Клещевой боррелиоз собак в условиях Вологодской области

Молотова, Надежда Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клещевой боррелиоз собак в условиях Вологодской области
ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Клещевой боррелиоз собак в условиях Вологодской области"

004662928 На правах рукописи

/П

МОЛОТОВА Надежда Владимировна

КЛЕЩЕВОЙ БОРРЕЛИОЗ СОБАК В УСЛОВИЯХ ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ

03.00.11 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

- 3 ИЮН 2010

Санкт-Петербург 2010

004602928

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и микробиологии ФГОУ ВПО «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия имени Н. В. Верещагина».

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор

Новикова Татьяна Валентиновна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ромашов Борис Витальевич

кандидат ветеринарных наук Гаврилова Надежда Алексеевна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московский государственный

университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)

Защита диссертации состоится 27 мая 2010 в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д. 5, тел/факс (812) 388 36 31

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГОУ ВПО ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Автореферат разослан и размещен на сайте академии (http://spbgavm.ru') 26 апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Л- М. Белова

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ, болезнь Лайма) - болезнь общая для человека и животного. Занимает по уровню заболеваемости, тяжести и продолжительности клинического течения, затруднений в диагностике, а также широкого распространения одно из ведущих мест среди природно-очаговых инфекций в России и за рубежом (Коренберг Э. И., 1990, 1996). Возбудители его - комплекс Borrelia burdorferi sensu lato - передаются иксодовыми клещами.

По данным управления Роспотребнадзора в Вологодской области ИКБ в структуре природно-очаговых инфекций составляет 61,2-83,8%. Показатель заболеваемости населения Вологодской области иксодовым клещевым боррелиозом превышает в пять раз средний показатель по России. В тоже время при анализе отчетов департамента ветеринарии в области по формам 1-вет и 4-вет информация о данном заболевании отсутствует. Необходимо отметить, что требуют уточнения и данные по краевой эпизоотологии - видовой состав, экология и биология иксодовых клещей в природных и урбанизированных территориях.

В настоящее время в связи с выявлением очагов ИКБ и зараженных клещей в непосредственной близости от жилищ человека особую актуальность приобретает вопрос об участии в циркуляции спирохет домашних животных, в особенности собак, Burgess Е.С., 1986; Appel M.J. et al, 1993; Ожерелков C.B. и соав., 2003) крупного рогатого скота (Burgess Е. С. 1988, 1989; Bushmich S.L. et al., 1989) и заболеваемости их ИКБ. Воспримчи-вость к спирохетам у собак очень высока. Зараженная собака не только весь период до окончательного выздоровления служит резервуаром инфекции, но и может передавать возбудителя потомству трансплацентарно и даже с молоком (Burgess Е.С., 1986; Appel M.J. et al, 1993; Bauerfeind R. et al, 1993; Васильева И.С. и соав., 2003).

ИКБ собак интенсивно изучается в США, все большее внимание уделяется этой проблеме в странах Европы, Канаде, в Японии (Magnarelli L.A., et al., 1997, Straubinger R.K., 2007). В России имеются все условия для циркуляции возбудителя ИКБ у собак, но заниматься этой проблемой стали лишь недавно, а диагностика и профилактика боррелиоза животных не узаконена и не принята ветеринарной практикой (Васильева И.С. и соав., 2003).

изучение проблемы ИКБ у собак в России крайне важно не только с позиций ветеринарии, но и для успешной профилактики ЛБ человека.

Диагностика ИКБ у собак по клиническим признакам крайне затруднительна т.к. имеет несколько форм. В настоящее время в России отсутствуют отечественные тест-системы для иммунологической диагностики ИКБ у собак, поэтому практикующие ветеринарные врачи при подозрении на данное заболевание испытывают затруднения в своевременной и правильной диагностике, проведении лечения и контроля за ним.

Все вышесказанное предопределило цель и задачи исследований.

Цель и задачи исследования. Целью проводимых исследований явилось изучение экологии и биологии иксодовых клещей в природных и урбанизированных территориях в условиях Вологодской области, проведение серологических исследований животных на зараженность клещевыми инфекциями и усовершенствование методов диагностики клещевого бор-релиоза у собак.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

- установить наличие АТ к боррелиям передающимися иксодовыми клещами у собак и крупного рогатого скота;

- изучить особенности клинического проявления ИКБ у собак;

- изучить изменения гематологических и биохимических показателей крови у собак, спонтанно инфицированных возбудителями боррелиозов;

- выяснить видовой состав иксодовых клещей, степень их сезонной активности и спонтанной инфицированности боррелиями в условиях Вологодской области;

- изучить влияние основных климатических факторов на распространение, активность и зараженность клещей на урбанизированных территориях;

- изучить эпидемиологическую ситуацию по ИКБ на территории Вологодской области;

- совершенствовать методы диагностики ИКБ у собак.

Научная новизна. Впервые в Вологодской области изучена эпизоотическая ситуация и степень распространения иксодовых клещевых боррелиозов у собак. Изучены клинико-гематологические показатели при ИКБ собак. Установлены маркеры данного заболевания. Впервые разработана математическая модель управления «двойным» маркером.

Впервые в России получено серологическое подтверждение инфицированности крупного рогатого скота возбудителями ИКБ. Определена роль домашних животных в распространении боррелиоза.

В условиях Вологодской области проведены исследования по определению видового состава иксодоидных клещей, с учетом численности их и сезонной активности. Определена спонтанная инфицированность иксодовых клещей возбудителями ИКБ. Определен видовой состав боррелий.

Впервые разработана тест-система для диагностики ИКБ у собак методом ИФА.

Теоритическая и практическая значимость. Материалы диссертации вносят существенный вклад в решение актуальной проблемы борьбы с природно-очаговыми заболеваниями, а в особенности с болезнями общими для человека и животных.

Материалы диссертации использованы при подготовке:

1. Методических рекомендации «Иксодовый клещевой боррелиоз (экология, эпидемиология, клиника, диагностика, лечение, профилактика)». Утв. метод, комиссией фак. вет. мед. ВГМХА им. Н. В. Верещагина от 10.10.03.

2. Методических рекомендации «Клещевой боррелиоз Лайма у собак». Утв. научным координационным советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научного центра Россельхозакадемии, от 10 апреля 2009 г.

В результате исследований разработана иммуноферментная тест-система для выявления суммарных антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов у собак.

Результаты работы включены отделом ветеринарии Департамента сельского хозяйства области в программу лекционного курса повышения квалификации врачей-эпизоотологов районных станций по борьбе с болезнями животных, Вологодским институтом переподготовки и повышения квалификации кадров агропромышленного комплекса (ФГОУ ВИППКК АПК) в план лекционного курса повышения квалификации ветеринарных врачей по программе «Технология сельскохозяйственного производства (ветеринария)», а также результаты исследований используются при проведении практических занятий и чтения лекций для студентов ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» и ФГОУ ВПО «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия имени Н.В. Верещагина».

Основные положения, выносимые на защиту.

- Инфицированность возбудителями клещевых иксодовых боррелиозов собак и крупного рогатого скота на территории Вологодской области.

- Особенности клинического течения ИКБ у собак.

- Видовой состав иксодовые клещей в природных и урбанизированных территориях в условиях Вологодской области.

- Численность и активность иксодовых клещей.

- Спонтанная инфицированность иксодовых клещей и видовой состав спирохет р. Borrelia.

- Совершенствование методов диагностики при посредстве разработки иммуноферментной тест-системы для выявления суммарных антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов у собак.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях:

- научной международной конференции «Современные проблемы -общей, медицинской и ветеринарной паразитологии», Витебск, 2004;

- международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных, Москва, 2004, 2007;

- научной международной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ, ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», Санкт-Петербург, 2004, 2009;

- в ежегодном смотре-сессии по отраслям науки на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых ВГМХА им. Н.В. Верещагина, ФГОУ ВПО «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н. В. Верещагина» 2009;

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, одна из которых опубликована в журнале, рекомендованном ВАК Ми-нобрнауки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций (Ж. «Ветеринария» № 11, 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертация включает в себя введение, обзор литературы, материалы и методы собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий в себя 224 источника, из них 155 иностранных, приложения. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста и иллюстрирована 16 таблицами и 24 рисунками.

Благодарности. Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю доктору ветеринарных наук Т. В. Новиковой за неоценимую помощь и постоянное внимание к работе. Мы искренне благодарны зам. генерального директора ООО «Омникс», Козаренко Александру Алексеевичу за предоставление лабораторного оборудования и всестороннюю помощь в разработке тест-системы. Отдельная благодарность специалистам Управления Роспотребнадзора по Вологодской области и ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области" за сотрудничество и консультации в освоении методик работы.

Выражаем благодарность коллективу ветеринарной клиники «Центр» г. Москва, а также специалистам ветеринарных клиник гг. Вологды и Череповца, сотрудникам приюта для животных г. Мурманск за помощь в сборе клинического материала и апробации результатов исследований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Диссертационная работа выполнена в период с 2001 по 2008 годы на кафедре эпизоотологии и микробиологии Вологод-

ской государственной молочнохозяйственной академии Н.В. Верещагина (ВГМХА).

На базе Территориального отдела Управления Роспотребнадзора по Вологодской области в городе Череповце и микробиологической лаборатории ЦГСЭН Вологодской области изучали эпизоотологию иксодовых клещей. На базе ООО «Омникс» (г. Санкт-Петербург) и ветеринарной клиники ООО «Центр» (г. Москва) проводили разработку и апробацию тест-системы.

Для изучения эпизоотической ситуации всего выпонено 3909 различных исследований проб, в том числе определение спонтанной инфициро-ванносТи у 1127 клещей (168 клещей снятых с животных и 959 из биотопов), 144 собак, 144 голов крупного рогатого скота на зараженность возбудителями ИКБ. У собак дополнительно проводили биохимическое исследование крови, клинический анализ крови, исследование мазков крови с целью исключения кровепаразитов.

Также проводили изучение видового состава иксодовых клещей, их численности и сезонной активности. Сбор клещей с целью изучения их видового состава, распространения в природных или хозяйственных биотопах, сезонной динамики и численности, а также их спонтанной инфицированное™. Учёты численности активных имаго и нимф клещей за сезон, активности на растительности проводили стандартизированным методом -флага с вычислением суммы ежедекадных учетов на флаго-километр (3.1.1027-01. МУ., М., 2001). С целью учета клещей на хозяине подвергались обследованию домашние животные. Клещей снимали с кожи животных, используя специальные приспособления для удаления клещей, такие как «Ручка-Лассо», «Тиктвистер». Определение видовой принадлежности собранного материала проводили по Померанцеву Б. И., 1950, Сердюковой Г.В., 1956, Филипповой Н. А, 1977. Исследовали собранных клещей с целью иключения возбудителей боррелиозов методами ТПР (темнопольная реакция), ПЦР, РНИФ и ИФА по утвержденным МЗ РФ методикам. При исследовании на клещевой боррелиоз методом темнопольной реакции, клещ должен быть обязательно живой (в работу берётся содержимое кишечника). Для обнаружения боррелий в клещах использовали темнополь-ную микроскопию по методике Ю.В.Ковалевского и соавт. (1988).

Кровь для серологического исследования у обследуемых животных забирали натощак из вены по общепринятым правилам. Определение антител к возбудителям иксодового клещевого боррелиоза у собак и крупного рогатого скота проводили при помощи корпускулярного боррелиозного диагностикума. Диагностику ИКБ осуществляли реакцией непрямой им-мунофлюоресценции. Для постановки РНИФ применяется корпускулярный боррелиозный антиген (КБА) производства ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Диагностику кровепаразитов у собак после присасывания иксодовых

клещей осуществляли методом окраски мазков периферической крови по Паппенгейму.

Биохимические исследования сывороток проводили на биохимических анализаторах «Clima МС-15» и «Stat Fax 1904» в течение 2 часов с момента взятия крови. Общий клинический анализ крови проводили на автоматическом гематологическом анализаторе «Sysmex КХ-21».

Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответствии с правилами биологической статистики - стандартных методов и при помощи компьютерной программы Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экология и биология иксодовых клещей в природных и урбанизированных территориях в условиях Вологодской области.

Вологодская область входит в состав Федерального Северо-Западного округа. Череповецкий регион является юго-западной частью Вологодской области. Территория Череповецкого региона, где проводились исследования, характеризуется наличием большого числа озер и болот. Общее представление о климате г. Череповца - город расположен в зоне достаточного увлажнения. В течение года осадки распределяются неравномерно - 69% годового количества осадков приходится на теплый период времени и 31% — на холодный. Относительная влажность воздуха - 80%; Продолжительность теплого периода - 208 дней; На территории Вологодской области находятся зоны с резко различающимися техногенными загрязнениями. Наибольшее количество выбросов загрязняющих веществ в атмосферный воздух принадлежит городу Череповцу (72% в 2000 г.). Известно, что ик-содовые клещи способны накапливать в наружном скелете тяжелые металлы, что приводит к изменениями хитинового экоскелета Последнее влияет на векторную способность зараженности. Двигательная активность аномальных зараженных особей и, следовательно, их агрессивность, вероятность нападения на человека и животных выше; причем, чем интенсивнее заражены такие клещи, тем они более активны и более опасны.

Таким образом, климатические факторы, такие как благоприятная температура воздуха, отимальная относительная влажность, а также ланд-шафтно-географические, техногенные загрязнения создают благоприятные условия для жизнедеятельности иксодовых клещей на изучаемой территории. Расширению ареала и росту популяции клещей также способствует и увеличение посещений людьми и животными мест природного обитания и распространения клещей. Остатки продуктов после посещения леса отдыхающими, наличие сухостоя и валежника, создают благоприятные условия для жизни диких млекопитающих - прокормителей иксодовых клещей.

Для наблюдения за видовым составом, активностью и спонтанной ин-фицированностью иксодовых клещей был взят контрольный участок «Зеленая Роща» в лесопарковой зоне г. Череповца.

По результатам исследований в нашем регионе из иксодовых клещей встречаются следующие виды:

-1. persulcatus (таежный клещ) - он имеет первостепенное эпидемиологическое и эпизоотологическое значение, активен с апреля по август;

-1. ricinus (европейский лесной клещ) - активен с апреля по сентябрь;

- /. apronophorus - вид клеща нападающий на грызунов, но преимущественно на водяную полевку;

- Dermacenter pictus -активен в мае и осенью, эпизоотологического значения по иксодовому клещевому боррелиозу и клещевому энцефалиту не имеет. Он является переносчиком бабезиоза.

Численность и активность клещей на контрольном маршруте за 2001 - 2003 гг. варьирует в разные годы от 113 до 307 штук. Иксодовые клещи проявляют наибольшую активность в мае - июне (рис.1). В остальном, сезонный ход активности клещей имел типичное течение: вслед за высокой численностью клещей в июне происходило медленное снижение их активности до первой декады сентября.

Рис. 1. Динамика численности иксодовых клещей на стационаре «Зеленая роща»

С целью выявления основных факторов, определяющих численность активных клещей в природе, мы проследили за влиянием климатических условий на протяжении всего периода исследований. В результате кросс-табуляционного анализа получили статистически значимую зависимость

(р<0,05) между количеством клещей в активном состоянии температурой и влажностью в течение вегетационного периода. Просматривается периодичность корреляционного ряда в 12 единиц - это свидетельствует о том, что периодические колебания численности иксодовых клещей определяют закономерно повторяющиеся, с периодом в год, изменения погодных условий. Коэффициенты корреляции в пиках (положительные и отрицательные) значимы на уровне доверия 0,05. А так же мы наблюдаем, что температура и влажность взаимодействуют с количеством клещей примерно одинаково, если рассматривать температуру смещенной на 4 лаги назад (рис. 2).

от температуры и влажности

Численность и активность иксодовых клещей в рекогносцировочные учеты на стационаре коррелирует с таковой на других участках. Хотя участки, на которых производили сбор клещей, различаются по составу растительности и степени посещаемости населения. По-видимому, это можно связать с существенными экологическими изменениями, вызванными антропогенным воздействием на природные очаги.

Как было отмечено выше, в последнее время клещи имеют стойкую тенденцию к распространению на урбанизированных территориях и объектом нападения часто бывают собаки и кошки.

Нами с аперля по август 2003 г и в мае 2004 г. в г. Череповце было снято 168 клещ с животных (с 38 кошек и с 83 собак). Максимальное ко-

личество (по 9 клещей) было снято с двух кошек. Количество нападений клещей на животных в разные месяцы варьировало с пиком в мае - июне и коррелировало с таковым у людей.

Расширению зоны распространения клещей на урбанизированные территории способствует рост численности домашних животных и возрастающая их миграция.

Иксодовый клещевой боррелиоз: эпизоотолого-эпидемиологичсская проекция

При исследовании клещей на территории Вологодской области методом ПЦР установлена циркуляция двух геновидов возбудителей ИКБ: В^аппи, В.а/яеШ. Согласно полученных данных доля спонтанной инфицированное™ клещей варьирует незначительно и за три года в среднем составляет 14,8 ±2,02 %. Следует отметить, что достаточно значимые колебания численности клещей - переносчиков в природных очагах (по данным многолетних наблюдений) практически не сказывается на уровне их спонтанной инфицированности.

Снятых с животных клещей (168 клещей) мы исследовали методом ПЦР, ИФА и методом темнопольной реакции в микробиологической лаборатории ЦГСЭН Вологодской области на наличие ИКБ. Результаты этих исследований были следующие: по ИКБ 19 клещей были положительными, что соответствует 11,3% ± 2,4.

По нашим наблюдениям в весенне-осенний период собаки и кошки, интенсивнее, чем люди, подвергаются нападениям клещей. Вероятность контактов с клещами, соответственно и присасываний, у этих животных очень велика вследствие таких факторов, как размеры (соответствуют ярусу концентрации на растительности активных взрослых клещей и нимф), наличие шерстного покрова, подвижность, обеспечивающая возможность контактов с клещами на обширных территориях.

С целью изучения состояния заболеваемости ИКБ людей в Вологодской области был проведен анализ официальной статистики и данных серологического мониторинга.

Ежегодно в области увеличивается число обратившихся в лечебно-профилактические учреждения по поводу укусов клещей. Так, в 2004 году по данным мониторинга количество пострадавших от присасывания клещей составило 10886 человек, а в 2007 г. 15 788 человек. Что коррелирует с показателем заболеваемости ИКБ за тот же период. Показатель заболеваемости ИКБ по Вологодской области в 1998 - 2007 гг. составил от 19,4 до 28,82% (выше среднероссийской в 5,7 раза). Заболеваемость населения Вологодской области иксодовым клещевым боррелиозом значительно превышает заболеваемость другими природно-очаговыми инфекциями, в частности и клещевым энцифалитом в 4-5 раз. С 1999-2007 гг. доля иксо-дового клещевого боррелиоза составила 61,2 - 83,8% в структуре природно-очаговых инфекций.

Приведенные данные показывают, что иксодовому клещевому борре-лиозу в Вологодской области принадлежит ведущее место среди природ-но-очаговых инфекций в связи с широким распространением возбудителя, значительным уровнем заболеваемости и риском заражения.

Серологический скрининг животных на зараженность клещевыми инфекциями

Решение проблемы диагностики паразитарных болезней животных с помощью серологических методов является перспективным направлением, которое значительно ускоряет время постановки диагноза и повышает чувствительность метода.

По данным Госветотчетности ИКБ у животных в Вологодской области не регистрируется. Диагностика клещевого боррелиоза в Областной ветлаборатории не ведется.

С целью выяснения эпизоотологической ситуации нами были отобраны сыворотки крови от 17 собак, клещи от которых были заражены борре-лиями, и исследованы при помощи диагностического теста на ИКБ реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). При исследовании проб сывороток на боррелиоз были выявлены суммарные антитела к антигену в 10 (58,82% ±11,93) пробах крови указанные антитела выявлены в разведении 1:40 и 1:80, а в 7 (41,17 % ±11,93) пробах антитела к антигенам возбудителей ИКБ не выявлены.

При повторном обследовании животных в динамике через четыре недели результаты оставались неизменными. Отсутствие антител у собак, которые подверглись покусам клещей можно объяснить тем, что несмотря на присутствие в клеще боррелий заражение не произошло. Это зависит от вида клеща и времени кровососания. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными. Только клещи с боррелиями в слюнных железах способны передавать их со слюной животным и человеку во время укуса (Никитин Н.Е., 1968; Григорьева Л. А., 2007).

С целью изучения состояния заболеваемости клещевым боррелиозом в Вологодской области крупного рогатого скота мы провели исследования сывороток крови методом РНИФ.

Проведенные исследования показали, что из 72 сывороток крови КРС, отобранных в апреле, только в 10 сыворотках обнаружены АТ против возбудителей боррелиозов, что составляет 13,88 ± 4,07%, а из 72 сывороток крови животных, взятых в ноябре повторно, уже 20 сывороток имели положительный титр АТ, что соответствует 27,77 ± 5,27% . Из всех 72 животных только у шести было совпадение и в первом и во втором случае. Данные результаты показали наличие АТ против возбудителей клещевых боррелиозов в сыворотках крови коров, титр варьировал от 1/10 до 1/40. Считаем, что несовпадение результатов и низкий титр вероятно зависят от разведения сывороток и от объема циркулируемой крови. Подобную закономерность отмечают и медицинской практике. Следует отметить, что

низкие титры и вообще исчезновение титра AT может наблюдаться, после курса антибиотиков в связи с лечением заболеваний бактериальной природы у коров, например, лечение маститов, что согласуется с данными Bushmich SL, Post JE. 1989. Также при интерпретации результатов реакций необходимо брать во внимание данные зарубежных исследователей (Burges Е.С., 1988 et el), что у коров титр антител при ИКБ в ИФА ниже, чем у собак и людей.

Полученные показатели по инфицированности крупного рогатого скота возбудителями клещевых боррелиозов, позволяют рассматривать крупный рогатый скот, как один из дополнительных резервуаров ИКБ в природных очагах.

Совершенствование методов диагностики клещевых инфекций у собак - иммунодиагностика ИКБ методом ИФА

Разработка тест-системы проходила на базе ООО «Омникс» Для исследования использовались сыворотки крови от 104 животных, собранные от собак с эндемичных по иксодовому клещевому боррелиозу территорий.

Разработка тест-системы проходила в несколько этапов, но по общей для ИФА схеме:

1. Подготовка проб (разведение) и приготовление рабочих растворов.

2. Инкубация сыворотки.

3. Промывка планшета (удаление не связанных AT).

4. Инкубация с конъюгатом.

5. Промывка планшета (удаление не связавшегося конъюгата)

6. Инкубация с хромогеном (субстратом).

7. Остановка реакции. (Внесение стоп- реагента).

8. Детекция, (считывание результата).

На всех этапах в качестве «иммуносорбента» использовался планшет от тест-системы #KS-001, 96-луночный планшет; раствор конъюгата-(пероксидазный конъюгат) Protein A, Peroxidase Conjugate CALBIOCHEM Cat# 539253 Lot 23147. Производитель Германия.

На первом этапе необходимо было выявить максимально положительные и максимально отрицательные сыворотки крови, которые в дальнейшем будут использоваться как К+ и К-. Параллельно подбирали и оптимальное разведение сывороток и конъюгата. Использовали следующие разведения:

сыворотки: 1/10 1/100 на буфере БИС VI.

конъюгата: 1/3000 1/1000

1/10000 1/3000

1/30000 1/10000 на буфере #KS-004.

Порядок проведения эксперимента:

1. Готовили рабочий раствор «ФСБ-Т» для промывки планшета. Для этого 10 мл «ФСБ-Т» переносили в мерный цилиндр и доводили объем

раствора до 400 мл дистиллированной водой. При наличии во флаконе с концентратом «ФСБ-Т» осадка солей, подогревали его при температуре (37±1)°С до полного растворения. Хранили рабочий раствор «ФСБ-Т» при температуре от +2 до +8°С не более 1 месяца.

2. Предварительно разводили сыворотки. Образцы исследуемых сывороток разводили 1:10 в «БРС». Для этого смешивали 10 мкл каждой сыворотки с 90 мкл «БРС». Разведенные образцы исследуемых сывороток хранению не подлежали.

3. Готовили рабочий раствор субстрата. Его готовят непосредственно перед использованием в отдельной чистой емкости. В расчете на 1 стрип 0,5 мл раствора из флакона «ЦФБ» (цитрат-фосфатный буфер, прозрачная, бесцветная жидкость) смешать с 0,5 мл «ТМБ» (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость). Раствор тщательно перемешивали. Хранили не более 10 мин при температуре 20-25 °С в защищенном от света месте.

4. В лунку планшета А1 вносили 100 мкл «БИС» и использовали как бланк. В остальные лунки планшета вносили по 90 мкл «БИС» и по 10 мкл неразведенной сыворотки (рабочее разведение 1:10) и предварительно разведенных исследуемых сывороток (рабочее разведение 1:100). После этого планшет закрывали клейкой лентой и инкубировали 30 мин при (37±1)°С в шейкере при скорости вращения платформы 500 об/мин.

5. По окончании инкубации планшет промывали рабочим раствором «ФСБ-Т» 5 раз следующим образом:

• удаляли содержимое лунок в емкость с дезинфицирующим раствором;

• в каждую лунку вносили по 300 мкл промывочного буфера, переме-шывали в течение 10 секунд;

• удаляли содержимое лунок в емкость с дезинфицирующим раствором;

• тщательно удаляли остатки содержимого лунок легкими постукиваниями перевернутой рамки по стопке фильтровальной бумаги.

6. После промывки и удаления влаги в каждую лунку вносили «РК» объемом по 100 мкл. Планшет закрывали клейкой лентой и инкубировали 30 мин при (37±1)°С в шейкере при скорости вращения платформы 500 об/мин.

7. По окончании инкубации планшет промывали «ФСБ-Т» пять раз и удалить остатки влаги из планшета как и в первый раз.

8. Вносили в каждую лунку планшета раствор субстрата объемом по 100 мкл, приготовленного ранее. Планшет помещали на 10 мин в шейкере при скорости вращения платформы 500 об./мин. и при температуре (37±1)°С.

9. Реакцию останавливали внесением в каждую лунку 100 мкл содержимого флакона «Стоп-реагент». Перемешивали содержимое лунок.

10. Производили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм в течение 10 мин. на спектрофотометре (ЕХ *800), а результаты распечатывались на принтере.

На втором этапе необходимо было оптимизировать разведение конъ-югата -(пероксидазный конъюгат) Protein A, Peroxidase Conjugate CAL-BIOCHEM Cat# 539253 Lot 23147. Производитель Германия. А так же найти величину cut-off.

Для этого сначала использовали разведение конъюгата 1:10000; 1:20000; 1:30000, а разведение сыворотки стандартное: предразведение 1:10, а рабочее 1:100 на буфере БИС VI. В лунку планшета AI вносили 100 мкл «БИС» и использовали как бланк, как и в первом случае. А вот в лунку В1 вносили уже 100 мкл «К+», выделенных на первом этапе, в лунки С1 и D1 вносили так же по 100 мкл , но уже «К-» тоже из первого эксперимента. В остальные лунки планшета, как и в первом случае, вносили по 90 мкл «БИС» и по 10 мкл предварительно разведенных исследуемых сывороток. Всю остальную часть ИФА проводили как на первом этапе.

В результате постановки этого эксперимента у нас получились повышенные фоновые значения (оптическая плотность) у клинически здоровых животных (г. Мурманск). Поэтому в последующем эксперимента мы заменили используемый буфер (БИС VI), на более «жесткий» БИС V2 и еще больше развели конъюгат : 1:30000; 1:40000; 1:60000, 1:80000; 1:120000.

Третий этап заключался в проверке и закреплении полученных результатов. Получившуюся тест-систему проверяли на всех 104 пробах. Использовали раствор конъюгата с разведением 1:140000 на буфере #KS-004, разведение сыворотки на буфере БИС V2.

И заключительным этапом нашей работы была апробация полученной тест-системы в ветеринарной клинике «Центр» г. Москва. Используя данную систему, была протестирована панель референт сывороток, полученных от больных животных. Панель референтных сывороток была создана, используя коммерческую тест-систему «Anti-Borrelia plus VlsE ELISA (IgG) » (Euroimmun). Для этой работы были использованы положительные сыворотки от больных ИКБ собак и контроли, которые любезно предоставила для работы сотрудник вет. клиники «Центр», кандидат биологических наук, Н. С. Пустовит. Для чистоты эксперимента исследование проводили параллельно и использовали одни и те же пробы сывороток после разведения.

В результате проведенных исследований на первом этапе были найдены положительные и отрицательные сыворотки крови, которые в дальнейшем стали К+ и К-, а так же оптимальное разведение сыворотки 1:100 на буфере БИС VI.

На втором этапе проведена оптимизация условий ИФА: найдены оптимальные значения разведения конъюгата, проведена замена буфера и определено значение cut-off.

На третьем этапе проведена отработка разработанной нами тест-

системы на всех 104 сыворотках. Результаты были следующие: 15 положительных проб, что составило 14,42 ± 3,44 %.

На заключительном этапе: апробация полученной тест-системы в ветеринарной клинике «Центр» и сравнение ее с коммерческую тест-систему «Anti-Borrelia plus VlsE ELISA (IgG) » (Euroimmun, Германия), были получены следующие результаты:

1. Негативные сыворотки показали отрицательные результаты.

2. Позитивные сыворотки референт-панели при анализе на тест-системе «Омникс» были положительными.

3. При анализе сывороток, значения которых соответствовали «серой зоне», тест-система показала высокую специфичность.

Но здесь необходимо учесть, что при сравнении двух тест-систем использовались разные антигены, поэтому 100% сходимости результатов быть не могло.

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана версия иммуноферментной тест-системы для выявления суммарных антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов у собак, на основе рекомбинантного антигена, содержащего белки молекулярной массы 66, 31, 34, 39, 41, 18 кДа. Она успешно прошла апробацию и сравнение с коммерческой тест-системой «Anti-Borrelia plus VlsE ELISA» набор Euroimmune (Германия), набор для выявления IgG на основе VlsE домена (это рекомбинантный белок боррелии с молекулярной массой 34 кДа) с добавлением цельноклеточного штамма В. burgdorferi. Полученные данные показывают высокую корреляцию результатов анализов и позволяют использовать данную тест-систему для диагностики ИКБ в ветеринарии у собак, в том числе ранней диагностики, что очень важно, когда еще отсутствуют клинические признаки ИКБ, а собака уже представляет собой источник боррелий для иксодовых клещей.

Нами были повторно происследованы все 104 пробы крови (от тех же животных, сыворотки которых использовались для разработки тест-системы) на разработанной и апробированной тест-системе. Результаты были следующие: 15 (14,42 ± 3,44 %) положительных проб по ИКБ, что полностью соответствовало полученным ранее данным в период разработки тест-системы.

Помимо исследования животных на ИКБ, мы диагностировали их на другие клещевые инфекции. Для диагностики использовалась та же группа животных. При микроскопировании мазков выяснили, что превалирующая роль среди гемоинфекций принадлежит риккетсиозам (Erlichia sp., Haemobartonella sp., Eperythrozoon sp., Rickettsiales sp.) - 6,0 % от числа обследованным, 3,7 % случаев составил бабезиоз и микстинфекции (бабе-зиоз+рикктсиоз) 0,75%. Полученные результаты подтверждают наши исследования в том, что наиболее распространен и многочислен на территории Вологодской области Ixodes persulcatus, который чаще других являет-

ся переносчиком риккетсий. Возбудители бабезиозов у собак в области могут передаваться, из обнаруженных нами, клещами р. ОегтасеШег. Последние очень малочисленны и обнаруживаются в прибрежной части водоемов, поэтому мы регистрировали один случай, на наш взгляд, «местного» бабезиоза, а остальные, считаем, за счет миграции животных.

Клинический аспект ИКБ собак При клиническом обследовании 10 собак, клещи от которых были заражены боррелиями, и в чьих пробах антитела к антигенам возбудителей ИКБ были выявлены методом РНИФ мы наблюдали следующее: что у 6 собак (60±15,49%) не наблюдались в период исследования никаких клинических признаков свойственных ИКБ., а у четырех (40±15,49%) наблюдались явные клинические признаки, характерные для ИКБ.

Среди положительных животных в ИФА и РНИФ по боррелиозу регистрировались различные первичные диагнозы и клинические состояния. Приведенные данные показывают, что при ИКБ у собак такие клинические состояния, как угнетенное состояние, потеря аппетита, повышение температуры тела, болезненность лимфоузлов, учащенное дыхание, позднее боль в мышцах, хромота регистрируются чаще (55,55-33,33%) в сравнении с другими первичными диагнозами. Добавим, что подострое течение ге-моинфекций и проявление ранних симптомов ИКБ могут быть схожи.

Результаты изучения гематологических данных при ИКБ собак свидетельствовали об изменениях со стороны неспецифических показателей воспаления - лейкоцитов и СОЭ (табл.1). Количество эозинофилов увеличилось в ср. до 6,53%, СОЭ - ср. 4,5 мм/ч (р<0,1).

Таблица 1

Гематологические показатели крови собак положительных по ИКБ

Показатели норма Среднее значение минимум максимум

Гемоглобин, г/л 120-180 142,2 90 178

Эритроциты, млн./мкл. 5,2-6,4 5,68 3,51 7,26

Цветной показатель 0,8-1,2 0,82 0,67 0,92

Среднее сод. гемогл. в эритроцитах, пкг 27-31 23,52 21,89 27,3

Ретикулоциты, % До 1 0,8 0,2 1,4

Тромбоциты, тыс./мкл. 100-500 179 69 312

Лейкоциты, тыс./мкл. 9,5-10,5 11,46 4,1 26,45

Гематокрит, об. % 44-52 46,15 28,6 57

Миелоциты% 0 0,14 0 1

Палочкоядерные, % 0-6 2,92 0 7

Сегментоядерные, % До 74 43,32 6,3 79

Эозинофилы, % 1-5 6,53 2 12

Базофилы, % 0-1 0,33 0 2

Лимфоциты, % 13-32 21,64 6 45

Моноциты, % 3-10 6,93 3 14

Плазматич. клетки, % - 0 0 0

СОЭ, мм/ч 2,5-3,5 4,5 0 22

Результаты исследований в целом показали, что при ИКБ собак наблюдаются изменения по некоторым гематологическим показателям. Сдвиги в сторону эозинофилии и увеличение скорости оседания эритроцитов подтверждают тот факт, что ИКБ собак характеризуется изменениями гомеостаза.

Результаты биохимического исследования крови представлены в табл.2.

Таблица 2

Биохимические показатели крови у собак положительных по ИКБ

Показатели норма Среднее значение минимум максимум

Общий белок, г/л 59-76 66,40 57 80

Альбумины, г/л 48-57 33,46 25 40,1

альфа 1-глобулины % 10-16 17,87 2 37,3

Бета-глобулины % 20-25 14,93 10,3 19,1

Гамма-глобулины % 10-14 25,8 18 31,1

Мочевина, ммоль/л 2,1-9,7 20,48 2,4 42

Креатинин, мкмоль/л 50-110 175,33 65,1 427

Кальций ммоль/л 2,2-3 2,9 1,9 4,02

Фосфор ммоль/л 0,8-1,9 1,72 1,1 2,0

Калий ммоль/л До 5,5 4,36 3,67 5,1

Натрий ммоль/л До 150 119,2 56 171

Магний ммоль/л 2-3,4 2,62 1,7 3,9

Амилаза, МЕ/л До 2000 1046,26 55,9 2701

АЛТ, МЕ/л 4-40 33,34 16,2 61

ACT, МЕ/л 10-75 62,88 9 107

Билирубин, мкмоль/л До 7,5 5,52 1,5 10,2

Билирубин пр., мкмоль/л До 55 16,72 7,9 25

Глюкоза,моль/л 3,5-7 3,74 1,1 6,2

Холестерин ммоль/л 3,2-7,5 4,2 2,9 7,0

Щелочная фосфатаза, МЕ/л До 260 174,86 59 380

Полученные результаты биохимического анализа крови собак показали, что у инфицированных возбудителем ИКБ собак регистрировалось в некоторых случаях повышение следующих показателей: альфа 1-глобулины, гамма-глобулины, а-амилаза, общий билирубин, но взаимодействие между положительными показателями ИФА и выше указанными по-

казателями статистически незначимо (р<0,1), поэтому маркерами по ИКБ считать их не можем.

Статистически значимо от нормы повышены мочевина - в среднем 175,33 ммоль/л (р < 0,05) и креатинин 20,48 мкмоль/л (р < 0,05). Необходимо отметить, что достоверное повышение показателей мочевины и креатина подтвердилось при расчетах индикации информативности: р-уровней Хи-квадрат и дисперсионного анализа (р < 0,05), частотного показателя (мочевина - 0,72; креатинин - 0,47), коэффициента корреляции (мочевина -0,51; креатинин - 0,2). Полученные данные показывают, что эти показатели могут служить маркерами ИКБ у собак.

На основании полученных данных разработана математическая модель управления «двойным» маркером (рис. 3).

700 650 600 550 500 450

I 400

I 350

* 300 250 200 150 100 50

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 80

мочевина

Л - результаты И ФА Д - результаты И ФА

положительные отрицательные

Рис. 3. Диаграмма рассеяния показателей креатина и мочевины в проекции ИФА у собак при ИКБ

При этом составляем уравнениие поверхности, сепаратрисы (линия на диаграмме разделяющая положительные и отрицательные ИФА) и подставляем в уравнение значения «мочевина» «креатинин» и если результат положителен, - точка лежит справа от сепаратрисы, если слева - отрицателен, если ноль, то точка попадает в точности на сепаратрису. Так работает

норма ь * Л й А .. Д & '' ' й ' « Сепаратриса ' 1 / * %* \ [ 1 * 1 У '' . . .1 ; '..............................- .............................. ........1............V' .........1:........"" • •>

ш?/-* ЧГ /А л г л * норма ч

■й &

коллективный (парный) маркер (табл. 3). Взависимости от полученных данных, при подозрении на ИКБ, мы можем рекомендовать дальнейшее исследование на ИКБ методом ИФА, либо нет.

Таблица 3

Пример расчетов:

Мочевина Креа тинин Значения правой части уравнения Маркер

30 300 0,42945000 >0 справа от сепаратрисы сработал

11 350 -0,09051330 <0 слева нет

8 300 - 0,06947920 <0 слева нет

5 600 - 87304600 <0 слева нет

14 4 -0,00003143 = 0 на сепаратрисе сомнительная реакция (реком. исслед. в динамике

Выводы

1. Впервые на территории Вологодской области у собак выявлен иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) с экстенсивностью инфекции 14,42 ± 3.44% и установлены генотипы возбудителей: Borrelia afzelii и В. garinii. и их переносчики: /. persulcatus и I. ricinus.

2. Установлено наличие AT к возбудителям ИКБ у крупного рогатого скота, из чего следует, что процент зараженности в апреле и ноябре соответственно 13,88 ± 4,07% и 27,77 ± 5,27% от числа обследованных. Полученные результаты позволяют рассматривать крупный рогатый скот, как один из дополнительных резервуаров ИКБ в природных очагах.

3. Основными клиническими проявлениями ИКБ у собак являются угнетенное состояние, потеря аппетита, повышение температуры тела, увеличение и болезненность лимфоузлов, учащенное дыхание, боль в мышцах, хромота (33,33 - 55,55 %).

4. Изменение при ИКБ у собак гематологических показателей таких, как СОЭ и количество эозинофилов - указывает на заболевание всего организма с выраженными изменениями гомеостаза.

5. Показаниями к обследованию собак на ИКБ является повышение биохимических показателей крови: мочевины и креатинина (р < 0,05). Впервые разработана математическая модель управления двойным маркером.

6. Первостепенное эпизоотологическое значение при распространении ИКБ среди животных имеет I. persulcatus. Погодовая динамика спонтанной инфицированное™ клещей возбудителями ИКБ варьирует незначительно и в среднем составляет 14,8 ±2,02 %.

6.1. Иксодовые клещи: 1. persulcatus и I. ricinus в условиях Вологодской области проявляют наибольшую активность в мае - июне (р < 0,05).

Численность клещей на стационаре коррелирует с таковой на других участках. Количество нападений клещей на животных варьировало с пиком их активности.

6.2. Численность иксодовых клещей в течение сезона статистически значимо определяется суммами эффективных температур и влажности окружающей среды (р < 0,05) и не зависит от количества осадков.

7. Разработана и внедрена иммуноферментная диагностическая тест-система для выявления суммарных антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов у собак на основе рекомбинантного антигена, содержащего белки молекулярной массы 66, 31, 34, 39, 41,18 кДа.

Практические предложения

1. В результате исследований разработана и внедрена отечественная иммуноферментная тест-ситема для выявления суммарных антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов у собак.

2. Результаты исследований по изучению экологии и биологии иксодовых клещей, эпизоотологии и эпидемиологии ИКБ, клинических аспектов при ИКБ у собак использованы при подготовке:

- Методических рекомендаций «Иксодовый клещевой боррелиоз (экология, эпидемиология, клиника, диагностика, лечение, профилактика)». Утв. метод, комиссией фак. вет. мед. ВГМХА им. Н. В. Верещагина от 10.10.03.

- Методических рекомендаций «Клещевой боррелиоз Лайма у собак». Утв. научным координационным советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научного центра Россельхозакадемии, от 10 апреля 2009 г.

3. Результаты работы включены отделом ветеринарии Департамента сельского хозяйства области в программу лекционного курса повышения квалификации врачей-эпизоотологов районных станций по борьбе с болезнями животных, Вологодским институтом переподготовки и повышения квалификации кадров агропромышленного комплекса (ФГОУ ВИППКК АПК) в план лекционного курса повышения квалификации ветеринарных врачей по программе «Технология сельскохозяйственного производства (ветеринария)», а также результаты исследований внедрены в учебный процесс в ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» и ФГОУ ВПО «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н.В. Верещагина».

4. Разработана и внедрена в практику ветеринарных специалистов через сеть ветеринарных клиник гг. Вологды и Череповца «Памятка для владельцев собак» с целью профилактики ИКБ у собак.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статья в журнале из списка, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ

1. Новикова Т.В. Экология иксодовых клещей и эпизоотология передаваемых ими заболеваний / Т.В. Новикова, Н.В. Молотова, Н.А.Рыбакова, И.В. Филоненко, Т.В. Чубарова, М.В. Щустрова // Ветеринария. - 2004. — № 11.-С. 32-34.

Работы, опубликованные в сборниках научных трудов и материалов конференций

2. Новикова Т.В. Иксодовый клещевой боррелиоз у собак: диагностика, лечение, профилактика / Т.В. Новикова, Н.В .Молотова, H.A. Рыбакова // Материалы научно-практической конференции. - СПб., 2004.-С. 47-51.

3. Новикова Т.В. Определение антител к возбудителям клещевых системных боррелиозов у собак при помощи корпускулярного боррелиоз-ного диагностикума / Т.В. Новикова, И.Р. Лесников, Н.В. Молотова // Труды IV Международной научной конференции «Современные проблемы общей, медицинской и ветеринарной паразитологии». - Витебск, 2004. -С. 371-373.

4. Молотова Н.В. Эпизоотолого-клинические аспекты иксодового клещевого боррелиоза у собак и их роль в поддержании природных очагов инфекций / Н.В. Молотова, Т.В. Новикова // Материалы XII международного конгресса по болезням мелких домашних животных. - М., 2004. -С. 34.

5. Молотова Н.В. Клинический случай смешанной инфекции: бабе-зиоз и риккетсиоз у собаки / Н.В. Молотова // Материалы XV международного конгресса по болезням мелких домашних животных. - М., 2007. -С. 17.

Подписано в печать 21.04.2010 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 1595.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Молотова, Надежда Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Видовой состав, морфология и физиология возбудителей иксодового клещевого боррелиоза.

1.2. Экология и эпизоотология иксодового клещевого боррелиоза.

1.2.1. Переносчики и резервуарные хозяева.

1.2.2. Пути и механизмы передачи возбудителей ИКБ.

1.2.3. Эколого-географическое распространение и зараженность основных переносчиков.

1.3. Эпидемиология ИКБ.

1.4. Течение и клинические проявления ИКБ у собак.

1.4.1. Клиническая классификация иксодовых клещевых боррелиозов у собак.

1.4.2. Клинические проявления иксодовых клещевых боррелиозов у других домашних животных.

1.5. Другие инфекции передаваемые иксодовыми клещами, клинические проявления и их диагностика.

1.6. Клинико-диагностические характеристики крови при иксодовом клещевом боррелиозе у собак.

1.7. Лабораторная диагностика ИКБ.

1.7.1. Прямые методы диагностики.

1.7.2 Непрямые методы диагностики.

1.8. Дифференциальная диагностика иксодового клещевого боррелиоза у собак.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Классические методы сбора и видового определения иксодовых клещей.

2.1.2. Классические методы выделение боррелий из клещей.

2.1.3. Диагностика других кровепаразитов, передаваемых посредством иксодовых клещей.

2.1.4. Биохимические и клинические исследования крови.

2.2. Экология и биология иксодовых клещей в природных и урбанизированных территориях в условиях Вологодской области.

2.2.1. Краткая характеристика эколого-географических и климатических условий в Вологодской области.

2.2.2 Видовой состав иксодовых клещей на исследуемой территории .71 2.2.3. Численность и активность иксодовых клещей.

2.2.3.1. Численность и активность иксодовых клещей на стационаре «Зеленая роща».

2.2.3.2. Численность и активность иксодовых клещей в рекогносцировочные учеты.

2.2.3.3. Численность и активность иксодовых клещей на животных.

2.3. Иксодовый клещевой боррелиоз: эпизоотолого - эпидемиологическая проекция.

2.3.1. Спонтанная инфицированность иксодовых клещей спирохетами р. Borrelia.

2.3.1.1. Спонтанная инфицированность иксодовых клещей спирохетами p. Borrelia на исследуемой территории.

2.3.1.2. Спонтанная инфицированность иксодовых клещей спирохетами p. Borrelia снятых с животных.

2.3.2. Эпидемиологическая обстановка по ИКБ.

2.4. Серологический скрининг животных на зараженность клещевыми инфекциями.

2.4.1. Исследование сыворотки крови животных методом РНИФ на ИКБ.

2.4.2. Совершенствование методов диагностики клещевых инфекций у собак - иммунодиагностика ИКБ методом ИФА.

2.4.2.1. Разработка и апробация тест-системы.

2.4.2.2. Исследование сыворотки крови животных разработанной тест-системой на ИКБ.

2.4.3. Диагностика других кровепаразитов, передаваемых посредством иксодовых клещей.

2.5. Клинический аспект ИКБ.

2.6. Клинико-диагностические характеристики крови при иксодовом клещевом боррелиозе собак.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клещевой боррелиоз собак в условиях Вологодской области"

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) — Лайм-боррелиоз (ЛБ), боррелиоз Лайма (БЛ), болезнь Лайма (БЛ) — представляет собой группу этиологически близких нозологических форм и занимает по уровню заболеваемости, тяжести и продолжительности клинического течения, затруднений в диагностике, а также широкого распространения одно из ведущих мест среди природно-очаговых инфекций в России и за рубежом.

Возбудителями ЛБ являются боррелии (спирохеты) рода Borrelia. Переносчиками служат паразитические иксодовые клещи рода Ixodes [16]. Заражение людей и домашних животных происходит при попадании боррелий при укусе зараженного клеща.

Впервые они были описаны в Европе, в том числе и в России, еще в конце XIX века [215, 136, 34]. В начале XX века шведский врач-дерматолог Арвид Афзелиус установил взаимосвязь между появлением на коже кольцевидной мигрирующей эритемы («эритема Афзелиуса») и присасыванием клеща [72]. В 1975 году в США, в штате Коннектикут, городке Лайм впервые были описаны случаи клещевого боррелиоза у группы детей с клиническими симптомами ювенального ревматоидного артрита [206, 205]. В 1982 году американский микробиолог Вилли Бургдорфер впервые выделил и идентифицировал неизвестные ранее спирохетоподобные микроорганизмы из клещей Ixodes dammini [99]. С 1991 года болезнь Лайма была включена в официальный государственный перечень заболеваний, регистрируемых на территории Российской Федерации [34].

Тот факт, что болезнь Лайма стала широко известна и получила самостоятельный статус лишь сравнительно недавно — с середины 70-х годов, во многом обусловлен экологическими изменениями, вызванными антропогенными воздействиями, приведшими к расширению распространения и росту численности клещей-переносчиков и к возникновению новых очагов. Было показано, что в США и странах

Западной Европы отказ от интенсивной агрокультуры, сокращение пахотных земель, развитие озеленения, увеличение пригородного строительства привели к мозаичному распространению лесов — созданию идеальных условий для существования клещей и их прокормителей [16]. Если ранее очаги ЛБ (как и очаги других природно-очаговых инфекций с теми же видами переносчиков) были приурочены, в основном, к лесным массивам в сельской местности, то теперь создалась реальная угроза городскому населению. Зараженные клещи по парковым коридорам стали проникать из пригородных лесов в городские парки и скверы. В США известны случаи заболевания горожан вследствие укуса одного клеща на газоне собственного дома [15].

Аналогичная ситуация сложилась и в нашей стране. Значительная часть случаев заражения людей происходит в пригородной зоне, на садово-огородных участках и в городских рекреационных зонах [15].

В связи с выявлением очагов ЛБ и зараженных клещей в непосредственной близости от жилищ человека особую актуальность приобретает вопрос об участии домашних животных, особенно собак, в циркуляции спирохет.

ЛБ собак интенсивно изучается в США, все большее внимание уделяется этой проблеме в странах Европы. Случаи ЛБ у собак или наличие у них антител против боррелий (что свидетельствует о факте заражения) регулярно отмечаются в США, Канаде, почти во всех странах Европы, в Японии. Там разработана и успешно применяется вакцина против ЛБ для собак. В России имеются все условия для циркуляции возбудителя ЛБ у собак, но заниматься этой проблемой стали лишь недавно, а диагностика и профилактика боррелиоза животных не узаконена и не принята ветеринарной практикой [15].

В весенне-осенний период собаки регулярно, гораздо чаще, чем люди, подвергаются нападениям клещей. Вероятность контактов с клещами, соответственно, и покусов, у собак очень велика вследствие таких факторов, как размеры (соответствуют ярусу концентрации на растительности активных взрослых клещей и нимф), наличие шерстного покрова, подвижность, обеспечивающая возможность контактов с клещами на больших территориях. Аттрактивность для клещей смыва шерсти собак выше, чем выделений потовых желез человека [59]. Восприимчивость к спирохетам у собак очень высока. Спирохеты или их ДНК регулярно обнаруживают в тканях собак, зараженных как в природе, так и в лаборатории [79, 207]. Экспериментально доказана способность собак сохранять возбудителей ЛБ и служить источником заражения для питающихся на них клещах [79, 85, 103, 174]. Спирохеты выделены из клещей, питавшихся на собаках в природных условиях.

В лабораторных условиях почти у 100% собак, на которых кормили инфицированных клещей, обнаружены специфические антитела к возбудителям ЛБ, сохраняющиеся на высоком уровне в течение длительного периода (до 505-581 дня, срок наблюдений) [79, 85]. Доля сероположительных среди собак, регулярно контактирующих с клещами в эндемичных районах, колеблется от 4—6 до 70-100% [116, 174]. Антитела отмечаются как у собак с клиническими проявлениями, так и у бессимптомных, но у последних несколько реже, к тому же титры антител у них обычно ниже. Так, например, в США в штатах Коннектикут и Нью-Йорк антитела выявлены у 92,9% собак с симптомами ЛБ и у 89,6% собак без клинических проявлений. Процент серопозитивных собак обычно значительно увеличивается от весны к осени [15].

Таким образом, четко выраженная способность воспринимать, сохранять возбудителей ЛБ и служить источником заражения для клещей определяет существенное значение собак, как резервуара спирохет, что особенно важно ввиду близости собак к человеку. Собаки участвуют в прокормлении клещей и в заносе их на садовые участки, лужайки вблизи домов, в городские парки, чем способствуют возникновению новых очагов и существенно увеличивают риск заражения людей. С увеличением урбанизации среды роль собак как резервуара спирохет все более возрастает [118]. Зараженная собака не только практически весь период до окончательного выздоровления служит резервуаром инфекции, но и может передавать возбудителя потомству трансплацентарно и даже с молоком [15].

Занесенные собаками не присосавшиеся клещи могут перейти на человека. Известны такие факты и для котов, вернувшихся домой и взятых на руки хозяевами. Считается, что без наличия переносчика зараженная собака не является источником инфекции для человека. Большинство авторов отрицает возможность контактного внеклещевого заражения- [127], однако имеются единичные данные о> заражении в экспериментах контрольных собак (и других лабораторных животных), содержавшихся вместе с инфицированными, предположительно через мочу [103]. ДНК спирохет в моче при помощи полимеразной цепной реакции довольно часто (14,8%) отмечаются у больных собак [85]. Однако патологический эффект существования антигена возбудителя ЛБ в моче не известен, равно как природа его и механизм распространения. Описаны случаи ЛБ человека в результате попадания возбудителя на конъюнктиву глаза, что вполне вероятно при раздавливании снимаемых с собак клещей [15].

Отмечается четкая корреляция серопозитивности собак с заболеваемостью человека, поэтому выявление уровня серопозитивности собак признано чувствительным, удобным и доступным методом оценки потенциальной эпидопасности территории и индикатором риска заболевания людей [165]. Так, например, было выявлено, что на различных территориях США при 1,5% серопозитивности собак риск заражения людей невелик, при 7-8% — достигает среднего уровня, а при 51% и выше — очень высок [116]. Дополнительным достоинством этого метода является возможность использования проб крови, которые регулярно берутся в ветеринарных лечебницах при других исследованиях.

Показана возможность использования больных собак в качестве лабораторной модели ввиду неоднократно отмечаемого сходства в развитии антительного ответа и в клинических признаках ЛБ у собак и людей [15].

Таким образом, широкое изучение проблемы ЛБ у собак в России крайне важно не только с позиций ветеринарии, но и для успешной профилактики ЛБ человека.

Цель и задачи исследования. Целью проводимых исследований явилось изучение экологии и биологии иксодовых клещей в природных и урбанизированных территориях в условиях Вологодской области, проведение серологического скрининга животных на зараженность клещевыми инфекциями и усовершенствование методов диагностики клещевого боррелиоза у собак.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

- установить наличие антител к боррелиям, передающимися иксодовыми клещами у собак и крупного рогатого скота;

- изучить особенности клинического проявления ИКБ у собак;

- выяснить видовой состав иксодовых клещей, степень их сезонной активности и спонтанной инфицированное™ боррелиями и их видовой состав в условиях Вологодской области;

- изучить эпидемиологическую ситуацию по ИКБ на территории Вологодской области;

- совершенствовать методы диагностики ИКБ у собак.

Научная новизна. Впервые в Вологодской области изучена эпизоотическая ситуация и степень распространения иксодовых клещевых боррелиозов у собак. г I

Изучены клинико-гематологические показатели при ИКБ собак. Установлены маркеры данного заболевания. Впервые разработана математическая модель управления «двойным» маркером.

В условиях Вологодской области проведены исследования по определению видового состава иксодовых - клещей, с учетом их численности и сезонной активности. Определена спонтанная инфицированность иксодовых клещей возбудителями ИКБ. Определен видовой состав боррелий.

Впервые разработана тест-система для диагностики ИКБ у собак методом ИФА.

Теоретическая и практическая значимость. Материалы диссертации вносят существенный вклад в решение актуальной проблемы борьбы с природно-очаговыми заболеваниями, а в особенности с болезнями общими для человека и животных.

Материалы диссертации использованы при подготовке:

Основные положения, выносимые на защиту.

- Инфицированность возбудителями иксодовых клещевых боррелиозов собак и крупного рогатого скота на территории Вологодской области.

- Особенности клинического течения ИКБ у собак.

- Видовой состав иксодовых клещей в природных и урбанизированных территориях в условиях Вологодской области.

- Численность и активность иксодовых клещей.

- Спонтанная инфицированность иксодовых клещей и видовой состав спирохет p. Borrelia.

Совершенствование методов диагностики путем разработки иммуноферментной тест-системы для выявления суммарных антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов у собак.

- научной международной конференции «Современные проблемы — общей, медицинской и ветеринарной паразитологии», Витебск, 2004;

- международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных, Москва, 2004, 2007;

- научной международной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ,

ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», Санкт-Петербург, 2004, 2009;

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, одна из которых опубликована в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций («Ветеринария» № 11, 2004).

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Молотова, Надежда Владимировна

4. Нами разработана и внедрена в практику ветеринарных специалистов (через сеть ветеринарных клиник гг. Вологды и Череповца) «Памятка для владельцев собак» с целью профилактики ИКБ у собак.

4.1. Правила поведения в очагах ИКБ:

• Владельцы могут следить за территорией вокруг своих домов, регулярно обрабатывая ее инсектицидами и борясь с грызунами-вредителями.

• В местах, где встречаются клещи, идите посередине тропы, не сворачивайте с нее, собаку ведите рядом, не спуская с поводка.

• В лесу, а также после выхода из него, сразу же осмотрите животное. Будьте очень внимательны, потому что размеры клеща очень малы. Осмотры проводятся через каждые 2-3 часа, лучше всего — на хорошо освещенной солнцем сухой поляне. При выходе из леса проводите тщательный осмотр. При осмотре особое внимание обратите на складки кожи, ушные раковины, подмышечные и паховые области.

4.2. Акарициды и репелленты:

Собак можно защищать репеллентами от клещей и ежедневным грумингом. Для защиты животных от нападения клещей в мире выпускается большое количество акарицидных препаратов. По отзывам собаководов наиболее надежными на сегодняшний день являются такие средства против клещей как ошейник Kiltix (фирма Bayer) и спрей Frontline (фирма Merial, пр-ва Франции). Обратите внимание на то, чтобы ошейник был водостойким. Можно также обработать собаку спреем против клещей. При этом следует избегать попадания этих веществ на слизистую оболочку глаз, носа, рта у животного.

Дополнительно, в качестве "растительной добавки" к ошейнику против клещей Вы можете ежедневно добавлять в корм собаке дольку чеснока. Запах кожи собаки станет для клещей непривлекательным. Одинаковое действие окажут лавандовое, розмариновое или кедровое масло. Перед каждой прогулкой нанесите на шерсть собаки шприцем состав, подготовленный из расчета один пузырек масла на пол-литра воды. 4.3. Способы извлечения клеща: Внимание! Ни в коем случае:

• не пользуйтесь пинцетом при извлечении клеща;

• не капайте маслом на присосавшихся к собаке клещей;

• не смазывайте с помощью кисти лаком для ногтей; Так как:

1. Хоботок клеща вытягивается и еще глубже проникает в кожу животного, поэтому удалить его становиться сложнее.

2. При сдавливании, а также задыхаясь, клещ выделяет слюну, что увеличивает риск заражения.

Для сшггия с животного присосавшегося клеща необходимо обратиться в ветеринарную клинику или произвести это в домашних условиях, но обязательно в перчатках. Клеща необходимо как можно скорее удалить, стараясь не оторвать погруженный в кожу хоботок. Своевременное удаление присосавшихся клещей уменьшает вероятность передачи бактерий p. Borrelia собаке;

Прочную нитку как можно ближе к хоботку клеща завязывают в узел, и, растянув концы нитки в стороны, клеща извлекают, подтягивая его вверх; резкие движения при этом недопустимы;

Можно использовать специальные приспособления для удаления клещей, такие как «Ручка-Лассо» фирмы «Омникс», «Тиктвистер» (выкручиватель клещей).

Их преимущества:

1. не сдавливают тело клеща;

2. извлекают клеща целиком;

3. извлекают быстро, легко и без боли;

4. не требуется дополнительных приспособлений.

РУЧКА-ЛАССО

Инструкция по применению устройства «РУЧКА-ЛАССО»:

1, Раскройте петлю нажатием на зеленую кнопку и накиньте её на клеща как можно ближе к кожному покрову (см.рис. 1). Для удаления клеща малого размера прижмите наконечник как можно ближе к клещу (см. рис. 4) и легким нажатием на зеленую кнопку накиньте на него петлю.

2. Отпустите кнопку и расположите устройство перпендикулярно поверхности (см. рис. 2).

3. Прижмите зеленый наконечник к коже и поверните устройство вокруг своей оси один раз (см. рис. 3).

4, Удалите клеща перемещением устройства вертикально вверх (от кожи), продезинфицируйте место укуса.

ТИКТВИСТЕР (вы кру ч и вател ь клещей)

Штттмйр

Uniclean Tick Twister - специальное приспособление, разработанное для удаления паразитных клещей из кожи животных и людей.

Удаление клещей с Uniclean Tick TWisten 1) Выбрать крючок, соответствую щии размеру клеща.

2) Взять крючок, приблизиться к клещу с плоской стороны тела. Подцепить клеща в прорезь крючка до тех пор, пока клещ не будет поддерживаться крючком.

3) Слегка приподнять крючок и повернуть его на 2-3 оборота (эффект вворачивания или отвинчивания).

В комплект входит: 2 крючка Uniciean Tick Twister: один большой и один маленький (для больших и маленьких клещей).

В случае отрыва головки клеща (случайно или во время его удаления), которая обычно остается в коже и имеет вид черной точки, место присасывания протирают влажной, смоченной спиртом ватой или бинтом, и головку удаляют, как занозу, стерильной иглой (предварительно прокаленной на огне). После снятия клеща ранку на теле животного тщательно дезинфицируют.

Клещей, извлеченных с животного, необходимо поместить во флакон или пробирку с пробкой и доставить в отделение диагностики вирусных инфекций базовой микробиологической лаборатории центра Госсанэпиднадзора в Вологодской области.

Заключение

На территории области проведен анализ распространения возбудителей болезней передающихся иксодовыми клещами у собак. Впервые в Вологодской области у собак выявлен иксодовый клещевой боррелиоз с экстенсивностью инфекции 14,42 ± 3.44% и методом ПЦР установлена циркуляция двух геновидов возбудителей ИКБ: B.garinii, B.afselii. В связи с тем, что заболеваемость собак является индикатором возможности заболевания людей ИКБ, территорию Вологодской области можно считать, как регион со средним уровнем риска заражения людей.

С целью выявления участия крупного рогатого скота в циркуляции возбудителей боррелиозов, как животных находящихся длительно в природных условиях, были проведены исследования методом РНИФ на предмет инфицированности их возбудителем ИКБ. Установлена инфицированность крупного рогатого скота возбудителями ИКБ, которая составила в апреле и ноябре соответственно 13,88 ± 4,07% и 27,77 ± 5,27% от числа обследованных. Полученные результаты показали, что животные к концу пастбищного периода имеют максимальную экстенсинфицированность, титры антител против боррелий сохраняются до весны. Полученные результаты позволяют рассматривать крупный рогатый скот, как один из дополнительных резервуаров ИКБ в природных очагах.

Необходимо отметить, что в России диагностика ИКБ у домашних животных не принята ветеринарной практикой, хотя достаточно давно уже известно в мире, что животные являются опосредованно источниками возбудителей ИКБ для человека и животных.

При изучении эпидемиологической ситуации у людей по ИКБ выяснили, что за 1999-2007 гг. иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) составил от 61,2 до 83,8% в структуре природно-очаговых инфекций регистрируемых на территории Вологодской области. Показатель заболеваемости людей ИКБ с 1998 года по 2007 гг. варьировал и составлял соответственно 19,4-28,82%, что в последнем случае выше среднероссийского в 5,7 раза.

Приведенные данные показали, что ЛБ представляет собой одну из актуальных проблем современной инфекционной патологии и паразитологии в Вологодской области.

При изучении видового состава иксодовых клещей установили, что на территории области встречаются следующие виды:

- I. persulcatus (таежный клещ) — он имеет первостепенное эпидемиологическое и эпизоотологическое значение, активен с апреля по август;

- I. ricinus (европейский лесной клещ) — активен с апреля по сентябрь, встречается реже, и как переносчик менее значим, чем первый; Наши исследования показали, что на исследуемых территориях I.ricinus встречается, намного реже, чем I. persulcatus.

- I. apronophorus — вид клеща нападающий на грызунов, но преимущественно на водяную полевку. При ИКБ не имеет значения.

- Dermacenter pictus — встречается в лесах, особенно расположенных около водоемов; прокормителями являются грызуны и насекомоядные, домашние и дикие животные; активен в мае и осенью, эпизоотологического значения по иксодовому клещевому боррелиозу не имеет. Он является переносчиком бабезиоза.

Выяснили, что иксодиды проявляют наибольшую активность в мае — июне (р < 0,05). В остальном, сезонный ход активности клещей имел типичное течение: вслед за высокой численностью клещей в июне происходило медленное снижение их активности до первой декады сентября. Погодовая динамика спонтанной инфицированности клещей возбудителями ИКБ варьировала незначительно и в среднем составила 14,8 ±2,02 %.

К способствующим факторам двигательной активности и интенсивности заражения клещей, особенно в г. Череповце, относится техногенное загрязнение. Максимальное количество измененных клещей обнаружено в районе Череповецкого металлургического комбината (Дубинина Н. В. 2003г.). По нашему мнению, расширению ареала и росту популяции клещей также способствует и увеличение посещений людьми и животными мест природного обитания и распространения клещей. Остатки продуктов после посещения леса отдыхающими, наличие сухостоя и валежника, создают благоприятные условия для жизни диких млекопитающих - прокормителей иксодовых клещей.

В результате кросстабуляционного анализа получили статистически значимую зависимость (р<0,05) между количеством клещей в активном состоянии и температурой, а также влажностью в течение вегетационного периода (изолированного периода). Просматривается четкая периодичность корреляционного ряда в 12 единиц — это свидетельствует о том, что периодические колебания численности иксодовых клещей определяют закономерно повторяющиеся, с периодом в год, изменения погодных условий.

Установили, что достаточно значимые колебания численности клещей - переносчиков в природных очагах практически не сказывается на уровне их спонтанной инфицированности.

Определили, что численность клещей на стационаре коррелирует с таковой на других участках (р<0,05). Хотя участки, на которых производили сбор клещей, различаются по составу растительности и степени посещаемости населения. По-видимому, это можно связать с существенными экологическими изменениями, вызванными антропогенным воздействием на природные очаги.

В последнее время клещи имеют стойкую тенденцию к распространению на урбанизированных территориях и объектом нападения часто бывают собаки и кошки. Количество нападений клещей на животных в разные месяцы варьировало с пиком в мае - июне и коррелировало с таковым у людей.

Полученные результаты позволили заключить, что в весенне-осенний период собаки и кошки, интенсивнее, чем люди, подвергаются нападениям клещей. Вероятность контактов с клещами, соответственно и присасываний, у этих животных очень велика вследствие таких факторов, как размеры (соответствуют ярусу концентрации на растительности активных взрослых клещей и нимф), наличие шерстного покрова, подвижность, обеспечивающая возможность контактов с клещами на обширных территориях.

При изучении вопроса по диагностике ИКБ у животных в Вологодской области выяснили, что по данным Госветотчетности ИКБ у животных в Вологодской области не регистрируется. Диагностика клещевого боррелиоза в Областной ветлаборатории не ведется. В РФ отсутствуют отечественные тест- системы для диагностики ИКБ у животных.

Установили, что решение проблемы диагностики ИКБ у животных, в частности, у собак, с помощью серологических методов является перспективным направлением, которое значительно ускоряет и облегчает постановку диагноза, в связи со значительным полиморфизмом клинических проявлений при ИКБ и разнообразным характером течения болезни. Последнее практически исключает возможность постановки диагноза только на основании клинической картины, в связи, с чем основное значение приобретают лабораторные иммунологические методы.

При проведении исследований сывороток крови у собак методом РНИФ на ИКБ выявили суммарные антитела к антигену в 10 (58,82% ±11,93) пробах крови. При повторном обследовании животных в динамике через четыре недели результаты оставались неизменными. Отсутствие антител у собак, которые подверглись укусам клещей можно объяснить тем, что, несмотря на присутствие в клеще боррелий заражение не произошло, что согласуется с литературными данными. Клещ приобретает инфицирующую способность только после того, как боррелии проникнут через гемолимфу в слюнные железы [52].

В настоящий период, несмотря на высокую чувствительность и специфичность, недостатком РНИФ является субъективность при чтении реакции. Выбор нами ИФА в качестве усовершенствования серологической диагностики ИКБ у собак связан, несомненно, с преимуществами иммуноферментного анализа: быстроты, объективности за счет автоматизации учета результатов.

Нами разработана и внедрена иммуноферментная тест-система для выявления суммарных антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов у собак на основе рекомбинантного антигена, содержащего белки молекулярной массы 66, 31, 34, 39, 41,18 кДа.

Тест-система успешно прошла апробацию и сравнение с коммерческой тест-системой «Anti-Borrelia plus VlsE ELISA» набор Euroimmune (Германия), набор для выявления IgG на основе VlsE домена (это рекомбинантный белок боррелии с молекулярной массой 34 кДа) с добавлением цельноклеточного штамма В.burgdorferi. Полученные данные показали высокую корреляцию результатов анализов и позволяют рекомендовать данную тест-систему для диагностики ИКБ в ветеринарии у собак.

При изучении симптоматики при ИКБ у собак установлено, что среди положительных животных в ИФА и РНИФ по боррелиозу регистрировались различные первичные диагнозы и клинические состояния. Анализ данных показал, что при ИКБ у собак такие клинические состояния, как угнетенное состояние, потеря аппетита, повышение температуры тела, болезненность лимфоузлов, учащенное дыхание, позднее боль в мышцах, хромота регистрируются чаще (55,55 - 33,33%) в сравнении с другими первичными диагнозами. Добавим, что подострое течение гемопаразитозов и проявление ранних симптомов ИКБ могут быть схожи. В связи с этим считаем, что при регистрации у животного выше указанной симптоматики после прогулок в природных массивах, тем более, если оно подверглось покусам клещей, является в первую очередь показанием к обследованию на гемопаразитозы бабезиоз и риккетсиозы методом окраски мазков по Романовскому-Гимза), проведение симптоматической терапии. В случае не подтверждения гемопаразитозов рекомендуем провести преждевременную антибиотикотерапию препаратами тетрациклинового ряда, т. к. ранняя диагностика по ИФА не дает результатов (антитела появляются спустя несколько месяцев). Обследование методом ИФА рекомендуется для контроля лечения, для массовых серологических исследований, для животных с проградиентным течением ИКБ (давшим клинику спустя несколько месяцев после инфицирования).

Выявили, что при ИКБ у собак в крови происходит изменение гематологических показателей свидетельствующих об изменениях со стороны неспецифических показателей воспаления — таких, как СОЭ и лейкоцитов (эозинофилов), которые указывают на заболевание всего организма с выраженными изменениями гомеостаза.

Увеличение числа эозинофилов в крови - симптом, характерный для аллергических реакций и некоторых паразитарных болезней. В отношении ИКБ собак можно сказать, что при данной болезни в организме отмечается полиморфизм клинических проявлений. К ранним поражениям можно отнести воспалительно-аллергические изменения кожи в месте присасывания клеща, слабо выраженный синдром общей интоксикации. К поздним — мигрирующие артриты и полиартриты, хронические артриты, что вероятно и в первом и во втором случае обуславливает увеличение числа эозинофилов в крови и имеет некоторую диагностическую значимость при на разных стадиях ИКБ собак.

Установленное повышенное СОЭ считаем высокочувствительным, но не специфическим тестом, указывающим на активно протекающий воспалительный процесс. Оно характерно для инфекционно-воспалительных заболеваний диффузных болезней соединительной ткани, что типично для ИКБ.

Из полученных результатов биохимического анализа крови собак выявили, что у инфицированных возбудителем ИКБ животных регистрировались в определенных случаях повышение следующих показателей: альфа-1, гамма, а-амилаза, общий билирубин, но взаимодействие между положительными показателями ИФА и выше указанными показателями статистически незначимо (р<0,1), поэтому маркерами по ИКБ считать их не можем.

Статистически значимы от нормы повышены показатели мочевины в среднем 175,33 ммоль/л (р < 0,05) и креатинина (рис.23) 20,48 мкмоль/л (р < 0,05). Необходимо отметить, что достоверное повышение показателей мочевины и креатина подтвердили при расчетах индикации информативности: р-уровней Хи-квадрат и дисперсионного анализа (р < 0,05), частотного показателя (мочевина - 0,72; креатинин. — 0,47), коэффициента корреляции (мочевина - 0,51; креатинин — 0,2). Полученные данные при статобработке указывают на то, что эти показатели правомерно могут служить маркерами ИКБ у собак.

Следует отметить, что наиболее информативны (уровень доверия по некоторым показателям выше — коэффициент корреляции и частотный показатель) сдвиги по показателям мочевины, что дает право считать повышение мочевины ведущим показателем при диагностике ИКБ у собак.

При признании показателей «мочевина» и «креатинин» маркерами на реакцию по ИФА в дальнейшей работе выяснили, что они могут служить «коллективным» маркером, т. е агентом маркера в этом случае служит не одно значение одного фактора, а упорядоченная пара значений двух факторов.

Учитывая вышеизложенное, разработали математическую модель управления двойным маркером, которая заключается в следующем:

За критическое значение ИФА приняли 0,23, т. е. для ИФА > 0,23 реакция считается положительной и ИФА < 0,23 реакция считается отрицательной. Предположили, что некоторая поверхность ИФА= F мочевина, креатинин) приближает исследуемые данные. Тогда F (мочевина, креатинин) = 0,23 — сечение этой поверхности, представляющее на плоскости мочевина-креатинин линию (сепаратрису), по одну сторону которой точки соответствуют положительной реакцией по ИФА, по другую — отрицательной реакции. Составляем уравнение поверхности и линии-сепаратрисы. Строим на диаграмме сепаратрису (на диаграмме отмечаем кранными точками). В соответствии с ситуационной задачей, пусть у некоторого объекта исследований известны одновременно значения двух факторов «мочевина» и «креатинин». Изображаем соответствующую точку (мочевина, креатинин) на плоскости диаграммы; если точка попадает справа от критической границы - сепаратрисы, объект подозрителен на положительную реакцию по ИФА, следует провести дополнительные исследования (шансов на положительную реакцию около 56%), если слева от границы, - проводить дополнительные исследования не нужно (шансов на положительную реакцию около 2,5%). Проценты приведены для конкретной обрабатываемой выборки. Как определить, куда попадает точка (мочевина, креатинин) по значениям факторов и известному уравнению критической линии — сепаратрисы? Подставляем в уравнение сепаратрисы значения «мочевина» «креатинин» и если результат положителен, - точка лежит справа от сепаратрисы, если слева — отрицателен, если ноль, то точка попадает в точности на сепаратрису. Так работает коллективный (парный) маркер.

Повышение уровня показателей мочевины и креатинина при ИКБ у собак указывает на развитие почечной недостаточности с синдромом уремии (интоксикации) и нарушением клубочковой фильтрации.

Таким образом, проведенные исследования указывают на инфицированность животных, в частности собак и крупного рогатого скота, возбудителями иксодовых клещевых боррелиозов, в связи, с чем повышается опосредованно риск заражения людей ИКБ. Причины ухудшения эпизоотолого-эпидемиологичской обстановки по ИКБ являются отсутствие диагностики ИКБ у домашних животных в ветеринарной практике. К основным причинам незаинтересованности ветеринарных специалистов к диагностике ИКБ можно отнести недостаточное оснащение лабораторий и низкую подготовку специалистов по данному вопросу. Это обусловливает внедрение новых специфических мер контроля над эпизоотологической ситуацией и диагностики иксодовых клещевых боррелиозов животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата ветеринарных наук, Молотова, Надежда Владимировна, Вологда

1. Акимов И. А., Небогаткин И. В. Видовой состав иксодовых клещей (Acarina, 1.odidae) Украины //Вестн. зоологии. — 2002. — 37, № 3. — С. 75-77.

2. Акимов И.А., Небогаткин И.В. Обнаружение Borrelia burgdorferi на территории г. Киева и его окрестностях// Вестник зоологии, 2001. Т. 35, №. 3., с. 14-18.

3. Ананьева Л.П. Лайм-боррелиоз или иксодовые клещевые боррлеиоза. Часть 1. Этиология, клиника, диагностика. Инфекции и антимикробная терапия, 2002, том 4, N 2, с.42-45.

4. Ананьева Л.П. Лаймская болезнь // В кн. Руководство по внутренним болезням. Ревматические болезни. М.: Медицина, 1997. -С. 344-352.

5. Антыкова Л.П., Вершинский Б.В., Пызина Л.В. Мониторинг очагов клещевого энцефалита и клещевого боррелиоза Лайм// В сб. «Экологический мониторинг паразитов». Санкт-Петербург, 1997.-С. 18-19.

6. Ашаткин А.Ф., Васильев А.В., Санин А.В. Гемобартонеллез // Справочник. М., 1998. - 255 с.

7. Балашов Ю.С. Иксодовые клещи — паразиты и переносчики инфекций. Л.: Наука, 1998. - 287 с.

8. Балашов Ю.С. Кровососущие клещи (Ixodoidea) — переносчики болезней человека и животных— Л., Наука, 1967 — 320 с.

9. Балашов Ю.С., Амосова Л.И., Григорьева Л.А. Трасвориальная и трансфазовая передача боррелий таёжным клещам Ixodes persulcatus (Ixodidae)// Паразитология, 1998, том 32, № 6, С. 112-121.

10. Балашов Ю.С., Григорьева Л.А., Оливер Дж.Х. 1967. Локализация боррелий в организме клеща Ixodes persulcatus на разных стадиях развития // Паразитология. Т. 31, вып. 2. С. 97-103.

11. Белименко В. В. Бабезиоз собак в Оренбургской и Московской областях : диссертация . канд. биол. наук. — М., 2008. — 141 с.

12. Бобкова О. О. Фауна ектопаразит1в кажашв Подшля // Вестн. зоологии. — 2002. — 36, № 2. — С. 77-81.

13. Буракова О.В. и др. 1999. Обнаружение спирохет Borrelia burgdorferi у мух-кровососок Lipoptena cervi L. (Diptera). РЭТ-инфо, № 3 стр.14-19.

14. Васильев И. К., Фурман И. М., Шелапутина И. А., Зипкина Т. С., Богаутдинова Т. В., Федорченко О. А., Санин А. В. Бабезиоз собак — новый подход к лечению // Ветеринарная клиника, 2003, май, с. 6 — 9.

15. Васильева И.С. Ришина Н. А. Заболевание собак Лайм-боррелиозом и их роль в поддержании природных очагов инфекций// РЭТ-инфо, 2003, №3, с. 10-14.

16. Васильева И.С., Наумов Р.Л. Паразитарная система болезни Лайма, состояние вопроса. Сообщение 1. Возбудители и переносчики // Acarina. 1996.Vol.4. № 1-2. Р.53-75.

17. Гаскелл Р.Н., Беннет М. Инфекционная анемия кошек (Гемобартонеллез) // Справочник по инфекционным болезням собак и кошек. М., 1999. 224 с.

18. Горелова Н. Б., Ковалевский Ю.В., Коренберг Э.И., Постик Д. 1999. Зараженность клеща Ixodes trianguliceps различными геновидами боррелий в приуралье.// VIII Акарол. Совещ. СПб., с.21-22.

19. Григорьева Л. А. Морфофизиологические изменения в организме питающихся клещей иксодин (IXODINAE), взаимодействие клещей с организмом хозяина и патогенами. Автореф. дис. доктора биол. наук. СПб. 2007. 39с.

20. Давыдова Н.С., Харитоненков И.Г., Бурлаков В.А. 1999 Серологическая диагностика Болезни Лайма у собак.// Материалы «Седьмого международного конгресса по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных». Москва, 3-5 марта. С. 292-294.

21. Доспехов Б.А. Планирование полевого опыта и статистическая обработка данных. М.: Колос, 1972. - 215 с.

22. Дубинина Е. В., Алексеев А. Н. Динамика биоразнообразия возбудителей болезней переносимых клещами рода Ixodes: анализ многолетних данных// Мед. паразитол., 1999, № 2, с. 13—19.

23. Дьяконов JI. П. Роль неспецифических хозяев в поддержании пироплазмидозных очагов. // Бюлл. Всес. инст. экспер. ветерин. 1974. № 18. С. 15-18.

24. Информационный сборник статистических и аналитических материалов. Часть 2. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации в 2001-2002 гг. М.: ФЦ ГСЭН, 2003. - С. 167.

25. Коренберг Э. И. Ковалевский Ю. В., Кузнецова Р. И. и др. 1988. Выявление и первые результаты изучения болезни Лайма на Северо-западе СССР//Мед. паразитол. №1 С. 111-113.

26. Коренберг Э. И. Природная очаговость болезней: Исследования института Гамалея РАМН. М.: Русаки, 2003. - С. 99-121.

27. ЗГКоренберг Э. И. Эрлихиозы — новая для России проблема инфекционной патологии// Мед. паразитол., 1999, № 4., с. 10-16.

28. Коренберг Э.И. // Медицинская паразитология. 1996. - № 3. - С. 14-18.

29. Коренберг Э.И. Взаимоотношения возбудителей трансмиссивных болезней в микстинфицированных иксодовых клещах (Ixodidae) // Паразитология. 1999. Т. 33, вып. 4. С. 273-289.

30. Коренберг Э.И. Иксодовые клещевые боррелиозы: основные итоги изучения и профилактики в России // Материалы научно-практической конференции «Клещевые боррелиозы». — Ижевск, 2002. — С. 165-172.

31. Коренберг ЭИ. Иксодовые клещевые боррелиозы как группа заболеваний человека и главные итоги ее изучения в России// Журнал инфекционной патологии, 1996.- Т.З.-4.- с.22-24.

32. Коротков Ю.С., Никитин А .Я., Антонова A.M., и др. Временная структура численности таежного клеща в пригородной зоне Иркутска // Бюлл. восточно- сибирского НЦ СО РАМН. 2007. Т.55, № 3. С. 126-130.

33. Крылов М. В. Определитель паразитических простейших. // Санкт-Петербург: Наука, 1996.

34. Крылов М. В. Пироплазмиды. // Ленинград: Наука, 1981. С. 62-63, 146-148.

35. Лебедева В. Л. Пироплазмоз собак. // Докл. 5 Всес. съезда протозоологов. / Витебск, 1992. № 4. С. 85.

36. Лобзин Ю.В., Рахманова А.Г., Усков А.Н. Эпидемиология, этиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика иксодовых клещевых боррелиозов // Методические рекомендации для врачей. СПб, 2000.- 63 с.

37. Лобзин Ю.В., Усков А.Н., Козлов С.С. Лайм-Боррелиоз (иксодовые клещевые боррелиозы).- СПб.: Фолиант, 2000.-155с.

38. Лукин Е. П., Грабарев П. А. Экологические аспекты патогенных для человека эрлихий и бартонелл// Мед. паразитол., 2000., №4, с. 17-22.

39. Манзенюк И.Н., Манзенюк О.Ю. Клещевые боррелиозы (болезнь Лайма). -Кольцово, 2005. 85 с.

40. МУ. 3.1.1027-01. Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих — переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекции. МЗ РФ. М., 2001

41. Наумов Р.Д., Гутова В.П. Привлечение таежных клещей запахом шерсти хозяина в природе // Мед. паразитол. 1992. № 5-6. С. 50-53.

42. Никитина Р. Е. Спирохеты птиц в клещах-переносчиках и механизм их передачи // Узб. биол. журн. 1968. № 5. С. 51—54.

43. Новикова Т.В., Молотова Н.В., Рыбакова Н.А., Филоненко И.В., Чубарова Т.В., Щустрова М.В. Экология иксодовых клещей и эпизоотология передаваемых ими заболеваний //Журнал Ветеринария-2004.-№ 11.-С.32-34.

44. Павловский Е.Н., Скрынник А.Н. 1945. О продолжительности сохранения самкой клеща Ornithodorus papillipes способности передавать клещевой возвратный тиф // Зоол. журн. Т. 24, №З.С. 161-16

45. Померанцев Б.И, Иксодовые клещи (Ixodinae). Фауна СССР. Паукообразные, IV(2), Москва-Ленинград, 1950. 223 с.

46. Пустовит Н. С. Иксодовые клещевые боррелиозы (болезнь Лайма) у собак / Дис. . канд. биол. наук. М. 2003. 154с.

47. Пустовит Н.С. 2001. Сезонная динамика и клинические проявления болезни Лайма у собак Московской области.// Материалы «Девятого Московского международного ветеринарного конгресса». Москва, 12-14 апреля. С.239-240.

48. Пустовит Н.С. Иксодовые клещевые боррелиозы (болезнь Лайма) у собак / Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 2003. 25с.

49. Санин, А.В. Бабезиоз собак новое решение старой проблемы / А.В. Санин, И.К. Васильев // Зооиндустрия. - 2007. - № 7. - С. 19.

50. Сердюкова Г.В. Иксодовые клещи фауны СССР. М.: изд - во АН СССР, 1956.-121с.

51. Уркхарт Г.М., Дж. Эрмур, Дж. Дункан Ветеринарная паразитология //М.: Аквариум ЛТД, 2000.- 352с.

52. Филиппова Н. А. 1990. Таксономические аспекты переноса возбудителей болезни Лайма.// Паразитология. 24(4):257-267.

53. Филиппова Н. А. Иксодовые клещи подсем. Amblyomminae. Санкт-Петербург: Наука. 1997. 436 с. (в серии "Виды фауны СССР и сопредельных стран").

54. Филиппова Н.А. Иксодовые клещи подсем. Ixodinae. Фауна СССР. Паукообразные, том IV(4). Ленинград «Наука», 1977. 395 с.

55. Филоненко И.В. Экологические аспекты функционирования природных очагов болезней на территории Вологодской области / Автореф. дис.канд. биол. наук. Ярославль, 2003. 20с.

56. Хейсин Е. М. Некоторые данные о строении Piroplasma bigemina и Piroplasma canis // Паразитология. 1968. Т. 2., № 1. С. 77-82.

57. Шубина А.В. Животные в городе: взаимодействие природного и социального. Материалы научно-практической конференции «Животные в городе». М, 2000., с. 133 138.

58. Aberer E., Kersten A., Klade H., Poitschek C., Jurecka W. 1996. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi in the skin // Am. J. Dermathopathol. Vol. 18, No. 6. P. 571-579.

59. Adam Т., Gossmann G.S., Rasiah C. et al. // Infect. Immunol. 1991. -Vol. 59.-P. 2579-2585.

60. Afzelius A. // Arch. Dermatol. Syph. 1910. - Vol. 101. - S. 403-404.

61. Akov S: Blood digestion in ticks. Oxford: Pergamon Press; 1982.

62. Alban P.S., Johnson P.W., Nelson D.R. 2000. Serum-starvationinduced changes in protein synthesis and morphology of Borrelia burgdorferi II Microbiol. Vol. 146. Pt. l.P. 119-127.

63. Alban P.S., Nelson D.R. 1999. Serum-starvation-induced cyst formation in Borrelia burgdorferi under defined conditions // Intern. Conf. on Lyme disease in Munich, Germany. June 20-24, 1999. Abst. book. P. 37.

64. Alekseev A. N., Dubinina H.V. Bloodsucking arthropods: the danger for travellers and hazard vector traveling. Wiad Parazytol., 2001 vol.47, no. 1., p.33-37.

65. Anderson J.F., Johnson R.C., Magnarelli L.A. et al. // Infect. Immunol. 1986.-Vol. 51.-P. 394-396.

66. Angelov L.L., Arnaudov D.A. et.al. 1996. Epidemiology of Dermacentor marginatus-borne Lyme borreliosis.// VII Int. Congr. Lyme Borreliosis. San. Francisco. California. Abstracts. P.110.

67. Appel M.J., Allan S., Jacobson R.H. et al. Experimental Lyme disease in dogs produces arthritis and persistent infection // J. Infect. Dis. 1993. Vol.167. №3. P.651-654.

68. Azuma Y., Kawamura K. et al. 1993. Neurologic abnormalities in two dogs suspected Lyme disease.// Microbiol. Immunol., 37(4), 325-329.

69. Baird AG, Gillies JCM, Bone FJ, Dale BAS, Miscampbell NT. Prevalence of antibody indicating Lyme disease in farmers in Wigtownshire. Brit Med J 1989;299: 836-37.

70. Balmelli Т., Piffaretti J.C. // Res. Microbiol. 1995. - Vol. 146. - P. 329-340.

71. Baranton G., Marti Ras N., Postic D. // Ann. Med. Interne (Paris). -1998. Vol. 149. - P. 455^158.

72. Barbour A.G., Fish D. //Science.- 1993. -Vol. 260. -P. 1610-1616.

73. Bauerfeind R., Kreis U., Weiss R. et al. Detection of Borrelia burgdorferi in urine specimens from dogs by a nested polymerase chain reaction // Zent.bl. Bakteriol. 1998. Vol. 287. №4. P.347-361.

74. Bellet-Edimo R., Gem L. Betschan B. Frequency and efficiency of transovarial transmission of Boirelia burg-dorferi in Ixodes ricinus / VII Intern, congr. Lyme borreliosis. San Francisco, 1996. P. 39.

75. Bennett C.E. //Adv. Parasitol. 1995. -Vol. 36.-P. 343-405.

76. Berglund J., Eitrem R., Ornstein K. et al. // N. Engl. J. Med. 1995. -Vol. 333.-P. 1319-1327.

77. Blowey R. W., Carter S. D., White A. G. & Barnes A. (1994) Borrelia burgdorferi infections in UK cattle: a possible association with digital dermatitis. Veterinary Record 135, 577-578.

78. Bosler E., Cohen D. et al.1990. Host responses to Borrelia burgdorferi in dogs and horses.// Ann NY Acad Sci:221234.

79. Bosler EM, Schulze TL. The prevalence and significance of Borrelia burgdorferi in the urine of feral reservoir animals. Zbl Bakt Mikrob Hyg AJ 1986;263:40-4.

80. Boujan C.E., Scharer V., Bestetti G.E. Haemobartonellen Nachwesin Katzenblutausstrich // Schweiz Arch. Tierherld. 1991. H. 133. № 3. p. 153-156.

81. Breitschwerdt, E. В., Hegarty. В. C. Hancock. S. I. Sequential evaluation of dogs naturally infected with Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis,

82. Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii or Bartonella vinsonii. Journal of Clinical Microbiology 1998; 36: 2645—2651.

83. Brorson 0., Brorson S.H. 1997. Transformation of cystic forms of Borrelia burgdorferi to normal, mobile spirochetes// Infection. Vol. 25. P. 240246.

84. Brunet I.R., Spielman A., Telford III S.R. // Am. J. Trop. Med. Hyg. -1995. Vol. 53. - P. 300-302.

85. Burgdorfer W. Analyse des Infectionsverlaufer bei Omithodorus moubata und der naturlichen Ubertragung von Spirochaeta duttoni. // Acta Tropica, 1951, vol. 8, N 3.- P. 193—262.

86. Burgdorfer W., Anderson J.E., et.al. 1991. Relationship of borrelia burgdorferi to its arthropod vectors.// Scand.J.Infect.Dis.Suppl. 77:35-40.

87. Burgdorfer W., Barbour A.G., Hayes S.F. et al. Lyme disease a tick-borne spirochetosis? // Science. - 1982. - Vol. 216. - P. 1317-1319.

88. Burgess E, Gillette D, Pickett JP. Arthritis and panuveitis as manifestations of Borrelia burgdorferi infection in a Wisconsin pony. J Am Vet Med Assoc 1986; 189: 1340-42.

89. Burgess E. C. (1988) Borrelia burgdorferi infection in Wisconsin horses and cows. Annals of the New York Academy of Sciences 539,235-243

90. Burgess E. C., Gendron-Fitzpatrick A. & Wright W. O. (1987) Arthritis and systemic disease caused by Borrelia burgdorferi infection in a cow. Journal of the American Veterinary Medical Association 191,1468-1470

91. Burgess E.C. Experimental inoculation of dogs with Borrelia burgdorferi.// Zbl. Bakteriol., Mikrobiol. und Hyg. 1986. Vol. A263. P.49-54.

92. Burgess EC, Schneider E. Testing for Borrelia burgdorferi. J Am Vet Med Assoc 1989;195:844-46.

93. Burgess EC. Natural exposure of Wisconsin dogs to the Lyme disease spirochete (Borrelia burgdorferi). Lab Anim Sci 1986;36:288-90.

94. Bushmich SL, Post JE. Lyme disease update for veterinarians. Cooperative Extension Publication #89-31, Spring 1989; The University of Connecticut, Storrs, Ct.

95. Callister S., Jobe D. et al. 1996. Sensitivity and specificity of the borreliacidal-antibody test during early Lyme disease: a "gold standard"// Clin. Diagn. Lab. Immun. 3:399-402.

96. Centers for Disease Control and Prevention . Recomendations for test performance and interpretation from the Second National Conference on Serologic Diagnosis of Lyme disease.// MMWR Morb. Mortal.Wkly Rep, 1995.-v.44.-p. 590-591.

97. Chang Y., Appel M., Jacobson R., Shin S., et al. 1995. Recombinant OspA Protects Dogs against infection and disease caused by Borrelia burgdorferi.//J. Infect.Immun. 63(9):3543-3549.

98. Chang Y.-F., Novosel V., Chang C.-F., Kim J.B., Shin S.L., Lein D.H. Detection human granulocytic ehrlichiosis agent and Borrelia burgdorferi in ticks by polymerase chain reaction. J. Vet. Diagn. Invest., 1998, vol.10, p.56- 59.

99. Clark A. M. Hopkins, G. F, Maclean, 1. A. Tick borne fever in dogs. Veterinary Record 1996:137:268.

100. Correa W. M. Babesiose canina: transmissao transplacentaria. // Biologico. Brasil., 1974, v. 11, p. 321-322.

101. Daniel M., Cerny, V. Occurrence the tick Ixodes ricinus (L.) under the conditions antropopressure. Folia parasitoligica, 1990, vol. 37, no.2, p. 183-186.

102. Daniels Т., Fish D. et al. 1993. Canine exposure to Borrelia burgdorferi and prevalence of Ixodes damini on deer as a measure of Lyme disease risk in Northeastern United States.// J. Med. Entomol. 30:171-178.

103. Daniels T.J., Falco R.C., Schwartz I., Varde S., Robbins R.G. Deer tick (Ixodes scapularis) and the agents Lyme disease and human granulocytic ehrlichiosis in a New York City park. Emerging Infectious Diseases, 1997, vol.3, p. 353-355.

104. Daniels T.J., Fish D., Levine J.F. et al. Canine exposure to Borrelia burgdorferi and prevalence of Ixodes dammini risk in the northeastern United States. //J. Med. Entomol. 1993. Vol.30. № 1. P. 171-178.

105. Egenvall A., Lilliehook. L. Bjoersdorff. A., et al. Detection of granulocytic Ehrlichia species DNA by PCR in persistently infected dogs. Veterinary Record 2000); 146: 186-190.

106. Eng Т., M.Wilson, et al.1988. Greater risk of Borrelia burgdorferi infection in dogs than in people.// J. Inf. Dis. 158:1410-1411.

107. Fahrimal Y., G f W.L., Jasmer D.P. Detection Babesia bovis carrier cattle by using polymerase chain reaction amplification parasite DNA. J. Clin. Microbiol., 1992, vol. 30, p. 2091-2096.

108. Falco R., H.D. Smith et al. 1993. The distribution of canine exposure to Borrelia burgdorferi in a Lyme disease endemic area. // Am. J. Publ. Health. 83:1305-1310.

109. Frank J.C. Taking a hard look at Borrelia burgdorferi. J Am Vet Med Assoc 1989-194:1521.

110. Garcia-Monco J.C., Benach J.I. 1997. Mechanism of injury in Lyme neuroborreliosis.// Sem. Neurol. 17:57-62.

111. Gern L et al. (1998). European reservoir hosts of Borrelia burgdorferi sensu lato. Zentralblatt fiXr Bakteriologie: International Journal of Medical Microbiology, 287:196-204.

112. Girschick H.J., Huppertz H.I. et al. 1996. Intracellular persistence of Borrelia burgdorferi in human synovial cells.// Reumatol. Int. 16:125-132.

113. Golightly M.G, Thomas JA, Viciana AL. The laboratory diagnosis of Lyme Borreliosis. Lab Med 1990;21:299-304.

114. Golightly M.G. Lyme borreliosis: Laboratory considerations // Seminars in Neurology. -1997.-v. 17.-N1 .-p. 11 -17.

115. Goossens H.A., van den Bogard A.E., Nohlmans M.K. Dogs as sentinels for human Lyme borreliosis in the Netherlands. // J.Clin. Microbiol. 2001. Vol.39. №3. P.844-848. и др.

116. Grauer G., Burgess A. et al. 1988. Renal lesions associated with Lyme borreliosis in a dog. J. Am. Vet. Med. Assoc. 193:237-239.

117. Gray J.S., Kahl O., Janetzki-Mittman C., Stein J., Guy E. Acquisition Borrelia burgdorferi by Ixodes ricinus ticks fed on the European hedgehog, Erinaceus europaeus L. Exp. Appl. Acarol, 1994, vol 18, p. 485-491.

118. Greene R. 1990. An update on the serodiagnosis of canine Lyme Borreliosis.// J Vet Intern Med 4:167-171.

119. Guy E.C., Robertson J.N., Cimmino M. et al. // Zentral. Bacteriol. — 1998. Vol. 287. - P. 241-247.

120. Halouzka J., Postic D., Hubalek Z. // Med. Vet. Entomol. 1998. - Vol. 12.-P. 103-105.

121. Harrus, S.3 Kass, P. H., Klement, E., Waner, T. Canine monocytic ehrlichiosis: A retrospective study of 100 cases, and an epidemiological investigation of prognostic factors for the disease. Veterinary Record 1997; 141: 360-363.

122. Harrus. S. Waner, T. Bark. H. et al. Recent advances in determining the pathogenesis of canine monocytic ehrlichiosis. Journal of Clinical Microbiology 1999; 37: 2745—2749.

123. Herxheimer K., Hartmann K. // Arch. Dermatol. (Berlin). 1902. -Vol. 61. -S. 57-76.

124. Higgins J.A., Azad A.F. Use polymerase chain reaction to detect bacteria in arthropods: A review. J. Med. Entomol. 1995, vol. 32, p. 213-222.

125. Hindle E, 1912. On the life-cycle of Spirochaeta gallinarum II Parasitology. Vol. 4. P. 463-477.

126. Horak (ed.) Tick Vector Biology: Medical and Veterinary Aspects, Springer Verlag, Berlin, 1992. 335 p.

127. Hovius K.E. Borrelia infections in dogs. Epidemiological, clinical and diagnostic aspects. 1999. 148p.

128. Ни C.M., Humair P.-F., Wallich R., Gern L. Apodemus sp. rodents, reservoirs hosts for Borrelia afzelii in an endemic area in Switzerland. Zentralbl. Bact. 1997, vol. 285,p. 558-564.

129. Humair P.F., Postic D., Wallich R., Gern L. // Zentralbl. Bakteriol. -1998. T. 4. - № 287. - P. 521-538. 46.

130. Huppertz H.I., Bohme M., Standaerth S.M. et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1999. - Vol. 18. - P. 697-703.

131. Irwin, P. J., Hutchinson. G. W. Clinical and pathological findings of Babesia infection in dogs. Australian Veterinary Journal 1991: 68: 204-209.

132. Isogai H., Isogai E., Masuzawa T, Yanagihara Y., Matsubara M., Shimanuki M., Seta Т., Fukai K., Kurosawa N., Enokidani M. & Others (1992) Seroepidemiological survey for antibody to Borrelia burgdorferi in cows. Microbiology & Immunology 36,1029-1039.

133. Jacobsen, L. S. Clark. 1. A. The pathophysiology of canine babesiosis: New approaches to an old puzzle. Journal of the South African Veterinary Association 1994; 65.

134. Jacobson R., Chang Y. et al. 1996. Lyme disease: laboratory diagnosis of infected and vaccinated symptomatic dogs.// Seminars Vet Med Surg. 11:172182.

135. Johansson. К. E. Pettersson. M. Uhlen. M. et al. Identification of the causative agent of granulocytic ehrlichiosis in Swedish dogs and horses by direct solid phase sequencing of PCR products. Research in Veterinary Science 1995; 58: 109-112.

136. Johnson R., Schmid G.P. et al. 1984. Borrelia burgdorferi sp. nov.: etiological agent of Lyme disease.// Int. J. Sys. Bacteriol. 34:496-497.

137. Jolivet G., Marchand A. Le piroplasme du chien aspects taxonomigue, morfologique et biologique. // Anim. Co., 1974, v. 2, p. 13, 125-126.

138. Kasbohrer A. & Schonberg A. (1990) Serological studies of the occurrence ofBorrelia burgdorferi in domestic animals in Berlin (West). Berliner undMunchener Tierarztliche Wochenschrift 103, 374-378

139. Kawabata H., Myouga F., Inagaki Y. et al. // Microb. Pathog. 1998. -Vol. 24.-P. 155-166.

140. Kontos. V. I., Papadopoulos, O., French, T. W. Natural and experimental canine infections with a Greek strain of Ehrlichia platvs. Veterinary Clinical Pathology 1991; 20:101-105.

141. Lane R.S, Foley JE, Eisen L, Lennette ET, Peot MA. 2001. Acarologic risk of exposure to emerging tick-borne bacterial pathogens in a semirural community in northern California.// Vector Borne Zoonotic Dis 2001 Fall;l(3):197-210.

142. Lane R.S., Burgdorfer W. 1988. Spirochetes in mammals and ticks from a focus of Lyme borreliosis in California.// J. Wildl. Dis. 24:1-9.

143. Ledue N.B., Collins M.F., Craig W.Y. // J. Clin. Microbiol. 1996. -Vol. 34.-P. 2343-2350.

144. Levin L.M., Des Vignes F, Fish D. Disparity in the natural cycles Borrelia burgdorferi and the agent human granulocytic ehrlichiosis. Emerg Infect Dis. 1999, vol.5, p. 204-208.

145. Liang F.T., Jacobson R.H., Straubinger R.K. et al. 2000. Characterization of a Borrelia burgdorferi VlsE Invariable Region useful in canine1.me disease serodiagnosis by enzyme-linked Immunosorbent assay.// J Clin Microbiol. 4160-4166.Vol38.No.l 1.

146. Liang, F. Т., Aberer E. et al. 2000. Antigenic conservation of an immunodominant invariable region of the VlsE lipoprotein among European Pathogenic genospecies of Borrelia burgdorferi SL.// J. Infect. Dis. 182:14551462.

147. Liang, F. Т., Alvarez A. L. et al. 1999. An immunodominant conserved region within the variable domain of VlsE, the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi.!'/J. Immunol. 163:5566-5573.

148. Liebisch G., Bautsch W., Sohns B. Typing Borrelia burgdorferi sensu lato in ticks attached to human skin. J. Clin. Microbiol., 1999, vol.37, p. 33953408.

149. Liebisch G., Sohns В., Bautsch W. Detection and typing Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. J. Clin. Microbiol., 1998, vol. 36, p. 3355-3358.

150. Lindenmayer J.M., Marshall D., Onderdonk A.B. Dogs as sentinels for Lyme disease in Massachusets // Am. J. Publ. Health. 1991. Vol.81. №11. P.1448-1455.И др.

151. Lischer C. J., Leutenegger С. M., Braun U. , Lutz H. Diagnosis of Lyme disease in two cows by the detection of Borrelia burgdorferi DMA The Veterinary Record, April 22, 2000, 146,497-499

152. Loebermann M., Fingerle V., Lademann M, Fritzsche C., Reisinger E.C. Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum coinfection. Emerg Infect Dis., 2006, vol. 12, no. 2, p. 353-355.

153. MacDonald A.B. 1988. Concurrent neocortical borreliosis and Alzheimer's disease: Demonstration of a spirochetal cyst form // Ann. N.Y. Acad. Sci. Vol. 539. P. 468-470.

154. Magnarelli I.A., Denicola A., Stafford K.C. III., Anderson J.F. Borrelia burgdorferi in an urban environment: white-tailed deer with infected ticks and antibodies. J. Clin. Microbiol., 1995, vol. 33, p.541- 544.

155. Magnarelli L, Anderson J, Schreier A, Riclce C. Clinical and serologic studies of canine borreliosis. J Am Vet Med Assoc 1987; 191:1089-94.

156. Magnarelli L.A, Anderson JF, Schreier AB. Persistence of antibodies to Borrelia burgdorferi in dogs of New York and Connecticut. J Am Vet Med Assoc 1990;196:1064-1068.

157. Magnarelli L.A. // Am. J. Med. 1995. - Vol. 98. - P. 10-20.

158. Magnarelli L.A., Anderson J.F., Fish D. 1988. Ticks and bitting insects infected with etiologic agent of Lyme disease Borrelia burgdorferi./'/ J. Clin. Microbiol. 26(8):1482-1486.

159. Magnarelli L.A., Flavell R.A.JPadula S.J. et al. Serologic diagnosis of canine and equine borreliosis: use of recombinant antigens in enzyme-linked immunosorbent assays // J. Clin. Microbiol. 1997. Vol.35. №1. P. 169-173. и др.

160. Magnarelli LA. Serologic testing for Lyme disease. Postgraduate Medicine 1990; 87:149-56.

161. Masuzawa Т., Takada N., Kudeken M. et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.-2001.-Vol. 51 (Pt. 5).-P. 1817-1824.

162. Mather T.N., Telfold S.R.III. et.al. 1990. Borrelia burgdorferi and Babesia microti: efficiency of transmission from reservoirs to vector ticks.// Exp. Parasitol. 70(1):55-61.

163. Matton P. & Van Melckebeke H. (1990) Bovine borreliosis: comparison of simple methods for detection of the spirochaete in the blood. Tropical Animal Health 6- Production 22,147-152.

164. Matushka F.R., Endepols S., Richter D., Ohlenbusch A., Eiffert A., Spielman A. Risk urban Lyme disease enhanced by the presence rats. J. Infect. Dis., 1996, vol. 174, p. 1108-1111.

165. McCrossin I. // Med. J. Aust. 1986.-Vol. 144.-P. 724-725.

166. Mhalu F.S., Matre R. // East Afrc. Med. J. 1996. - Vol. 73. - P. 583585.

167. Murphy G.L., Ewing S.A., Whitworth L.C., Fox J.C., Kocan A.A. A molecular and serological survey Ehrlichia canis, E. chafeensis, and E. ewingii in dogs and ticks from Oklahoma. Vet. Parasitol., 1998, vol. 79, p. 325-339.

168. Nadelman R.B.,Wormser G.P. Lyme borreliosis // Lancet. 1998. -Vol. 352.-P. 557-565.185.0schmann P., Kraiczy P. et al. Lyme Borreliosis and Tick-Borne Encephalitis / Eds. Bremen, 1999, Germany. —144 p.

169. Pcken R.N., Strle F., Ruzic-Sabljik E. et al. // J. Invest. Dermatol. -1997.-Vol. 108.-P. 92-97.

170. Pechere J.-C., first edition Intercellular bacterial infections / Eds. first edition. 1996.- 187 p. 25.

171. Persing D.H., Telford III S.R., Rys P.N. et al. // Science. 1990. - Vol. 249.-P. 1420-1423.

172. Pichon В., Godfroid E., Hoyois В., Rodhain F., Perez-eid C. Simultaneous infection Ixodes ricinus nymphs by two Borrelia burgdorferi sensu lato species: possible implications for clinical manifestations. Emerg. Infect. Dis., 1995, vol. l,p. 89-90.

173. Piesman J. 1989. Transmission of Lyme disease spirochetes.// Esp.Appl. Acarol. 7(l):71-80.

174. Piesman J. 1991. Experimental acquisition of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi by larvae I.dammini during partial blood meal.// J.Med.Entomol. 28(2):259-262.

175. Piesman J. 1992. Vector competence of ticks for the Lyme disease spirochete.// Int. Conf. Tick-Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An

176. Agenda for Research. Proc. And Abstracts.// Saint Paul. Minnesota. USA. 130134.

177. Post J.E, Shaw E, Palka F. Lyme disease in horses. Proceedings of the American Association of Equine Practitioners 1987;32:415-85.

178. Post J.E, Shaw EE, Wright SD. Suspected borreliosis in cattle. Ann NY Acad Sci 1988;539:488.

179. Randolph, S.E., Craine, N.G. (1995) General framework for comparative quantitative studies on transmission of tick-borne diseases using Lyme borreliosis Europe as an example. Journal of Medical Entomology 2, 765777.

180. Rauter C., Hartung Th. Prevalence Borrelia burgdorferi sencu lato Genospecies in Ixodes ricinus Ticks in Europe: a Metaanalysis. Applied and Enviromental Microbiology, 2005, p. 7203-7216

181. Regendanz P., Reichenov E. Die Entwicklung von Babesia canis in Dermacentor reticulatus. // Arch. Protistenk. 1933, v. 1. P. 50-71.

182. Rothwell J. T, Christie В. M., Williams C. & Walker К. H. (1989) Suspected Lyme disease in a cow. Australian Veterinary Journal 66, 296-298

183. Russell R.C. // Emerg. Infect. Dis. 1995. - Vol. 1. - P. 29-31.

184. Sarih M., Jouda F., Gern L., Postic D. // Vector Borne Zoonotic Dis. -2003.-Vol. 3.-P. 133-139.

185. Schafrank S.N., Kurban A.IC., Martone G. // Arch. Dermatol. 1990.-Vol. 126.-P. 685-686.

186. Schmid G.P. // Rev. Infect. Dis. 1985. - Vol. 7. - P.41-50.

187. Shin S.J., Chang Y.F. et al.1993. Cross-reactiviti between B.burgdorferi and other spirochetes affects specificity of serotests for detection of antibodies to the Lyme disease agent in dogs.// Vet Microbiol. 36(1-2): 161-74.

188. Sonenshine DE, Ceraul SM, Hynes WL, Macaluso KR, Azad AF: Expression of defensin-like peptides in tick hemolymph and midgut in response to challenge with Borrelia burgdorferi, Escherischia coli and Bacillus subtilis. Exp ApplAcarol 2002, 28:127-134.

189. Steere A.C., Broderick T.F., Malawista S.E. // Am. J. Epidemiol. -1978.-Vol. 108.-P. 312-321.

190. Steere A.C., Malawista S.E., Snydman D.R. et al. // Arthritis Rheumatism. 1977. - Vol. 20. - P. 7-17.

191. Straubinger R.K. PCR-based quantification of Borrelia burgdorferi in canine tissues over a 500-day postinfection period // J.Clin.Microbiol. Vol.38. № 6. P.2191-2199. и др.

192. Strle F., Picken R.N., Cheng Y. et al. // Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol. 25. -P. 273-280.

193. Taboada, J., Harvey. J. W. Levy, M. G. et al. Seroprevalence ofbabesiosis in izrcyhounds in Florida. Journal of the American Veterinary Medical Association 1992: 200: 47-50.

194. Tugwell P., Dennis D.T., Weinstein A. et al. // Ann. Intern. Med. -1997.-Vol. 127.-P. 1109-1123.

195. Van Dam A.P. // Exp. Rev. Mol. Diagn. -2001. Vol. 1. - P. 413-427.

196. Van Dam A.P., Kuiper H., Vos K. et al. // Clin. Infect. Dis. 1993. -Vol. 17.-P. 708-717.

197. Wang G., van Dam A.P., Dankert J. Phenotypic and genetic characterization a novel Borrelia burgdorferi sensu lato isolate from a patient with Lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol., 1999, vol. 37, no. 9, p. 3025-3028.

198. Wang G., van Dam A.P., Schwartz I., Dankert J. // Clin. Microbiol. Rev. 1999.-Vol. 12.-P. 633-653.

199. Weber K. and Pfister H.-W. History of Lyme borreliosis in Europe /К. Weber and W. Burgdorrfer (ed.). Aspects of Lyme borreliosis. Springer-Verlag KG, Berlin, Germany. 1993. - P. 1-20.

200. Wells S. J., Trent A. M., Robinson R. A., Knutson K. S. & Bey R. E (1993) Association between clinical lameness and Borrelia burgdorferi antibody in dairy cows. American Journal of Veterinary Research 54, 398-405

201. Welzl. C., Leisewitz. A., Jacobson. L. Vaughn-Scott. T. Systemic inflammatory response syndrome and secondary multiple organ dysfunctionsyndrome in canine babesiosis. Journal of Veterinary Internal Medicine 2000; 14: 244.

202. Wilske B. // Intern. J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 291. - Suppl. № 33.-P. 314-319.

203. Wilske B. // Vector Borne Zoonotic Dis. 2003. - Vol. 3. - P. 215227.

204. Wlosniewski, A. Leriche. M. A. Chavigny. C. et al. Study on asymptomatic Babesia cam's infections in an enzootic area. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 1997; 20: 75-86.

205. Wolf V., Wecke J. 1994. Formation of multiple treponemes // Zbl. Bakt. Bd. 280. S. 297-303.

206. Zhang, J. R., Hardham J. M. et al. 1997. Antigenic variation in Lyme disease borrelia by promiscuous recombination of VMP-like sequence cassettes.// Cell 89:275-285.

207. Ресурс Интернета: http: // petrocrest.narod.ru/lyme.htm Маргарет Мане, доктор ветеринарии. 1998.

Информация о работе

Молотова, Надежда Владимировна
кандидата ветеринарных наук
Вологда, 2010
ВАК 03.02.11

Диссертация

Клещевой боррелиоз собак в условиях Вологодской области - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы