Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетическое моделирование системы фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетическое моделирование системы фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов"

На правах рукописи

Метёлкин Евгений Александрович

КИНЕТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ГЕПАТОЦИТОВ

03 00 02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2008

003447374

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ имени М В.Ломоносова

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических профессор

Энно Куставич Рууге

доктор физико-математических наук, профессор

Романовский Юрий Михайлович

кандидат биологических наук, Горячева Екатерина Александровна

наук,

Ведущая организация.

Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится " ^ " О^У^-О^ 2008 в ч && мин на заседании Диссертационного совета Д 501.002 11 физического факультета МГУ имени М В Ломоносова по адресу г. Москва, Ленинские горы, МГУ имени М В Ломоносова, физический факультет, аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ имени М.В Ломоносова.

/г -НЬУЧн

Автореферат разослан "Ш "

, ¿и 'X

.

Учёный секретарь Диссертационного I доктор физико-математических наук^

Ш

'ел*4

ь^ОСКВ*

У <*; > ДМЯ г г

о° УТ0В Г Б'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается значительный прогресс в численных точных методах описания молекулярных механизмов жизнедеятельности клетки Этому способствует как развитие вычислительной техники, так и разработка новых экспериментальных технологий Действительно, в настоящее время существуют методы, позволяющие проводить поточные измерения на системах in vivo и in vitro, то есть, регистрируя одновременно несколько характеристик в режиме «реального времени». Развитие автоматизированных экспериментальных установок, появление возможности хранения и обработки больших объемов данных привело к необходимости более тщательно анализировать и интерпретировать полученные данные. Для решения такого рода задач была выделена специальная область науки, названная «системной биологией» Одним из возможных способов обработки экспериментальных данных для выяснения особенностей функционирования живых систем, а также предсказаний функционирования этих систем в условиях, отличных от экспериментальных, является различные методы моделирования. Применительно к данным, характеризующим изменения концентраций и скоростей биохимических реакций, наиболее эффективным и точным методом является кинетическое моделирование ферментативных систем. Несмотря на то, что кинетическое моделирование развивается уже несколько десятков лет, практическое их использование для биоинженерных и биомедицинских задач стало актуальным только недавно, после появления достаточного количества точных экспериментальных данных и мощной вычислительной техники, доступной рядовому исследователю. Так, ранее большинство кинетических моделей имели качественный характер (то есть не ставили задачу описания точных количественных данных), а сложность (количество компонент) описываемых систем была невысока В настоящее время описываемые системы усложняются, .количество компонент может достигать нескольких сотен и т£юяч, а требования к точности все время повышаются. Кроме того, практическое Использование кинетического моделирования диктует необходимость построения моделей нового типа, описывающих также метаболическую и генетическую регуляцию метаболизма, эффекты, связанные

с мпогокомпартментным системами, процессы на границах раздела двух и более компартментов, а также эффекты влияния электрических зарядов на мембранах клетки. Все эти задачи стимулируют разработку новых методов и подходов к построению моделей

Примером такой многокомпартментной системы со значительным влиянием мембранного потенциала на скорости реакций является митохондрия, построению частичной модели которой посвящена данная работа. Система транспорта и фосфорилирования в митохондрии состоит из ферментов и переносчиков, со сложным механизмом работы, который зачастую неизвестен или пока не описан с помощью дифференциальных уравнений. Кинетическое моделирование, решающее фундаментальную задачу описания функционировании фермента/переносчика, могло бы помочь выбрать из существующих гипотез функционирования отдельных компонент системы ту, которая наиболее соответствует экспериментальным данным В частности, для физиологически значимого переносчика аденилатов (АНТ) до сих пор не известен механизм работы и кинетические константы элементарных стадий. Кроме того, имеется такой практический (прикладной) аспект моделирования данной системы, как предсказание поведения системы фосфорилирования в различных условиях, подбор оптимальных условий для экспериментальных измерений, при которых наблюдается тот или иной эффект. Более того, многие практические биомедицинские задачи не могут быть решены только экспериментально из-за сложности проведения эксперимента, таким образом, постренная модель могла бы стать вспомогательным инструментом при изучении влиянии различных биоактивных веществ на метаболизм, например, при тестировании лекарств

Целью данной диссертационной работы является выявление и описание с помощью разработанных теоретических методов особенностей функционирования и регуляции системы фосфорилирования митохондрии, а также ее отдельных компонент

Для достижения поставленной цели в рамках настоящей работы решались следующие основные задачи:

1) Разработать подход для описания зависимости скорости работы ферментов и переносчиков, располагающихся на границе двух компарт-

ментов, от разности электрохимических потенциалов на мембране,

2) На основе разработанного метода создать детальные стационарные модели АТФ-синтазы, АТФ/АДФ-антипортера, переносчика неорганического фосфата митохондрий;

3) Построить кинетическую модель системы фосфорилирования в митохондриях клеток печени;

4) Сделать предсказания особенностей функционирования ферментов и переносчиков в широком диапазоне условий;

5) Получить с помощью кинетической модели ответы системы на изменение внешних условий - энергетической нагрузки, концентраций метаболитов, наличие ингибитора.

Научная новизна. Разработан новый подход, позволяющий описать зависимость скорости работы переносчиков и ферментов от потенциала мембраны. Данный подход позволяет использовать кинетические модели для создания «больших моделей» метаболических систем, функционирование отдельных частей которых зависят от потенциала Модели такого рода могут быть использованы для явного задания функции скорости в дифференциальных уравнениях, в отличие от использовавшегося ранее подхода, в котором система описывалась статистическими методами В работе впервые, исходя из кинетических и структурных данных,построена кинетическая модель АТФ/АДФ-антипортера, которая учитывает зависимость кажущихся параметров от разности потенциала на мембране Для модели определены кажущиеся и реальные параметры элементарных стадий. На основе механизма чередующегося сродства построена модель АТФ-синтазы, которая объединена с моделью переноса протонов, которая описывается одной функцией. Ранее созданные модели АТФ-синтазы представляли собой либо модели Р^комплекса, либо модели переноса протонов через Рсгкомплекса, не связанные между собой, причем ранее описание функционирования комплексов решалось статистическими методами, а не с помощью дифференциальных уравнений. Была построена модель фос-форилирующей системы митохондрии. Для верификации параметров этой

модели использовались экспериментальные данные, полученные в сотрудничестве с нашими коллегами, использовавшими ряд оригинальных экспериментальных разработок. Так впервые удалось построить модель, которая количественно точно описывает зависимость основных характеристик энергетического метаболизма от концентраций метаболитов и потенциала мембраны.

Практическое значение. Методика описания зависимости скорости катализа или транспорта от потенциала через его влияние на элементарные стадии может быть также использована для других систем, где влияние электрического потенциала существенно. Построенная модель фосфорили-рующей системы митохондрии может быть использована для решения прикладных задач как самостоятельно, так и в составе более сложных систем, таких как система окислительного фосфорилирования митохондрии и т п. Результаты такого моделирования могут быть использованы для решения, в частности, биомедицинских задач, таких как тестирование лекарственных средств для изучения влияния последних на систему энергетического метаболизма или изучения влияния ядов на систему.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семи научных конференциях, в том числе на третьей европейской конференции по вычислительной биологии (Глазго, 2004), на второй международной конференции по системной биологии (Канада, 2004), на Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005), на 12 международной конференции по био-термокинетике (Тракай, 2006), на 12 международной конференции «Математика Компьютер.Образование » (Пущино, 2005), на 15 международной конференции «Математика.Компьютер.Образование.» (Пущино, 2008), на конференции «Российская биоэнергетика- от молекул клетке» (Москва, 2005)

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, трех глав и списка цитируемой литературы. Рукопись включает в себя 125 страниц, в том числе 32 рисунков, 8 таблиц. Список литературы включает в себя 133 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследуемой проблемы, сформулирована цель и задачи диссертационной работы, перечислены полученные в диссертации новые результаты, их практическая ценность и описана структура диссертации.

Глава 1. содержит литературный обзор. В разделе 1.1. приводится описание свойств и особенностей адениннуклеотид-транслоказы (АНТ) -основного высокоспецифичного переносчика АТФ и АДФ в митохондрии Важность точного кинетического описания этого переносчика объясняется тем, что во многих случаях он может лимитировать весь путь окислительного фосфорилирования. Ранее исследователями было показано, что переносчик работает по принципу антипорта со стехиометрией 1-1, то есть на одну перенесенную молекулу АДФ приходится одна молекула АТФ, транспортируемая в противоположном направлении, что приводит к выходу одного отрицательного заряда из матрикса. Тем не менее, механизм работы и степень влияния электрического потенциала на элементарные стадии переноса до сих пор обсуждаются в литературе Имееются две гипотезы функционирования антипортера: механизм случайного связывания (Random Bi-Bi) и механизм пинг-понг (Ping-pong). Аргументы за и против каждого механизма приводятся в этом разделе. В обзоре также рассматриваются существующие модели АНТ и показывается, что до сих пор не построена модель, которая бы количественно описывала экспериментальные данные.

Раздел 1 2. посвящен Н+-АТФ-синтазе - ферменту, связанному с внутренней мембраной митохондрии и катализирующему фосфоршшрование АДФ неорганическим фосфатом за счет протон-движущей силы Фермент обнаружен также в хлоропластах растений и в бактериях, где выполняет аналогичную функцию АТФ-синтаза имеет сложный субъединичный состав и необычные каталитические свойства, усложняющие его кинетическое описание В частности, ранее было показано, что гидролиз и синтез АТФ происходит в соответствии с уникальным механизмом чередующегося сродства, впервые описанным П.Д. Бойером. Результаты ренихшострук-турного анализа и ряд уникальных экспериментальных методик привели к

представлениям об АТФ-сиитазе, как о молекулярной машине, в которой перенос протонов сопряжен с вращательным катализом. Приводится описание элементарных процессов, преобразования протон-движущей силы в энергию синтеза. В настоящем обзоре также обсуждается стехиометрия переноса протонов. Приводятся различные экспериментальные методики измерения стехиометрического соотношения и его значения для различных организмов В работе описываются существующие в литературе модели АТФ-сиптазы.

Раздел 1.3 посвящен описанию основных свойств фосфатного переносчика митохондрии. Этот переносчик может быть описан как электронейтральный антипоргер аниона Рг и аниона ОН~, либо как симпорт Рг и иона Я+. Обсуждается природа движущей силы для переноса неорганического фосфата, а также каталитические параметры такого переноса Так, приводятся данные, что только протонированная форма фосфата (Н2РО4 ) может переноситься посредством переносчика.

Раздел 1.5. полностью посвящен существующим кинетическим моделям процессов синтеза АТФ в митохондриях. Приводится 3 примера построения кинетических моделей. Указаны их слабые и сильные стороны.

В главе 2. приведено описание методов исследования Подробно описаны: методика построения каталитического цикла механизма переносчиков или ферментов, вывод функции скорости и различные приближения, упрощающие вывод. Приводятся также методы определения параметров, входящих в функцию скорости и критерии точности их определения Рассматриваются методы изучения поведения построенных моделей, используемые в работе. Перечислены программные и аппаратные средства для моделирования.

Глава 3. представляет собой основную часть работы, содержащую вывод функций скорости работы для отдельных переносчиков, ферментов и описание модели пути фосфорилирования в целом, а также определение значений параметров Раздел 3 1. посвящен выводу уравнений для описания концентраций различных форм метаболитов. Под формами метаболитов здесь подразумеваются комплексы аденилатов и неорганического фосфата с ионами водорода и магния, учет которых важен, поскольку

Т. кт

^ • ТЕТ

ТЕТ

БЕБ

Рис. 1. Кинетическая схема функционирования адениннуклеотид-транслоказы митохондрии. Т, О обозначают АТФ, АДФ соответственно, нижний индекс обозначает локализацию ! — в матриксе, о — в межмембранном пространстве Е-свободная форма переносчика. ХЕУ - тернарный комплекс АНТ с молекулой X со стороны матрикса, У -со стороны межмембранного пространства Линиями показаны процессы образования комплекса Стрелками - процессы транспорта На схеме приведены константы скоростей переноса и константы диссоциации для соответствующих стадий

ферменты и переносчики обладают специфичностью к той или иной форме субстрата Выводится зависимость стационарной концентрации каждой такой формы от полной концентрации метаболитов и ионов. Приводится предварительный рассчет соотношений между формами метаболитов при условиях, близких к физиологическим

Раздел 3.2. посвящен построению модели адениннуклеотид-транслоказы митохондрии. Исходя из кинетических и структурных данных рассматривается димерная модель функциональной единицы переносчика, работающего как два взаимосогласованных канала, переносящих две молекулы аденилатов одновременно в двух направлениях Как показано в работе, это согласуется с кинетическим механизмом работы, структурными данными и результатами экспериментов с ингибиторами Рассматриваются две возможные схемы расположения мономеров в составе функциональной единицы. Исходя из экспериментальных данных для построения модели нами выбирается цис-схема расположения. Исходя из данной схемы построен каталитический цикл функционирования переносчика, изображенный на рисунке 1. Исходя из схемы функционирования и набора экспериментально обоснованных приближений была

Рис 2. Модель адениннуклеотид-транслоказы используемая для вывода зависимости скорости переноса от электростатического потенциала мембраны А, Б, В - ряд последовательных состояний АНТ в процессе переноса. 5т{В) ~ отношение разности потенциалов между местом связывания аденилата с внешней стороны мембраны и свободным состоянием к полной разности потенциала на мембране, - отношение разности потенциалов между местом связывания аденилата с внутренней стороны мембраны и свободным состоянием к полной разности потенциала на мембране, ах, аг - эффективное перемещение аденилатов от устойчивого состояния до максимума потенциального барьера

выведена функция скорости, описывающая зависимость скорости работы переносчика от концентраций метаболитов: уА1*т = /(Д, Т,, 00,Ти).

Зависимость скорости трансмембранного переноса аденилатов от электростатического поля заряженной мембраны мы учитывали через описание зависимости кажущихся кинетических константант от разности потенциала мембраны Для этого мы разбили путь, по которому проходит молекула при переносе условно на три участка (см. рис 2), что позволило в рамках некоторых приближений описать зависимость константы скорости переноса от величины полного потенциала мембраны: к-, = кй{2\а\ф + ^гагф + азф). В полную модель АНТ вошло 11 независимых параметров, которые мы идентифицировали исходя из экспериментальных данных, взятых из работы /1/. С помощью численных методов идентификации параметров удалось добиться хорошего соответствия между экспериментальными данными и результатами моделирования, что показано на рис 3 Основываясь на результатах подбора параметров можно заключить, что около 7% падения электрического потенциала приходится на стадию связывания АТФ. В значительно меньшей степени потенциал влияет на связывание АДФ, однако получить точных оценок такого влияния, основываясь на используемых экспериментальных данных невозможно - требуются дополнительные эксперименты. Вычисленные значения параметров

Рис. 3. Результаты подбора параметров Представлены экспериментальные точки из работы /1/ и теоретические кривые - результаты моделирования после подстановки найденных параметров. А) Зависимость скорости транспорта меченного аденилата от концентрации внешнего меченного АТФ или АДФ; Б) Зависимость скорости транспорта меченного аденилата от внешнего меченного АДФ, В) Зависимость скорости транспорта меченного аденилата от концентрации внешнего меченного АДФ

показали также, что в процессе переноса аденилаты значительно смещаются в направлении переноса, кроме того, имеются заряженные группы в составе мономера АНТ, которые смещаются при переносе аденилатов

Предсказания построенной модели при параметрах близких к физиологическим изображены на рисунке 4. Так, удалось показать, что транспорт АДФ в матрике митохондрии осуществляется только при величине потенциала более 100 мВ, при прочих параметрах близких к физиологическим. При меньших значениях наблюдается обратный перенос Для оценки эффективности работы АНТ было изучено отношение количества перенесенных молекул АДФ к полному числу оборотов переносчика. Рассчет показал, что эффективность работы АНТ не превышает 0,5 даже при высоких значений потенциала. Учет множественности форм аденилатов (Мд2+, Несвязанные формы) позволил оценить влияние рН на скорость переноса аденилатов рис.4. Сравнение построенной модели с прочими моделями АНТ из литературы показал, что наша модель точнее описывает переносчик как по величине невязки, так и по критерию Акаике.

Рис 4 А) Зависимость скорости обмена АТФ/АДФ от концентрации внешней АДФ при различных значениях потенциала на мембране Б) Зависимость скорости обмена АТФ/АДФ от потенциала на мембране В) Зависимость эффективности обмена АТФ/АДФ (отношение скорости обмена к полному числу оборотов) от потенциала на мембране. Г) Зависимость скорости обмена АТФ/АДФ от величины рН внутри и снаружи митохондрии. Каждая кривая отражает изменение значения в одном из компартментов при фиксированной рН в другом

Раздел 3.3. посвящен построению модели Н+-АТФ-синтазы Модель включает в себя как описание механизма чередования сродства в каталитических центрах, так и процесс векторного переноса протонов через внутреннюю мембрану митохондрии. Ряд экспериментально обоснованных приближений позволил упростить вывод функции скорости синтеза/гидролиза АТФ Влияние векторного переноса протонов на направление и скорость работы АТФ-синтазы учитывалось путем рассмотрения статистического ансамбля 7-субъединиц, связанных с кольцом с-субъединиц. Была выведена функция распределения (см. рис. 5) по энергетическим состояниям субъединиц в зависимости от угла скручивания упругого стержня 7-субъединицы, а затем произведен переход от характеристик микросостояний к величине константы скорости реакции синтеза/гидролиза, путем усреднения всех возможных переходов исходя из функции распределения.

Исходя из кинетических и структурных данных о функционировании АТФ-синтазы и схемы Бойера чередующегося сродства нами был постро-

21п2

Рис. 5. Вид функции распределения состояний упругих стержней по углам скручивания.

ен каталитический цикл фермента (см. рис. б). С использованием ряда приближений для быстрых стадий катализа, методом Кинга-Альтмана была выведена функция скорости синтеза АТФ. Зависимость скорости катализа от потенциала мембраны и разности рН учитывалось через изменение константы скорости, что было описано выше. В итоге была выведена функция скорости, содержащая семь независимых параметров, которые мы идентифицировали исходя из экспериментальных данных по кинетике АТФ-синтазы, найденных в литературе /2/. С помощью численных методов идентификации параметров удалось добиться хорошего соответствия между экспериментальными данными и результатами моделирования, что показано на рис. 7. Основываясь на оценке параметров, можно заключить, что константы скорости диссоциации АТФ и АДФ в двух каталитических центрах имеют одинаковый порядок. Константа диссоциации для АТФ в три раза больше, чем для АДФ. Кроме того показано, что потенциал мембраны влияет как на скорость гидролиза, так и на синтез АТФ при любых физиологических условиях

Предсказания построенной модели, при параметрах, близких к физиологическим, изображены на рисунке 8. С помощью данного моделирования удалось показать, что при значениях АДФ выше 5 мМ скорость работы АТФ-синтазы изменяется незначительно. Кроме того, из графиков видно, что при значениях концентраций Р1 от 10 мМ и выше, скорость сип-

Рис б. Каталитический цикл, используемый для вывода функции скорости АТФ-синтазы.

Рис 7 Сравнение результатов экспериментальных данных из работы /2/ и моделирования после идентификации параметров

Рис. 8. А) Зависимость скорости синтеза АТФ от концентрации АДФ при различных концентрациях неорганического фосфата Значения параметров рНг = 7,8; рН0 = 7,2, Мд2+ = 0,32 мМ; Г, = ЮтМ - Д, Д-ф = 180 мВ. Б) Зависимость скорости синтеза АТФ от концентрации Pi. Значения параметров. рН, = 7,8, рН0 = 7,2; Мд2+ = 0,32 мМ, Тг = 3 мМ, Д = 7; Д^ = 180 мВ В) Зависимость скорости синтеза АТФ от величины рН Значения параметров рНг = 7,8; рН0 = 7,2, Мд2+ = 0,32 мМ; Тг = 3 мМ, Д = 7, Рг = 20 мМ, Дт/> = 180 мВ Г) Зависимость скорости синтеза АТФ от величины электрического потенциала Значения параметров рЯ, = 7,8, рН0 = 7,2, Мд2+ = 0,32 мМ, Тг = 3 мМ, Д = 7, Рг = 20 мМ.

теза практически не изменяется. Графики 8В,Г показывают, что как электрический потенциал, так и разность влияют на скорость гидролиза и синтеза во всем диапазоне условий. В разделе 3.4. приводится построение стационарной модели фосфатного переносчика митохондрии.

Раздел 3 5. посвящен описанию объединенной модели системы фос-форилирования митохондрии, включающей в себя адениннуклеотид-транслоказу, Н+-АТФ-синтазу, фосфатный переносчик, а также процессы образования различных форм метаболитов. Схема на рис. 9 предста-ляет собой метаболическую карту взаимодействий различных участников описываемой системы. На основе приведенной схемы и выбранных ранее приближений была составлена система дифференциальных уравнений, описывающих зависимость концентраций метаболитов от времени. Кроме определенных в предыдущих разделах параметров, система содержит два неизвестных параметра - активности адениннуклеотид-транслоказы н Н+-АТФ-сингазы, которые необходимо было определить исходя из экснерлмен-

межмембранное пространство

(МдНР04)„-^-(НР0Л),

Мд."

н; (нгРОЛ

,ч

(МдНРОЛ~^-(НРОЛ

МдГ

матрикс

Рис 9. Схема для описания системы фосфорилирования митохондрии, используемая для построения модели. На схема указаны также процессы образования магниевых и протонированных форм метаболитов

тальных данных. Такие экспериментальные данные были получены нами в сотрудничестве с лабораторией нейробиохимии Университета Будапешта в Венгрии под руководством В. Адам-Визи. Использованная оригинальная экспериментальная методика позволяет проводить измерения концентраций АТФ, АДФ и потенциала мембраны в режиме реального времени В итоге удалось получить данные, представленные на рисунке 10, где представлены результаты экспериментов с разобщителем и ингибитором АНТ. Используя численные методы, удалось определить неизвестные параметры уравнения. Сравнить, насколько результаты моделирования после идентификации параметров соотвествуют экспериментальным данным можно на рисунке 10. Исходя из экспериментальных данных удалось определить активность АНТ, для АТФ-синтазы удалось найти только нижнюю границу активности. Таким образом, нами была численно описана система фосфо-рилирования митохондрии гепатоцита крысы. С учетом литературных данных о коэффициентах управления для АНТ и АТФ-синтазы и используя данную систему можно сделать количественные предсказания поведения системы в условиях, близких к физиологическим. Результаты моделирования представлены на рисунке 11. С помощью моделирования зависимости

Рис. 10. Сравнение экспериментальных данных и результатов моделирования системы фосфорилирования митохондрии после определения параметров. А) Зависимость стационарной скорости образования АТФ в зависимости от потенциала мембраны (эксперимент с разобщителем) Б) Зависимость стационарной скорости образования АТФ в зависимости от количества разобщителя сАТР В) Зависимость потенциала мембраны от количества разобщителя.

выхода АТФ из митохондрии при фиксированных концентрациях внеми-тохондриальных метаболитов (рис 11 А) удалось показать, что только при значении потенциала более 100 мВ наблюдается синтез АТФ. При меньших значениях наблюдается гидролиз АТФ, независимо от значения активности АТФ-синтазы. Величина разности рН влияет на скорость синтеза АТФ в диапазоне ДФ от 60 до 160 мВ, поскольку при больших значениях фосфорилирование определяется исключительно скоростью работы АНТ, на которую разность рН влияет незначительно. При возрастании внешней энергетической нагрузки (АДФ/АТФ) скорость синтеза значительно увеличивается, что объяснимо с точки зрения физиологии клетки. Действительно, высокие концентрации АДФ в клетке могут быть опасны, чего митохондрия пытается избежать, увеличивая скорость гидролиза.

Кроме того, была построена зависимость концентрации внутренних аденилатов от энергизации митохондрии. Ранее, концентрации метаболитов пытались получить экспериментально, однако, поскольку соотношение АТФ/АДФ в матриксе сложно измерить экспериментально, были получены довольно противоречивые данные. Полученная нами теоретическая

Рис. 11. А) Зависимость скорости фосфорилирования в митохондрии от потенциала мембраны- ADP0 = 50 мкМ; АТР0 = 2 мМ; рН0 = 7,2; Мд0 = 1 мМ, Мдг — 0,35 мМ, Рг0 = 10 мМ. Б) Зависимость скорости фосфорилирования митохондрии от энергетической нагрузки. АТР0 = 2 мМ, рН0 = 7,2, рНх = 7,8; Мд0 = 1 мМ, Mgt = 0,35 мМ, Рг0 = 10 мМ. В) Зависимость стационарной концентрации АТФ от потенциала мембраны (данные для двух активностей АТФ-синтазы). АТР0 = 2 мМ; ADP0 = 50 мкМ; рНа = 7,2, рНг = 7,8, Мд0 = 1 мМ, Мд, — 0,35 мМ, Pi0 = 10 мМ Г) Зависимость стационарной полной концентрации Pi от разности рН рН0 = 7,2, рНг = 7,8, Мдв = 1 мМ; Мдг = 0,35 мМ, Рг0 = 10 мМ

зависимость является чувствительной по отношению к активности АТФ-синтазы. Так, при минимальном значении активности, концентрация АТФ в матриксе имеет ярко выраженый минимум, что можно объяснить низкой скоростью работы АТФ-синтазы при низких значениях потенциала В этом случае, концентрация аденилатов в матриксе будет определяться работой АНТ и распределяться в соответствии с разностью потенциалов мембраны и концентрацией аденилатов со стороны межмембранного пространства. При увеличении активности АТФ-синтазы минимум сглаживается, поскольку в этом случае соотношение АТФ/АДФ распределяется в соответствии с приближением быстрого равновесия для АТФ-синтазы и не зависит от работы АНТ. Была также построена зависимость стационарной концентрации неорганического фосфата в матриксе (рис. 11Г), которая полностью определяется разностью рН на мембране.

На основе результатов, полученных в данной работе были сделаны следующие выводы-

1) Подход, в рамках которого зависимость скорости работы фермента или переносчика от величины энергизации митохондрии учитывается через зависимость кажущихся кинетических констант от значения потенциала мембраны, позволяет количественно описать существующие экспериментальные данные.

2) Подход, применяемый в настоящей работе, позволяет описать функционирование ферментов и переносчиков точнее, чем ранее использовавшиеся методы, как по величине невязки, так и по интегральному критерию Акаике

3) Функционирование адениннуклеотид-транслоказы хорошо описывается кинетикой ИапсЬт В1-В1 (классификация Клеланда)

4) Электрический потенциал значительно влияет как на стадию связывания аденилатов с адениннуклеотид-транслоказой, так и на стадию их переноса.

5) Эффективность работы адениннуклеотид-транслоказы не превышает 0,5 при потенциале мембраны от 0 до 200 мВ

6) Транспорт АДФ в матрикс митохондрии при физиологических параметрах осуществляется при значении потенциала мембраны митохондрии более 100 мВ.

7) В составе функциональной субъединицы АНТ, по-видимому, присутствуют заряженные группы, смещаемые в процессе переноса аденилатов.

8) Потенциал мембраны и разность рН влияют как на скорость синтеза, так и скорость гидролиза АТФ АТФ-синтазой.

9) Константа скорости диссоциации АТФ и АДФ в двух каталитических центрах (О, Ь) АТФ-синтазы составляют величину порядка 102 с-1, что многократно превышает константу скорости катализа

10) При высоком значении потенциала (160-190 мВ) насыщающая концентрация неорганического фосфата в матриксе составляет около 10

мМ, насыщающая концентрация АДФ в матриксе составляет около 5 мМ.

11) Величина протон-движущей силы значительно влияет на скорость работы АТФ-синтазы во всем физиологическом диапазоне значений (0-190 мВ).

12) Синтез АТФ митохондрией происходит при потенциале от 100 мМ и выше, при более низких значениях потенциала наблюдается гидролиз

13) При потенциале от 160 мВ скорость синтеза АТФ не зависит от ДpH

14) При возрастании внешней нагрузки скорость синтеза АТФ увеличивается.

15) Зависимость концентрации АТФ в матриксе может иметь минимум.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Kramer R., Klingenberg М. Electrophoretic control of lecoiistructed adenine nucleotide translocation (1982) Biochemistry, 21(5), 1082-1089.

[2] Panke 0., Rumberg B. Kinetic modelling of the proton translocating CF0Fi-ATP synthase from spinach. FEBS Lett. (1996) V.383(3) p 196200.

Основное содержание диссертационной работы изложено в следующих публикациях:

1) Metelkm Е, Goryanin I., Demin О. Mathematical Modeling of Mitochondrial Adenine Nucleotide Translocase. Biophysical Journal 2006. V.90, pp.423-432.

2) Метелкин E. «Кинетическая модель адениннуклеотид-транслоказы митохондрии», Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005», Москва, С. 67.

3) Metelkin Е. «Kinetic Model of Mitochondrial Adenine Nucleotide Translocase», 12th International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 2004), Glasgo, p.217.

4) Demin O, Lebedeva G , Zobova E., Metelkin E., Plyusmna T, Lavrova A., Gizzatkulov N. «Strategy to develop laige-scale kinetic models», E.Coli. 2nd International E Coli Alliance Conference on System Biology Project Gemini, Canada, 2004.

5) Metelkin E, Demm O. «Mathematical Modeling of Mitochondrial Adenine Nucleotide Translocase», 12th International conference «Mathematics.Computer.Education.», Pushchino, 2005.

6) Metelkin E, Demin 0 «Mathematical Modeling of H+-ATP-synthase», 15th International conference «Mathematics.Computer Education.», Dubna, 2008.

7) Metelkin E., Demm O. «A Kinetic Model of Mitochondnal ATP-synthase. the binding change machanism», Systems Biology: redefining BioThermoKinetics, Trakai, Lithuania, 2006, p.56.

8) Metelkin E, «Kinetic Model of Mitochondrial Adenine Nucleotide Translocase», Russian Bioenergetics: from molecule to the cell, Moscow, Russia

Подписано к печати -¡(>,09,0% Тираж Р>0 Заказ НО

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Метёлкин, Евгений Александрович

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Адениннуклеотид-транслоказа.

1.1.1. Механизм функционирования АНТ

1.1.2. Кинетические модели АНТ.

1.2. Н+-АТФ-синтаза.

1.2.1. Субъединичный состав и структура.

1.2.2. Схема чередующегося сродства.

1.2.3. Экспериментальные наблюдения вращательного катализа

1.2.4. Преобразование протон-движущей силы в механическое вращение.

1.2.5. АТФ-синтаза как молекулярная машина.

1.2.6. Экспериментальные измерения стехиометрии Л+/АТФ

1.2.7. Каталитические свойства РхРо- и Рх-АТФ-синтазы

1.2.8. Кинетические модели Н+-АТФ-синтазы.

1.3. Фосфатный переносчик митохондрии

1.4. Модели фосфорилирующей системы, построенные ранее

2. Методы, используемые при моделировании

2.1. Алгоритм построения модели.

2.2. Программные и аппаратные средства.

3. Построение модели и результаты

3.1. Моделирование процессов связывания метаболитов с ионами Mg2+, Н+

3.1.1. Вывод формул для связывания метаболитов с ионами

3.1.2. Предварительные оценки соотношений между различными формами метаболитов

3.2. Модель адениннуклеотид-транслоказы.

3.2.1. Механизм функционирования АНТ

3.2.2. Уравнение скорости АНТ.

3.2.3. Зависимость параметров уравнения скорости от электрического потенциала.

3.2.4. Идентификация параметров модели АНТ.

3.2.5. Обсуждение результатов моделирования АНТ

3.3. Модель Н+-АТФ-синтазы митохондрии.

3.3.1. Модель переноса протонов через мембрану.

3.3.2. Образование фермент-субстратного комплекса и изменение конформации фермента

3.3.3. Идентификация параметров модели АТФ-синтазы . . 88 3.314. Промежуточные результаты по моделированию Н+

АТФ-синтазы.

3.4. Модель фосфатного переносчика миохондрии.

3.5. Модель системы фосфорилирования митохондрии.

3.5.1. Описание системы.

3.5.2. Система дифференциальных уравнений.

3.5.3. Размерности параметров и переменных модели

3.5.4. Экспериментальные данные для верификации модели

3.5.5. Верификация модели

3.516. Результаты моделирования системы фосфорилирования митохондрии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетическое моделирование системы фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов"

Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается значительный прогресс в численных точных методах описания молекулярных механизмов жизнедеятельности клетки. Этому способствует как развитие вычислительной техники, так и разработка новых экспериментальных технологий. Действительно, в настоящее время существуют методы, позволяющие проводить поточные измерения на системах in vivo и in vitro, то есть, регистрируя одновременно несколько характеристик в режиме «реального времени». Развитие автоматизированных экспериментальных установок, появление возможности хранения и обработки больших объемов данных привело к необходимости более тщательно анализировать и интерпретировать полученные данные. Для решения такого рода задач была выделена' специальная область науки, названная «системной биологией». Одним из возможных способов обработки экспериментальных данных для выяснения особенностей функционирования живых систем, а также предсказаний функционирования этих систем в условиях, отличных от экспериментальных, является различные методы моделирования. Применительно к данным, характеризующим изменения концентраций и скоростей биохимических реакций, наиболее эффективным и точным методом является кинетическое моделирование ферментативных систем. Несмотря на то, что кинетическое моделирование развивается уже несколько десятков лет, практи-, ческое их использование для биоинженерных и биомедицинских задач стало актуальным только недавно, после появления достаточного количества точных экспериментальных данных и мощной вычислительной техники, доступной рядовому исследователю. Так, ранее большинство кинетических моделей имели качественный характер (то есть не ставили задачу описания точных количественных данных), а сложность (количество компонент) описываемых систем была невысока. В настоящее время описываемые системы усложняются, количество компонент может достигать нескольких сотен и тысяч, а требования к точности все время повышаются. Кроме того, практическое использование кинетического моделирования диктует, необходимость построения моделей нового типа, описывающих также метаболическую и генетическую регуляцию метаболизма, эффекты, связанные с многокомпартмептным системами, процессы на границах раздела двух и более компартментов, а также эффекты влияния электрических зарядов на мембранах клетки. Все эти задачи стимулируют разработку новых методов и подходов к построению моделей.

Примером такой многокомпартмеитной системы со значительным влиянием мембранного потенциала на скорости реакций является митохондрия, построению частичной модели которой посвящена данная работа. ,

Система транспорта и фосфорилирования в митохондрии состоит из ферментов и переносчиков, со сложным механизмом работы, который зачастую неизвестен или пока не описан с помощью дифференциальных уравнений. Кинетическое моделирование, решающее фундаментальную задачу описания функционировании фермента/переносчика, могло бы помочь выбрать из существующих гипотез функционирования отдельных компонент системы ту, которая наиболее соответствует экспериментальным данным. В частности, для физиологически значимого переносчика аденилатов (АНТ) до сих пор не известен механизм работы и кинетические константы элементарных'стадий. Кроме того, имеется такой практический (прикладной) • аспект моделирования данной системы, как предсказание поведения системы фосфорилирования в различных условиях, подбор оптимальных условий для экспериментальных измерений, при которых наблюдается тот или иной эффект. Более того, многие практические биомедицинские задачи не могут быть решены только экспериментально из-за сложности проведения эксперимента, таким образом, постренная модель могла бы стать вспомогательным инструментом при изучении влиянии различных биоактивных веществ на метаболизм, например, при тестировании лекарств.

Целью данной диссертационной работы является выявление и описание с помощью разработанных теоретических методов особенностей функ-} ционирования и регуляции системы фосфорилирования митохондрии, а также ее отдельных компонент.

Для достижения поставленной цели в рамках настоящей работы решались следующие основные задачи:

1) Разработать подход для описания зависимости скорости работы ферментов и переносчиков, располагающихся на границе двух компарт-ментов, от разности электрохимических потенциалов на мембране;

2) На основе разработанного метода создать детальные стационарные, модеди АТФ-синтазы, АТФ/АДФ-антипортера, переносчика неорганического фосфата митохондрий;

3) Построить кинетическую модель системы фосфорилирования в митохондриях клеток печени;

4) Сделать предсказания особенностей функционирования ферментов и переносчиков в широком диапазоне условий;

5) Получить с помощью кинетической модели ответы системы на изменение внешних условий - энергетической нагрузки, концентраций метабрлитов, наличие ингибитора.

Научная новизна. Разработан новый подход, позволяющий описать зависимость скорости работы переносчиков и ферментов от потенциала мембраны. Данный подход позволяет использовать кинетические модели для создания «больших моделей» метаболических систем, функционирование отдельных частей которых зависят от потенциала. Модели такого рода могут быть использованы для явного задания функции скорости в дифференциальных уравнениях, в отличие от использовавшегося ранее подхода, в котором система описывалась статистическими методами. В работе впервые, исходя из кинетических и структурных данных,построена' кинетическая модель АТФ/АДФ-антипортера, которая учитывает зависимость кажущихся параметров от разности потенциала на мембране. Для модели определены кажущиеся и реальные параметры элементарных стадий. На основе механизма чередующегося сродства построена модель АТФ-синтазы, которая объединена с моделью переноса протонов, которая описывается одной функцией. Ранее созданные модели АТФ-синтазы представляли собой либо модели Рх-комплекса, либо модели переноса протонов через Ро-комплекса, не связанные между собой, причем ранее описание функционирования комплексов решалось статистическими методами, а не. с помощью; дифференциальных уравнений. Была построена модель фос-форилирующей системы митохондрии. Для верификации параметров этой модели использовались экспериментальные данные, полученные в сотрудничестве с нашими коллегами, использовавшими ряд оригинальных экспериментальных разработок. Так впервые удалось построить модель, которая количественно точно описывает зависимость основных характеристик энергетического метаболизма от концентраций метаболитов и потенциала мембраны.

Практическое значение. Методика описания зависимости скорости катализа или транспорта от потенциала через его влияние на элементарные I стадии может быть также использована для других систем, где влияние электрического потенциала существенно. Построенная модель фосфорили-рующей системы митохондрии может быть использована для решения прикладных задач как самостоятельно, так и в составе более сложных систем, таких как система окислительного фосфорилирования митохондрии и т.п. Результаты такого моделирования могут быть использованы для решения, в частности, биомедицинских задач, таких как тестирование лекарственных средств для изучения влияния последних на систему энергетического метаболизма или изучения влияния ядов на систему.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семи научных конференциях, в том числе на третьей европейской конференции по вычислительной биологии (Глазго, 2004), на второй международной конференции по системной биологии (Канада, 2004), на Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005), на 12 международной конференции по био- ■ термокинетике (Тракай, 2006), на 12 международной конференции «Математика.Компьютер.Образование.» (Пущино, 2005), на 15 международной конференции «Математика.Компьютер.Образование.» (Пущино, 2008), на конференции «Российская биоэнергетика: от молекул клетке» (Москва, 2005).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Метёлкин, Евгений Александрович

Выводы

1) П0ДХ9Д, в рамках которого зависимость скорости работы фермента или п.ереносчика от величины энергизации митохондрии учитываетI ся через зависимость кажущихся кинетических констант от значения потенциала мембраны, позволяет количественно описать существующие экспериментальные данные.

2) Подход, применяемый в настоящей работе, позволяет описать функционирование ферментов и переносчиков точнее, чем ранее использовавшйеся методы, как по величине невязки, так и по интегральному критерию Акаике.

3) Функционирование адениннуклеотид-транслоказы хорошо описывается кинетикой Random Bi-Bi (классификация Клеланда).

4) Электрический потенциал значительно влияет как на стадию связывания аденилатов с адениннуклеотид-транслоказой, так и на стадию их переноса.

5) Эффективность работы адениннуклеотид-транслоказы не превышает 0,5 при потенциале мембраны от 0 до 200 мВ. Этот эффект ранее экспериментально не регистрировался.

6) Транспорт АДФ в матрикс митохондрии при физиологических параметрах осуществляется при значении потенциала мембраны митохондрии более 100 мВ.

7) В составе функциональной субъединицы АНТ, по-видимому, присутствуют заряженные группы, смещаемые в процессе переноса аденилатов. Для проверки данного вывода необходимо экспериментальное I исследование.

8) Потенциал мембраны и разность рН влияют как на скорость синтеза, так и на скорость гидролиза АТФ АТФ-синтазой.

9) Методами кинетического моделирования подтверждены ранее полученные данные, что константа скорости диссоциации АТФ и АДФ в двух каталитических центрах (О, L) АТФ-синтазы составляют величину порядка 102 с-1, что многократно превышает константу скорости катализа.

10) При высоком значении потенциала (160-190 мВ) насыщающая концентрация неорганического фосфата в матриксе составляет около 10 мМ, насыщающая концентрация АДФ в матриксе составляет около 5 мМ.

11) Величина протон-движущей силы значительно влияет на скорость работы АТФ-синтазы во всем диапазоне значений , от 0 до 190 мВ.

12) Синтез АТФ митохондрией происходит при потенциале от 100 мВ' и выше, и концентрации внематриксной АДФ порядка 10 мкМ, при более низких значениях потенциала наблюдается гидролиз.

13) Впервые показано, что при потенциале от 160 мВ скорость синтеза АТФ митохондрией не зависит от АрН.

14) При возрастании внешней нагрузки (АДФ0/АТФ0) скорость синтеза АТФ митохондрией увеличивается.

15) Зависимость концентрации АТФ от значения потенциала мембраны в матриксе митохондрии может иметь локальный минимум, что раннее-не измерялось экспериментально.

Благодарности

Я выражаю глубокую признательность своему научному руководителю, Рууге Эино Куставичу.

Благодарю своего научного консультанта, Дёмина Олега Владимировича, за помощь в изучении методики построения и исследования кинетических моделей сложных биохимических путей. Выражаю благодарность I академику Скулачеву Владимиру Петровичу за обсуждение и критику модели адени'ниуклеотид-транслоказы. Выражаю благодарность венгерской группе исследователей, предоставивших свои экспериментальные данные, за возможность участвовать в планировании эксперимента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Метёлкин, Евгений Александрович, Москва

1. Abrahams J., Leslie A., butter R., Walker J. Structure at 2.8 A resolution of Fl-ATPase from bovine heart mitochondria // Nature. - 1994. - Vol. 370. - P. 621-628.

2. Boyer< P.D. Oxidative phosphorylation and photophosphorylation //, Annu.jRev. Biochem. - 1977. - Vol. 46. - P. 957-966.

3. Noji H., Yasuda R., Yoshida M., Kinoshita K.Jr. Direct Observation of the Rotation of Fl-ATPase // Nature. - 1997. - Vol. 386. - P. 299-302.

4. Kinoshita K.Jr., Yasuda R., Noji H., Ishiwata S., Yoshida M. Fl-ATPase: A Rotary Motor Made of a Single Molecule // Cell. - 1998. - Vol. 93. -P. 21-24.

5. Sabbert D., Engelbrecht S., Junge W. Intersubunit rotation in active F- ATPase // Nature. - 1996. - Vol. 381. - P. 623-625.

6. Boyer' P.D. The binding change mechanism for ATP synthase-some probabilities and possibilities // Biochim. Biophys. Acta. - 1993. - Vol. 1140. - P. 215-250.

7. Cross RL. The mechanism and regulation of ATP synthesis by F l- ATPases // Annu. Rev. Biochem. - 1981. - Vol. 50. - P. 681-714.

8. Weber J., Senior A.E. Catalytic mechanism of Fl-ATPase // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. - Vol. 1319. - P. 19-58.

9. Kay alar C, Rosing J., Boyer P.D. An alternating site sequence for oxidative phosphorylation suggested by measurement of substrate binding patterns and exchange reaction inhibitions // J. Biol. Chem. - 1997. Vol. 252. - P. 2486-2491.

10. Perez J.A., Ferguson S.J. Kinetics of oxidative phosphorylation in Paracoccus denitrificans. 1. Mechanism of ATP synthesis at the active' site(s)'of FOFl-ATPase // Biochemistry. - 1990. - Vol. 29. - P. 10503-10518.

11. Бойер П.Д. На пути к пониманию каталитического механизма АТР- Синтетазы // Биохимия. - 2001. - Т. 66, Вып. 10. - 1312-1322.

12. Murataliev М.В., Boyer P.D. Interaction of mitochondrial Fl-ATPase with trinitrophenyl derivatives of ATP and ADP. Participation of third catalytic site and role of Mg 2+ in enzyme inactivation // J.Biol.Chem. -1994. T Vol. 269. - P. 15431-15439.

13. WeberJ., Senior A.E. ATP synthase: what we know about ATP hydrolysis and what we do not know about ATP synthesis // Bochim. Biophys. Acta. - 2000. - Vol. 1458. - P. 300-309.

14. Allison W.S. Modulation of 2,6-dinitrotoluene genotoxicity by alachlor treatment of Fischer 344 rats // Ace. Chem. Res. - 1998. - Vol. 31. - P. 819-826.

15. Leslie A.G.W., Walker J.E. Structural model of Fl-ATPase and the implications for rotary catalysis // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. - 2000. - Vol. 355. - P. 465-472.

16. Yasida R., Noji H., Yoshida M., Kinosita K., Hiroyasu I. Resolution of distinct rotational substeps by submillisecond kinetic analysis of Fl-ATPase // Nature. - 2001. - Vol. 410. - P. 898-904.

17. Boyer P.D., Kohlbrenner W.E. Energy Coupling in Photosynthesis (Selman В., Selman-Reiner S., eds). - New York, Elsevier/North Holland, 1981 - P. 231-240.

18. Duncan T.M., Bulygin V.V., Hutcheon M.S., Cross R.L. Rotation of subunits during catalysis by Escherichia coli Fl-ATPase // Proc. Natl. Acad. ,Sci. USA. - 1995. - Vol. 92. - P. 10964-10968.

19. Elston' Т., Wang H., Oster G., Energy traunsduction in ATP synthase // Nature. - 1998. - Vol. 391. - P. 510-513.

20. Wang H., Oster G. Energy transduction in the F l motor of ATP synthase // Nature. - 1998. - Vol. 391. - P. 279-282.

21. Walker J.E., Saraste M., Gay N.J. The unc operon. Nucleotide sequence, regulation and structure of ATP-synthase // Biochim. Biophys. Acta. -1984. - Vol. 768. - P. 164-200.

22. Watts S.D., Watts Y., Zhang R., FilUngame H., Kapaldi R.A. The gamma, subuni;t in the Escherichia coli ATP synthase complex (ECF1F0) extends through the stalk and contacts the с subunits of the F0 part // FEBS 1.ett. - 1995. - Vol. 368. - P. 235-238.

23. Groth G., Walker J. E. Model of the c-subunit oligomer in the membrane domain of F-ATPases // FEBS Lett. - 1997. - Vol. 410. - P. 117-123.

24. Panke 0., Rumberg В. Kinetic modeling of rotary CF0F1-ATP synthase: storage of elastic energy during energy transduction // Biochem. Biophys. Acta. - 1999. - Vol. 1412. - P. 118-128.

25. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. - М.: Наука, 1989. г

26. К адата Y., Racker Е. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation XXV. Reconstruction of vesicles catalyzing 32Pi.-adenosine triphosphate exchange // J. Biol. Chem. - 1971. - Vol. 246. - P. 5477-5487.

27. Fang J., Jackobs J.M., Kanner B.J., Racker E., Bradshaw R. A. Amino acid sequence of bovine factor 6 // Proc. Nat. Acad. Sci. US. - 1984. -Vol. 81. - P. 6603-6607.

28. Kagava Y. Proton motive ATP synthesis. Bioenergetics - Edl. Ernster. Amsterdam. NY, Oxford. Elsevier, 1984. - P. 149-157.

29. Walker J.E., butter R., Dupuis A., Runswick M.J. Identification of the subunits of FIFO-ATPase from bovine neart mitochondria // Biochemistry. - 1991. - Vol. 30. - P. 5369-5378.

30. Walker J.E., Runswick M.J., Poulter L. ATP synthase from bovine mitochondria. The characterization and sequence analysis of two membrane-associated sub-units and of the corresponding cDNAs // J. Mol. Biol. - 1987. - Vol. 197. - P. 89-100. i' ,

31. Van Walraven H.S., Strotmann H., Schwarz 0., Rumberg B. The H+/ATP coupling ration of the ATP synthase from thiol-modulated chloroplasts and cyanobacterial strains is four // FEBS Lett. - 1996. -Vol. 379. - P. 309-313.

32. Stock D., Leslie A.G., Walker J.E. Molecular architecture of the rotary motor in ATP synthase // Science. - 1999. - Vol. 286. - P. 1700-1705.

33. Seelert H., Poetsch A., Dencher N.A., Engel A., Stahlberg H., Muller D.J. Structural biology. Proton-powered turbine of a plant motor // Nature. -2000. - Vol. 405. - P. 418-419.

34. Fergus'on S.J. ATP synthase: What dictates the size of a ring? // Current Biology. - 2000. - Vol. 10. - P. R804-R808.

35. Scemidt R.A., Williams J.R., Brusilow W.S.A. Effects of carbon source on expression of F0 genes and on the stoichiometry of the с subunit in the FOFlATPase of Escherichia coli // J. Bacteriol. - 1998. - Vol. 180. - P. 3205-3208.

36. Cross R.L., Boyer P.D. Evidence for detection of AT32P bound at the couplingsites of mitochondrial oxidative phosphorylation // Biochem. a. Biophys. Res. Commun. - 1973. - Vol. 51. - P. 56-59.

37. Boyer P.D. Cross R.L., Momsen W. A new concept for energy coupling in oxidative phosphorylation based on a molecular explanation of the oxygen г , exchange reactions // Proc. Natl. Acad. Sci. US. - 1973. - Vol. 70. - P.' 2837-2839.

38. Skulachev V.P., Kozlov LA. H+-ATPase: a substrate translocation concept // Curr.Top. Membr. A. Transp. - 1982. - Vol. 16. P. 285-301.

39. Скулачев В.П., Козлов И.А. Протонные аденозиитрифофатазы. - М.: Наука, 1977. - 93с.

40. Skulachev V.P., Kozlov LA. H+-ATPase and membrane energy coupling // Biochim. Biophys. Acta. - 1977. - Vol. 463. P. 29-89. i' i

41. Bragg P.D. The ATPase complex of Escherichia coli // Canad. J. Biochem. and Cell Biol. - 1984. - Vol. 62. - P. 1190-1197.

42. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gay N.J. Distantly related sequences in the a- and /5-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold // EMBO J. - 1982. - Vol. 1. - P. 945-951.

43. Harris D.A., Boork J., Baltscheffsky M. Hydrolysis of ATP by the isolated catalytic subunit of the coupling ATPase from Rhodospirillum rubrum // Biochemistry. - 1985. - Vol. 24. - P. 3876-3883.

44. Minko'v LB., Vasilyeva E.A., Fitin A.F., Vinogradov A.D. Differential effects of ADP on ATPase and oxidative phosphorylation in submitochondrialparticles // Biochem. Intern. - 1980. - Vol. 1. - P. 478-485.

45. Vinogradov A.D. Steady state kinetics of the ATP hydrolysis and synthesis by mitochondrial ATP synthase complex: XVI FEBS Meet. Abstr. Moscow. - 1984. - p.68.

46. Harris D.A., Boork J., Baltscheffsky M. Hydrolysis of ATP by isolated, catalytic subunits of the coupling ATPase from Rhodospirillum rubrum // Biochemistry. - 1985. - Vol. 24. - P. 3876-3883.

47. Chernyak B.V., Kozlov LA. Adenylylimidodiphosphate release from'the active site of submitochondrial particles ATPase // Ibid. - 1979. - Vol. 104. - P. 215-219.

48. Kozlov L.A., Chernyak B.V. Regulation of H+-ATPases in oxidative and photophosphorylation // Trends Biochem. Sci. - 1986. - Vol. 11. - P. 32-35.

49. Skulachev V.P. Pathways of generation and utilization of electrochemical' potential of H + ions in biomembranes // Sovjet scientific review. Sec.D / Ed.V.P. Skulachev. Amsterdam: OPA, 1980c. - Vol. 1. - P. 83-156.

50. Frangione В., Rosenwasser E., Penefsky H.S., Pullman M.E. Amino acid sequence of the protein inhibitor of mitochondrial adenosine triphosphatas // Proc. Nat. Acad. Sci. US. - 1981. - Vol. 78. - P. 7403-7407.

51. Bulygin V.V., Vinogradov A.D. Interaction of Mg2+ with FOFlmitochondrial ATPase as related on its slow active/inactive transition // Biochem. J. - 1991. - Vol. 276. - P. 149-156.

52. Bronnikov G.E., Zakharov S.D. Microquantitative determination of Pi- ATP and ADP-ATP exchange kinetics using thin-layer chromatography on silica gel // Anal. Biochem. - 1983. - Vol. 131. - P. 69-74.

53. Cleland W. W. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products // Biochem. Biophys. Acta. - 1963. - Vol. 67. - P. 104-137.

54. Скулачев В. П. Энергетика биологических мембран- М.: Наука, 1989. - 266 с.

55. Холоденко Б.Н. Стабилизирующая регуляция в полиферментных системах: Дис. док. биол. наук. М. 1988.

56. Холоденко Б.Н. Митохондриальный переносчик аденилатов осуществляет регуляцию производства АТФ в физиологическом диапазоне скоростей дыхания // Биофизика. - 1984, №29, - 453-458.

57. Холоденко Б.Н. Регуляторные характеристики метаболических систем, Метаболическая регуляция физиологического состояния: Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума. - Пущино, 1984. - 36-37.

58. Alberty R.A. Equilibrium calculations on system of biochemical reactions at specified pH and Mg // Biophys. Chem. - 1992. - Vol. 42. - P. 117-131.

59. Aprilla J.R., Austin J. Regulation of the mitochondrial adenine nucleotide pool size // Arch. Biochem a. Biophys. - 1981. - Vol. 212. P. 689-699.

60. Aquila H., Eiermann W., Klingenberg M. Incorporation of N-' ethylnialeimide into the membrane-bound ADP/ATP translocator // Europ. J. Biochem. - 1982. - Vol. 122. - P. 133-139.

61. Aquila H., Klingenberg M. The reactivity of SH-groups in the ADP/ATP carrier isolate from beef heart mitochondria // Europ. J. Biochem. - 1982. - Vol. 122. - P. 141-145.

62. Aquila H., Musra D., Eulitz M., Klingenberg M. Complete amino acid sequence of the ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria // Hoppe-Seyler's Ztschr. Physiol. Chem. - 1982. - Vol. 363. - P. 345-349. §

63. Asimdkis G.K., Aprilla J.R. Net uptake of adenine nucleotides in isolated rat liver mitochondria // FEBS Lett. - 1980. - Vol. 117. - P. 157-160.

64. Barbour R.L., Chan S.H. Characterization of the kinetics and mechanism of mithochondrial ADP-ATP carrier // J. Biol. Chem. - 1981. - Vol. 256. - P. 1940-1948.

65. Bohnensack R. The role of the adenine nucleotide translocator in oxidative phosphorolation. A theoretical investigation on the basis of a comprehensive rate law of the translocator // J. Bioenerg. Biomembr. - , 1982.-Vol. 14(1).-P. 45-61.

66. Brandolin G., Marty I., Vignais P.V. Kinetic of nucleotide transport in rat heart mitochondria studied by a rapid filtration technique // Biochemistry. - 1990. - Vol. 29. - P. 9720-9727.

67. Brustovetsky N., Becker A., Klingenberg M., Bamberg E. Electrical currents associated with nucleotide transport by the reconstructed mitochondrial ADP/ATP carrier // Biophysics. - 1996. - Vol. 93. - P. 664-668.

68. D'Souza M.P., Wilson D.F. Adenine nucleotide efflux in mitochondria indused by inorganic pyrophospatase // Biochim. Biophys. Acta. - 1982. - Vol. 680. - P. 28-32.

69. Davis'E.J., Davies-Van Thienen W.I.A. Rate control of phosphrilation-' coupled respiration by rat liver mitochondria // Arch. Biochem. Biophys. - 1984. - Vol. 233. P. 573-581.

70. Dupont Y., Brandolin G., Vignais P.V. Exploration of the nucleotide binding sites of the isolated ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria // Biochemistry. - 1982. - Vol. 21. - P. 6343-6347.

71. Duszynski J., Savina M. V., Wojtczak L. Effect of the divalent cation ionophore A23187 on the translocation of adenine nucleotides in liver mitochonria // FEBS Lett. - 1978. - Vol. 86. - P. 9-13.

72. Duyckfierts С, Sluse-Goffart CM. Kinetic mechanism of the exchanges, catalysed by the adenine-nucleotide carrier // Eur. J. Biochem. - 1980. -Vol. 106. - P. 1-6.

73. Gropp Т., Brustovetsky N., Klingenberg M., Muller V., Fendler K, Bamberg E. Kinetics of electrogenic transport by the ADP/ATP carrier // Biophys J. - 1999. - Vol. 77(2). - P. 714-726.

74. Heldt H., Pfaff E. Adenine nucleotide translocation in mitochondria. Quantitative evaluation of endogenous and exogenous ADP in mitochondria // Europ. J. Biochem. - 1969. - Vol. 10. - P. 494-500.

75. Huber Т., Klingenberg M., Beyer K. Binding of Nucleotides by the mitochondrial ADP/ATP carrier as Studied by 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy // Biochemistry. - 1999. - Vol. 38. - P. 762-769.

76. Kholodenko B.N. Control of mitochondrial oxydative phoshorylation // J. theor Biol. - 1984. - Vol. 107. - P. 179-188.

77. Klingenberg M. ATP synthesis and adenine nucleotide transport in mitochondria. Mitochondria: biogenesis and bioenergetics. Biomembranes: molecular arrangement and transport machanisms. - N.Y., 1972. - P. 147-162. ,-

78. Klingenberg M. The adenine nucleotide carrier in the mitochondrial membrane // Boll Soc Ital Sper. - 1973. - Vol. 49 - p. 2.

79. Klingenberg M. The adenine nucleotide exchange in submitochondrial (sonic) particles // Europ. J. Biochem. - 1977. - Vol. 76. - P. 553-565.

80. Klingenberg M. The ADP-ATP carrier in mitochondrial membranes // The enzymes of biological membranes. N. Y. and L., Plenum Press, 1976 - Vol. 3. - P. 383-438.

81. Klingenberg M. The ADP-ATP translocation in mitochondria, a, membrane potential controlled transport // J. Membr. Biol. - 1980. -Vol. 56. - P. 97-105.

82. Klingenberg M. Transport catalysis in biomembranes elucidated by the interactions of ADP, ATP-carrier of mitochondria // Naturwissenschaften. - 1978. - Vol. 65(9). - P. 456-461.

83. Klingenberg M., Aquila H. Some charactiristics of the isolated ADP/ATP carrier // Tokai J. Exp. Clin. Med. - 1982. - Vol. 7. - P. 43-49.

84. Klingenberg M., Nelson D.R. Structure function relationships of the ADP/ATP carrier // Biochim. Biophys. Acta. - 1994. - Vol. 1187(2). P. 241-244.

85. Klingenberg M., Nohl H. Kinetics of ADP, ATP transport in mitochondria as studied by quench-flow method // Biochim. Biophys. Acta. - 1978. -Vol. 503(1). - P. 155-169.

86. Klingenberg M., Rottenberg H. Relation between the gradient of the ATP/ADP ratio and the membrane potential across the mitochondrial membrane // Eur. J. Biochem. - 1977. - Vol. 73(1). - P. 125-130.

87. Klingenberg M. Structure-function of the ADP/ATP carrier // Biochem. Soc. Trans. - 1992. - Vol. 20(3). - P. 547-550.

88. Korzeniewski B. Regulation of ATP supply during muscle contraction // Biochem. J. - 1998. - Vol. 330. - P. 1189-1195.

89. Korzeniewski В., Wojciech F. An extended dynamic model of oxidative phosporilation // Biochim. Biophys. Acta. - 1991. - Vol. 1060. - P. 210-223.

90. Kramer R. Characterization of pyrophosphate exchange by the reconstructed adenine nucleotide translocator from mitochondria // Biochem. Biophys. Res. Comm. - 1985. - Vol. 127(1). - P. 129-135.

91. Kramer R. Interaction of membrane surface charges with the reconstructed ADP/ATP carrier from mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. - 1983. - Vol. 735(1). P. 145-159.

92. Kramer R., Klingenberg M. Electrophoretic control of reconstructed adenine nucleotide translocation / / Biochemistry. - 1982. - Vol. 21(5). - P. 1082-1089.

93. Kramer R., Klingenberg M. Modulation of reconstrituted adenine nucleotide exchange by membrane potential / / Biochemistry. - 1980. -Vol. 19(3) . -P . 556-550.

94. Kramer R., Klingenberg M. Reconstritution of adenine nucleotide transport from beef heart mitochondria / / Biochemistry. - 1979. - Vol. 18(19).-P. 4209-4215.

95. Kramer R., Klingenberg M. Reconstritution of adenine nucleotide transport with purified ADP, ATP-carrier protein / / FEBS Lett. - 1977. -Vol. 82(2) . -P . 363-367.

96. Kramer R., Klingenberg M. Structural and functional assymetry of the ADP/ATP carrier from mitichondria / / Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1985. - , Vol. 456. - P. 289-290.

97. Kramer R., Kurzinger G. The reconstructed ADP/ATP carrier from mitochonria is both inhibited and activated by anions / / Biochim. Biophys. Acta. - 1984. - Vol. 765(3). - P. 353-362.

98. Muller M., Krebs J.J.R., Cherry R.J., Kawato S. Selective labeling and rotational diffusion of the ADP/ATP translocator in the inner mitochondrial membrane / / J. Biol. Chem. - 1982. - Vol. 257(3). - P. 1117-1120.

99. Panov^A., Filippova S., Lyakhovich V. Adenine nucleotide translocase as a site of regulation by ADP of the rat liver mitochondria permeability for H+ and K+ ions / / Arch. Biochem a. Biophys. - 1980. - Vol. 199. - P. 420-426.

100. Pfaff E., Held E., Klingenberg M. Adenine nucleotide translocation of motochondria. Kinetics of the adenine nucleotide exchange // Europ. J. Biochem. - 1969. - Vol. 10. - P. 484-493.

101. Shild JJ., Gellerich F.N. Effect of the extramitochondrial adenine, nucleotide pool size on oxidative phosphorilation in isolated rat liver mitochondria // FEBS Lett. - 1998. - Vol. 252. - P. 508-512.

102. Souverijn J., Huisman L., Rosing J., Kemp A. Comparison of ADP and ATP as substrates for the adenine nucleotide translocator in rat liver mitochondria // Biochem. Biophys. Acta. - 1973. - Vol. 305. - P. 185-198.

103. Vignais P.V. Molecular and physiological aspect of adenine nucleotide transport in mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. - 1976. - Vol. 456. - P. 1-38.

104. Vignais P.V., Block M.R., Boulay F. Molecular aspects of structure- function relationships in mitochondrial adenine nucleotide carrier // Structure and properties of Cell Membranes. - CRC Press, 1985 - P. 139-179.

105. Vignais P.V., Block M.R., Boulay F., Brandolin G., Lauquin G.J.M. Membranes and transport. - NY: L. Plenum Press, 1982. - Vol. 1. - P. 405-414.

106. Андреев А.Ю., Волков Н.И., Мохова E.H., Скулачев В.П. Карбокси-1 атрактилат препятствует снятию дыхательного контроля пальмитиновой кислотой в митохондриях скелетных мышц // Биологические мембраны. - 1987. №4. - 474-478.

107. Duyckaerts , Sluse-Goffart СМ., Fux J.P., Sluse F.E., Libecq Kinetic mechanism of the exchange catalysed by the adenine-nucleotide carrier // Eur. J. Biochem. - 1980. - Vol. 106. - P. 1-6.

108. Pebay-Peyroula E., Dahout-Gonzalez C., Kahn R., Trezeguet V., Lauquin M., Brandolin G. Structure of mitochondrial ADP/ATP carrier in Г i complex with carboxyatractyloside // Nature. - 2003. - Vol. 426. - P. 39-44.!

109. Алиев M.K., Сакс В.А. Анализ механизма работы митохондриальной аденин нуклеотид транслоказы используя математические модели // Биофизика. - 2003. №48 - 1075-1058.

110. Демин О.В., Вестерхофф Х.В., Холодеико Б.Н. Математическое моделирование генерации супероксида bcl комплексом митохондрии // Биохимия. - 1998. №63 - 37-53.

111. Демин О.В., Горяпин И.И., Холоденко Б.Н., Вестерхофф Х.В. Мо-' дель генерации 02 в комплексе III электронно-транспортной цепи // Молекулярная биология. - 2001. №35. - 1095-1104.

112. Gizzatkulov N., Klimov A., Lebedeva G., Demin О. DBSolve7: New update version to develop and analyze models of complex biologycal systems: 12th International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. - Glasgo, 2004. - p. 210.

113. Panke O., Rumberg B. Kinetic modelling of the proton translocating CFoFi-ATP synthase from spinach // FEBS Lett. - 1996 - Vol. 383(3). -P. 196:200.

114. Palmieri F. Mitochondrial carrier proteins // FEBS Lett. - 1994. - Vol. 346. - P. 48-54.

115. De Pinto V., Tommasino M., Palmieri F., Kadenbach B. Purification of the active mitochondrial phosphate carrier by affinity chromatography with an organomercurial agarose column // FEBS Lett. - 1982. - Vol. 148. - P. 103-106.

116. Kolbe H.V., Costello D., Wong A., Lu R.C., Wohlrab H. Mitochondrial phosphate transport. Large scale isolation and characterization of the phosphate transport protein from beef heart mitochondria // J. Biol. Chem. - 1984. - Vol. 259. - P. 9115-9120.

117. Mende P., Huther F.-J., Kadenbach B. Specific and reversible activation and inactivation of the mitochondrial phosphate carrier by cardiolipin and nonionic detergents, respectively // FEBS Lett. - 1983. - Vol. 158. - P. 331-334.

118. Ligeti E., Brandolin G., Dupont J., Vignais P. Kinetics of Pi-Pi exchange in rat liver mitochondria. Rapid filtration experiments in the millisecond time range // Biochemistry. - 1985. - Vol. 24. - P. 4423-4428.

119. Coty W.A., Pedersen P.L. Phosphate transport in rat liver mitochondria. Kinetics and energy requirements // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249. -P. 2593-2598.

120. Stappen R., Kramer R. Kinetic mechanism of phosphate/phosphate and phosphate/OH- antiports catalyzed by reconstituted phosphate carrier from beef heart mitochondria // J.Biol.Chem. - 1994. - Vol. 269. - P. 11240-11246.

121. Noma Т., Fujisawa K., Yamashiro Y., Shinohara M., Nakazawa A./ Gondd Т., Ishihara Т., Yoshinobu K. Structure and expression of human mitochondrial adenylate kinase targeted to the mitochondrial matrix // Biochem. J. - 2001. - Vol. 358. - P. 225-232.

122. Schricker R., Magdolen V., Strobel G., Bogengruber E., Breitenbach M., Bandlow W. Strain-dependent occurence of functional GTP:AMP phosphotransferase (AK3) in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol.270. - P. 31103-31110.

123. Noma,- T. Dynamics of nucleotide metabolism as a supporter of life, phenomena // J. Med. Investigation. - 2005. - Vol. 52. - P. 127-136.

124. Тихонов A.H., Погребная А.Ф., Романовский Ю.М. Электростатические взаимодействия в каталитических центрах Fi-АТФазы // Биофизика. - 2003. - Т. 48. Вып. 6. - 1052-1070.

125. Oster G., Wang Н. Reverse engineering a protein: the mechano chemistry of ATP synthase // Biochim. Biophys. Acta. - 2000. - Vol. 1458. - P. 482-510.

126. Oster )G.; Wang H. Why is the mechanical efficiency of Fi-ATPase so high? // J. Bioenerg. Biomembr. - 2000. - Vol. 32(5). - P. 459-469.

127. Jain S., Nath S. Kinetic model of ATP synthase: pH dependence of the rate of ATP synthesis // FEBS Lett. - 2000. - Vol. 476. - P. 113-117.

128. Graber P. The H+-ATPase from chloroplasts: energetics of the catalytic cycle // Biochim. Biophys. Acta. - 1994. - Vol. 1187. - P. 171-176.

129. Korzeniewski B. Theoretical studies on the control of oxidative phosphorylation in muscle mitochondria: application to mitochondrial deficiencies // Biochem. J. - 1996. - Vol. 319. - P. 143-148.

130. Korzeniewski B. Theoretical studies on the regulation of oxidative phosphorylation in intact tissues // Biochim. Biophys. Acta. - 2001. -Vol. 1504. - P. 31-45.

131. Beard D. A biophysical model of the mitochondrial respiratory system and oxidative phosphorylation // PLOS Сотр. Biol. - 2005. - Vol. 1. -P. 1-13.

132. Wu F., Yang F., Vinnakota K.C., Beard D.A. Computer Modeling of .Mitochondrial Tricarboxylic Acid Cycle, Oxidative Phosphorylation, Metabolite Transport, and Electrophysiology // J. Biol. Chcm. - 2007. -Vol. 282. - P. 24525-24537.

133. Goryanin I.I., Lebedeva G.V., Mogilevskaya E.A., Metelkin E.A., Dentin

134. V. Cellular kinetic modeling of the microbial metabolism // Methods. Biochem. Anal. - 2006. - Vol. 49. - P. 437-488.

135. Hook R., Jeeves T.A. "Direct search "solution of numerical and statistical > problems. // J. ACM. - 2006. - Vol. 8. - P. 212-229.

136. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. - М.: Мир, 1979. i