Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетические закономерности фотосинтетического выделения кислорода при импульсном освещении

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетические закономерности фотосинтетического выделения кислорода при импульсном освещении"

; о

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УШВЕРШТГ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет На правах рукописи УДК 577.3

птищн Григорий Анатольевич

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО ВЫДШГИ КИСЛОРОДА ПРИ ИМПУЛЬСНОМ ОСВЕЩЕНИИ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук ;

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в Институте химической физики ем. Н.Н.Семенова РАН.

Научные руководители: - доктор химических наук,

профессор Г.Г.Комиссаров

- доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник

В.А.Платовский

Официальные оппоненты: - доктор физико-математических наук.

профессор А.Ю.Борисов

- кандидат физико-математических наук Е.М.Сорокин

Ведущее учреждение: ,- Институт почвоведения и

фотосинтеза РАН г.Пущино

Защита состоится

"_"_1994 г.

в час.

на заседании Специализированного совета К.063.05.68. при Московском Государстенном Университете. Адрес: Н9899, Москва, ИГУ, Биофак.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ!

Автореферат разослан _"_1994' г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук Б.А.Гуляев

СПИСОК ШТОЛЬЗУЕШХ СОКРАЩЕНИИ КВК - кислородвнделявдий ферментный комплекс РЦ - реакционный центр ФС - фотосинтез

CCI ,®С2 - фотосистема I, фотосистема 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Растительный фотосинтез (ФС) является доминирующим биоэнергетическим процессом на Нашей планете. Это объясняется повсеместной доступностью основных потребляемых растениями ресурсов: солнечного света,.углекислоты и воды. Вода, как ресурс ФС, служит источником водорода для синтеза органических соединений, и именно способность к окислению этого инертного, но зато доступного вещества обеспечивает растениям широкие возможности к распостранению в сравнении с другими фотосинтезирущими организмами.

Считается, что с появлением растений около 3 млрд. лет назад выделяемый ими (при окислении воды) кислород накопился в атмосфере, возтш защитный озоновый слой. Тем самум были созданы (и с тех пор поддерживаются) условия для возникновения животных и человека. Таким образом, возникновение реакции фотосинтетического окисления воды является одним из ключевых моментов в биологической истории Земли.

В силу Фундаментальной роли, которую ФС играет в биосфере, изучение его организации, в том числе механизма разложения воды и выделения кислорода, представляет интерес не только для биологии, но и для многих других наук и для практической деятельности человека: сельского хозяйства, охраны, окружающей среды, энергетики и др.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы являлось изучение механизма окисления воды при фотосинтезе и выявление побочных процессов в кислородвыделяющем комплексе (КВК) растений, сопровождающих этот процесс. В соответствии с этим были поставлены следующие основные задачи: .

- провести теоретический анализ кинетики фотосинтё>лческого окисления воды в рамках схемы последовательного накопления окислительных эквивалентов. Рассмотреть сопутствующие темновые и световые процессы в КВК и их воздействие на кинетику выделения кислорода;

- исследовать обратную задачу кинетики и предложить методики

измерений и обработки данных для восстановления кинетической схемы и констант редокс-переходов в КВК;

- создать программы для компьютерной оработки данных по кинетике фатосинтетического выделения кислорода;

- сконструировать и собрать экспериментальную установку для импульсного и непрерывного освещения растений с полярографической регистрацией кинетики кислородного обмена;

- экспериментально исследовать кинетику йыдоления кислорода растениям;!. На основании разработанных методик кинетического анализа исследовать особенности механизма этого процесса при различных уровнях освещенности и воздействии биологически активных веществ.

- провести экспериментальный поиск' спектральных эффектов в функционировании ФС2 и различий в спектрах действия четырех стадия окисления воды;

Научная новизна работы. Разработан матричный формализм для описания кинетики редокс-превращенкй КВК и связанных с ними сигналов. Получено общее решение прямой задачи кинетики выделения кислорода ФС при импульсном освещении для произвольной схемы переходов между редокс-состояниями КВК (з-состояниями).

Впервые проведен последовательный учет нроцессов темновой дезактивации КВК и других сопутствующих окислению воды процессов, протекающих во время импульсного освещения. Описаны возможные типы кинетического поведения, в том числе, впервые, - апериодический.

Рассмотрена обратная задача кинетики. Показано, что полную схему основных и побочных переходов в КВК мокно'однозначно восстановить посредством совместных измерений кинетики трех сигналов, связанных с его состоянием {например: выделения кислорода ФС, внутритилакоидных • изменений рН, электрохромных сдвигов спектров поглощения фотосиктетическцх мембран).

Обосновано методика тестирования таких сигналов, связанных с функционированием выявление их корреляций с кинетикой КВК и определение стехиометрии вызывающего их процесса на основе сопоставления их кинетики с кинетикой фотосинтетического выделения кислорода.

Разработана методчка обработки данных но кинетике выделения . кислорда, обеспечивающая корректное определение" эффективных иинчтичеоких параметров и лучшу» аппроксимацию на всем классе ■ четнрехтактшикинетических схем.

• Прог-едвня компьютерная обработка массива экспериментальных

данных. Обнаружено, что эффективность процесса окисления вода контролируется, в основном, скоростью дезактивации КВК. При интенсивном импульсном освещении с частотой следования вспышек . . 2 из-за дезактивации состояний Sf, St снижается квантовая эффектианость переходов S^S^, Sj-»Sj (до25%) и эффективность процесс« в целом. Однако, при понижении интенсивности действующего ckera (до 10'*-10'3 солнечной постоянной) стационарная citopocTil дезактивации КВК также пропорционально снижается. Благодаря этому квантовая эффективность окисления воды при этих освещеннрстях, соответствующих в природе вечерним и ночным часам, остается относительно высокой и составляет величину порядка 0.3.

У одноклеточных водорослей обнаружено пятое устойчивое состояние КВК s.t, имеющее на один восстановительный эквивалент больше состояния so, располагающееся вне четырехтактного кислородного цикла и заселяющееся благодаря темновой дезактивации КВК. В хлоропластах бобов состояние s не наблюдается.

Изменения кинетики выделения кислорода хлореллой в присутствии экзогенного пероксида водорода согласуются с гипотезой о том, что он на свету встраивается в КВК и, конкурируя с водой, слукит для ФС2 независимым .донором электронов и источником фотосинтетического кислорода. В темноте экзогенный пероксид также способен вытеснять воду из КВК, хотя скорость этого процесса мала. По оценкам, энергия связи КВК с пероксидом больше, чем с водой на величину около 0.2 эВ. Полученные данные говорят в пользу предположения о том, что Нж02 в связанной форме является естественным промежуточным продуктом (фотосинтетического окисления воды.

Установлено влияние синтетического регулятора роста растений на активность ФС2 и ее взаимодействие с ФС1, которое коррелирует с рострегулируклцей функцией пррпарата. Ростстимулирущая концентрация активизирует ФС2 на 10-15%, в тормозящая рост концентрация регулятора производит обратный йффект (М5%). Обнаруженные эффекты вызываются, главным образом, воздействием регулятора на скорость_процессов дезактивации КВК.

Экспериментально показано совпадение •спектров действия четырех стадий окисления воды с точностью до 2 им по положении длинноволновой границы. Это подтверждает представление о том, что все четыре стадии инициируются одним ГЦ и не оказывают обратного действия на процессы светосбора и фотохимического разделения зарядов.

Практическая значимость работы. Практика применения созданных нами компьютерных программ показывает, что предложенная схема обработки данных в среднем болое чем на порядок улучшает качество аппроксимации экспоримонталъпта кинетических зависимостей по сравнению с обычно применяемой схемой Кока. Это делает результата обработки более чувствительными к небольшим изменениям кинетического поведения, возникающим, например, при воздействии микроколичеств биологически активных веществ, и открывает перспективы использования одноклеточных водорослей в качестве Oi t сенсоров.

Созданный пакет программ для IBM-совместимих компьютеров позволяет, проводить пакетную обработку экспериментальных кинетических зависимостей по различным модификациям четырехтактных схем. Текст одной из программ приведен в Приложении. Эта к другие программы могут быть безвозмездно предоставлены заинтересованным лицам.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывались на конкурсе молодых ученых ИХФ АН СССР 1990 г. (I место), конкурсе научных работ ИХФ РАН 199?, г. (Ill место), на ряде международных и всесоюзных конференций и изложены в 10 публикациях. •

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения и четырех глав. В конце Гл.2 и каждого из параграфов Гл.4 подводятся текущие итоги. Б конце работы сформулированы общие вывода За ниш следуют список цитируемой литературы и приложение. Объем диссертации составляет страниц, включая 18 рисунков и 2

таблицы. Список литературы включает IT>fi наименований.

СОДЕЯАНИЕ РАБОТЫ ' Глава I. Литературный обзор.

Обзор состоит из двух разделов. В первом разделе кратко рассмотрен весь комплекс фотосинтетических процессов с точки зрения их взаимосвязи с процессом фотосинтетического выделения кислорода. Второй раздел посвящен кинетике выделения кислорода при импульсном освещении, как информативному методу изучения механизма фотосинтетического разложения воды." Обсуждаются достоинства и недостатки существующих кинетических моделей выделения кислорода.

Глава 2. Теоретическое рассмотрение кинетики ы.деления кислсГ эда

при фотосинтезе

Теоретически рассмотрена кинетика фотосинтетического видения кислорода при импульсном освещении в рамках следующих предположений:

а) существует четыре (относительно) устойчивых редокс-состояния КВК;

б) редокс-переходн КВК некооперативны (т.е.обмены окислительными эквивалентами между ними отсутствуют) и независимы;

в) ансамбль КВК однороден (все РЦ находятся в одинакс тах условиях и имеют одинаковые динамические характеристики).

В диссертации вводится матричный формализм в котором'измеримые величины представляются скалярными выражениями. Состояние образца определяется распределением его РЦ по Б- состояниям:

Но

|8> =

ni

n2 na

(2.1)

где N. - число РЦ, находящихся в состоянии Б.. Перераспределение населенностей под действием вспышки света описывается умножением вектора состояния системы на некоторую 4x4 матрицу иг:

|в'> = Ц.|в> . (2.2)

Ее элементы имеют смысл вероятностей переходов между состояниями КВК под действием вспышки. Основная циклическая цепочкь переходов была установлена Коком с сотр. [Кок et а1., 1970]: ,, ьг»с 1Г1>,

5S —>s_

(2.3)

- . , . 5о

У

2Н20 02

Помимо нее в КВК идут побочные процессы, усложняющие кинетическое поведение системы. В кинетической схеме Кока вводятся два типа побочных процессов. Это "пропуски" (S^S^) и "двойные срабатывания" ^¿^(Б^,)^'^,*). с учетом которых матрица и имеет вид (Delrieu, 1983J:

=

а оо 1-а-р а о р 1-а-р а

1-а" о о

(2.4)

О р 1-а а

где аир- вероятности пропусков и двойных срабатываний соответственно.

Матрица (2.4) является модельной, поскольку, например,

равновероятность пропусков для четырех S-состояний - это только априорное предположения. Оде Солее существенно, что в РЦ ФС2 идут другие типы побочных процессов, которые могут существенно изменять кинетическое поведение системы, но не отражены в (2.4).

Так, в темноте КВК постепенно дезактивируется, теряя накопленные окислительные эквиваленты по схеме Sj-»S2-»Si CForbuah et al. 1971]. Эти процессы должны идти, естественно, и во время импульсного освещения (в промежутках между вспышками), причем их вклад при частоте следования вспышек 1Гц, по оценкам, может достигать 10%, что не уступает типичным значениям а, р. При увеличении темновых интервалов их роль еще более возрастает. Ход этих процессов можно описать матричным уравнением:

jf|e'(t)s = D|e'(t)> ' , (2.5)

ООО О 0.0 кж к^ О О ~кж ks

ООО -к -к

D =

(2.6)

где ks, ks, к4 - эффективные константы скоростей дезактивации по каналам si-*sj, s^s^ и Ss->Si соответственно. Интегрирование (2.5) дает:

|e(t)> = UD(t)|e'(0)> . (2.7)

Здесь |в'(о)> - состояние ансамбля КВК сразу после вспышки, а |в(t)> - спустя время t. U0=exp(Dt) - оператор "темповой дезактивации",. элементы которого (ilD)i имеют смысл вероятностей темновых переходов S.-»S. за время t после очередной вспышки.

Объединяя (2.2) и (2.7) получаем оператор полной эволюции системы за период Т от вспышки до вспышки:

U(T) = UD(T)UF 'i . (2.8)

Состояние системы перед (п+1) -вой вспышкой получится п-кратным действием оператора (2.8) на вектор.начального состояния |в(0)>: |в(пТ)> = [ЩТ)Г|в(0)> .' (2.9)

Выход кислорода ( на вспышку определяется, согласно (2.3), световыми переходами Ss^(S4)-»So, число которых равно произведению населенности состояния Sa перед вспышкой на вероятность этого перехода:

Y = d-a)N3 ■ . (2.10)

Этому выражению удобно придать вид скалярного произведения:

Y = <02|s> , COJ = (0,0,0,1-а) . (2.II) Здесь |я> - вектор состояния системы перед вспыижой, a <02| -вектор, который мы назовем "измерительным", и вид которого опре-

еляется стехиометрией процесса, являющегося источником измеряемого ^сигнала (2.10).

Методами проективной геометрии в Гл.2 найдено общее решение прямой Задачи кинетики для фотосинтетического выделения кислорода при импульсном освещении:

\êv > k> 1

Y..= N <0Jvo> , Y„bk= <0t|vkXujB(0)> (2.12)

Здесь Y^ - выход на n-ую вспышку, YM- амплитуда стационарного выхода 02па вспышку, Àk, <uk|, | vk > - собственные значения,. левые и правые собственные вектора оператора U(T), соответственно. При выводе выражений (2.12) не используется явный вид оператора и(Т), поэтому они справедливы для любой схемы световых и темновых переходов между s-состояниями. Кинетика выделения кислорода, согласно (2.12), определяется заданием семи параметров. Из них три коэффициента ьк зависят от начального состояния системы |в(0)>, а величины Y<<t \ определяются только видом оператора U(T), то есть динамическими свойствами ФС2 и режимом освещения.

■ Для анализа кинетического поведения удобно графическое изображение параметров А.к, ьк на комплексной плоскости. В практически важном случае вспышек насыщающей интенсивности с частотой следования около 1Гц вклады побочных процессов минимальны и их можно учитывать по теории возмущений. На Рис.I изображены нввоэмущенные значения Хк и их сдвиги при "включении" различных побочных процессов. Анализ возмущений показал, в частности, что известный эффект аномального поведения параметра двойных срабатываний [Deirieu, 1983), по-видимому, является артефактом, вызванным неуче том процессов дезактивации КВК.

Если вклад побочных процессов не мал, то полученное общее .решение предсказывает, в отличие от схемы Кока, не только колебательное, но и апериодичесоке кинетическое поведение, как например, при увеличении вероятностей темновых переходов. Это дает возможность объяснить апериодический характер кинетики, • наблюдаемый экспериментально при увеличении интервалов между вспышками до нескольких десятков секунд [Лушлэв, 1975].

Предложенный матричный формализм позволяет продвинуться вперед в решении обратной задачи кинетики. Показано, что измерение кинетики только одного сигналя (например выделения 0 )". недостаточно для однозначного определения двенадцати независимых

ЯеЛ

РИС. I. Собственные значения оператора и(Т) (2.9) в отсутствзаз возмущения при трех значениях параметра пропусков а. О - \о=1, • - Ь, о - >а. Стрелками указаны смещения собствэкыа. значения при увеличении кавдого из поправочных членов р, ьт, к»т, к«т от О до 0.4 (смещениям Л« отвечав! проекции стрелок на действительную ось).

элементов оператора П(Т) и начальных населенностей 5-соотояний. Для однозначного восстановления полной схемы переходов КВК в рамкнХ .предложенной ньми общей четырехтактной схемы необходима синхронная регистрация, как минимум, трех сигналов разной природа', Моторы« кестко связаны с состоянием КВК и имеют линейно независимые измерительные вектора. Примером может служить следу-пцая тройка сигналов: выделение О ФС (2.11), высвобождение протонов ФС2 (измерительный вектор этого процесса имеет вид: <Н*|Ч1|0,1,2)), низкотемпературный многокомпонентшй ЭПР-сигнал Ип <1С2 <<№1^1^(0,0,1,1)). При этом простейший рецепт восстановления полной матрицы переходов есть:

ЩТ) = Z~tY^Y'^Z (2.13)

Здесь Ъ - матрица, составленная из измерительных векторов регистрируемых сигналов, а матрицы У', У составлены из амплитуд самих сигналов на первые 5 вспышек.

При разработке новых кинетически методов изучения ФС2 встает вопрос: связан ли новый регистрируемый сигнал с состоянием КВК, и каюта состояниям (переходам) он соответствует. Для ответа на эти вопроси мы предлагаем сопоставить значения кинетических параметров (2.12) нового (г) и известного (0 ) сигналов. Если полученные в результате компьютерной обработки значения корней ^ попарно совпадают, а отношения коэффициентов ьк(г)/ък(ог) для двух сигналов не зависят от начального состояния системы, то из этого еле,вдет, что новый сигнал жестко связан с состоянием КВК. В этом случае для его измерительного вектора справедлива следующая формула:

т.^) ь (Ъ)

<г\ - гта-у Е ^П <0»1 V <и*1 " (2Л4)

я Л 2 V к г

Определение параметров (2.12) проводится путем фитировяния экспериментальных кинетических зависимостей, например, с помощью Функционала вида:

® = Е , (2.15)

п * 1

где ^ - число вспышек в серии, У'ксп~. экспериментальные амплитуды сигнала, модельные амплитуды, по 'свободным параметрам которых производится минимизация (функционала (К. 15).

Если в эксперимент« измеряется кинетика только одного сигнала (Ог ФС), то при ее интерпретации нельзя обойтись без привлечения дополнительных модельных предположений о схеме переходов. В этом случае рнбор пространства подгоночных пчрамет-

ров (2.12) обеспечивает, по крайней мере, наилучшее решение первой части обратной задачи - фитирования икепериментальных данных. Минимизация (2.15) в этом пространстве дает наилучшув аппроксимацию на всем классе четырехтактных схем и единственный набор оптимальных параметров (в отличие от "жестки" схем типа схемы Кока). Более точная аппроксимация должна повышать чувствительность методики к малым изменениям кинетического поведения. Начальное состояние ансамбля КВК можно вычислить по рецепту:

" ' К >ъ.

| в(0)> = £ > (2Л6)

где |у1> -правый собственный вектор модельной матрицы переходов.

Глава 3. Материалы и методы

Объектом исследования слукили чистые штаммы хлореллы и ■целые хлоропласта бобов, которые выделяли но стандартной методике.. Измерения проводили в» среде: фосфатный буфер (рН 6.8 -водоросли, рН 7.5 - хлоропласта) + 0.1 Н КС1, либо в среде Тамия.

Для изучения кинетики фотосинтетического .выделения кислорода была спроектирована и собрана .экспериментальная установка. В ее состав входят источник импульсного света (длительность вспышки Змкс, электрическая энергия разряда 1Дж, частоты следования Г=0-50Гц) и источник непрерывного света. Оптическая схема включает блоки светофильтров, диафрагмы, фотозатвор и фокусирует свет источников на ячейку с объектом исследования. Выделяющийся' кислород ФС регистрируется в модифицированном варианта электрохимический ячейки Колио с дополнительным кольцевым платиновым электродом (чувствительность до Ю~,5моль 0г на вспышку, постоянная времени регистрации 0.05с). Ток сигнала фильтру&тся и усиливается предусилителем на микросхеме ЬТ544УД1А, собранным по схема преобразователя ток-напряжение с коэффициентом преобразования ГВ/ТмкА. Усиленный сигнал подается на запоминающий осциллограф С8-13, а также на скоростной самописец Н-3030-4, работа которых синхронизована с работой импульсного осветителя. В состав установки входит также вспомогательное оборудование для контроля параметров освещения, компенсации постоянной составлявшей сигнала, сопряжения блоков регистрации и др. В диссертации проведены расчеты, технических характеристик основных узлов исходя из специфики изучаемой система.

Глава 4. Экспериментальная част^ I. Действие инфракрасного освещения на кинетику кислородного обмена растений

Экспериментально изучено действие ИК-освощения на гашетику кислородного обмена растений. Целью экспериментов бил поиск спектральных кинетических эффектов в ФС2. Если спектры действия четырех световых стадий разложения воды не совпадают, то измене-¡ше спектрального состава возбуждающего света будет приводить к перераспределению населенностей э-состояний. Максимального эффекта следует ожидать при интенсивной, но "подпороговой" подсветке, для которой процесс окисления воды в целом близок к остановке, но его стадии чувствительные к ИК-диапазону (если таковые имеются) еще идут. Контролем слукит белый свет, подоб-рашшй по интенсивности • так, чтобы активности ФС2 по выделению кислорода в обоих случаях совпадали. Распределения "населеннос-тей, формирующееся на подсветках разных видов, контролировали по кинетике выделения 0 на измерительную серию вспышек белого света насыщающей интенсивности с частотой следования 2Гц.

Эксперименты проводили на хлорелле и хлоропластах бобов. На первом этапе после предварительной серии из 40 насыщающих вспышек растительный материал в течение длительного времени (15 шш) экспонировали на дальнем красном свету (Я>850нм) или на белом свету различной интенсивности. Вслед за этим давали измерительную серию вспышек и регистрировали кинетику выделения кислорода. Из Рис.2 видно, что отсечение фотосинтетически активного света дает эффект отличный от полной темноты, но весьма близкий к тому, который получается при равномерном ослаблении белого света нейтральными светофильтрами НС8+Н0П (В=5.0±0.5). Еще отчетливей это видно на Рис.З, где выход Ог на п-ую вспышку представлен в виде функции от выхода на первую вспышку в той же серии (рассматриваемого в качестве меры активности ФС2)'. Т.о., в стационарном режиме "подиороговая" подсветка не дает аномальных распределений нас«ленностей Б-состояний, т.е. но является селективной по, отношению к отдельным световым реакциям ФС2. о На втором этапе исследовали динамику перераспределения населенностнй на "подпороговой" подсветке и на наиболее близкой к ней по стационарному эффекту "надпороговой" (по результатам первого этапа) ив темноте. О этой целью после предварительной серии 40 вспышек варьировали длительность непрерывной подсветки.

РИС. 2. Кинетика выделения кислорода при импульсной освещении после разных видов подсветки.

Частота следования вспышек 2 Гц. Длительность предварительной подсветки 15 мин. + -инфракрасная подсветка (полосовой фильтр ИКС1+КС10, А. > 850 нм); □ -слабая белая подсветка (нейтральный фильтр HC7+HCII, D= э.5±0.5); о -белая подсветка меньшей интенсивности (нейтральный фильтр HC8+HCII, D= 5.0±0.5); • -темновая адаптация.

Х/У«

РИС. 3 . Выход кислорода (в относительных: единицах) на вспышку с номером N (указанным на рисунке) после длительной (15 ют) пред-верительной подсветки различных видов как функция выхода кислорода на первую вспышку в той ге серии вспышек, о - белая подсветка разной интенсивности и теиновая адаптация; + - инфракрасная подсвэткЬ;-

РИС.4. Выход кислорода (в относительна единицах) на вспышку с номером п (указанным на рисунке) после предварительной подсветки разной длительности (1 < г < 15 мин) и различных видов как функция выхода кислорода на первую вспышку в той ез серии вспышек, о - белая подсветка разной интенсивности и темновйя' адаптация; + - инфракрасная подсветка;

продзествугашй измерительной серии вспышек. Выяснилось, что стационарное распределение населенностей устанавливается для "надпороговой" подсветки приблизительно втрое быстрее, чем в случае ИК (5 и 15 мин). Однако, зависипсть выхода 0г на п-ув вспышку как функция от выхода на первую вспышку для обоих видов подпвйтки и здесь оказалось одинаковым (Рис.4). Это означает, что перераспределение населенностей под действием двух подсветок илот с различной скоростью, но по одной и той же траектории (в четырехмерном пространстве населенностей). Т.о., и этот динамический эф!»юг не селективен по отношению к четырем световым реакциям ФС2. Из проведенных экспериментов, следует, что положение красных границ спектров действия четырех. световых стадий разложения вода отличаются друг от друга не более чем на ?. км. Отсутствие спектральных кинетических эффектов внутри ФС2 подтверждает представление о том, что фотосинтетическое окисление" годн является периферическим процессом, все стадии которого инициируются из одного РЦ и не оказывают заметного обратного воздействия на процессы светосбора и фотохимического разделения зарядов.

Перераспределение населенностей 5-состояний определяется совместным действием световых и темновых переходов. Обнаруженная независимость траектории перераспределения (в пространстве населенностей) от его темпа означает, что при низких исследованных освещенностях (ГСГ'-ТСГ3 солнечной постоянной) скорости световых процессов и дезактивации пропорциональны. Благодаря этому квантовая эффективность окисления воды при этих освещенностях, соответствующих в природе вечерним и ночным часам, остается относительно высокой и составляет величину порядка 0.3. Токую зависимость можно объяснить в предположении, что восстановительные эквиваленты для дезактивации поступают с акцепторной стороны ФС2 через пул какого-то. эндогенного восстановителя.

2. Изменение кинетики фотосинтеза в присутствии регулятора роста

Влияние регуляторов роста растений на кинетику процессов интересно как с точки зрения изучения механизма их действия, так и для разработки новых методов тестирования VI скрининга биологически активных соединений. Для экспериментов был вобран синтезированный в лаборатории фотобионики ИХФ РАН регулятор роста амбиол, являющийся производным оксибензичидазолз. Эксперимептн проводили на хлорелле. Для этой культуры пик суимулирующего

действия приходится на концентрации 2-20 мкМ (до 100* по скорости нарастания массы в лабораторных условиях), а существенное замедление роста (вплоть до полной остановки) наблвдается при концентрациях превышающих 150 мкМ. Препарат вводили в культура-льную среду и через 2 часа проводили измерения кинетики выделения кислорода при импульсном и непрерывном освещении.

Ростстимулирущая концентрация препарата 7 мкМ вызывает появление опережающего сдвига Фазы колебаний выхода кислорода. Ингибируицая рост, концентрация 250 мкМ вызывает уменьшение первого максимума выделения кислорода н глубины осцилляций по сравнению с контролем.

На непрерывном насыщающем свету ростстимулирущая концентрация амбиола также вызывает ускорение переходных процессов выхода на стационарный режим, обусловленных балансировкой активности двух фотосистем. Кнгибируюцая рост концентрация приводит к затягиванию этих процессов.

Компьютерная обработка по предложенной общей четырехтактной схема позволила выявить смещение эффективных кинетических констант к^, А, , при различных концентрациях амбиола (Рис.5). Графический анализ этих данных приводит к оценкам средней квантовой эффективности 7 цикла выделения кислорода, которые приведены в . -вой ччсти Табл.1.

Характер расположения параметров \ , \г на комплексной плоскости свидетельствует о том, что квантовые эффективности отдельных стадий цикла не равны. Этот эффект вызывается частичной дезактивацией состояний в , в процессе импульсного освещения, что приводит к снижению эффективностей переходов , на \Т0%. для ростстимулирущих концентраций

регулятора роста и на ч25$ для контроля.

Для контроля правильности исходных посылок предложенной схемы, в привой части • Табл.1 сопоставляются две независимо получаемые величины, значения которыхдолжны .совпадать. Видно, что 'расхождения чп дятпя в пределах экспериментального разброса. • '

Таким образом 'показано, что исследованный регулятор роста влияет на активность ФС2 хлореллы и на ее взаимодействие с ФС1, и это воздействие, коррелирует с его рострегулирующей функцией. Ростстимулирущая концентрация активизирует процесс выделения 'кислорода; .увеличивая 'его квантовую эффективность на 10-15% и ускорял 'процесс оптт.п'чтш работы двух фотосистем.> Ингибирушая рост концентрация реп ячторя производит обратный эффект (^52).

РИС; 5. Расчитанны® значения кинетических констант в присутствии смбиола. .

\ -темные символы, \ -светлые символы; Оплошная линия соединяет пары К2 полученные при частоте следования вспшек 2 Гц. Пунктир соединяет пары полученные при частоте следования 0.1 Гц. х,+ - 7 мкМ амбиола; а,о - 250 мкМ амбиола; в,о - контроль.

ТАБЛИЦА I

Вычисленные средние квантовые эффективности переходов Б.-» 8. кислородного цикла и отношения средних эффективностёй на двух частотах следования вспышек

Концент- Средняя эффективность Отношение эффективностей

рация переходов на двух частотах

амбиола Гц) 7(0.1 Гц) 7(0.1Гц)/7(2Гц)

7 мкМ 0.85 0.66 0.78, 0.72

250 мкМ 0.75 0.44 0.59' 0.65

контроль 0.73 0.50 0.68 0.68

ошибка ±0.05 ±0.05 ±0.05 ±0.06

Эти изменения вызываются, главным образом,'воздействием регулятора роста на скорость темновой дезактивации КВК.

Предложенная для обработки данных общая четырехтактная схема показала, что неравенство эффективности четырех стадий разложения воды .является существенным кинетическим фактором. Его учет уьеличивает точность аппроксимации в 3-30 раз и позволяет зафиксировать изменения кинетического поведения в присутствии микроколичеств биологически активного вещества, которые не регистрируются обычно применяемой схемой Кока.

3. Кислородная кинетика фотосинтеза в присутствии Н20а

Имеется ряд аргументов в пользу того, что фотосинтетическое окисление вода идет через стадию формирования пероксида водорода [Комиссаров, 1973] Если это так,то образующийся пероксид должен быть прочно связан с КВК, иначе он вытеснялся бы молекулами вода, и цикл окисления прорывался на этапе формирования Нг0а. Но высокое сродство к 1. роксиду означает, что молекула Н201 из внешней среды может встроиться в КВК вместо воды и окислиться до О то есть может служить альтернативным донором электронов для ФОЗ и независимым источником фотосинтетического кислорода. Прямые :указания на sio были получены масс-спектрометрическим методом с использованием меченого по кислороду пероксида Н 4*0t [Wano.et, al., 1987). В настоящей работе взаимодействие .КВК с Нг0г било изучено кинетически. .

При построении кк"атической схемы мы исходили из следую-

щвго:

- связывание КВК с HtOjt имеющим на два окислительных эквивалента больше чем ?НгО, должно приводить к возникновению состояния S , а не s ;

X о

- тэмновые реакции обмена типа

so + н,о, fc» s2 + гн20 (4.1)

подавлены (что' следует из • относительной устойчивости четырех s-состояний в темноте {Porbueh et il., 1971]);

- возможно светозависимое конкурентное связывание Ki0t с КВК на стадии вытеснения молекулы 0t в конце цикла окисления:

' Р» * 5<

S + 2Н О -» S + О (4.2)

4 2 О 2

+ НЛ - S* + V ■

В кинетическую схему введено дополнительное состояние s , стоящее вне четырехтактного окислительного цикла. Оно необходимо при количественных расчетах для описания смещения первого максимума выделения кислорода на 5-6 вспышки, которое наблюдается у одноклеточных водорослей.

Полная схема переходов КВК имеет следующий вид:

„ KU _ hV _ hV д hV KU

t_L_____I

Пунктиром показаны темновые процессы дезактивации КВК, обеспечивающие заселение состояния S . Анализ показывает, что вовлечение Нг02 в окислительный цикл КВК можно зафиксировать по появлению переходов, кинетически эквивалентных "тройным срабатываниям" реакционного центра:

Ö, ^ (S„) . (4.4)

При этом величины пропусков i} двойных срабатываний в опыте и контроле должны быть близки.

Экспериментальная кинетика выделения кислорсдя в присутствии 0.03 М экзогенного Н^О и в контроле, усредненная по шести сериям, приведена на Рис.6. Отличия между опытом и контролем хороню выряжены. В присутствии НО амплитуда кислородных осцилляций возрастает, а фаза смещается на одну вспышку вперед.

Результаты компьютерных расчетеов приведены в Табл.2. Здесь «,. a_t - средняя доля пропусков для циклических переходов и состояния S_(, (1 - доля двойных срабатываний, в - вероятность

НОМЕР ВСПЫШКИ

РИС 6. . Кинетика выделения кислорода при импульсном освещении с частотой следования вспышек 2 Гц в присутствия экзогенного пероксида водорода. + - О.ОЗ Ы Н,Оа; о - контроль.

21

ТАБЛИЦА 2.

Кинетические константы, гсолучеюте при учете состояния S_i и без "то (п скобках).Ошибки отвечают одному стандартному отклонению.

иара^ метр . опыт контроль

а 0.24 ± 0.02 0.22 ± 0.05

(0.15 i 0.04) (0.17 ± 0.09)

а оиз ± 0.07 0,17" i 0.07

Р 0.12 + 0.04 0.00 í 0.05

6 0.25 ± 0.08 0.01 ± 0.05

(0.30 ± 0.10) (0.15 ± 0.09)

перехода (Se)-»S2 (связывания КВК с пероксидом). Видно, что величины пропусков в опыте и контроле практически совпадают как для циклических состояний, так и для s . В то ке время в присутствии пероксида водорода происходит резкое увеличение параметра 6, свидетельствующее о связывания экзогенного H20t с КВК с вероятностью:

р = еопыт^контроль = 0>24 (45)

Неожиданное увеличение в опыте параметра двойных срабатываний р не предсказывалось в предложенной схеме световых переходов (4.3). Однако оно хорошо вписывается в развиваемые нами представления о существенной роли процессов дезактивации КВК в процессе освещения,- поскольку сьетозависимое связывание КВК с пероксидом в сочетании с последующей дезактивацией приводит к новому комбинированному переходу вида:-

hv к.

5» — <SJ - V5* • (4.6)

т.е. часть "тройных срабатываний" (4.4) эффективно превращается в "двойные", что должно вызывать рост параметра р. Это приводит к переоценке доли КВК,связывающихся с пероксидом водорода вместо воды до значения:

Р'= Д(е + 2(3/7) = °-5б - (4.7)

Для начальных населенчостей s -состояний были получены следующие распределения:

{0.1 : 0.5 : 0.4 : 0 г 0 -опыт

(4.8)

0.7 : 0.3 : О : 0 : 0 -контроль Ансамбль КВК в присутствии Н^ окислен, в среднем, на один эквивалент больше, чем в контроле. Расчет, сделанный с учетом различий в световой предыстории контрольных и опытных образцов, показывает, что при длительной томновой адаптации (7 мин) около 35% КВК дополнительно окисляются экзогенным пероксидом благодаря медленным процессам обмена (4.1). Эта величина имеет тот ке порядок, что и оценки (4.5), (4.7) для вероятности связывания КВК с НД на свету. Если на этом основании допустить, что полученные значения близки к термодинамически равновесным, то из закона действующих масс для реакции (4.1) легко оценить разность энергий связывания КВК с пероксидом водорода и с водой:

[Но ]

Е(8г + 2Яг0) - Е(Бо + Н204) » ? 1 п [н*0] = -0.19 эВ .

Здесь Е(Б2 + 2Нг0) обозначает внутреннюю энергию связанного (с КВК) пероксида и свободной вода, а Е(Бо + Н10г) - внутреннюю энергию связанной воды и свободного пероксида.

Обнаруженное сильное светозависимов и темновое связывание КВК с пероксидом водорода оправдывает исходное предположение кинетической модели о том, что НгОж в связанной форме является естественным промежуточным продуктом фотосинтетического окисления воды. •

Качественный вывод о том, что экзогенный пероксид водорода способен эффективно встраиваться в КВК ФС2 вместо воды, остается в силе и при обработке полученных данных по усеченной кинетической схеме (4.3) без состояния 8 , результаты которой также ггредставлены в Табл.2. Это показывает, что характерные изменения кинетических параметров в опыте не являются артефактом, связанным с введением в расчетную схему дополнительного ' состояния. •

В то жэ время, г ч вычислениях без учета теряет устойчивость параметр. \, который принимает значения близкие или к к^ или к , вычислешшм по полной схеме. В последнем случае возникают нефизические отрицательные значения вероятностей и нпсвлетюотей в-состоятий. Кроме того, значения минимизируемого Функционала возрастают в среднем более чем в три раза. Это оправдывает вводвние дополнительного состояния в кинетическую схему (4.3). Помимо этого, из полученных распределений (4.8) видно, что состояние Я первым опустошается при ' добавлении

H.0,. то есть при увеличении окислительно- восстановительного потенциала средн. Кроме того, вероятность выхода из этого состояния 1-я., близка к вероятностям циклических переходов 1-а. Это позволяет заключить, что оно имеет ту же физико-химическую природу, что и остальные Г>-соотояния, то есть является редокс-состоятшем КВК причем более восстановленным, чем любое из состояний цикла (а не связано с блокировкой электронного транспорта через ФС2, например). Таким образом получает оправдание и расположение состояния в предложенной кинетической схеме.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

I. Разработан матричный формализм для описания редокс- превращений КВК, и проведен анализ кинетики фотосинтетического окисления водн. Показано, что характер кинетики зависит от структуры побочных процессов в КВК и может существенно отличаться от предсказаний общеупотребительной модели Кока.

2. Предложены методики обработки кинетических данных, обеспечивающие лучшую аппроксимацию экспериментальных зависимостей на всем классе четырехтактных кинетических схем и корректное определение эф1ективннх параметров процесса. На основе разработанных подходов создан пакет компьютерных программ.

3. Компьютерная обработка массива собственных вкспериминтнль-ннх данных показала, что одним из основных побочных процессов, сопровождающих окисление воды, является дезактивация КВК, приводящая к избирательному снижению эффективности переходов Г>4-»5г,

При частоте следования вспышек 2 Гц это снижение достигает 2Б% и возрастает с увеличением интервалов между вспниками.

4. С понижением интенсивности действующего света (до Ю^-Ю"' солнечной постоянной) скорость дезактивации КВК также пропорционально снижается. Благодаря э'Грму квантовая эффективность окис. ления воды при этих, освещенностях, соответствующих в природе

вечерним и ночным часам, остается относительно высокой и состав-'• ляет величину около 0.3.

5. У сдноклеточ!"1Х водорослей обнаружено пятое устойчивое состояние КВК з , имеющее на один восстановительный рквивялент больше состояния Зо, располагающееся вне четырехтактного кислородного 1Шчла и заселяющееся в результате темповой дезактивации. В хлороплвстах бобов состояние Б > не наблюдается.

6. Получены данные о способности ФС2 на свету аффективно связывать пероксид водорода и окислять его до кислорода. В темно з пароксид водорода также медленно замещает воду в КВК. По оценкам, энергия связи КВК с пероксидом больше чем с водой на величину около 0.2 еВ. Это подтвервдает предположение о том, что Н^ в связанной форме является естественным промежуточным продуктом фотосинтетического окисления вода.

7. Экспериментально показано с впадение спектров действия четырех стадий окисления воды. Это подтверждает представление о том, что все четыре стадии инициируются одним РЦ и не оказывают обратного действия на процессы светосбора и фотохимического разделения зарядов.

8. ' В целом, продемонстрирована 'эффективность' предложенного метода кинетического анализа. Он оолее чем на порядок улучшает качество аппроксимации экспериментальных зависимостей и позволяет изучать par юобразные побочные процессы в КВК, сопровождающие фотосинтетичэское окисление воды.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Птицын Г.А., Апашева Л.М., Дмитриев И.В., Кузнецов ,Ю.В., Комиссаров Г.Г. Влияние биоантиоксиданта на выделение кислорода хлореллой при импульсном освещении // Изв. АН

V СССР Сер. биол. 1988. JS 6. С. 939-942.

2. Птицын Г.А., Комиссаров Г.Г. Формально-кинетический анализ фотосинтетического выделения кислорода при импульсном освещении // Биофизика. 1990. Т.35. J6I. С.175. М.: 1989. -Деп. в ВИНИТИ. JSS4I0 - В89.

3. Комиссаров Г.Г., Птицын Г.А. Влияние №0г на кинетику фотосинтетического выделения кислорода // ДАН. 1993. Т.329. JS6.

> . С.661-662.

4. Пт. ,(ын Г.А., Комиссаров Г.Г. Кинетика выделения кислорода

. при фотосинтезе в присутствии №0г // Химическая физика.

. 1993. Т.12. >811. C.I462-I468.

5. Птицын Г.А., Рязанцева С.В., Илатовский В.А., Комиссаров

Г.Г. Влияние инфракрасной подсветки на импульсное выделение кислорода хлореллой // В сб.: Тезисы докладов II Всесоюзной конференции "Фотокаталитическое преобразование солнечной энергии". ,- Л. 1987. Новосибирск. 1987. С.44. " •

6. Птицнн Г.А., Апатева Л.М., Дмитриев И.Б., Кузнецов Ю.В., Комиссаров Г.Г. Влияние биоянтиоксидантя на выделение кислорода хлореллой при импульсном освещении // В сб.: Тезисы докладов гт Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях" Пущино. 1989. С. 102-103.

7. Птицнн Г.А..Комиссаров 1\Г. Общая четырехтактная схема Фотосинтетического выделения кислорода. Кинетический анализ и компьютерная обработка данных // В сб.: Тезисы докладов И Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях". Пущино. Г989. С. 50-51.

8. Птицнн Г.А., Комиссаров Г.Г. Кинетический анализ и экологические аспекты фотосинтетического' разложения воды // Труды III Всесоюзной школы по экологической химии водной среды. Аяма-ата. 1990. С.61-63.

9. Птицнн Г.А., Комиссаров Г.Г. Влияние №0» На кислородную кинетику фотосинтеза // Материалы Всесоюзной конференции "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран и их моделей". Пущино. 8-II июня 1993. С.41.

10. Ptitpyn O.A., KomiBsarov 0.0. Dark and lJght-iruluoed

inaotivation of PS2. // 11-th Int. Blopynioß Congress. July 25-30. 1993. Hungary. Abut.E1.53. Р.1Я9.

П» * " Зэк. Z81 Tap. LUV