Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кишечная микрофлора и метаболизм оксалатов (Экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Кишечная микрофлора и метаболизм оксалатов (Экспериментальное исследование)"

р Г Б О Л

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

■ СТЕПАНЧУК Юлия Борисовна

^ УДК 615.231.015.

4:612.336.31

КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА И МЕТАБОЛИЗМ ОКСАЛАТОВ (Экспериментальное исследование)

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой .степени кандидата медицинских наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре микробиологии Российской медицинской академии последипломного образования и на базе Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского.

Научный руководитель академик РАМН, доктор медицинских наук,' профессор Навашин СМ.

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор Воропаева СД. доктор медицинских наук, профессор Быков A.C.

Ведущее учреждение - Российский Университет Дружбы народов

Защита состоится 1994 г. в " " часов на

заседании специализированного Совета Д 074.05.10 при Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова по адресу: 119881, г.Москва, ул.Б.Пироговская, Д.2/6

С диссертацией можно ознакомиться , в библиотеке ММА им.И.М.Сеченова

Автореферат разослан " "_ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

доцент А.Ю.Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Известно, что нормальная, кишечная микрофлора принимает активное участие в метаболизме различных соединений■•• в организме хозяина... При ее нарушении, возникают патологические состояния с различными клиническими проявлениями [Подопригора Г.К., 1979; Шендеров Б.А., 1987; Midtvedt А-С.,1994]. Для профилактики и лечения заболеваний, этиопатогенетически связанных с дисбалансом юшечной микрофлоры, в течение последнего времени успешно применяют эубиогики на основе жиеых бактерий - представителей нормальной микрофлоры [Шендеров Б.А-., Манвелова М.А., 1994; Goldin B.R. et а-1.. 1988]. Наше внимание привлекло исследование возможной роли микрофлоры толстого кишечника в деструкции щавелевой кислоты, поступающей в организм с пищей при идиопатическом нефролитиазе. Частота этой патологии в популяции человека неуклонно возрастает, что дало основание рассматривать мочекаменную болезнь (МКБ) как "болезнь цивилизации" [Schneider H.J., 1989]. Причины ее развития продолжают привлекать внимание специалистов различного профиля. Установлено, что оксалатурия в значительной степени определяется содержанием оксалата в пище. Из организма соли щавелевой ' кислоты преимущественно выводятся с фекалиями и с мочой [Kodama Н.,1989]. Основным местом абсорбции оксалата являются дистальный отдел тонкой и слепая кишки [Dobson D.M., Finlayson В., 1973]. Абсорбция оксалатов из кишечника в значительной степени связана с содержанием в пище кальция [Menon М., Mahle C.J., • 1982]. Расшифровка механизмов формирования гкпероксалурии (для людей это означает превышение оксалата в моче 0,39-0,45 ммоль/24 часа) поставила в последние годы вопрос об участии кишечной микрофлоры в развитии этой, патологии. К настоящему времени показано, что ■'некоторые микроорганизы, постоянно или временно присутствующие в толстом кишечнике, могут как фернентативно разрушать поступающий с пищей оксалат, так и синтезировать щавелевую кислоту из таких присутствующих в пище предшественников, как белки, аминокислоты, углеводы, спирты, витамин С [Williams Н.Е., Wansilak R., 1989]. Помимо прямого вмешательства в метаболизм оксалата кишечные микроорганизмы способны и опосредованно влиять на пул щавелевой кислоты в организме за счет участия в водно-солевом обмене, метаболизме органических кислот, печеночно-кишечной рециркуляции и т.д. [Шендеров '"Б.А., 1987; Midtvedt А-С.,1994, Midtvedt

Т. ,1985].

К сожалению, работ, посвященных нормализации метаболизма щавелевой кислоты путем направленного поиска

оксалат-деградирующих-бактерий, с-целью их назначения с пищей - для. профилактики и лечения гипероксалурии,практически нет. Известна единственная публикация на эту тему [Daniel S.L. et- al. 1993], хотя, возможно, микроэкологический подход для борьбы с все возрастающим количеством случаев гипероксалурии и МКБ может оказаться эффективным, экономически целесообразным и экологически безопасным.

Кроме того, использование этого подхода может дополнить, а возможно, и по-новому осветить роль кишечной микрофлоры хозяина в поддержании его здоровья. Обнаружение культур микроорганизмов с повышенной оксалат-деградирующей активностью может послужить также основой создания биосенсоров для экспрессного обнаружения и количественного определения оксалата в различных субстратах.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы: в условиях -эксперимента выявить роль кишечной микрофлоры в этиопатогенезе гипероксалуриии и . селектировать штаммы деструкторы оксалатов, перспективные для создания- эубиотиков со специфической направленностью.

ДЯя достижения- поставленной цели были определены следующие задачи: .

1. Отработать методы определения оксалата в биологическом материале с использованием различных хроматографических и ферментных методов. 4

2.Исследовать экскрецию ионов щавелевой кислоты с мочой и фекалиями у безмикробных и конвенциональных линейных крыс.

3.Отработать модель гипероксалурии на животных с целью установления коррелятивных связей гипероксалурии с содержанием оксалата и кальция в пище.

4.Создать селективные среды для изоляции бактерий- представителей нормальной микрофлоры, метаболизирующих оксалат и исследовать распространенность таких микроорганизмов в фекалиях различных животных, птиц и человека.

5.Отобрать штаммы бактерий с/ выраженной .оксалат-деструктивной активностью и дать их детальную биологическую характеристику. 6. Исследовать в модельных экспериментах динамику деструкции оксалата лактобациллами и кишечными палочками.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые исследована экскреция ионов щавелевой кислоты с мочой и фекалиями у безмикробных и конвенциональных крыс, отработана модель гипероксалурии на безмикробных и конвенциональных крысах -линии AGUS,- не содержащих в - своем кишечнике оксалат-деградирующих бактерий.' У конвенциональных жйвотных этой линии установлена четкая зависимость содержания в моче щавелевой кислота от количества оксалата й кальция в пищевом рационе.

Сконструированы простые по составу элективные и дифференциально-диагностические среды с оксалатом, позволяющие вести массовое обследование значительных групп животных и людей на присутствие микроорганизмов, метаболйзирующих оксалат.

Установлено, что в фекалиях разных животных, птиц и человека содержатся значительные количества микроорганизмов, способных использовать оксалат в качестве источника углерода и энергии. •.

Отработана методология отбора штаммов, различной таксономической принадлежности, способных метаболизировать оксалаты.

Создана оригинальная коллекция штаммов-деструкторов оксалата из лактобацилл различного происхождения и энтеробактерий.

Впервые экспериментально обоснованы микроэкологические подходы конструирования препаратов и продуктов функционального татания для профилактики и лечения гипероксалурии и МКБ на основе пактобацилл.

' ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые создана коллекция дтаммов-деструкторов, способных утилизировать оксалат, используя зго в качестве единственного источника углерода и энергии.

В Государственную коллекцию микроорганизмов - представителей термальной микрофлоры человека в Московском'

1аучно-исследовательском Институте Эпидемиологии и Микробиологии ш. Г.Н.Габричевского депонированы два высокоактивных итамма-деструктора оксалата Lactobacterium plantarum CS^-..actobacterium plantarum 421-2. Подана заявка о выдаче патента РФ и изобретение "Штамм Lactobacillus plantarum CS, деградирующий жсалат" (N94018728, дата приоритета от 25.05.1994).

Сконструированы среды, позволяющие- выделять

жсалат-деградирующие бактерии из различного материала.

Результаты исследования позволили с новых позиций подойти к 1тиопатогенезу гипероксалурии и МКБ и наметить пути создания

оригинальша препаратов на основе лактобацилл для профилактики и лечения этой патологии.

Настоящая работа является часть» комплексных исследований, выполняемых- Московским •• научно-исследовательским.- институтом-эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского по программам Государственного • Комитета Санэпиднадзора РФ "Разработка экспресс-методов диагностики нарушений микробной экологии и иммунитета, создание эубиотиков второго и третьего поколения, способствующих оздоровлению населения и снижающих заболеваемость в условиях усиливающегося воздействия экстремальных факторов внешней среды" N 3-131-66 и "Разработка новых типов эубиотиков и модуляторов биологических эффектов из бифидобактерий и лактобацилл на основе структурных компонентов микробной клетки" N 3-131-183.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ,

1.Оксалат-метаболизирующие бактерии широко распространены в кишечнике различных животных, птиц и человека.

2.Создание экспериментальной модели гипероксалурии на крысах линии AGUS, на которой показана четкая корреляция выраженности гипероксалурии от содержания оксалата в пище.

3.Изолированы лактобациллы и кишечная палочка, способные в культуральнои. среде и фекалиях на 30-70% снижать содержание оксалата.

4.С новых позиций рассматривается этиопатогенез гипероксалурии и связанных с ней патологических состояний и обосновываются оригинальные микроэкологические подходы профилактики и лечения этой патологии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы исследования и основные положения работы обсуждались на научно-практической конференции "Дисбиотические состояния человека, пути профилактики и лечения" (Пермь, 1993), на XI Международном симпозиуме по гнотобиологии (Xlth International Symposium on Ghotobiology), Brasil, Belo-Horisonte, June 1993; на XIX Международном Конгрессе по микробной экологии и болезням (XIX International Congress on Microbial Ecology and Disease), Italy, Rorae, September, 1994.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 6 работ...

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка основной использованной литературы.

включающего 153 работы, из них 130 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, включающих 10 рисунков, 17 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

. МАТЕРИАЛЫ. И МЕТОДЫ. Исследования , по изучению роли микроорганизмов в метаболизме оксалата проведены in vitro и на экспериментальных животных: При этом были использованы различные микрЬбиологиче ские и физико-химические методы исследования.

Материалом для .выделения штаммов-деструкторов оксалата служили свежевзятые фекалии (82 образца) белых крыс линйи Вистар, мышей линий С57/6, СВА, морских свинок, кроликов, баранов, цесарок (по 6 в каждой группе) и людей (18). Оксалат-деградирующая активность исследована у 166 культур, из которых 49 штаммов были выделены на среде с оксалатом из фекалий различных живо-тных, цесарок и человека, а 117 - нузейные и свежевыделенные штаммы аэробных, факультативно-анаэробных, микроазрофильных и анаэробных грамположительных и

грамотрицательных бактерий, относящихся к родам Pseudomonas, Escherichia, Proteus,^ Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter , Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, которые хранились или были изолированы в неселективных условиях.

-Для отбора микроорганизмов, способных -деградировать оксалат, использовали полусинтетические селективные среды, содержащие в качестве источника углерода соли щавёлевой кислоты (3,0-50,0 г/л), разработанные нами.

Идентификацию микроорганизмов осуществляли на основе изучения морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств [Блохина И.Н. и. др. 1986, Bergey's manual 1994].

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли методом бумажных дисков по диаметру зоны задержки роста на МПА (для кишечной палочки) или . на MRS (для лактобацилл) [Навашин С.М., Фомина И.П. 1982].

Б работе использованы также 6 безмикробных и 40 конвенциональных крыс самок линии AGUS в возрасте 7 - месяцев (200-230 г.), выведенные В.Gustafsson из линии Long Evans в 50-х годах в. лаборатории Медицинской Микробной Экологии Каролинского института (Швеция)?,., Животные получали стерилизованный автоклавированием коммерческий корм (Lactamin R-36) и питьевую

всду. В ходе проведения изучения потребления и выделения ими кальция и оксалата крыс помещали в метаболические клетки. Все животные на протяжении эксперимента находились в метаболических клетках, позволяющих .раздельно , собирать мочу. . и . фекалии. Конвенциональные животные содержались в комнате вивария в клетках. Безмикробные животные содержались в . специальных боксах лэ методу B.Gustafsson [1948]. Суточные ■ порции чмочи и фекалий исследовались по следующим параметрам: о&ьему, весу, процентному содержанию воды в фекалиях, количеству оксалата/

Аналитическое исследование химического состава корма, мочи и испражнений проводили, используя различные хроматографические, спектрофотометрические и ферментные методики. Образцы подготавливались в соответствии с задачами аналитического исследования по методикам экспериментально подобранным для соответствующего соединения.

Сухой остаток фекалий взвешивали после вакуумной сушки.

Для определения оксалата в различных биологических пробах (моча, фекалии) и в культуральной жидкости были использованы несколько различных методик: хроматографические [Moye М.А., Malagodi М.Н., 1981; Yanagawa et al.1983] и ферментный с помощью коммерческой оксалатдегидрогиназы (Boehririger, Австрия).

Определение кальция проводили на ' атомно-абсорбционном спектрофотометре фирмы Паркин-Элмер (США) [Shenderov В.А., Mitrokhin S.D., 1990]. Динамику деградации щавелевой кислоты лактобациллаии изучали на жидкой среде API 50HL на протяжении 72 часов культивирования при 37°С в анаэробных условиях. Бифидобактерии культивировались на кукурузно-лактозной среде [Сундукова Н.Б., Хорькова-Е'.А. и др. 1986]. При исследовании 5.coli в качестве питательной основы. использовалась модифицированная наш полусинтетическая среда Allison M.J. [1985]. Микробная нагрузка составляла в большинстве случаев

7 q г

10'-10 КОЕ/кл. Для количественного определения анализируемого компонента использовали метода газовой и ионно-жидкостной хроматографии, ферментный метод с помощью коммерческой оксалатдегидрогиназы (Boehringer, Австрия).

Антагонистическую . активность ' оксалат-деградирующих лактобацилл определяли методом отсроченного антагонизма на плотной среде с казеиновым гидролизатом с использованием в качестве тест культур S. sonnei 117b, S.flexneri 170, 337, E.coli

>111, S. aureus 209", P. mirabilis F-196, P. vulgaris F-30, голученные из ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

Безвредность, штаммов оценивали по наличию патологических [зменений.во внутренних органах и транслокации в них бактерий при ¡ведении микробной взвеси лабораторным мышам per оs в течение [едели.

Статистическую обработку полученных в ходе исследований (анных проводили общепринятыми методами вариационной статистики, ¡равнительного, корреляционного и дисперсионного анализа с учетом сонкретных целей решавшейся задачи. Для расчета использовали ПЭВМ •1ВМ-РС-АТ".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Из известных более 60 методов определения оксалата в >азличных субстратах [Chalmers А.H. Cowley D.M. 1984; Moye M.A., lalagodi M.H., 1981; Yanagawa et al.1983], в работе использовано i. При этом нет данных об использовании ферментного метода для >пределения оксалата в культуральной • жидкости, а юнно-эксклюзионного - для определения этого соединения в зекалиях. Это потребовало отработки условий для воспроизводимости юзультатов. Опыт работы с количественным определением оксалата в ¡иологических субстратах позволил прийти к заключению, что )ерментный метод, адаптированный нами для микроанализатора "Suma" !Куба),. является самым быстрым, позволяющим за, короткое время фоанализировать большое количество проб. Это позволяет рекомендовать теот-систему Boehringer (Австрия) для широких жрининговых исследований культур, способных метаболизировать жсалат. Его ограничением является необходимость присутствия в (ультуральной среде оксалата не ниже - 0,05мг/мл.

Методы . газовой и ионно-эксклюзионной хроматографии при ^следовании оксалат-деградирующих свойств являются равноценными ю чувствительности, однако требуют значительного времени (20-30 шн) на прогон, пробы. Они рекомендуются, нами для детализации метаболизма оксалата бактериями. Кроме того, их высокая ¡увствительность позволяет рекомендовать эти 2 метода для шределения количества оксалата в моче, фекалиях, корме.

В литературе имеются указания о зависимости концентрации жсалата в моче от пищевого рациона [Doane L.T. et al.1989, lobertson W.G.et alM989], Но ни в одной публикации не указана ¡ависимость концентрации от состояния микрофлоры толстого

кишечника.

В связи с этим нами была разработана модель гипероксалурии с использованием 46 крыс линии AGUS, выведенной ~ в Каролинском институте ( 6 были безмикробные, и 40 - конвенциональные).

Были исследованы некоторые физиологические параметры безмикробних и конвенциональных крыс'Линии AGUS. 'Оказалось,, что отсутствие микрофлоры влияло на количество потребляемой животными пищи, вес и обьем испражнений и выделенной мочи (табл.1). С другой стороны, нам удалось впервые выявить, что суммарная экскреция оксалата с мочой и фекалиями у безмикробных крыс была ниже, чем у конвенциональных (табл.2).

Безмикробные крысы аккумулировали почти 40% кальция, поступившего в организм с пищей. Это, по нашему мнению, может служить объяснением более частого возникновения нефрокальциноза у безмикробных крыс линии AGUS при назначении им несбалансированной диеты. Мы не обнаружили существенных различий в величине экскреции оксалата с мочой у безмикробных и конвенциональных животных при наличии в корме щавелевой кислоты в концентрации 0,2%. Это дало нам основание сделать вывод об отсутствии в кишечнике конвенциональных "крыс линии AGUS оксалат-деградирующих микроорганизмов. В пользу этого говорили и наши данные по ■ инкубации фекалий крыс с оксалатом натрия в культуральной среде, а также'наши'наблюдения по "скармливанию крысам с пищей оксалата. Оказалось, что инкубирование фекалий в среде с оксалатом практически не отражалось на его количестве после 7 дней, а пятидневное скармливание крысам щавелевой кислоты мало влияло на ' их устойчивость к токсическому эффекту оксалата при ' интрацекальном введении. , .

С другой стороны, на этих же животных нам удалось выявить отчетливую зависимость концентрации экскретируемого с фекалиями и мочой оксалата от его количества в пище. . Так, 10-ти- кратное увеличение оксалата в корме сопровождалось 20-тикратным повышением его в моче, и почти 8-микратным - в фекалиях.

Следует подчеркнуть, что в данной серии экспериментов нами убедительно'подтверждена высказываемая рядом авторов гипотеза, что в развитии гипероксалурии первостепенную роль играет количество потребляемого с пищей оксалата, а так же присутствие в пище ионов кальция {Robertson W.G. et al. 1989, Smith L.H. 1992].

Табл.1.Некоторые физиологические характеристики безникробных (йЮ и конвенциональных (СУ) крыс линии' ДИК. *

Параметру .. СУ.

Объем мочи (мл/сутки) 9,3±0,9 ■ 7,3+0,8

рН мочи 6,7+0,1 6,8+0,3

Объем фекалий (г/сутки) 3,4+0,4 12,1+1,4

% вода в фекалиях 56,8+5,5 74,0+4,3

'Средняя арифметическая ± стандартная девиация для 6 крыс в каждой группе, р<0,01.

Табл.2. Суточное потребление и выделение кальция крысами линии. Ай^.*

и оксалата

Параметры

СУ

СГ

Кальций (р<0,01) (Т-ЬеэЬ)

Суточное потребление (мг/24^ч) . 103,8±6Д 160,2±20,1

Экскреция с мочой (мг/24 ч) 1,39+0,39 1,36±(},1

У- 1,43±0,44 0,9+0,12

Экскреция с фекалиями (мг/24 ч) 83,3+16,5 89,5+15,7

% ' 82,4±16,0 58,4+14,8

Суммарная экскреция (мг/24 ч) 83,6+12,3 84,0+14,2

% 82,7±14,4 59,3+12,2

Оксалат

Суточное потребление (мг/24 ч) 17,3+1,0 26,8+3,4

Экскреция с мочой (мг/24 ч) 0,4±0,04 0,5+0,07

% 2,06+0,28 1,9±0,31

Экскреция с фекалиями (мг/24 ч) 17,0±1,8 24,2+2,1

X 97,0+8,4 90,5±3,3

Суммарная экскреция (мг/24 ч) 17,4+1,8 24,7±2,0

X 99,8+7,8 92,5±3,5

'Средняя арифметическая ± стандартная девиация для 6 крыс в каждой группе.

С. учетом наметившихся тенденций замены в перспективе лекарственных препаратов на ^продукты питания, содержащие компоненты, регулирующие те или иные звенья метаболизма, и важного значения, . . . которое придается в этих продуктах микроорганизмам - представителям нормальной микрофлоры, актуально определить, какие . представители кишечной микрофлоры способны вмешиваться в оксалатовый метаболизм организма хозяина. Ввиду многочисленности как по количеству, так и по составу микроорганизмов в кишечном содержимом, подобную работу невозможно осуществить в короткие промежутки времени без специальных сред, позволяющих провести массовый скрининг бактерий, способных расти и использовать оксалат в качестве источника углерода и энергии. Из имеющихся в этом направлении публикаций, мы остановились на питательных средах, предлагаемых группой американских исследователей, работающих в области ветеринарии, возглавляемой профессором Аллисоном [1985]. В результате манипуляций с составом сред Аллисона, а такие кукурузно- лактозной, АР1-50Н1. путем введения в них . различных индикаторов, замены или исключения отдельных компонентов, нам удалось сконструировать ряд жидких и плотных элективных сред, позволяющих изолировать оксалат-деградирующие аэробные, факультативно- анаэробные, -и микроаэрофильные бактерии и изучить динамику этого процесса.

Исследования фекалий животных,-цесарок и человека показали присутствие вних различных микроорганизмов (от 4,0 до 7,0 КОЕ/г), способных расти на полусинтётической среде с оксалатом (от 10 до 50 г/л)

В результате исследования экологии кишечных бактерий, разрушающих щавелевую кислоту, нам впервые удалось создать достаточно большую коллекцию из 79 штаммов микроорганизмов, способных метаболизировать это соединение.

Давая количественную характеристику оксалат-метаболизирующей активности отобранных нами бактерий, относящихся к различным таксономическим группам, отметим, что нами впервые удалось установить, что в метаболизме щавелевой кислоты могут принимать участие такие микроорганизмы пищеварительного тракта, как лактобациллы, и бифидобактерии (табл.3). Нами впервые изолирован штамм кишечной

палочки с достаточно высокой оксалат-деградирующей активность», способный осуществлять этот процесс на голодной водно-солевой среде Симонса, где традиционный- цитрат натрия был заменен на оксалат натрия в .• той же концентрации . (0,2%) в качестве .единственного источника углеррда и энергии. Интересной особенностью экспериментов, с нашей точки зрения, -является обнаружение среди лактобацилл, бифидобактерий и других микроорганизмов культур, как снижающих концентрацию оксалата в культураль-ной жидкости при инкубировании, так и, в меньшей степени, повышающих ее (табл.4). Более того, в зависимости от условий (зремя инкубации, концентрация оксалата, тип соли, присутствие других углеродсодержащихсоединений) одна и та же культура могла проявить как оксалат-деградирующую, так и оксалат-продуцирующую активность. Это явление не было связано с сорбцией или десорбцией оксалата бактериями в культуральной среде. Так, при осаздении их s из среды с оксалатом и последующим помещением микробного осадка з дистиллированную воду не происходило перехода оксалата из клеток в окружающую среду. Во всех случаях уменьшение концентрации оксалата в культуральной среде в присутствии оксалатразрушающих лактобацилл сопровождалось ростом числа бактерий в среде и появлением продуктов метаболизма (молочная кислота) в возрастающих концентрациях,'свидетельствующих об' активном размножении этих бактерий и накоплении биомассы.

Две культуры , проявляющие наибольшую оксалат-деградирующую активность, были депонированы в Государственной коллекции микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека в Московском научно-исследовательском Институте Эпидемиологии и Микробиологии им. Г.Н.Габричевского и подверглись детальному микробиологическому исследованию. В результате изучения более 60 феноти-пических характеристик (морфологические, культуральные, физиолого биохимические свойства, чувствительность к^антибиотикам, антагонистическая активность, патогенность) изолированные культуры -деструкторы были идентифицированы" и названы Lactobacterium plantarum CS, Lactobacterium plantar™ 421-2, Escherichia coli M-93. На штамм Lactobacillus plantarum CS направлено заявление о выдаче патента Российской Федерации на. изобретение (N гос. регистрации 94018728, дата" приоритета 23.05.94). После установления таксономической принадлежности штаммы были подвергнуты более детальному исследованию деструктивной активное-

ти в отношении оксалата. При этом оказалось, что как лактобацил-лы, так и кишечная палочка в опытах in vitro наиболее интенствно ^разрушают оксалат в первые 24 часа инкубации {рис.1). В последующие сроки снижение-в среде концентрации- оксалата замедляется, или даже при определенных условиях его количество возрастает. Оксалат-деградирующая.активность лактобацилл проявляется не только в питательной среде, но и при внесении этих бактерий в фекалии, взятые от конвенциональных крыс линии AGUS, получавших на протяжении 7 дней пищу с 1-2% оксалатом, и хранившихся до использования при -40°С. Так, недельное выдерживание размороженных в СВЧ-печи "Электроника" фекалий с содержанием оксалата натрия 19,5 мг/г в присутствии лактобацилл CS и 421-2 (108 КОЕ/г) приводило к 30% уменьшению этого соединения. При этом в описанных условиях оба штамма проявляли схожую оксалат-деградирующую активность.

Табл.3.Распространенность штаммов-деструкторов , среди бактерий различных таксономических групп. *

Родовая принадлежность Количество штаммов

исследуемых _

штаммов исследуемых деструкторов

оксалата

Bifidobacterium spp.** 8 . 1

Citrobacter freundii 1

Enterobacter agglomerans 1 -

Escherichia coli 20 ^ 8

Klebsiella spp. 4 * i

Lactobacillus spp.*** 69 18

Proteus spp. 3 1

Pseudomonas spp. 2 -

Staphylococcus spp. 4 -

Streptococcus spp. 5 '

*48 часов инкубации, метод определения - газовая хроматография. Среда культивирования - модифицированная среда Allison М. [1985].

** Среда культивирования - кукуру'зно-лактозной среде [Сундукова

М.Б.,'Хорькова Е.А. и др. 1986] .* * * Среда культивирования - API 50HL.

lg КОЕ/мл

io ^

48 Время,чае

Рис. 1.Динамика деструкции оксалата натрия штаммом E.coli М-93

1.Прирост биомассы

2.Концентрация субстрата в среде

Табл.4. Оксалат-модифицирующая активность лактобацилл различных видов.*

Вида лактобацилл . Число исследуемых . Результат ...

штаммов /¿повышения ' %снижения

уровня оксалата в среде

Контроль

API-среда +оксалат Na 2 мг/мл (100%)

Lactobacillus 40 0-41 0-69

piantarura — . .

L.fermentum 6 0-15 0-13

L.casei 4 0-15 0-17

L.acidophilus 9 0-24

L.delbrueckii 5 0-25 7-34

L.brevis 1 без изменений

L.helveticus 1 15

L.pentosus 1 без изменений

L.oris 1 без изменений

L.alimentariura без изменений

*48 часов шшубащш. Определение оксалата проводили методом газовой хроматографии.

Хранение отобранных штаммов лактобацилл в ■ лиофилизированном состоянии на протяжении 8 месяцев или путем пересева на среде MPC без оксалата (через 7-10 дней) - не сопровождалось утратой бактериями их оксалат-деградирувдей активности.

Все вышеуказанное дает основание утверждать, что микрофлора кишечника участвует в регуляции пула щавелевой кислоты в организме животных, в развитии гипероксалурии при определенных .. состояниях. Кроме того, полученные нами результаты дают основание рекомендовать дальнейшую разработку микроэкологических приемов профилактики и лечения гипероксалурии и : связанных с ней патологических состояний, а отобранные .нами -штаммы, исследовать как основу принципиально новых эубиотиков - бактериопрепаратов " специфического назначения.

вывода.

1.Ha модели безмикробных и конвенциональных животных исследованы процессы абсорбции и экскреции с. мочой, и. фекалиями оксалата. и , кальция. Установлено, что у крыс линии AGUS ■ кишечная микрофлора принимает слабое участие в метаболизме оксалата, и у этих животных прослеживается четкая корреляция содержания оксалата в моче от его концентрации в пище.

2.Исследована экология кишечных микроорганизмов, разрушающих щавелевую кислоту. Показано, что бактерии, обладающие этой способностью, широко представлены ' среди грамположительных и грамотрицательных .факультативно-анаэробных, микроаэрофильных и анаэробных микроорганизмов у различных животных, птиц'и человека. Количество подобных бактерий колеблется в пределах Ю^до ю'' КОЕ/г фекалий.

3.Создана коллекция штаммов - деструкторов, насчитывающая '23 культуры, в том числе 18 штаммов лактобацилл различных видов и 1 штамм бифидобактерий.

4.Селектированы 2 штамма Lactobacterium plantarum CS, Lactobacterium plantarum 421-2 и Escherichia coli M-93 с высокой деструктивной активностью в отношении оксалата". Установлено, что •эти культуры в экспериментально подобранных условиях (t-37°C, pH 6,8+0,1, концентрация соли -10-20 г/л, микробная нагрузка 10 -

о

10 КОЕ/мл, аэробные для кишечной палочки и анаэробные для лактобацилл) уменьшают содержание в среде оксалата на 30-70% за 24-72 часа/ Признак деструкции оксалата у отобранных лактобацилл и кишечной палочки является стабильным и не утрачивался при селективных и неселективных условиях хранения (срок наблюдения 8 месяцев).

5.В модельных экспериментах продемонстрировано что при добавлении лактобацилл штаммов CS и 421-2 к фекалиям конвенциональных крыс линии AGUS, содержащих 19,5 . мг оксалата/г фекалий, происходит снижение концентрации этого соединения на 30% от исходного уровня после 168 часов инкубации при 37°С в анаэробных условиях.

6.Впервые экспериментально обоснована перспективность использования лактобацилл для конструирования эубиотиков-направленного действия для профилактики гипероксалурии и связанных с ней патологических состояний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Степанчук D.B., Шендеров Б.А. "Роль микроорганизмов в метаболизме оксалатов"/ ЖМЭИ N5, -1992.,- стр.. 58-61......

2.Степанчук В.Б. "Экология аэробных бактерий, растущих на полусинтетической среде с оксалатом"/ Медицинские аспекты микробной-экологии, В. 6,--1992,-стр.58-61

3.Степанчук В.Б. "Метаболизм щавелевой кислоты микроорганизмами"/ Тезисы докладов научно-практической конференции "Дисбиотические состояния человека, пути профилактики и лечения" (Пермь,1993), стр.18-19.

4.Степанчук Ю.Б. "Экскреция оксалата ■ конвенциональными и безмикробными крысами линии AGUS"/ Медицинские аспекты микробной экологии, В.8, часть I ,-стр.112-116

5.Shenderov В.A., Tarasov A., Stepanchuk J., Voropaeva Е. Modification of cholesterol, oxalic acid and histamin by some human intestinal tract bacteria in vitro./ Program and abstracts of XI International Symposium on Gnotobiology, Brasil, Belo-Horisonte, June 6-10-1993, -p.48

6.Stepanchuk J.B. ' Microecology aspects of hyperoxaluria regulation./Abstract book:, XIX International Congress on Microbial Ecology and Disease, Italy, Rome, September 18-21, 1994, -p.125.