Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие тормозной системы поля СА1 гиппокампа в раннем постнатальном онтогенезе

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Развитие тормозной системы поля СА1 гиппокампа в раннем постнатальном онтогенезе"

московский гссударсгвкншй университет

им. II Б. ЛОМОНОСОВА

ШОХОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

' Еа правах рукописи УДК 512. 325. 3: 512. 822

«ккороз ншгхшй БУ??С03ЙЧ

РАЗБИТИЕ ТОРШЗНОЙ-СИОТЕШ ПОЛЯ СМ ГгйТБОКАША В РАНВЕ'Н ПОСТКАТАЛЬЖМ ОНТОГЕНЕЗЕ

03. С?. 13 - ф-змсжетга человека и гзсгосздс

АВТОРЕФЕРАТ '

диссертации на соискание ученой' степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа 'выполнена в лаборатории функциональной

синаптологии Института мозга РАЖ

(зав. лабораторией - проф., д. б.н. В. Г. Скребицкий)

Научный руководитель: доктор биологических наук;

профессор а Г. Скребицкий

Официальные оппоненты:

.доктор биологических наук, профессор В. Е Шульговский кандидат биологических наук Л. К Анциферова

Ведущее учреждение Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии АН РФ

Защита состоится 1992 на заседании Специализиро-

ванного совета Д. 053.05.35 при Московском Государственном Университете иы М. Е Ломоносова по адресу: 117234, Москва, Ленинские горы, Ш, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан "_"_ 1992 Г.

Ученый секретарь ' специализированного совета, кандидат биологических наук Б. А. У.чарова

Актуальность темы. В настоящее время ведется интенсивное изучение структурно-функциональных принципов организации тормозной системы мозга. Показано, что тормозная* система принимает участие в организации ритмической активности мозга, пластических перестройках, является мощным ограничивающим фактором в развитии эпилептиформной активности ( Виноградова, 1S75; Скре-бицкий, 1977; Никитина с соавт., 1980; Воронин с соавт. , 19S2; Серков, 1386; Brailowsky et al., 1988; Kanphuis et al., 1988).

С помощью морфологических, элекгрофиз-иологичееких, имму-ногистохимических и нейрофамакологических методов выявлены структурные и физиологические основы процессов торможения в ЦНС. Установлено, что основным тормозным медда?ором в ЦНС является -аминомаслянная кислота (ГАМК). Выделяясь из пресинап-тических терминалей тормозных интернейронов. ГАМК. вызывает генерацию тормозных постсинаптических потенциалов (ТБСП). В поле СА1 гилпокампа, как и во многих других структурах мозга, ТБСП состоит из двух компонентов - ранней и поздней фаз. Ранний ТПСП (рТПСП) возникает сразу после ВПСП и является, результатом активации как возвратных, так и прямых тормозных путей (Kandel et al., 1961; Andersen et al., 1964; Alger a Nicoll,- 1982) и мозкет быть вызван либо ортодромной, либо антидромной стимуляцией. рТПСП связан с активацией хлорной проводимости мембраны и опосредуется ГАМК(а) рецепторами на телах пирамидных нейронов. Поздний ТБСП ( пТПСП) является результатом активации прямых синадтических путей и возникает только при ортодромной стимуляции (Alger a. Nicoll, 1982; Alger, 1984; Hewbery а. Nicoll, 1984,1985). пТПСП опосредуется ГАМК(б) рецепторами, сопряженными с калиевыми каналами и локализованными постсинап-тически на дендритах пирамидных клеток (Gahwlller a Brown, 1985; Dutar a. Micoll, 1988). Кроме того, в некоторых условиях (присутствие барбитуратов, 4-аминолиридина) афферентная стимуляция вызывает длительный деполяризационный ТИШ, опосредованный ГАЩ а) рецепторами, локализованными на дендритах. Эти ТПСП, по-видимому, связаны с активацией тормозных интернейронов, участвующих в прямом торможении (Alger a Nicoll, 1982;

Avoli et aL , 1987;.

Ыы предполоюиш, что отдельные типы торможения имеют ге-терохронное развитие в раннем постнатальном онтогенезе и что электрофизиологтеские исследования развития тормозной системы на ранних сроках постнатального развития (ПР) позволят определить время формирования подтипов торможения и глубже понять их функциональное. значение.

Удобной модель» для изучения закономерностей функционального развития скнаптических связей в ЦКС являются переживающие срезы гиппокампа, имеющего относительно простое строение (L. de No, 1S34) и созревающего в значительной степени постнаталь-но (Bayer a Altяап, 1974; Зауег, 1930).

В настоящее вреш гисто-, цдао-, и скнаптогенез гиппокам-па изучен достаточно хорошо (Bayer a. ^fcMurray, 1981; Coyle et al. , 1976; Aldinio et al, 1980; Baudry et al., 1981; Kunkel et al. , 1982, 1986; Schwartzkroin et al,, 1981, 1982). В то же время электрофизиологические исследования постнатального развития гиппокампа немногочисленны и направлены главным образом на изучение функционального созревания возбуждающих внутренних и внешних систем связей. Данные о развитии тормозных систем гиппокампа на ранних сроках постнатального развития крайне ограничены. Работы, проведенные in vivo,.показали наличие хорошо выраженного Т11СД в пирамидных нейронах гиппокампа уяе на ранних сроках постнатального развития на все стимулируемые входы (Purpura et al., 1968). В то же время имеются элекгрофизиологические исследования, указывающие на более позднее формирование тормозной системы гиппокампа относительно развития возбуждающих связей (Harris a. Teyler, 1983; Janigro а. Schwartzkroin, 1988; Michelson a. Lothman, 1983).

Дели и задачи.иселёдования. Целью настоящего исследования являлось изучение развития торможения в поле СА1 гиппокампа в раннем постнатальном онтогенезе. Конкретные задачи данного исследования состояли в следует ем: *

1. Адаптировать имеющуюся методику переливающих срезов гиппокампа для работы с новорожденными животными и определить ее адекватность при изучении свойств незрелой нервной ткани.

2. Описать формирование вызванной суммарной электрической активности в поле СА1 гиппокампа на ранних сроках постнаталь-

ного развития.

3. Определить сроки созревания систем пряного и возвратного торможения (хлорного и калиевого типов).

4. Описать электрофизшлогические характеристики пирамидных нейронов поля CAI гилвокзмпа на разных сраках постнаталь-ного развития.

5. Провести сравнительный анализ действия агонистов и антагонистов ГАМК рецепторов на ранних сроках постнатального развития.

Научная нозизна и ¡фактическая значимость. В настоящей работе получены новые данные о сроках формирования в раннем постна-тальном онтогенезе тормозных систем гипнокакаа и особенностях их функционирования. Полученные данные свидетельствуют о гетерохронии развития возбуждающей и тормозной светем гиппокакпа.

Было обнаружено, что система прямого тсрможания, опосредуемая ГАЩа) рецепторами, функционирует в гишюкампе уже на самых ранних исследованных сроках БР (Э-5 яаей), в то время как система возвратого тормо:геяия формируется значительно лоз-ле (на второй неделе жизни). Впервые показано, что функционирование • системы тормокения, опосредуемой ГАЩб) рецепторами и связанной с повышением калиевой проницаемости мембраны нейронов, начинается лишь со второй недели постнатального развития. Описаны особенности развития судорожной аютвноетм у молодых ' животных в услозиях естественного отсутствия калиевого и блокады хлорного типов торможения.

Результаты данной работы могут быть ло-вззны для понимания принципов' развития торшжеяия в ЗНС, а такае для выяснения особенностей действия на незрелую нервную ткань некоторых фармакологических препаратов. Язвестно, что целый ряд изпользуе-мых в клинике нейротропиых препаратов (барбитураты, бензодиа-зешшы, некоторые анестетики) осуществляют свое фармакологическое влияние, взаимодействуя с ГАШергической системой мозга. В этой связи результаты данной работы могут быть пблезны для понимания механизмов действия этих препаратов на развивающийся мозг, а разработанная модель (срезы развивающегося гип-покампа) может быть использована для направленного скрининга новых фармакологических препаратов.

- б -

Структура л объем диссертации. Диссертация включает страниц машинописного текста, рисунков и 1 таблицу. Текст' состоит из введения, обзора литературы, описания методики и объекта исследования, обсуждения результатов и выводов. В списке использованной литературы - названий, в том числе-зарубежных легочников. Основное содержание диссертации отражено в 7 печных работах.

Апробация работы, ^сериалы диссертации докладывались на двух Всесоюзных конференциях по кейронаукам (1988, 1990); :-ненаучных конференциях молодых ученых в ' Институте. ВНД и 5íK (1986, 1988). в Институте мозга (1988) и на V Всесоюзной конференции, поевюешшй 80-летию со дня рождения XI С. Коштоянца (1990). •

Материалы и методы.

Элэктрофизамогические исследования in vivo на ранних сроках постнатадьного развития сопровождаются целым рядом трудностей, связанных с фиксацией жесткого и большой повреждаемостью нейрокэв во время внутриклеточной регистрации. ■ В связи с згим ш применяли методику регистрации электрической ■активности нейронов в переживающих срезах гиппокампа, которая,-по сравнению с in vivo, имеет- следующие преимущества:

1. Возможность визуализации мест стимуляции и отведения.

2. Возможность контроля химического состава среды и подведения фармакологических препаратов в известной концентрации.

3. Стабильность отводимых параметров.

4. Уменьшение числа неконтролируемых факторов.

Б качестве подопытных животных в данной работе использовались мыши sann С57/В1аок в возрасте от 3-4-х дней до б месяцев.

Изготовление среза производили следующим образом. Животное декапитировали и глазными ножницами делали разрез кожи и теменной костя до еагитапьному шву. Кости удаляли загнутым пинцетом. Сколом лезвия бритвы перпендикулярно к поверхности коры делали глубокий разрез мозга параллельно его медиальной

линии," на растоянии 1-1,5 "мм. На сечении мозга идентифицировали гиштоками и параллельно первоначальному разрезу отсекали несколько (2-3) поперечных-срезов гшшокаша. После вырезания срезы переносили в инкубационную камеру. Процедура изготовления срезов занимала от 30 до 90 сек. Перед началом регистрации электрической активности срезы инкубировали при комнатной температуре 10-15 мин, и после постановки электродов - в течение одного часа при температуре 30 градусов.

В настоящей работе был использован широко распространенный модифицированный раствор Ямамото (ïamamoto, 1979) следующего состава (в МВД: NaCl - 126;. КС1 - 3,5; Mg50y - 2; CaCl^ -2; NaaHPOv - 1,25; МаНС03 - 26; глюкоза - 10. Отведение электрической активности и стимуляция срезов осуществлялись стеклянными микроэлектродами. В эксперименте • использовали биполярное раздражение нервной ткани. Длительность ишульсов изменяли в пределах 0,1-G,4 мкс, при токах стимуляции 5-500 мкА. '

Для оценки работы системы возвратного торможения использовали парную стимуляцию. Кондиционирующая стимуляция alveus (место прохождения аксонов пирамидных нейронов поля СА1) вызывала активацию системы возвратного торыояения через коллатера-ли аксонов пирамидных нейронов. Изменение ответа на тестирующую стимуляцию коллатералей ЕЬффера (ЕШ) сзщгяило показателем развивающегося тормозного процесса Шхстимульный интервал в случае, использования ритмической стимуляции составлял 20 сек.

В работе использовалась проточная термоетабилизированная камера Солевой раствор поступал в камеру вследствие перепада высот мезду емкостью, в которой он находился, и собственно камерой. ïïrm помощи поплавкого измерителя скорости поддерживалась постоянная скорость протока (2,5 мл/мин). Принципиальные .изменения, внесенные в конструкцию камеры, ошсанной в работе ЕЕ Воробьева (1982), состояли в уменьшении объема инкубационной камеры, в организации протока самой камеры, во. введении дополнительной камеры по типу сообщающихся сосудов для стабилизации уровня раствора и во введении дополнительной сетки над срезом для стабилизации среза (Alger a. Mi coll, 1980). Уровень раствора при этом поддерживался на 1-2 мм выше поверхности среза. Эти изменения позволили получить более стабильные внутриклеточные записи для всех исследованных возрастов и обеспечили равномерную аппликацию фармакологических веществ.

с

В настоящей работе использовались усилители для внутриклеточных отведений MZ-4 (Япония) и WPÍ-S-7G72 (США), а также стимулятор WPÍ (CEA). Дополнительная стимуляция осуществлялась с миникомпьютера FDP-8A (США). Запись результатов производилась на фотопленку, на магнитограф 3DR-13 (Япония) и ка гибкие диски.

Дяк оценки достоверности результатов применялся критерий Стьюдента. Бее описанные изменения ответов оценивались по критерию знаков и были достоверны, по крайней мере, с вероятностью р < 0,05.

В . работе использовались следующие соединения: бикукуллин (Серва), пикротоксин (Сигма), диазепам (Сигма).

Результаты исследований и их обсуждение

I. Общая характеристика суммарной и синаптичеекой активности и свойств -мембраны нейронов гиплокампа на ранних сроках постнатального развития.

1. Развитие вызванной суммарной электрической акгивнссти поля CAI гипшжампа

Фокальные потенциалы гиплокампа представляют собой суммарную активность большого числа нейронов и являются хорошими показателями степени зрелости синапгических систем. Так как еинаптическая активность нейронов, лежащая в основе генерация фокального потенциала, включает в себя и тормозные процессы, можно предположить, что формирование тормозной системы будет также отражено в развитии суммарной электрической активности гиплокампа Поэтому первым этапом в изучении постнатального развития тормозной системы поля CAI гиплокампа явилось изучение формирования суммарной вызванной активности. Было обнаружено, что фокальные •потенциалы, возникающие в ответ на раздражение КШ в гиппокампе мышей первой недели жизни, существенно отличаются от фокальных потенциалов у взрослых животных. На третий - четвертый день постнатального развития фокальный потенциал при отведении в слое тел имел вид негативного или позитивно - негативного колебания амплитудой около 1 мВ. Преси-наптичеекмй компонент ответа был выражен незначительно. На не-

гатизной фазе вызванного потенциала часто регистрировались асинхронные спайковые разряды отдельных нейронов. При нанесении парных стимулов наблюдалось облегчение второго ответа, состоявшее в увеличении амплитуды негативкой волны или в появлении, дополнительных негативных колебаний. Следует отметить, что в этой возрастной группе популяционные пики (п-пики) возникали только при.использовании максимальной силы стимуляции (до 500 )жА). На 5-6 день П? амплитуда негативной волны возрастала и иногда этот потенциал напоминал п-пик, регистрируе-хшй у взрослых животных. Однако этот п-пик имел относительно небольшую амплитуду, часто возникал лишь при частотном раздражении и имел большую длительность. На 7-12 день постнатального развития наблюдалось формирование высокоашлитудного негативного п-пкка, регистрируемого в слое тел. Отличительная особенность этих фокальных потекщалов в этот • период состояла в отсутствии или слабой выраженности компонента позитивной волны, следующего за п-пиком. Кроме того, после п-пика часто регистрировались разряды отдельных нейронов, что никогда не наблюдалось у животных более старшего возраста. Отсутствие поздней позитивной волны фокального потенциала и наличие разрядов нейронов во временном интервале, соответствующем развитию этой волны, может свидетельствовать об отсутствии иди слабой выраженности ТПСП в пирамидных нейронах гиппокампа ыышей в первые две недели лизни.

Наш было показано, что кривые "вход-выход" для п-пика существенно отлетались у экивотных разных возрастов. Так, на 7-8 день постнатального развития эта кривая икела пологое нарастание с медленным выходом на плато. К 30-12 дню постнатального развития она приобретала характерную "5"-образную форму, причем для более взрослых животных был характерен крутой подъем с быстрым выходом на плато. Фокальные потенциалы двух-трех-недельных животных не отличались от таковых у взрослых.

2. Электрические характеристики пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа на ранних стадиях постнатального развития.

Внутриклеточная регистрация на ранних сроках постнатального развития сопровождается, как правило, большими поврежде-

ниями нейронов, что связано в первую очередь с малыми размерами клеток и свойствами мембраны нейрона В связи с этим особое внимание, уделялось поиску критерия успешного прокола .мембраны нейрона. Критерии! успешного прокола являлась стабильность внутриклеточно регистрируемых параметров по крайней мере з течение 10-15 мин. Как правило, эти клетки имели мембранный потенциал от -65 m2l

Средний мембранный потенциал нейронов животных 4-7 дней составлял -57.3+9 ыВ, входное сопротивление' около 15 MOM (14.3+5.7), для группы животных 8-10 дней эти параметры составляли соответственно 67. 4+6. 9 мВ и 27.7+9.5 МОЕ В группе животных в возрасте 13-30 дней средний мембранный потенциал был 69.1+4.1 мБ, а входное сопротивление - 20.7+8. 4 МОЕ

Несмотря на достаточно высокий мембранный потенциал, незрелые нейроны обладали низким входным сопротивлением (около 20 ЮМ) и длительный -потенциалом действия без овершута. *

Одной из причин . низкого входного сопротивления незрелых нейронов может бнгь наличие обширных электрических связей между нейронами на ранних сроках ПР.

В настоящее время в литературе появились данные, свидетельствующие о наличии между нейронами гиппокампа и некоторых других структур мозга электрических связей, выявляемых с помощь» окраски нейронов флюоресцентными красителями (проционо-вым желтым и лииэфэровып желтым) (Connors et al., 1983). Кроме этого, на ' новой коре получены данные о том, что в процессе развития происходит уменьшение числа контактов этого типа При окраске пирамидных нейронов гиппокампа люциферовым желтым нами было показано, что при введении этого красителя в одну пирамидную клетку как правило происходит групповое окрашивание нейронов, причем на ранних стадиях ПР (1-ая- неделя жизни) число нейронов в группе колебалось от 2 до 6, в то время как у взрослых животных обычно происходило парное окрашивание нейронов. Снижение чжла внесинатаческих контактов в ходе ПР позволяет предположить, что электрические контакты принимают непосредственное участие в синхронизации разряда нейронов в условиях неразвитости или отсутствия синаптических связей.

- 11 -

3. Вызванные синаптическиэ ответы нейронов на ранних сроках постнатального развития

Синаптические ответы нейронов поля CAI иа раздражение ко ллате ратей Шаффера у животных первых двух недель жизни значительно отличались от аналогичных ответов у взрослых животных. Отличительными особенностями ответов нейронов до 7 дня ГЕР были их большая длительность и отсутствие гиперполяризационных компонентов ответа. Для возрастной группы 8-14 дней была характерна значительная вариабельность длительности ответов нейронов, но, начиная с 7-8 дня ПР, были обнаружены нейроны, длительность деполяризационных ответов которых быта соизмерима с длительностью ответов у взрослых яивотных. Начиная с 15 дня ПР, нейроны с длительными деполяризациокиыми ответами отсутствовали. - .

II. Развитие торможения в поле CAI гипдакамла.

1. Изменение фокальных потенциалов под действием бикукуллича на разных сроках развития.

Считается доказанным, что тормозная система гиппокампа является ГАШергической. В настоящее время извест ны и широко используются специфические блокаторы ГАМЩ а) рецепторов - би-кукуллин и блокатор хлорного,канала - пикротоксин. Мы использовали эти препараты как инструмент для определения сроков Функционального развития тормозной системы. Степень зрелости торможения^, приэтом оценивали по величине облегчения п-лика вызванного ответа под действием антагонистов FAMK, а по доэо-зависимости эффекта судили о специфичности действия применяемого диапазона концентраций вещества и степени зрелости данной сикалгической структуры.

Уже на самых ранних'исследованных сроках (3-4- дня ПР) влияние бикукуллина на п-пик было хорошо выравено. Аппликация бикукуллина в концентрации 1 мкМ приводила к увеличению длительности п-пика, вызываемого стимуляцией КШ,с незначительным ростом его амплитуды и появлению отставленного асинхронного разряда нейронов, . который формировал длительную негативную вомну. В отличие от этого, п-пик у более взрослых животных при

аппликации тех «а концентраций бикукудлина возрастал: на 20Z -у животных 6-8 и 9-11 дней и на 50% - у животных 12-14 дней H?. ..... • •

Тот факт, что бикукуллин вызывал увеличение амплитуды п-пинаСШ и появление дополнительных клеточных разрядов, позволяет говорить о наличии ГАШ(а) рецепторов на нейронах гиппо-камла в этот возрастной период и, возмогло, о существовании системы прямого торможения. Однако последнее утверждение не является строгим, так как возможно существование -экстрасинап-тических рецепторов, осуществляющих тоническое торможение.

2. Развитие системы возвратного торможения.

Для определения степени зрелости системы возвратного торможения применялся методический прием, суть которого состояла в следующем. Кондиционирующая стимуляция s. alveus* использовалась. для активации системы возвратного -торможения, величина которого определялась по степени угнетения ортодромного попу-ляционного пика, появляющегося в ответ на тестирующую- стимуляцию коллатералей Шаффера Интервал мэаду тестирующим и кондиционируютум стимулами составлял 20 мс.

Применение этого теста показало, что антидромный популя-ционный пик, по являщийея в ответ на стимуляцию al veus, регистрируется уж на-самых ранних исследованных сроках (3-4 дня ПР), в то Bpeta как система возвратного торможения начинает функционировать лишь на второй недели жизни. Это говорит о том, что на 3-4'день шетнагальяого развития пирамидные клетки имеют аксоны, проходящие в alveus, в то время как активация тормозных интернейронов через коллатерали этих аксонов отсутствует. Вгойходимо отметить существенный разброс в сроках формирования этого типа торможения у животных разных пометов. Так, в 11 исследованных выводках наиболее ранние сроки, когда было обнаружено достоверное вЖяние системы возвратного торможения на п-лик, колебались от 8 до Л дней развития.

3. Особенности развития раннего ТШП и ответа на ГАШ в пирамидных нейронах поля CAI гиппокампа.

У взрослых животных реверсия рТПСП происходила при мемб-

- - 13 -

ранном потенциале около -70 мВ, что было Слизко к значению .среднего мембранного потенциала (-57-69 мВ) и к потенциалу реверсии ответа на ионофоретическое подведение ГАМК к телам клеток (-71 мВ). рТБСЯ и ответ на ГАМК блокировались пикротокси-ном (10 мкМ), что говорит о их хлорной природе. При подведении ГАМК к дендритам нейронов зрелых животных при потенциале покоя наблюдались, как правило, деподяризационные и, значительно ре- • же,' двухфазные (де- и гиперполяризационные) ответа Шкро-токсин в тех же концентрациях блокировал делоляризационный ответ, в то вреда как гштерполяризационный ответ оставался без изменений. Изменения деполяризационного ответа в зависимости от мембранного' потенциала носили нелинейный характер. При изменении мембранного потенциала от -90 до -60 мВ он сначала уменьшался (в диапазоне примерно от -90 до -80 мВ), а затем возрастал и ' сопровождался появлением . потенциалов действия. Точка инверсии этого ответа, измеренная путем экстраполяции значений, полученных на низких уровнях мембранного потенциала, варьировала от -50 до -60 мВ. Точка инверсии гиперполяризационной фазы ответа на ГАШ. находилась в пределах от -90 до -100 мВ.

У молодых животных стимуляция Кй сразу после прокола, когда мембранный потенциал нейрона был от -20 до -40 мВ, во всех случаях приводила к появлению хорошо выраженного гиперполяризационного ГПСП, который по мере восстановления мембранного потенциала быстро уменьшался, а затем превращался в деполя-риэациоюшй потенциал. После восстановления мембранного потенциала в 30% нейронов у животных до 8 дня жизни гилерполяриза-ционные компоненты ответа отсутствовали при всех значениях мембранного потенциала (от -90 до -40 мВ), а в 60% нейронов -появлялись лри мембранном потенциале от -57 до -40 мВ (п=24).

При ионофоретическом подведении ГАМК как в слой тел, так и в слой апикальных дендритов у молодых животных (до 8 дней) регистрировался деполяризационный ответ с точкой инверсии около -55 мВ. Г'иперполяризационные ответы на ГАМК в этой возрастной группе отсутствовали. В течение второй недели жизни потенциал реверсии рТПСП и ответ на ГАМК постепенно смещался в гиперполяризационном направлении.

4. Постнатальное развитие позднего ТШЕ

У взрослых животных при ортодромной стимуляции нейронов, как правило, регистрировали медленную, длиннолатентную гиперполяризацию или пТГОЛ. Время достижения максимальной амплитуды поздней гиперполяризации было в пределах 180-200 мс, общая длительность этого -компонента ответа составляла 700-1000 мс. Поздняя, гиперподярйзация нейронов взрослых животных при околопороговых силах стимула имела амплитуду 2- 3 мБ и сопровождалась падением сопротивления мембраны на величину от 17% до 367= ь разных нейронах.

Как было описано в предыдущем разделе, у жвотных до 8 дня ПР, в ответах нейронов, регистрируемых при потенциале покоя, гиперполяризационные компоненты ответа рТПСП и пТПСП полностью отсутствовали (п-24).

Для возрастной группы 8-12 дней (п=18) была характерна значительная вариабельность длительности деполяризационных компонентов ответа Так же, как и на более ранних сроках развития, у части нейронов этой группы при мембранном потенциале около -70 мЗ гиперполяризационные ТГОЕ не регистрировались, и ответ представлял собой длительное деполяризационное колебание.

Б ответах нейронов в возрастной группе 13-15 дней ПР пТПСП отсутствовали в подавляющем большинстве клеток (25 из 31), а в оставшихся 6 нейронах были выражены слабо, т.е. их амплитуда слабо 'зависела от силы стимуляции и оставалась незначительной (до 0.5 мВ) даже при больших силах стимула (до 100 мкА).

Для группы животных в возрасте от 16 до 30 дней (п-21) были характерны отсутствие длительных деполяризационных ответов и появление выраженных гиперполяризационных компонентов ответа. Наиболее ранним сроком, когда в ответах нейронов была зарегистрированы пТШП, сходные по параметрам с пТБСП у взрослых животных, был 16 день. В целом в возрастной группе 16-30 дней пТПСП были зарегистрированы в 8 из 21 нейронах, в 8 нейронах пТПСП были выражены слабо, а в 5 нейронах отсутствовали.

- 15 -

III. Особенности судорожной активности на

■ • ранних сроках развития.- •

У взрослых животных при аппликации ликротоксина (10 мкМ) наблюдали начальное увеличение амплитуды ВПСП с последующей блокадой рТЯСП и дальнейший рост амплитуды и длительности ВШП, на вершине которого начинал регистрироваться пачечный разряд длительностью 20-30 мс. Эти изменения синаптических ответов сопровождались перестройками фокальных потенциалов: сначала наблюдался рост амплитуды первого, а затем - последовательное появление нескольких дополнительных п-пиков в ответах на раздражение. Блокада рГПСП сопровождалась, как правило, увеличением амплитуды и длительности поздней гиперполяризации, которая обрывала судорожный разряд нейрона. У животных первых двух недель жизни изменения ответов под действием пикротоксина носили иной характер. Основные отличия заключались , в значительно ■ большей длительности судорожного разряда и в возникновении начального уменьшения амплитуды ВПСП. Начальное уменьшение амплитуды ВЖП под действием пикротоксина у животных до 7-го дня П? каблвдалось во всех 7 исследованных нейронах. По мере развития судорожного разряда амплитуда ЕПСП частично восстанавливалась. Длительность судорожного разряда у животных этого возраста составляла около 1.5 сек. Аппликация пикротоксина на срезы гиппокампа у животных в возрасте 8-12 дней такте вызывала продолжительный судорожный разряд или длительную (до 8 сек) деполяризацию мембраны. В нейронах более зрелых животных (около 15 дней ПР) при аппликации тех же концентраций пикротоксина длительность судорожного разряда была меньшей.

Заключение

Проведенное нами исследование позволило выявить основные закономерности развития тормозной системы в поле CAI гиппокампа и определить сроки функционального созревания разных типов торможения в этой области.

В настоящее время в гиплокампе описано три типа тормозных постсинаптйческих потенциалов, которые являются результатом взаимодействия ГАМК с рецепторами разного типа, имеющими различную локализацию на теле пирамидных нейронов (Nicoll et al. ,

1990). Полагают, что синаптическое торможение в поле СА1 опосредуется по крайней мере тремя типами интернейронов (LaçaiIje a Schwarz, 1988). Два типа этих интернейро.чов - интернейроны, расположенные в str. oriens/alveus к корзинчатые клетки - получают возвратные возбуддавдие связи от пирамидных клеток СА1 и имеют прямой возбуждающий вход от коллагералей шффера/коммиссуралькых волокон. Эти интернейроны в свою очередь образуют ГАЬЖергкческие синапсы на соме пирамидных нейронов (Knowles a Scbwartzkroin 1981; Schwartzkroin a. Kunkel, 1985; Laçai Не et al., 1987). Считают, что активация этих интернейронов приводит к генерации рТПСП. Третий тип кнтернейро-нов, расположенных в * молекулярно-лакуяозном слое, получает только прямой афферентный вход и образует ГАШ-ергические синапсы на декдритах пирамидных нейронов (Laçai Не а. Schwartzkroin, 1988; Turner,.1990). Предполагает, что активация этих нейронов' приводит к генерации пТПСП.

Полученные нами данные о гетерохронии созревания разных • типов торможения поддергивают представление о том, что разные типы торможения опосредуются разными популяциями кнтернейро-нов. 'Это согласуется с анатомическими и физиологическими исследованиями, указывающими на существование гетерогенной популяции интернейронов в гмшокампе (Schwartzkroin a Kunkel, 1985; Kawaguchi а. Наш, 1SS8; Drake et al., 1991).

В наших опытах аппликация антагонистов ГАЩа) рецепторов вызывала появление судорожной активности в срезах гиппокампа животных уже в первые дни жизни. Лри внутриклеточной регистрации в нейронах л&вогных первой недели жизни в ответ на аффе-' рентную стимуляцию регистрировались деполяризационные TTCÏÏ, а при ионофоретической аппликации ГАМК к соме и дендритам пирамидных нейронов - деполяризационные ответы, точка инверсии ко-' торых (-65 мБ) была близка к точке инверсии рТШП.

Эти наблюдения позволяют предположить, что торможение, опосредуемое ГАЩа) рецепторами, функционирует уже в первые дни жизни животного, однако оно отличается по своим свойствам . от этого типа торможения у взрослых животных и, возможно, связано с активацией другого типа ГАЩа) рецепторов или ГАЩа) рецепторов, сопряженных с каналами, ионселективность которых отличается от ионселективности каналов зрелых животных.

Тормокение;опосредуемое деполяризационными ТПСП, по-види-

мому. обладает слабой эффективностью в ограничении распостра-нения возбуждения нейронов,' поскольку эти ТГОТ сами могут вызвать генерацию потенциалов действия. С этим обстоятельством, по- крайней мере частично, может быть связана повышенная судорожная готовность незрелой нервной ткани.

Морфологическим субстратом этого вида торможения являются, по-видимому, интернейрокы, участвующие в ' прямом торможении, поскольку, как было обнаружено нами, возвратные тормозные связи в тот период постцатального развития когда регистрируются деполяркзационные TIÏCÏÏ, eue не функционируют.

Не исключено такке, что деполяризационное торможение опосредуется специальным типом штернейронов, которые продолжают функционировать и у зрелых животных, вызывая генерацию делоляризационных ТБСП, ' наблюдаемых при определенных условиях регистрации. Однако относительный вклад этого вида торможения в гиппокампе взрослых животных уменьшается в связи с развитием других типов торможения.

Использование элекгрофизиологического приема для тестирования функционирования системы воавратного торможения показало, что оно, в отличиё от системы прямого торможения, формируется полностью постнатально, и что, начиная с 8-10 дня жизни, присходит резкий рост эффективности возвратного торможения при общем снижении порога его активации. В этот же период постна-талького развития (середина второй недели жизни) наблюдали появление гиперполяризаодонньйс ГПСП,- опосредуемых активацией ГАШ(а) рецепторов.

Таким образом, сформирование системы возвратного торможения значительно отстает от сроков развития прямых торкозных связей, что, возможно, связано с более поздним созреванием тормозных интернейронов, опосредующих; этот тип торможения, или более поздним Формированием возврзпшх коллатералей пирамид, оканчивающихся на этих иятеряейронах.

Возникалчше при активации системы возвратного торможения рТГСП, генерирующиеся в соме пирамидных нейронов, являются мощным фактором, ограничивающим длительность ЗПСП при чрезмерной актиЕащш возбуждающих входов. Поэтому незрелость система возвратного торможения в первые две недели жизни, по-видимому, также может быть одной из причин более низкого порога генерации судорожной активности в незрелом гиппокампе.

-Исследование сроков функционального развития пТПСП показало, что-этот вид торможения, так же как и возвратное торможение, формируется полностью постнатально. Отсутствие пТПСП в первые две недели жизни может быть сЕязано как с незрелостью интернейронов, опосредующих этот тип торшдания, так и с поздней экспрессией ГАМК(б) рецепторов.

Большая длительность судорожного разряда в условиях блокады ГАЩа) рецепторов у незрелых животных позволяет предположить, что функциональное значение пТПСП состоит в ослаблении эффективности системы возвратного возбуждения, участвующей в генерации длительного послеразряда.

Выводы

1. В опытах на срезах гилпокампа мышей равного возраста с помощью методов регистрации фокальных.потенциалов и внутриклеточного отведения вызванной синаптической активности и ответов на ионофоретическое подведение ГАМК проведено исследование функционального развития торможния в поле CAI, позволившее установить основные закономерности формирования различных типов торможения в этой области гилпокампа

2. При регистрации фокальных*потенциалов, вызываемых стимуляцией коллатералей Шффера/комкиссуральных волокон, показано, что формирование суммарной электрической активности, отражающей функциональное созревание основных возбуждающих и тормозных связей пирамидных нейронов поля CAI, происходит в течение первых двух недель жизни.

3. Функциональное созревание пирамид CAI на уровне свойств лостсинапткческой мембраны происходит в течение первых двух недель постнатального периода и состоит в росте величины мембранного потенциала, снижении длительности потенциала действия и увеличении входного сопротивления. . .

4. В ходе постнатального развития уменьшается число элект- -рических контактов между нейронами в поле CAI гилпокампа, выявляемых с помощью окрашивания нейронов люциферовым желтым.

5. Синаптическая система прямого торможения, опосредуемая ГАЩа) рецепторами, • функционирует, начиная с первых дней постнатального периода Однако, в отличие от взрослых живот-

ных, ТШП, возникающие при афферентной стимуляции в нейронах животных, до 10 дня жизни, имеют деполяризационную природу, так. же как и ответы на ионофоретическое подведение ГАМК. -•

6. Функциональное развитие системы возвратного торможения происходит полностью постнатально и критическим сроком ее созревания является середина второй недели жизни.

7. Постсинаптическое торможение, опосредуемое ГАМК(б) рецепторами, начинает функционировать лишь к концу второй недели поетлатального развития, и его эффективность постепенно возрастает в течении первого месяца, жизни.

8. Методика переживающих срезов гиппокампа является адекватной моделью для изучения функционального развития синапти-ческих систем связей в.постнатальном онтогенезе.

9. Полученные данные свидетельствуют о' гетерохронии созревания разных типов постсинаптического торможения в поле CAI гиппокачпа, что, по-видимому, отражает их разное функциональное значение: Значительное отставание функционального созревания систем возвратного торможения и прямого торможения, опосредуемого ГАВДб) рецепторами, от развития возбуждающих сшаптических связей может лежать в основе повышенной судорожной готовности незрелого гиппокампа.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Федоров Е Б. Развитие системы возвратного торможения поля CAI гиппокампа з раннем постнатальном периоде. Вкил. эксп. биод. и мед., 1Э90, 11, 359-361

2. -Гусев А. Г., Федоров H. Е Межклеточные взаимодействия нейронов в новой и старой коре. В сб. : Интегративная деятельность нейрона: молекулярные основы. Тезисы докладов. M. ÍSSV, 40

3. Федоров H В. Окраска Люцифером желтым пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа в раннем постнатальном онтогенезе мыши. В сб.: Интегративная деятельность мозга Вып. 17, ред. О. С. Адриачов, Москва, 1983, 44-46

4. Федоров H Б., Шаронова И. Н. Поетнатальное развитие тормозных систем гиппокампа. Тезисы докладов., Киев, 1988, 255

5. Федоров Н. Б. Гетродотоксин-чувствительный компонент

деполяризационного ответа на подведение Г АМН. к дендритам пирамидных нейронов поля CAI гиппокамла Бшл. зксп. биол. и мед. 1990,. 4,. 359-361 . •

6. Федоров Н. Е , Шаронова И. К. Свойства деполяризгционных ответов, вызванных, локальным подведением ГАМК к дендритам пирамидных нейронов гиплокампа. В сборнике: "Физиология и биохимия медиаторных процессов. К. 1990 , 341

7. Sharonov'a- Г.N. , Fedorov N.B. Ontogenetic properties of the late GABA-mediated hyperpol ari zat i on in hippocanpal CAI neurons. In: Proc. Thrid Symp. of Neuroscie., 1S90, Kiev, p. 92.

8. Клещевников К A., Федоров H. E , Воронин JIJL Подавление быстрого ТПСП( aj во время развития медленного ТПСП( б) является основной причиной прайминга б лнралшдных нейронах поля CAI гиппокамла. Нейрофизиология, 1990, т. 22, 6 , 730-738