Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная стенка и водообмен растений. Исследование импульсным методом ЯМР

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Клеточная стенка и водообмен растений. Исследование импульсным методом ЯМР"

о

_ 9 ИЮЛ "

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

На правах рукописи УДК 581.176:542.63:539.143.3

ДАУТОВА НАИЛЯ РИФГ АТОВНА

КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА И ВОДООБМЕН РАСТЕНИЙ. ИССЛЕДОВАНИЕ ИМПУЛЬСНЫМ МЕТОДОМ ЯМР

03.00.12 - физиология растений 03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-1997

Работа выполнена в Казанском институте биологии Казанского института биологии КНЦ РАН.

Научный руководитель - доктор физ.-мат. наук А.В.Анисимов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук А.А.Зялалов

- кандидат физ.-мат. наук -----Е.А.Никифоров

Ведущее учреждение -

Казанский государственный университет, кафедра физиологии растений.

Защита состоится ¿^¿«У^У 1997 г. в " ^ " часов на

заседании специализированного Совета К.002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (специальность - физиология растений и биофизика) при Казанском институте биологии КНЦ РАН (420503, г.Казань, а/я 30).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "

сгг-&я mir.

Ученый секретарь специализированного Совета, канди- с/Л^ дат биологических наук _} Л.Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Общебиологическое значение проблемы транспорта воды в растениях известно. В литературе обсуждается гипотеза, согласно которой ограничивающим фактором роста растений является гидродинамическое сопротивление тканей току воды (Mclntyre, 1987). Даже гормональная регуляция метаболизма, по мнению автора, обеспечивается через контроль осмотически индуцированного поглощения воды растением. Эти и другие данные позволяют утверждать, что исследования гидродинамического сопротивления структур растительного организма являются несомненно актуальной задачей современной биофизики и физиологии растений.

Логическая схема исследований процессов переноса воды в растениях предполагает последовательное рассмотрение барьерно-регуляторных функций клеточных стенок, мембран, межклеточных контактов - плазмодесм, сосудистых систем ксилемы и флоэмы. До недавнего времени должного внимания клеточным стенкам (КС) не уделялось. Роль КС связывалась с физико-химическими процессами удержания воды за счет явлений гидратации биополимеров, поверхностных и капиллярных сил. В последние годы наблюдается возрастание интереса к структуре и синтезу КС (Тарчевский, 1985, Лозовая с соавт., 1980, 1990), роли КС в депонировании ассимилятов (Чиков, 1987), в создании автономной водной среды симпласта, барьерно-регуляторным функциям КС в процессах межклеточного транспорта водных растворов (Зялалов, 1984), адсорбционной роли КС в накоплении загрязнений из окружающей среды (Лапин, Едигарова, 1990), развитию представлений о внецитоплазматическом пространстве как составной части обобщенного биохимического реактора клеток, в котором совершаются ферментативные процессы, регулирующие транспорт различных веществ, включая воду (Tepfer, Taylor, 1981). В суммарном объеме доля информации по динамике взаимодействия КС с водой довольно незначительна, и причина этого заключается в ограниченном числе методов неразрушаюшего контроля, адаптированных к особенностям биологических объектов. Развитие техники прямых измерений диффузии и теоретических подходов к интерпретации данных импульсного ЯМР по пористым системам (Mitra et al., 1993,1995; Маклаков с соавт., 1987; Анисимов, Раткович, 1992) создает новые возможности исследования биологических тканей, учитывая, что последние относятся к классу сложных пористых объектов. В литературе

приводится ряд работ по использованию импульсного ЯМР для исследования системе целлюлоза-вода, однако в большей части они посвящены релаксационным характеристикам системы (Sasaki et al., 1960; Child, 1972; Froix et al., 1975).

Целью настоящей работы является изучение трансляционной динамики внещггоплазматической воды во взаимосвязи с барьерно-адсорбционными свойствами КС. Решались следующие задачи:

1. изучалась диффузия воды, сорбированной хлопковым волокном (ХВ) (модель КС), при низких и высоких уровнях влажности;

2. исследовались барьерные свойства КС для межклеточного cell-to-cell переноса воды в растительной ткани в оптимальных по водосо-держанию условиях;

3. изучались особенности диффузионного переноса и магнитной релаксации воды в условиях отклонения водосодержания тканей от оптимума, в частности, при обезвоживании тканей в гипертонических растворах осмотиков и атмосфере пониженной влажности.

Научная новизна. Впервые методом импульсного ЯМР проведены исследования особенностей диффузии воды сорбированной модельной системой КС - хлопковым волокном в широком диапазоне влажности. Исследованиями при низких уровнях влажности установлен факт межмолекулярных взаимодействий сорбированной воды. В диапазоне сравнительно высоких влажностей выявлен эффект облегченной диффузии. Показана высокая связность внеклеточного пространства корня кукурузы и оценена нижняя граница эффективного коэффициента проницаемости КС. Обнаружено распределение клеток по устойчивости к осмотическому обезвоживанию.

Практическая значимость. Известные применительно к пористым системам теоретические подходы анализа диффузионных данных импульсного ЯМР адаптированы к специфике растительных тканей. Обнаруженные особенности диффузии воды, сорбированной на хлопковом волокне, позволяют под новым углом зрения рассматривать механизмы формировании надмолекулярной структуры КС. Факт немонотонного отклика ткани по величине коэффициента диффузии воды на обезвоживание осмотиком дает информацию к механизмам адаптации и противодействия ткани стрессу обезвоживания.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на: Все-союзн. конференциях "Синтез целлюлозы и его регуляция" (Казань, 1980, 1985); конференции молодых ученых "Исследования в области химии древесины" (Рига, 1981); IV Всесоюзной конференции

по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981); III Международной конференции "Water and Ions in Biological system" (Bucharest, Romania, 1984); V Респ. конф. "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Целиноград, 1984); Всес. конференции "Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений" (Иркутск, 1984); конференциях молодых ученых биофака МГУ "Молодые ученые и основные направления развития современной биологии" (Москва, 1985); 5 Межд. Конференции "Water in biological systems" (Лагодехи, 1989); VIII Всес. конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Черноголовка, 1990); XVI Международной конференции "Magnetic Resonance in Biological Systems" (Veldhoven, the Netherlands, 1994); итоговых конференциях КИБ КНЦ РАН (Казань, 1995, 1996); 3 Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем" (Йошкар-Ола, 1996).

Публикации. По теме работы опубликовано 14 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на.... страницах машинописного текста, содержит.... рисунков. Список использованной литературы состоит из .... наименований, из них .... на иностранном языке.

Первая глава посвящена обзору литературы о строении, синтезе и функциональной роли КС в метаболизме растения, рассмотрены основные гипотезы синтеза целлюлозы КС, приведены последние результаты о связи синтеза с мембранным потенциалом на плазмалемме, аналогии между строением терминальнызх комплексов и межмембранных контактов. Введение в проблему настоящей работы проводится на примерах работ Tepfer and Taylor (1981), Зялалова (1984), Neuman (1974) и др. Тепфер и Тейлор, наблюдая существенное сокращение размеров КС при помещении клеток в раствор осмотика, пришли к выводу, что это сокращение может уменьшить проницаемость матрикса КС для растворенных веществ, в том числе ферментов. К похожему выводу, но уже по отношению к воде, пришел Зялалов (1984): при изменении влажности изменяются расстояния между микрофибриллами целлюлозы КС, благодаря чему обеспечивается эффективный механизм регуляции проницаемости КС для воды, в том числе механизм регуляции апертуры устьиц. Постулируя перенос водных растворов по КС, в вопросе сопротивления переносу мнения разных авторов расходятся. Так Newman (1976) из экспериментов на корнях с исполь-

зованием датчика давления приходит к выводу об относительно высоком сопротивлении переносу. 81еи<31е (1983, 1985) на основе экспериментов с той же техникой датчика давления приходит к заключению об относительно свободном движении воды по внеклеточному пространству. Эксперименты с маркерами (тяжелыми, электронно-плотными металлами) свидетельствуют о локализации путей межклеточного переноса воды по каналам КС, но не дают ответа на вопросы по динамике переноса. В целом создается впечатление, что основные литературные заключения по транспорту водных растворов по КС касаются структурных аспектов и макроэффектов переноса, но в вопросах динамики взаимодействия водных растворов с компонентами КС наблюдается определенный провал. Эти впечатления вместе с известным прогрессом в области теории и практики применения техники импульсного ЯМР к исследованию сложных пористых систем послужили обоснованием к формированию задач настоящей работы.

Глава 2. Объекты и методы.

В качестве объектов использовались хлопковое волокно С.Ташкент-1 как модель клеточной стенки, сегменты корней 7-дневных проростков кукурузы с.Стерлинг, выращенных в стандартных условиях. Необходимая увлажненность волокна достигалась вакуум-инфильтрацией в воде с последующим центрифугированием, а также эксикаторным методом.

Основным методом исследования являлся спин-эхо метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля (Stejskal, Tanner, 1965). Диффузионные измерения проводились на частотах протонного резонанса 19,2 и 60 Мгц. Регистрировалась относительная амплитуда эха, R, в зависимости от амплитуды, g, и длительности, 5, градиентных импульсов и интервала между ними, Д, - времени диффузии. Средний -Dcp и эффективный - коэффициенты диффузии вычислялись из соотношения

R = р, ехр [- у2 52 g2 (Д -5/3) Оэф] + р2 ехр [- у2 52 g2 (Д -5/3) Dcp]

где у - гиромагнитное отношение. Точность определения D^ и Dcp лучше 10%.

Времена спин-решеточной релаксации во вращающейся системе координат, Tip, измерялись методом спин-локинга, в лабораторной, Ть - последовательностью стимулированного эха (90°-90°-90°) и двухим-пульсной последовательностью Хана (180°-90°). Времена спин-

спиновой релаксации, Т2, измерялись последовательностью Карра-Парселла-Мейбума-Джилла (90°-180°-180°-..). Времена релаксации измерялась на частоте 19,2 Мщ с точностью лучше 7%. Термостатирова-ние образцов Обеспечивалось с точностью ±1,0°С.

В части экспериментов на тканях использовался метод парамагнитного допинга (ПМД). Парамагнитные ионы марганца внедрялись во внеклеточное пространство ткани экспозицей образцов в растворах солей марганца - МпС12, концентрацией 0,025 М, в течении 10-60 мин.

Дегидратация тканей корня осмотическим методом проводилась выдерживанием интакгных корней в растворах маннита концентрацией до 15%. Дегидратация в атмосфере пониженной влажности проводилась эксикаторным методом. Сегменты корней на специальных этажерках выдерживались в термостатированных эксикаторах с насыщенными растворами солей, обеспечивающими требуемые влажности. Этажерки позволяли взвешивать объекты непосредственно в эксикаторах, через горловину, что обеспечивало сохранение равновесной влажности воздуха в объеме эксикатора.

Глава 3. Оригинальные результаты.

3. 1. Диффузия воды, сорбированной на хлопковом волокне, при низких уровнях сорбция.

Техника импульсного градиента значительно расширила возможности измерения диффузии сорбированных жидкостей, однако с уменьшением уровня влажности времена релаксации и коэффициент диффузии сорбированной воды уменьшаются настолько, что даже техника импульсного градиента становится малоэффективной. Выход - в измерении параметров, чувствительных к медленным движениям, в частности, Т1р. В работе Woessner, Snowden (1971) показано, что вращательные и трансляционные движения молекул связанной воды могут характеризоваться различными временами корреляции. В этом случае, как показано Burnett, Harmon (1972), Т]р есть линейная функция от со,1/2 (coi = уН,), причем в соотношение входит коэффициент диффузии сорбированных молекул

¿(V1)/^©,-1/2) = 21/2 у4 h2 N/80 я Dt3/2 (1)

где Hi - напряженность поля локирующего радиочастотного импульса, h - постоянная Планка, N - плотность спинов, Dt - коэффициент трансляционной диффузии. Применительно к хлопковому волокну, действи-

10-2 10 -

Т .1 1 ¡>

10 11

10-2<в"2, радс...

Рис. 1. Зависимость Т^'1 от coi"2 для образцов хлопкового волокна .влажностью: 1 -28% при температуре 25°С и 2 - 35% при температуре -30 С

тельно, оказалось, что при малой влажности и при отрицательных температурах, когда замерзает вода в крупных капиллярах, наблюдается линейная зависимость Tip'1 от он"2, рис. 1.

Факт линейной за-

висимости Т1р'' от coi свидетельствует в пользу межмолекулярного вклада в процесс спин-решеточной релаксации и дает возможность с помошью (1) вычислить коэффициент самодиффузии незамерзающей, гидратной воды. Определенные проблемы возникают при выборе значения N плотности сорбированной воды. Если принять плотность сорбированной . воды равной таковой свободной воды, тогда для образца влажностью 35% при -10 °С D, = 2,0x10"9 см2/с и уменьшается по активационному

1/2

1Ó7T, К"

Рис. 2. Зависимости 1 - Т|р, 2 - коэффициента диффузии D от обратной температуры для образцов хлопкового волохяа влажностью 35% при 10~*<ог. 1 - 106,8 рад/с'И 1" - 26,7 рад/с.

Аррениусовскому закону до 0,3x10"9 см2/с при -40 °С при энергии активации диффузии Еа =8,1 ккал/моль, рис. 2. В литературе приводятся данные, что плотность сорбированной воды может быть понижена в зависимости от уровня сорбции на величину до 20%, и, если учесть этот факт, тогда вышеприведенные величины Б, соответственно уменьшатся на 14%. По-видимому, разумно считать, что значения Б в зависимости от уровня сорбции будут распределены в диапазоне 14%. Высокое значение Еа и низкая величина О, свидетельствуют о сильной связи молекул воды с центрами адсорбции, в роли которых могут выступать гидроксильйые группы ангидроглюкозно- го кольца макромолекул целлюлозы, трансляционная диффуфузяя воды по которым происходит с разрывом двух водородных связей.

3.2. Диффузия воды, сорбированной на хлопковом волокне, при высоких уровнях влажности.

На рис. 3 приведены зависимости Б Эф от влажности для образцов зрелого (1, 2) и незрелого (3) волокна в ориентированном и клубкообразном состояниях. Особенностью является экстремальный характер зависимости Бэф от влажности при 75%, где коэффициент диффузии превышает таковой для свободной воды, и анизотропия Д,ф в зависимости от ориентации волокна по отношению к направлению регистрации диффузии. Повышение значения Оэф в области высоких влаж-Рис. 3. Зависимость коэффициента диффузии ностей, 50-75%, может от влажности для образца зрелого (1,2) и не- объясняться эффектом зрелого (3) хлопкового волокна. 1 и 2 - ориен- поверхностной диффу-тации волокон, обеспечивающие максималь- ^ который обязан ка-ное и минимальное диффузионное затухание талитическоиу дейсТвию эха, соответственно

Влажность, %

действию поверхности. Таким действием обладает, по-видимому, именно целлюлоза, поскольку для образцов незрелого, хлопкового волокна, где содержание целлюлозы мало, СЭф значительно ниже. Уменьшение диффузии при влажностях выше 75% обусловлено появлением капиллярно- конденсированной водяной "шубы" на адсорбирующей поверхности, диффузия которой подобна диффузии в свободной воде.

Поверхностная диффузия в сочетании с эффектом ограниченной диффузии объясняет наблюдаемые анизотропные явления. Известно, что диффузия адсорбированных молекул по поверхности адсорбента не является свободной, а определяется энергетическим рельефом поверхности.

В хлопковом волокне этот рельеф задается высокоупорядоченным расположением микрофибрилл целлюлозы, и эта упорядоченность может задавать анизотропию диффузии. При этом высокие значения 0Эф наблюдаются только при малых Л , что определенно свидетельствует о маскирующем влиянии ограниченной диффузии.

Факт повышенной анизотропной диффузии воды, наводит на мысль о возможной его роли в процессе синтеза КС. Просматриваются по крайней мере три возможности участия этого процесса в формировании структуры КС: 1, модификация гипотезы синтеза МФЦ терминальными комплексами плазмалеммы (ПЛ) в пункте механизма быстрого синтеза вторичной КС: глюкозные остатки - предшественники целлюлозы через щелевой контакт между ПЛ и мембранами пузырьков аппарата Гольджи выплескиваются в перипластное пространство и вовлекаются в водном потоке по поверхности МФЦ первичной КС к терминальным комплексам, где используются как субстрат синтеза МФЦ; 2. предшественники целлюлозы в перипластном пространстве вовлекаются в водном потоке по поверхности МФЦ первичной КС к концам МФЦ, где образуется зона повышенной концентрации глюкоз-ных остатков - область синтеза МФЦ; 3. повышенная диффузия воды по поверхности микрофибрилл целлюлозы (МФЦ) увлекает строительные компоненты матрикса - пектиновые вещества, гемицеллюлозы и др., образуя область повышенной концентрации этих веществ вблизи поверхности МФЦ и их встраивание в структуру КС.

Таким образом, повышенная, анизотропная диффузия воды по поверхности целлюлозы может играть роль концентрирующего, направляющего процесса для транспорта строительных компонент КС и, возможно, задает ориентацию МФЦ

З.З.Особенности диффузии воды по внеклеточному пространству корня Zea mays L.

Форма диффузионного затухания намагниченности для исследуемого образца в зависимости от амплитуды градиента в' диапазоне трех порядков величины имеет сложный неэкспоненци альный характер при всех временах диффузии, рис. 4. Экстраполяция "хвостов" затухания экспонентой и последовательное вычитание этих экспонент из суммарных огибающих для каждого времени диффузии привело в итоге к проявлению быстроспадающего экспоненциального спада, независящего от времени диффузии в диапазоне 5-2000 мс с коэффициентом диффузии D„j= 1,9 10 см2/с и долей в 40%. Вычитание этой быстрой компоненты из суммарных огибающих для разных времен диффузии определило набор медленно затухающих неэкспоненциальных компонент с S-образной зависимостью Dcp от времени диффузии, рис. 5, на которой можно выделить три области: область свободной диффузии, область проявления ограничения диффузии и, наконец, область диффузии, заторможенной эффектом проницаемости ограничивающих стенок - плато с момента 1000 мс.

ков кукурузы в норме при вариации времени диффузии у как параметра.

При допинге парамагнитных ионов во внеклеточное пространство эти ионы, укорачивая времена релаксации внештоплазматиче-ской фазы воды, полностью убирают из суммарного затухания быст-роспадающую компоненту, но оставляют видимой медленно затухаю-

щую внутриклеточную фазу волы. Следовательно, быстро затухающая компонента обязана диффузии внеклеточной воды по пористой системе каналов целлюлозной клеточной стенки, окружающей клетку.

Независимость от времени диффузии коэффициента диффузии внецитоплазматической воды во всем диапазоне его изменений позволяет оценить максимальный размер каналов из соотношения Эйн-штейна-Смолуховского (<a2>=6tdD). При минимальном времени наблюдения в эксперименте td = 5 мс и коэффициенте диффузии свободной воды D„ = 2,5 10'5 см2/с = 8,7мкм. Из величины D3(J) и максимального размера канатов 8,7 мкм нижняя граница эффективного коэффициента проницаемости клеточной стенки оценивается как 10"4 см/с, что сравнимо с проницаемостью плазматической мембраны.

Известно, что из S-образной зависимости Dcp, рис. 5, область ограничения диффузии может быть проявлена, учитывая вклады неограниченной и заторможенной (с проницаемостью) диффузии с помощью выражений (Валиуллин 1996):

Def(td) = [D(td)-Dp] [D/(D0-DPJ]; D:f(td)=[DaD(td)/(D0-D(td)]

где D0 - коэффициент диффузии внутри поры, Dp - средний коэф фици-ент диффузии в области заторможенной (проницаемой) диффузии, т.е. в области нижнего плато на рис. 5. Из Dorp с помощью соотношения

D , М 2/с

ч>

t., мин

Рис. 5. Зависимость среднего коэффициента диффузии (СКД) от времени диффузии. 1 - СКД после вычитания быстрозатухающей компоненты; 2 -СКД; 3 - СКД с учетом вкладов свободной и ограниченной диффузии (см. текст); 4 - теоретическая зависимость Оср °с и

Эйнштейна-Смолуховского определяется характеристический ограничивающий размер. Для корней этот размер, равный 15 мкм, отождествлен с размером клеток в поперечном направлении.

3.4. Транспорт воды корня в динамике изменения водосодержа-ния.

а). Дегидратация тканей в растворах осмотиков.

Приведенные в литературе примеры влияния проводимости КС на транспорт ферментов (Tepfer, Taylor, 1981) и изменение проводимости для воды при изменениях равновесного водосодержания ткани (Зялалов, 1984) в рамках задач настоящей работы явились побудительным мотивом к исследованию динамики изменений Оэф и Ti при дегидратации ткани корня растворами осмотиков.

В диапазоне концентраций осмотика до 5% снижение D3ltj, рис. 6, Воды ткани корня под влиянием маннита объясняются ростом гидродинамического сопротивления клеточной стенки и снижением интенсивности переноса воды по системе межклеточных контактов во время дегидратации. При этом параллельное укорочение Ть рис. 7, свидетельствует в пользу адаптивного роста проницаемости плазма-леммы для воды.

При средних и высоких концентрациях осмотика (5-15%) D31j, увеличивается со временем (рис. 8) и через 40 мин достигает плато, уровень которого зависит от концентрации осмотика.

0 5 10 15 0 5 10 15

конц. осмотика. % коиц, осмотика, %

Рис. 6. Приведенный к контролю Рис. 7. Зависимость времени релак-эффективный коэффициент само- сации воды в корнях кукурузы от диффузии воды в корнях кукурузы концентрации раствора осмотика после инкубации (1 ч) в растворах (время инкубации 1 час), маннита различной концентрации.

Изменения (1/Tj) в корнях Zea mays L. с прокачкой внутри измерительной ампулы 100 мкмоль/л раствора МпС12 после предвари-

тельной 1-часовой обработки 1, 5, 10 и 15% pacтвopaiMи мангала показывают восстановление часта клеток после дегидратации за первые 0.5 ч, причем наблюдается положительная корреляция между (1/Т1) и концентрацией маннита, рис. 9.

-'эф

1/Т,

i 0.8

время, мин

5 10 15

конц. осмотика,%

Рис. 8. Зависимость эффективного коэффициента самодиффузии воды в корнях кукурузы от времени инкубации в растворах маннита разной концентрации.

Рис. 9. Нормированная скорость релаксации воды в ткани корня кукурузы а зависимости от концентрации маннита при прокачке раствора парамагнетика в течение 5 мин (о) и 60 мин (•).

Кривая для 60-минутной инкубации имеет две области относительно концентрации маннята: при концентрации ниже 10% скорость релаксации (1/Т() увеличивается монотонно, затем резкий скачок в диапазоне 10-15% (рис. 9). Рост Ц,ф в диапазоне высоких концентраций и особенно скачок Т1 в варианте с парамагнитным допингом марганца приписывается разрыву клеточных мембран, благодаря чему марганец быстро проникает в клетки и укорачивает Т1. Выход на плато, уровень которого зависит от концентрации осмотика, свидетельствует о распределении клеток по чувствительности к осмотическому стрессу. Последнее связывается с распределением клеток по эластичности клеточной стенки, благодаря чему плазмолиз происходит при разных уровнях осмотического давления. В свою очередь распределение по эластичности, вероятно, связано с разным возрастом клеток.

2

1.5

б). Дегидратация тканей в атмосфере с пониженной влажно-

стью,

Как известно, эксикаторный метод дегидратации по сравнению с осмотическим является неравновесным (Зялалов 1984) и поэтому дает собственный, нетождественный осмотическому методу объем информации. Зависимости водосодержания от влажности воздуха в эксикаторах показывают 4-х ступенчатую динамику, рис. 10. Первоначальное быстрое обезвоживание при 90-75% логично связывать с испарением внеклеточной воды. Сравнительно медленная потеря воды при 75-45% обязана выходу воды из клеток, динамика которого обусловлена проводимостью плазмалеммы и КС и изменениями в перераспределении воды между клетками по системе плазмодесм из-за уменьшения их проводимости, по-видимому, благодаря эффекту автономизации водообмена клеток в стрессовых условиях (Анисимов и др., 1983).Новое убыстрение уменьшения влажности образцов при 45-30% благоразумно связать с потерей свойства полупроницаемости плазмалеммы из-за пробоя мембран и/или срыва эффекта автономизации при росте водо-отнимающей силы выше некоторого предела. Последующий выход на плато при влажностях ниже 30% связан с физико-химическими силами удержания воды в пористых средах.

влажность воздуха, %

Рис. 10. Изменение содержания воды в сегментах корней кукурузы при выдерживании их в эксикаторах с разной влажностью воздуха.

время, мин

Д. 400

?2, МС

Рис. 11. Изменение содержания и времени релаксации Тз воды в сегментах корней кукурузы при продувке воздуха.

Во временном разрезе для диапазона 1-7 часов наблюдается монотонное снижение водосодержания образцов, но динамика обезвоживания остается неизменной (параллельность зависимостей на рис. 10). ЯМР-исследования релаксации на корнях в процессе их обезвожива-

ния в потоке воздуха показали, что при даже значительной потере воды, когда доля медленно спадающей компоненты, относящейся к внутриклеточной воде, уменьшалась на 50%, время Т2 этой компоненты изменялось незначительно. Для объяснения фактов сохранения 4-х ступенчатой динамики обезвоживания при монотонном характере потери воды образцом в зависимости от времени, стабильности времен спин-спиновой релаксации при значительном обезвоживании ткани вновь уместно привлечь представления о распределении клеток по чувствительности к стрессу обезвоживания, которое формируется в связи с разным возрастом клеток по радиусу корня, а также морфологическими особенностями строения корня.

Выводы.

Проведено исследование адсорбционных и барьерно-регуляторных функций клеточной стенки в цепи структур на пути межклеточного транспорта воды растительных тканях.

1. На модельной системе - хлопковом волокне - установлено, что времена Tip во вращающейся системе координат определяются межмолекулярными взаимодействиями молекул сорбированной воды. Кроме фундаментального значения этот факт дает методическую основу для определения величин коэффициентов диффузии при малых уровнях влажности.

2. Определены коэффициенты диффузии незамерзающей воды, сорбированной на высокоэнергетических центрах сорбции ХВ. Установлен акгивационный характер диффузии с энергией активации, соответствующей разрыву двух водородных связей.

3. Для диапазона сравнительно высоких уровней влажности ХВ (50-100%) показано экстремальное поведение величины Б,ф- от влажности с максимумом, в 1,5-2 раза превышающим значение Д,ф свободной воды. Эффект связывается с явлением облегченной диффузии по поверхностной сетке адсорбата и предполагает наличие каталитических свойств волокон целлюлозы.

4. Предложена гипотеза о роли явления облегченной диффузии в процессе формирования структуры клеточной стенки. Суть ее заключается в том, что на конце МФЦ может формироваться зона синтеза, повышенная концентрация субстрата в которой поддерживается облегченной анизотропной диффузией водного раствора субстрата по поверхности МФЦ.

5. Техника анализа результатов диффузионных ЯМР измерений для пористых систем адаптирована к растительным тканям. Показаны возможности установления характеристического ограничивающего размера водосодержащих отсеков в тканях в сложных случая сочетания неограниченной и ограниченной диффузии с проницаемостью ограничивающих клеточных структур. Для корней кукурузы ограничивающий размер -15 мкм, отождествлен с размером клеток в радиальном направлении корня.

6. Из факта эффективного усреднения диффузионного пробега молекул воды по КС показана высокая связность внецитоплазматиче-ского пространства всасывающей зоны корня кукурузы. Нижняя граница эффективного коэффициент проницаемости КС, определенная как 10"4 см/с, сравнима с проницаемостью плазмалеммы.

7. При воздействии на корни осмотика - маннита в диапазоне концентраций до 5%, обнаружено снижение скорости переноса воды из клетки в клетку экстремального характера. Явление связывается с адаптивным снижением проводимости плазмодесм и клеточной стенки при обезвоживании.

8. Установлен факт распределения клеток по устойчивости к стрессу обезвоживания. Явление распределения проявляется при дегидратации клеток как осмотиками, так и в атмосфере пониженной влажности и связывается с распределением эластичности клеточных стенок, возникающим из-за возрастных изменений и морфологической неоднородности строения корня.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Анисимов A.B., Даутова Н.Р. Исследование подвижности, воды, сорбированной на целлюлозе, импульсным методом ЯМР. // Биофизика, 1979. T.24..N6, С.985-989.

2. Анисимов A.B., Даутова Н.Р., Еварестов A.C. Исследование обменных процессов в водонасыщенной целлюлозе импульсным методом ЯМР. // Тез.докл. I Всес. конф."Синтез целлюлозы и его регуляция", Казань, - 1980, - С.8.

3. Анисимов A.B., Даутова Н.Р. Исследование самодиффузии воды в водонасыщенной целлюлозе методом импульсного градиента спин-эхо техники ЯМР. // Тез.докл. I Всес. конф. "Синтез целлюлозы и его регуляция", - Казань, - 1980, - С.9.

4. Еварестов A.C., Анисимов A.B., Даутова Н.Р. Влияние сорбированных ионов Мп и Со на магнитную релаксацию воды во влажном

хлопковом волокне. И Тез докл 3-й конф, мол. уч. "Исследования в области химии древесины".- Рига. - "Зинатне". -1981.- С.85-86.

5. Анисимов А.В., Даутова Н.Р. Облегченная самодиффузия воды, сорбированной хлопковым волокном. // Тез.доклЛУ Всес. конф. по спектроскосхопии биополимеров. - Харьков. -1981. - С.10-11.

6. Анисимов А.В., Даутова Н.Р. Исследование самодиффузии воды в водонасыщенной целлюлозе методом импульсного градиента спин-эхо техники ЯМР. // сб. "Вопросы водообмена и состояния воды в растениях". - Казань. - 1981. - С. 187-198

7. Еварестов А .С., Анисимов А.В., Даутова Н.Р. Межклеточный водообмен и его регуляция по данным импульсного ЯМР. // Деп.ВИНИТИ. 14.04.83, N2004-83.

8. Анисимов А.В., Еварестов А.С., Ионенко И.Ф., Даутова Н.Р. Intercellular water transport and its regulation. NMR pulsed method of investigation.// Abstr.III Int. conf. "Water and Ions in Biological system". Bucharest, Romania. - 1984. - 3.151-152.

9. Анисимов A.B., Даутова H.P., Еварестов A.C., Ионенко И.Ф. Исследование импульсным методом ядерного магнитного резонанса транспорта воды в тканях растений после действия низких температур и обезвоживания Тез. докл. Всес. конф. "Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений". - Иркутск. - 1984. - С.120.

10. Еварестов А.С., Анисимов А.В., Даутова Н.Р. Протонный обмен увлажненной хлопковой целлюлозы при сорбции парамагнитных ионов. // Тез. докл: II Всес. конф. "Синтез целлюлозы и его регуляция". - Казань. - 1985. - С.9.

11. Даутова Н.Р. Межклеточный транспорт воды при обезвоживании. Исследование методом. ЯМР. // "Материалы 5-й науч. конф.мол.учен.КИБ КФАН СССР. окт. 1985".- Казань. - 1986. - С84-87. Деп.ВИНИТИ 21.04.86.N2888-B

12. Anisimov A.V., Evarestov A.S., Dautova N.R., Ratcovic S. The effect of osmotics on plant cells: A study using 'H NMR relaxation and self-diffusion of water. Gen. Physiol. Biophys. 1991. V. 10. 569-576.

13. Анисимов A.B., Даутова Н.Р. Самодиффузия воды, сорбированной хлопковым волокном. Исследование импульсным ЯМР. Биофизика. 1993. Т.38. вып.З. 500-503.

14. Anisimov A.V., Dautova N.R. Water diffusion and flow in plants: An NMR approach. XVI th International Conference on Magnetic Reso-