблюдалось до 40 минут включительно, а снижение ПГДС сохранялось свыше 1 часа, возвращаясь затем к контроль-

шм значениям. И только 3 и более эпизодов приводили к долговременному достоверному снижению ПГДС и увеличению ЧСП (> 2 часов).

Похожие эпилептогенные зффекты вызывали также периодические (но не од-юкратные) удаления Mg2+0 (рис.3).

Полученная модель эпилептогенеза in vitro имела характеристики, свойствен-1ые традиционному киндлингу in vivo: (1) прогрессирующие снижение порога ¡ызванных пачек ПС (в зависимости от числа эпизодов в эпилептогашом воздей-твии) и (2) диителыюе поддержание такой активности после окончания воздействия. На основании этого данная модель была названа in vitro киндлинг-юдобным состоянием (КПС).

Анализ эффективностей гпутаматергической ситптической и ВПСП-спайк хсредач

Анализ "передаточных функций" показал наличие устойчивого сдвига кривой ;ависимостей наклона полевого ВПСП от амплитуды ПрС (долговременная по-"енциация глутаматергической синаптической передачи - ДПСП) при 3-х без-víg2+0 эпизодах и кривой зависимости амплитуды ПС от наклона пВПСП (долго-феменная ВПСП-спайк потенциация - ДПВС) при 3-х К+0 -эпизодах (рис.4).

Таким образом, в зависимости от характера эпилепгогенного воздействия (К+0 ни 6e3-Mg2+0 эпизоды) в пирамидных нейронах поля CAI гиппокампа наблюда-¡тся ДПВС или ДПСГ1, соответственно. По-видимому, это различие связано с юобенностями действия эпилептогенных стимулов. Удаление Mg2+0 приводит, по !сей вероятности, к преимущественной активации NMDA-зависимых Са2+ капа-юв благодаря освобождению их от Mg2+0 блока. Для поля CAI показано, что раз-¡итие ДПСП происходит именно благодаря NMDA рецептор-опосредованным механизмам. IC-деполяризация, помимо удаления Mg2+0 блока этих каналов макет активировать потенциал-зависимые Са2+ каналы, в частности L-типа, что, в :вою очередь, может быть важным для развития ВПСП-спайк потенциацга. В :вязи с этим, следующей задачей исследования было изучить роль NMDA рецепторов глугамата, а также роль L-типа Са2+ каналов в развитии КПС и ассоцииро-!анных с этим состоянием ДПСП и ДПВС.

Анализ paiи ШЮА рецепторов глутамата и L-ПЗКК в развитии КПС

Три периодических К+0 или 6e3-Mg2+0 эпизода на фоне APV (50 цМ) приводи-ш к достоверно меньшему снижению ПГДС и увеличению ЧСП, чем без APV.

Таким образом, развитие КПС зависит от активаций NMDA-зависимой Са2+ троводимости только частично. Использованный антагонист полностью устранял

Контроль 1 К* ЭК*

Время (мин)

-20 0 20 40 60 80 100 120

Время (мин)

Рис.2 Эффекты кратковременных повышений К+„ на развитие вызванной пачечной активности в поле CAI срезов гиппокампа. А. Типичные формы пачечных разрядов в str. pyramidale поля CAI (стимул - 620 цА). Контроль - регистрация через 5 часов суперфузии без экспериментального воздействия. 1К* - регистрация через 1 час после 1-го повышения К+„ (30 сек.). ЗК+ - регистрация через 1 час после 3-х повышений К*0 (3*30 сек. через 10 мин.) Б. Динамика изменения ПГДС после 1-го (-Ф-), 2-х (-■-), 3-х (-А-) и 6-и (-Л-) увеличений К+0. Контрольные значения (пунктир) приняты за 1. Остальные данные нормированы относительно контроля. За 0 времени принята последняя регистрация перед воздействием, далее отсчет ведется от окончания последнего К+0-эпизода. Разбросы - стандартная ошибка среднего. * и ** - достоверность отличия от контроля при Р<0,05 и Р<0,01, соответственно. В. Динамика изменения ЧСП после 1-го (-♦-), 2-х (-м-), 3-х (- Á -) и 6-и (-Д-) увеличений К+0. Пунктир - контрольные значения. Отсчет времени и достоверности как на рис.2Б.

А.

Контроль \

Vv t

I Mg"

3 Mg'

Л

Лл

1 мВ

10 мс

Б.

В.

40 60 Время (мин)

120

40 60 Время (мин)

120

Рис.3 Эффекты кратковременных удалений Mg2+0 на развитие вызванной пачечной активности в поле CAI срезов гиппокампа. А. Типичные формы пачечных разрядов в str. pyramidale поля CAI (стимул - 620 цА). Контроль - регистрация через 5 часов суперфузии без экспериментального воздействия. 1 Mg2+„ - регистрация через 1 час после 1-го удаления Mg2+0 (30 сек.). 3 Mg2+0 - регистрация через I час после 3-х удалений Mg2+0 (3*30 сек. через 10 мин.) Б. Динамика изменения ПГДС после 1-го (-♦-) и 3-х (-А-) удалений Mg2+0. Контрольные значения (пунктир) приняты за 1. Остальные данные нормированы относительно контроля. Отсчет времени и достоверности как на рис.2Б. В. Динамика изменения ЧСП после 1-го (-♦-) и 3-х (-А-) удалений Mg2+0. Пунктир - контрольные значения. Отсчет времени и достоверности как на рис.2Б.

3 к*

3 Мд

0.2 0.3 0.4 ПрС (мВ)

ч 0.5

0.2 0.3 ПрС (мВ)

3.5

3 -

ш 2.5 „

В 1.5 1

0.5 0

-Ь

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 О.В пВПСП (мВ/мс)

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 пВПСП (мВ/мс)

Рис.4 "Передаточные функции" (усредненные значения) после 3-х К\, (3 К 0) и (3 Мз2+о) эпизодов А - значения через 1 час после окончания воздействия; -о- контрольные значения, соответствующие моменту времени регистрации после воздействия.

4

как ДПВС при К+0 эпизодах, так и ДПСП при без-М£2+0 эпизодах. Этот факт указывает на важную роль ММЕ)А-зависимой Са2+ проводимости для развития этих типов потенциации. Кроме того, полученные результаты указывают на то, что ни ДПСП, ни ДПВС не являются абсолютно необходимыми для развития КПС.

Три периодических К+0 или без-1^2т0 эпизода на фоне нимодшина (10 ¡лМ) не приводили к долговременному снижению ПГДС и увеличению ЧСП. Это указывает на то, что Ь-ПЗКК, по-видимому, играют ключевую роль в развтие КПС. Нимодипин устранял также как ДПВС, так и ДПСП. Отсюда следует, что развитие ассоциированных с КПС долговременных потенциаций, по всей видимости, определяется как ММГ)А рецептор-, так и Ь-ПЗКК-зависимой Са2+ проводимо-стями.

Анализ роли Са2+/калшодулш-зависшюй протеинкиназы II в .механизмах развития КПС

Три К+0 эпизода на срезах, предварительно проинкубированных с KN62 (3 цМ), не приводили к изменению фазы инициации КПС, однако фаза поддержания этого состояния подавлялась. Таким образом, КаМК П, в данном случае, может играть роль в поддержании, но не в инициации, долговременного снижения порога развития ЭФА.

Анализ "передаточных функций" показал, что К+0 эпизоды в срезах гиппо-кампа, преинкубированных с KN62, не приводили к развитию ДПВС в пирамидных нейронах поля CAI. Это может свидетельствовать в пользу того, что КаМК II принимает участие также в развитии долговремешюй потенциации, сопровож-даощей КПС.

Исходя из полученных данных, на рисунке 5 показана гипотетическая схема участия синаптических NMDA-зависимых Са2+ каналов, L-ПЗКК и КаМК П в механизмах индукции и поддержания КПС. Эпилептогешгые стимулы индуцируют дшггелькые следовые изменения в свойствах L-ПЗКК, которые приводят к возникновению деполяризационных сдвигов мембранного потенциала. Fla фоне такого сдвига развиваются пачки №+-спайков. Развитие ДПВС или ДПСП способно потенцировать азспжность L-nma Са2+ каналов и, таким образом, вносить свой вклад в развитие ЭФА. Обе формы долговременной потенциации связаны как с NMDA рецептор-, так и L-ПЗКК-зависимым поступлением Са2+ в нейроны, которое приводит к активации КаМК II. Этот фермент играет ключевую роль в развитии этих потенциации. Помимо механизмов инициации пачечного эпилеп-тиформного разряда, на схеме (на основании литературных данных) представлены механизмы его терминации. Во-первых, это могут быть Са2+-зависимые К+-каналы, активирующиеся при увеличении внутриклеточной концентрации Са2+ и приводящие к послеспайковой гиперполяризации, подавляющей деполя-ризационный сдвиг (Brown and Griffith, 1983; Azouz, Jensen and Yaari, 1992; Pongracz et al., 1992). Во-вторых, гиперполяризующее действие может оказывать возвратное ГАМК-ергическое торможение (Traub, Jefferys and Whittington, 1994; Arai, Silberg and Lynch, 1995; Traub et al., 1996). И, в-третьих, терминация пачечных разрядов может бьггь связана с инактивацией L-ПЗКК (Vreugdenhil and Wadman, 1992; Qin et al., 1996).

миссуральные волокна, ИН - тормозные интернейроны, минус - тормозные ГАМКергиче-ские синапсы, плюс - возбуждающие глугаматергические. ДП - долговременная потенциа-пия (ДПСП или ДПВС). Сплошные стрелки - механизмы формирования ДП и деполяриза-ционного сдвига; прерывистые - модулирующие (облегчающее) действие ДП, точечные -механизмы терминации деполяризационного сдвига (по литературным данным).

Особенности развития in vitro киндлинг-подобного состояния у крыс Вистар после электрического киндлинга in vivo

У крыс через 1 сутки после окончания киндлинговой стимуляции in vivo ПГДС в пирамидных нейронах срезов поля CAI был ниже, а ЧСП больше, чем у контрольных животных (рис.6). Следовательно, киндлинг in vivo приводит к снижению порога генерации ЭФА в пирамидных нейронах поля CAI гиппокампа.

А .

крысы

без воздействия

1 час после 3 К *

нормальные

/синд л и и го 8 ы е

io/Yv

20 40 60 80 100 120 Время (мин)

40 60 Время (мин)

1 20

Ри.:. 6 Эффекта 3-х периодических КЛ, эпизодов на развитге вызванных пачек ПС в поле СЛ1 срезоз гиппокампа после киндлинга in vivo. Л. Типичные формы разрядов в str. pyramidale (стимул - 620 цА) для "нормальных" и киндлинговых крыс, "без воздействия" -регистрация через 5 пасов сунерфузии без экспериментального воздействия. "1 час после 3 К+" - регистрация ч-.'рсз 1 тас после 3-х К+„ эпизодов (3*30 сек. через 10 мин ) Стрелка -дополнительный ПС. Б. Динамика изменения ПГДС после 3-х К+„ эпизодов в поле CAI срезов гиппокампа "нормальных" (-А-) и киндлинговых (-♦-) крыс. Широкчй пунктир -ПГДС без воздействия для киндлинговых крыс. Узкий пунктир - ПГДС без воздействия для "нормальных" крыс (принят за 1, остальные данные нормированы относительно него). * и ** - достоверности отличия от ПГДС для "нормальных" крыс без воздействия при Р<0,05 и Р<0,01, соответственно. Отсчет времени как на рис.2Б. В. Динамика изменения ЧСП после 3-х К о эпизодов в поле CAI срезов гиппокампа "нормальных" (-А-) и киндлинговых (-*-) крыс. Широкий пунктир - ЧСП без воздействия для киндлинговых крыс. Узкий пунктир -ЧСП без воздействия для "нормальных" крыс. Отсчет времени как на рис.2Б, достоверности как на рис. 6Б.

без воздействия

1 час после Z К

1.2 1

í°

:0.6

0.4

0.2

Л

I А А Л"4

1 ЛЛ/ V! и

Л/

ñíW74-

20 40 60 Время (мин)

100

Рис.7 Эффекты 3-х К+0 эпизодов на развитие вызванных пачек ПС в поле CAI срезов гии-покампа крыс линии КМ после хронической звуковой стимуляции. Л. Типичные формы разрядов в str. pyramidale (тестирующий стимул - 620 цА) для нативных (КМ) и крыс поело аудиогеиного киндлинга (КМ АК). "без воздействия" - через 5 часов суперфузии среза без экспериментального воздействия. "1 час после 3 К+" - через 1 час после 3-х К+0 эпизодов (3*30 сек. через 10 мин.) Стрелка - дополнительный ПС. Б. Динамика изменения ПГДС после 3-х К+<, эпизодов для нативных (-А-) и крыс после аудиогенного киндлинга (-в-). Широкий пунктир - ПГДС без воздействия для киндлинговых крыс. Узкий пунктир - ПГДС без воздействия для нативных крыс (принят за I, остальные данные нормированы относительно него). * и ** - достоверности отличия от ПГДС для нативных крыс без воздействия при Р<0,05 и Р<0,01, соответственно. Отсчет времени как на рис.2Б. В. Динамика изменения ЧСП после 3-х К+0 эпизодов для нативных (-А-) и киндлинговых (-Ш-) крыс. Широкий пунктир - ЧСП без воздействия для киндлинговых крыс. Узкий пунктир - ЧСП без воздействия для нативных крыс. Отсчет времени как на рис.2Б, достоверности как на рие.7Б.

А

Б

В

Три периодических К+0 эпизода не приводили к дальнейшему снижению ПГДС и увеличению ЧСП в этих клетках. Эти данные говорят в пользу окклюзии между механизмами развитая КПС и механизмами снижения порога генерации ЭФА, индуцируемыми электрическим киндлингом in vivo. Таким образом, данная модель эпилептогенеза in vitro не только напоминает традиционный киндлинг по некоторым своим характеристикам, но и, по-видимому, имеет одинаковые с ним механизмы развития.

Особенности развития in vitro киндлинг-подобного состояния у крыс КМ с генетической предрасположенностью к аудиогенньш судорогам

Величины ПГДС и ЧСП в пирамидных нейронах поля CAI срезов гиппокампа крыс линии КМ без и после однократных аудиогенных судорог не показали отличий от значений этих параметров для крыс Вистар. Таким образом, сама по себе генетическая предрасположенность к аудиогенным судорогам не приводит к снижению порога генерации ЭФА в этих клетках. Три повторяющихся К+0 или 6e3-Mg2+0 эпизода приводили к снижению ПГДС и увеличению ЧСП в пирамидных нейронах срезов поля CAI у крыс линии КМ (менее выраженному, чем у крыс Вистар) независимо от того: вызывались ли у животных аудиогенные судороги на однократный звуковой стимул или нет. Таким образом, сами по себе острые аудиогенные судороги не оказывают влияния на порог развития ЭФА в пирамидных нейронах поля CAI. Однако, у животных после хронической звуковой стимуляции наблюдалось ярко выраженное развитие пачек вызванных ПС в ответ на одиночный электрический стимул. При этом, ПГДС у данных крыс был ниже, а ЧСП больше, чем у крыс, не подвергавшихся хронической звуковой стимуляции (рис.7). Три К+0 эпизода не приводили к дальнейшему снижению ПГДС и увеличению ЧСП, что говорит в пользу окклюзии между механизмами развития КПС и механизмами снижения порога генерации ЭФА, индуцируемыми аудиогенным киндлингом.

Суммируя результаты исследований на срезах поля CAI гиппокампа крыс линии КМ после аудиогенного киндлинга и крыс Вистар после электрического киндиинга in vivo, можно говорить о наличии сходных механизмов в развитии КПС, индуцируемого эпизодами повышения К+0 и в развитии судорожной активности, вызываемой киндлингом in vivo.

выводы

1. Повторяющиеся (3-6) кратковременные эпизоды повышения (до 20 мМ) или удаления Mg:t0 приводят к длительному следовому снижению порога гене-ращш вызванных пачек популяционных спайков и увеличению их числа в пачке в поле CAI (независимо от активности нейронов поля САЗ) срезов гиппо-камна крыс Вкстар. Эти эпилептиформные события по некоторым своим характеристикам напомипают развитие традиционного киндаинга in vivo и были названы in viiro киндлинг-подобньш состояшем (КПС).

2. Развитие этого состояния сопровождается долговременным увеличением эффективное гей проведения сигнала в нейрональной сети поля CAI: увеличением возбудимости внесинаптической мембраны пирамидных нейронов (ВПСП-спайк потепцкация) в случае повторяющихся эпизодов повышения К+0 и увеличением эффективности глутаматергической синоптической передачи в случае повторяющихся эпизодов удаления Mg2+0. Обе формы долговременной потен-циащш модулируют (облегчают) развитие индуцируемой К+0 или 6e3-Mg2+„ эпизодами эпилептиформной активности, но не являются необходимым! для ее инициации.

3. Вход Са2+ через L-тии потенциал-зависимых кальциевых каналов играет ключевую роль в развитии КПС, а через NMDA-регулируемые кальциевые каналы оказывает модулирующее (облегчающее) влияние нэ развитие этого состоят«.

4. Поддержание, но не швщиащш эпилептогепных эффектов, связанных с поступлением Са2' в пирамидные нейроны поля CAI гиппокампа при КПС, по всей видимости, опосредуются активацией Са27кальмодулин-зависимой протеин-кшшзы II.

5. Традиционный электрический киндлинг in vivo сам по себе приводит к снижению порога генерации ЭФА в пирамидных нейронах срезов поля CAI гиппокампа крыс Вистар. Причем наблюдается окклюзия этой ЭФА и ЭФА, индуцируемой периодическими эпизодами повышения К+0 в тех же нейронах.

6. Нейрональная сеть поля CAI срезов гиппокампа крыс линии Крушинского-Молодкиной, генетически предрасположенных к аудиогенным судорогам, сама по себе не обладает сниженным порогом генерации ЭФА. Однако, хроническая (но не однократная) звуковая стимуляция крыс данной линии (аудиогенный киндлинг) приводит к снижению этого порога. Причем наблюдается окклюзия ЭФА, вызываемой хронической звуковой стимуляцией, и ЭФА, индуцируемой периодическими эпизодами повышения К+0 в тех же нейронах.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Semyanov A., Godukhin О. Kindling-like state in rat hippocampal CA1 slices induced by the repeated short-term extracellular K+ increases: the role of L-tvpe Ca2+-channels. Neuroscience Letters 1997, V.223, P. 177-180.

2. Semyanov A., Morenkov E. and Godukhin O. The decreased susceptibility to the development of in vitro kindling-like state in hippocampal CA1 slices of rats sensitive to audiogenic seizures. Neuroscience Letters 1997, V.230, P. 187-190.

3. Семьянов A.B., Калеменев G.B., Годухин O.B. Киндлинг-подобное состояние, вызываемое периодическим повышением внеклеточного 1С, в поле СА1 гип-покампа крыс. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова 1997, Т.83, №8, С.14-23.

5. Семьянов А.В., Моренков Э.Д., Калеменев С.В., Ярошенко В.П., Годухин О.В. Повышение порога развития эпилепгиформной активности в поле СА1 срезов гиппокампа крыс линии Крушинского-Молодкиной как адаптивный защитный механизм. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова 1998 (принято к печати).

6. Семьянов А.В. Роль различных путей входа Са2+ в развитии энилепгиформ-ной активности в поле СА1 срезов гиппокампа крысы. Тезисы докладов Городской конференции молодых ученых, Пущино, 23-25 апреля 1997, с. 145.

7. Semyanov A., Godukhin О. Kindling-like state in rat hippocampal CA1 slices induced by the repeated short-term extracellular K+ increases. The role of L-type Ca2f-channels. Abstracts' of XXXIII International Congress of Physiological Sciences, St.Petersburg, Russia, June 30 - July 5 1997, P075.51.

8. Semyanov A., Godukhin O. Kindling-like state in vitro induced by the repeated short-term extracellular Mg2+ removals in Wistar rat CA1 hippocampal slices. Abstracts of Cortical Plasticity Conference. Berlin, Germany, June 24-26 1998 (accepted).

9. Semyanov A., Godukhin O. The modulation of the in vitro kindling-like state development by NMDA receptor. Abstracts of Forum meeting of European Neuroscience. Berlin, Germany, June 27-July 1 1998 (accepted).