Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фотосинтетического газообмена в клеточном цикле микроводорослей

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование фотосинтетического газообмена в клеточном цикле микроводорослей"

РГ6 од

Н "" РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи УДК 581.132+581.19

АКЫЕВ

Агамурад Язджумаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО ГАЗООБМЕНА В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

(03.00.12 - физиология растений)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1993

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева Российской Академии Наук.

Научный руководитель - кандидат физико-математических наук Л.Н.Цоглин Официальные оппоненты: доктор биологических наук П.С. Венедиктов кандидат биологических наук С.Н. Чмора

Ведущее учреждение - Институт почвоведения и фотосинтеза РАН. Защита состоится "¿Р'^ъ&ц?-/ 1994 г. в /Р* . час на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К 002.45.01 при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН по адресу 127276, Москва, Ботаническая ул.35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Автореферат разослан "¿У" 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

канд. биол. наук Л.И. Сергеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Знание закономерностей 02- и СОг-газообмена микро-

водорослей, биохимического состава клеток разных возрастов при различной концентрации кислорода в культуральной жидкости, а также влияния его на длительность клеточного цикла микроводорослей поможет решению проблем, связанных с регуляторны.ч действием 02 на клеточные процессы, позволит найти пути управления биохимическим составом микроводорослей для получения наибольшего выхода целевых продуктов из биомассы, оптимизировать режимы культивирования и повысить производительность промышленных фотобиореакторов.

закономерностей фотосинтетического 02- и С02-газообмена, накопления сухой массы клеток, изменения биохимического состава клеток в клеточном цикле СЫогеПа при различной концентрации 02 в культуральяой среде, оптимизация на основании полученных данных режимов культивирования в модуле промышленного фотореактора трубчатого типа.

Научная новизна. Показано, что низкая концентрация 02 в среде вызывает значительное увеличение скорости выделения кислорода при сохранении длительности клеточного цикла, скорости накопления сухой массы клеток и удельной скорости поглощения СОг на уровне нормальных (контроль, 21% кислорода) условий роста. Содержание суммы жирных кислот и хлорофиллов при этом выше, чем в нормальных условиях. Биомасса клеток более восстановлена, что объясняет раз-балланс между накоплением сухой массы клеток и их высокой фотосинтетической активностью по выделению О2.

При высокой концентрации О2 в культуралыюй среде происходит удлинение клеточного цикла и замедляется нарастание сухой массы клеток по сравнению с нормальными условиями. Причина этого заключается в задержке формирования фотосинтетичесокго аппарата клеток.

При измерении скорости поглощения кислорода сразу после выключения света (переход -"свет-темнота") обнаружен колебательный характер изменений этого параметра по клеточному циклу при низкой и высокой концентрации Ог в культуральной среде, связанный с авторегулированием в этих условиях энергетических потребностей клетки на разных стадиях жизненного цикла.

Исследована динамика накопления кислорода в культуральной среде при интенсивном росте СМогеЧа в модуле промышленного реактора трубчатого типа и показано, что в установившемся режиме рОг достигает 70-80%, значительно снижая скорость роста культуры. Применение ультразвука (240 кГц) для дегазации суспензии не дало положительного результата, по-видимому, из-за низкой удельной мощности (100 Вт на 70 л суспензии). Однако было обнаружено стимулирующее действие ультразвука на рост клеток. Разработано дегазирующее устройство,

Основными целями и задачами работы являются: исследование

позволившее снизить рОг в суспензии до 30-40% и почти в 4 раза повысить производительность реактора.

Практичег.кля ценность. Полученные данные могут быть использованы:

- при крупномасштабном культивировании микроводорослей;

- при разработке систем культивирования;

- при разработке технологий культивирования с направленным изменением метаболизма микроводорослей для получения биомассы с наибольшим содержанием целевых продуктов;

- при расчетах замкнутых систем жизнеобеспечения с биологической регенерацией атмосферы и активным управлением составом атмосферы за счет изменения рОг в культуральной жидкости.

Апробяпия работы. Основные результаты работы обсуждались на международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино-на-Оке,

1991), 1 Европейском совещании по биотехнологии микроводорослей (Потсдам,

1992), III Всероссийском съезде общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), VI международной конференции по прикладной альгологии (Чехия,

1993) и на научных семинарах Отдела внутриклеточной регуляции и биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ. Структура и объем работу. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, методическую часть, экспериментальную часть, в которой приведены результаты исследований и их обсуждение, заключение и выводы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и иллюстрирована 31 рисунком. Список литературы включает 128 наименований, из которых 84 на иностранных языках.

Список сокращений: КЦ - клеточный цикл; хл а, хл b - хлорофиллы а и Ь, соответственно.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования была синхронная культура одноклеточной зеленой водоросли Chlorella sp.K (Chlorella vulgaris Bei/er. vor. IPPAS C-l) из коллекции одноклеточных микроводорослей Института физиологии растений РАН.

В опытах использовали 3 разные газовые смеси. Культуру в измерительной ячейке, в опытном сосуде и в фотореакторе барботировали: 1 - газовоздушной смесью (контроль,2% С02 + воздух); 2 - безкислородной смесью (2% С02 + азот) и 3 - смесью с повышенным содержанием Ог (2% С02 + 60-70% 02 + азот). Смеси приготавливали с помощью перистальтических насосов и микрокомпрессора.

Синхронизацию клеток проводили чередованием света и темноты (7 ч свет: 5 ч темнота) по методике, описанной в работе [Цоглин, Клячко-Гурвич, 1980]. Число клеток определяли на счетчике Культера фирмы "Coultronics" (Франция) и в камере Горяева. Сухую массу клеток определяли на спектрофотометре Specol фирмы "Carl Zeiss" (Германия) по калибровочному графику при 750 нм. Количество растворенного в среде кислорода измеряли в измерительной ячейке с встроенным 02-датчиком, описанной в работе [Семененко и др., 1972], по разработанной нами схеме. Т95 системы, для изучения Ог-газообмена составляло менее 35 сек. Поглощение СО2 суспензией клеток измеряли с помощью инфракрасного газоанализатора по открытой схеме [Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения, 1989]. Время достижения 95% величины максимального сигнала составляло менее 20 мин. Общее содержание ДНК в клетках определяли по флуоресценции. Клетки окрашивали акридиновым оранжевым. Флуоресцен-цию снимали с помощью микрофлуориметра МСФ-2. Хлорофиллы экстрагировали горячим метанолом, оптическую плотность измеряли на Specord 400 фирмы "Carl Zeiss" и рассчитывали по формулам, описанным в работе [Hipkins, Baker, 1986]. Белки определяли по Лоури [Lowry et al, 1951] в тех же пробах после извлечения хлорофиллов, углеводы - фенол-серным методом [Рудова, 1981], Липиды - методом ГЖХ на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия) по методике, описанной в работе [Клячко-Гурвич, Семененко, 1978].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. 02-газообмен в клеточном цикле микроводоросли Chlorella.

Выделение кислорода клетками хлореллы в течение КЦ приведено на рис.1 (кривые 1-3). Во всех вариантах удельная скорость выделения 02 менялась ступенчато и была максимальна к 5 ч КЦ. Такое неравномерное выделение 02 по клеточному циклу отмечено в работах [Lorensen, 1959; Sorokin, Kraus, 1961; Senger, Bishop, 1969; Цоглин, Клячко:Гурвнч,1980]. Примечательно, что удельная скорость выделения 02 в случае пониженной концентрации кислорода в среде (pÖ2 4-7% за счет фотосинтетического выделения 02) (рис.1, кривая 2) намного больше, чем в обычных условиях (рис.1, кривая 1). Различие в удельной скорости выделения 02 не постоянно в течение КЦ и зависит от возраста клеток. В равномерной культуре микроводорослей были получены данные о том, что при низкой концентрации 02 в среде (около 0.5%) удельная скорость выделения 02 может увеличиваться от 1.02 до 1.5 раз [Coombs, Whittingham, 1966; Карабаев и др., 1977.]. Поскольку по клеточному циклу удельная скорость выделения 02 меняется, для количественного сравнения мы взяли ее значение в максимуме. В разных опытах в нормальных условиях эта величина менялась в пределах от 3.3 мл-минЧ .

г"1 до 8.5 мл-мин"1'!-"1 и от 8.8 до 21 мл мин"1- г"1 в случае пониженной концентрации 02 в среде.

При низкой концентрации Ог в культуральной среде, несмотря на значительное увеличение фотосинтетической активности, измеренной по выделению 02, практически не изменялась длительность КЦ (рис.2, кривая 2) и не наблюдалось адекватного с фотосинтетической активностью увеличения роста сухой массы клеток в течение КЦ (рис.3, кривая 2).

Повышенная концентрация 02 в среде вызывала незначительное уменьшение удельной скорости выделения 02 в начале КЦ ( в интервале от 0 до 3.5 ч) и в конце КЦ (после 6.5 ч) по сравнению с контролем (рис. 1, кривая 3). В наших опытах клетки не были адаптированы к высокой концентрации 02.

ВРЕМЯ ОГ НАЧАЛА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (Ч>

Рис. 1. Динамика удельной скорости выделения 02 по клеточному циклу при различной концентрации 02 в культуральной среде. р02- 1 - 21-24%; 2-4-7%; 3 -60-73%

ВРЕНя ОТ НАЧАЛА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (Ч)

Рис. 2. Изменение числа клеток по клеточному циклу при различной концентрации 02 в культуральной среде. Обозначения те же, что на рис.1.

Синхронизацию культуры проводили в обычных условиях (р02 - 21-24%). Поэтому уменьшение и тем более увеличение концентрации 02 в среде в какой-то степени являлись "шоковыми" для клеток.

В чем причина уменьшения удельной скорости выделения 02 в начале КЦ при высокой концентрации 02 в среде? Является ли это следствием "шокового" воздействия 02 на клетки или же молодые клетки более чувствительны к действию высокой концентрации 02? Скорее всего, последнее, поскольку с началом появления автоспор (которые образуются из клеток, выросших в условиях повышенной концентрации 02) в конце КЦ также наблюдали меньшую удельную скорость выделения 02 по сравнению с контролем.

При высокой концентрации 02 в среде КЦ удлиняется на 1-2 ч (рис.2, кривая 3) и рост сухой массы клеток идет медленнее, чем в контроле (рис.3, кривая 3). В равномерной культуре хлореллы было обнаружено, что удельная скорость выделения 02 при р02 в среде 62% уменьшается на 42% [Карабаев и др., 1977]. Но в наших опытах такое существенное уменьшение удельной скорости выделения 02 не наблюдалось, более того, в интервале 3.5-6.5 ч КЦ она даже вы-

1№Ш1 ОТ НАЧАЛ* КАРТОЧНОГО ЦИКЛА <Ч>

ВГЕМЯ ОТ НАЧАЛА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (

Рис. 3. Накопление сухой массы клеток в клеточном цикле Chlorella sp.K в зависимости от концентрации 02 в культуральной среде. Обозначения те же, что на рис.1.

Рис. 4. Динамика темнового дыхания

и поглощения 02 при переходе свет-

темнота в клеточном цикле Chlorella

sp.K при различной концентрации 02

в культуральной среде.

р02 : 1,4 - 21-24%; 2,5 - 4-7%; 3,6 -

60-73%

ше, чем в контроле.

Влияние растворенного в среде 02 на динамику темнового дыхания по КЦ представлено на рис.4 (кривые 1-3). При пониженной концентрации 02 и в нормальных условиях динамики темновых дыханий идентичны (рис.4, кривые 1,2), при повышенной концентрации Огона носит сложный характер (рис.4, кривая 3). Но по величине темновое дыхание во всех вариантах различается не сильно. Это согласуется с тем, что темновое дыхание достигает насыщения уже при 2% 02 в среде [Карабаев и др., 1977].

Значительное различие обнаруживается при сравнении поглощения 02 после выключения света. В контрольном варианте оно увеличивается к 3.5 ч КЦ в 3 раза, затем медленно падает. При пониженной и повышенной концентрации 02 в среде изменение этой величины носит синусоидальный характер и после 3.5ч КЦ выше в обоих вариантах, чем в контроле (рис.4, кривые 4-6), Увеличение поглощения Ог после выключения света при пониженной, и повышенной концентрации 02 в среде можно объяснить тем, что для клеток такие условия являются "шоковыми" и, возможно, в клетке происходят адаптивные процессы, которые протекают с участием 02. Возможно, такие изменения являются следствием само- '

регуляции клеткой собственных потребностей в энергии и различных субстратах. В литературе имеются работы, посвященные футильным циклам, имеющим место в жизнедеятельности живой клетки [Иваницкий и др.,1978], исследования которых проводятся с применением методов математического моделирования. Возможно, обнаруженный нами феномен, а именно синусоидальное изменение поглощения 02 по КЦ после выключения света, является отражением процессов энергетического самоконтроля клетки. По-видимому, синхронные культуры микроводорослей могли бы служить хорошим объектом для исследований, связанных с футильными циклами.

Что может быть причиной того, что: 1 - при пониженной концентрации 02 в культуральной среде увеличивается удельная скорость выделения 02 и не происходит адекватное увеличение скорости накопления биомассы клеток; 2 -повышенная концентрация 02 в среде приводит к удлинению КЦ, замедлению накопления биомассы клеток, а фотосинтетическая активность клеток, измеренная по выделению 02 в период от 3.5 до 6.5 ч КЦ сопоставима с фотосинтетической активностью клеток, выращиваемых при нормальной концентрации 02 в среде?

Можно предположить несколько причин:

1. Действие 02 на генетические процессы, связанные с синтезом ДНК;

2. Действие 02 на формирование фотосинтетического аппарата клеток; 3. Действие 02 на фотосинтетический метаболизм, что может привести к изменению биохимического состава клеток (к изменению степени восстановленное™ биомассы клеток); 4. Действие 02на фиксацию С02.

Б дальнейшем мы проверяли высказанные предположения посредством определения относительного содержания ДНК , содержания хла и хлЬ, белков, углеводов, липидов в клетках, одновременного изучения С02- и 02-газообменов в КЦ..

2. Изменение содержания ДНК в клетках в течение клеточного цикла.

На рис. 5 а-в представлены данные, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа при окрашивании клеток красителем акридиновым оранжевым. Приведены распределения клеток разных возрастов по содержанию ДНК. По оси абсцисс отложены величина сигнала флуоресценции ДНК при 538 им. По ординате отложено число клеток, попавших в каждый из интервалов. На кривых указан возраст клеток.

По мере роста клеток в КЦ во всех вариантах происходит постепенное смещение сигнала вправо, что свидетельствует о накоплении ДНК в клетках (рис. 5 а-в).

Рис. 5. Распределение клеток по содержанию ДНК. Цифры на кривых - возраст клеток (ч).

0.5

0.4

Щ

% 0.2 I

0.1

о I 2 3 4 5 6

ВРЕМЯ ОТ НАЧАЛА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (Ч)

Рис. 5Г. Изменение содержания ДНК в клетках в клеточном цикле при различной концентрации Ог в культуральной среде. Обозначения те же, что на рис.1.

Более наглядно динамика содержания ДНК видна при рассмотрении средних значений сигнала флуоресценции (рис.5Г, кривые 1-3). Видно, что накопление ДНК происходит во всех вариантах идентично и его содержание в клетках увеличивается примерно в 6 раз, что коррелирует с изменением числа клеток к концу КЦ (рис. 2). Обычно синтез ДНК в КЦ микроводорослей имеет лаг-период. В некоторых опытах мы также наблюдали этот период, в начале КЦ (примерно 11.5 ч). Исходя из содержания ДНК в клетках можно сказать, что в 5 ч КЦ количество ДНК в клетках приблизительно одинаково во всех вариантах.

3. Динамика содержания хлорофиллов а и Ь в клеточном цикле.

Указанные в разделе "Ог-газообмен" различия в удельной скорости выделения 02 у разных вариантов должны быть непосредственно связаны с изменениями в фотосинтетическом аппарате клеток. Известно, что молодые клетки хлореллы не обладают окончательно сформированным фотосинтетическим аппаратом [Цоглин, Клячко-Гурвич, 1980; УепесШцоу е!а1., 1981]. Фотосинтетический аппарат клеток формируется в течение первых часов после начала КЦ.

Для того, чтобы судить, как происходит формирование фотосинтетического аппарата клеток при различной концентрации кислорода в среде, мы определяли содержание хлорофиллов а и Ь и их соотношения в течение КЦ (рис. 6).

В случае пониженной концентрации 02 и в нормальных условиях соотношение хл а/хл Ь достигает максимума к 3.5 ч КЦ. В то же время в случае повышенной концентрации 02 оно достигает максимума только к 5 ч КЦ. Это свидетельствует о влиянии кислорода в среде на процессы формирования фотосинтетического аппарата клеток и объясняет удлинение клеточного цикла в случае повышенной концентрации 02 в среде.

4. Изменение содержания белков и углеводов в КЦ при разной концентрации Ог в среде.

В начале КЦ содержание белков находилось в интервале от 35 до 42% сухой массы клеток. С ростом клеток содержание белков в контрольном варианте постепенно увеличивалось до 5 ч КЦ, к концу КЦ оно уменьшилось и составило 22% от сухой массы клеток (рис.7, кривая 1). При низкой концентрации 02 в среде содержание белков несколько уменьшилось в первые 2 ч КЦ, затем колебалось на определенном уровне до 6,5 ч КЦ, а к концу КЦ уменьшилось далее до 27% от сухой массы клеток (рис.7, кривая 2). Большее падение содержания белков наблюдалось при повышенной концентрации 02 в среде (рис. 7, кривая 3). Оно уменьшалось до 5 ч КЦ, от 5 до 8 ч имело место незначительное увеличение. В конце КЦ также произошло уменьшение содержания белков до 23% от сухой массы клеток. В то же время, синтез белков происходил постоянно во всех вариантах, что можно видеть по динамике содержания белка в объеме культуральной среды (рис.7, встав-

о

(J <

« о

X

cj

f-o

e?

X

ВРЕМЯ ОТ НАЧАЛА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (Ч)

ВРЕМЯ ОТ НАЧАЛА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (Ч)

Рис. 6. Изменение содержания хлорофиллов а и b в биомассе клеток и их соотношения в клеточном цикле Chlorella sp.K. при различной концентрации 02 в культуральной среде. Обозначения те же, что на рис. I.

ВРЕМЯ ОТ ИАЧМА ШТОЧЯШО ЦИКЛА (41

Рис. 7. Изменение содержания белков в биомассе клеток в клеточном цикле СМагеНа кр.К при различной концентрации 02 в культуральной среде. Обозначения те же, что на рис.1.

ВРЕИЯ ОТ НАЧАЛА МЕТОЧНОГО ЦИШ (41

Рис.8. Изменение содержания углеводов в биомассе клеток в клеточном цикле Chlorella sp.K при различной концентрации 02 в культуральной среде.

Обозначения те же, что на рис.1.

ка), хотя динамика этого процесса была различной. Уменьшение относительного содержания белков, очевидно, связано с увеличением содержания углеводов, жирных кислот и других соединений. В начале КЦ содержание углеводов составляло от 13 до 15 % от сухой массы клеток (рис.8, кривые 1-3) и постепенно увеличивалось к концу КЦ во всех вариантах и достигло в контрольном варианте 34 % (рис.8, кривая 1), при пониженной и повышенной концентрации О2 в среде оно было одинаково и составило 26% (рис.8, кривые 2,3).

Сравнение динамики содержания белков (рис.7, кривые 1-3) и углеводов (рис.8, кривые 1-3) показывает, что однозначно говорить о преимущественном синтезе этих соединений в каком-либо из вариантов сложно. Можно лишь отметить общую тенденцию - снижение содержания белков и увеличение содержания углеводов в сухой массе клеток к концу КЦ.

Уменьшение содержания белков и увеличение содержания углеводов к концу КЦ у синхронной культуры СМатуйотопаь показано в работе [Антонян, Галкина, 1974]. В работе [Бикетс, СагшеЦ, 1990] у микроводоросли ЫаппосМо-гор$1$ Бр. показано, что содержание белков в клетке максимально через 9 часов после включения света при режиме чередования света и темноты 12:12, что согласуется с нашими результатами, полученными при нормальной концентрации Ог в среде (рис.7, кривая I). В то же время при низком и высоком содержании 02 в

среде (рис. 7, кривые 2,3) наблюдается неравномерное уменьшение содержания белков в биомассе клеток. К концу светового периода содержание углеводов у МишосЛ/ого/мм также выше чем, в начале КЦ, что аналогично данным, полученным нами для всех вариантов.

5. Изменение содержания жирных кислот в КЦ в зависимости от содержания Ог в среде.

Динамика содержания суммарных жирных кислот представлена на рис.9. При пониженной концентрации 02 в среде содержание жирных кислот выше, чем в контрольном варианте для клеток всех возрастов, кроме "8-часовых" (рис. 9 , кривые 1,2). Из представленного рисунка можно заключить, что при пониженной концентрации 02 в среде сухая масса клеток более восстановлена по сравнению с контролем. Это может объяснить увеличение удельной скорости выделения 02 при пониженной концентрации 02, без увеличения скорости накопления сухой массы клеток.

Особый интерес представляет динамика содержания жирных кислот, связанных с формированием фотосинтетического аппарата и развитием хлоропласта клеток - 16:1п131г, 16:3, 18:2, 18:3. Их динамика по КЦ представлена на рис.10. Видно, что при пониженной концентрации 02 в среде и в контрольном варианте их максимумы находятся в интервале между 2 и 3.5 ч КЦ и совпадают между собой (рис.10, кривые 1,2). Это указывает на то, что в этих вариантах формирование фотосинтетического аппарата клеток происходит идентично. Об этом же свидетельствует, как было показано в предыдущем разделе, изменения соотношения хлорофиллов а и Ь. Максимум накопления указанных кислот в варианте с повышенным содержанием 02 в среде сдвинут на более поздние этапы КЦ (рисЮ, кривая 3). И соотношение хлорофиллов а и Ь также достигает своего максимума позже, чем в других вариантах. Это еще раз подтверждает наше предположение о том, что высокая концентрация 02 приводит к задержке формирвания фотосинтетического аппарата клеток. <

Полученные данные свидетельствуют также о возможности использования кислорода в качестве фактора управления метаболизмом клеток микроводорослей для повышения содержания в биомассе углеводов, белков или жирных кислот.

Таким образом, из представленных результатов можно сделать следующие выводы: низкая концентрация Ог в среде увеличивает удельную скорость выделения 02, но на длительность КЦ и накопления биомассы не влияет. Биомасса в этом случае более восстановленная, чем в других вариантах. Формирование фотосинтетического аппарата клеток происходит идентично контрольному. Высо- . кая концентрация 02 удлиняет КЦ, уменьшает накопление биомассы клеток. Причиной замедления КЦ является задержка формирования фотосинтетического

ВРЕМЯ ОТ НАЧАЛА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА <Ч>

Рис. 9. Изменение содержания суммарного количества жирных кислот в биомассе клеток в зависимости от содержания 02 в среде. Обозначения те же, что на рис.1.

Рис. 10. Динамика содержания жирных кислот в клеточном цикле Chlorella sp.K. при различной концентрации Ог в среде. Обозначения те же, что на рис.1.

аппарата клеток. Это, видимо, является главной причиной уменьшения накопления сухой массы клеток в КЦ. Причиной последнего может быть также выделение в среду фиксированного СОг в виде органических веществ, например в виде гликолевой кислоты, которое должно иметь место в этих условиях [Basshain, Kirk, 1962; Graham, Wittingam,1968; Демидови др., 1983].

7. Одновременное изучение 02- и С02-газообмена в КЦ в зависимости от содержания О2 в среде.

Известно, что как и удельная скорость выделения 02 в КЦ, удельная скорость поглощения С02 имеет максимум. Этот максимум наблюдается в первые часы КЦ (рис.11). Как видно из рисунка, максимум удельной скорости поглощения СО2 при пониженной концентрации 02 к 2 ч КЦ, в контрольном варианте - 3 ч, в варианте с повышенным содержанием О2 в среде - между 3 и 4 ч КЦ. Динамики удельных скоростей поглощения СО2 в вариантах 1 и 2 идентичны, что согласуется с процессами накопления сухой массы клеток в этих вариантах (рис.11, кривые 1,2). При повышенной концентрации 02 в среде удельная скорость поглощения СО2 в первые 5 ч КЦ ниже, чем в других вариантах (рис.11, кривая 3) и накопление сухой массы клеток также ниже (рис.2, кривая 3).

Динамики удельных скоростей выделения 02 в этих опытах приведены на рис. 12 . Они несколько отличаются от данных, представленных в разделе "02-га-зообмен ...", поскольку для одновременного измерения 02- и С02-газообмена нами (в связи с методическими трудностями измерения С02 в малых объемах) был использован фотореактор с объемом суспензии 6 л, а не измерительная ячейка. Несмотря на то, что основные параметры культуры поддерживались на том же уровне, что и в измерительной ячейке, условия культивирования несколько отличались. Однако, общие закономерности в этих экспериментах и опытах, результаты которых приведены в "02-газообмен..." в основном сохраняются. Закономерности накопления сухой массы клеток также сохранились, что видно из < рис. 13.

Таким образом, при одновременном исследовании С02- и 02-газообмена мы обнаружили, что удельная скорость поглощения 002, также как и удельная скорость выделения 02 имеет максимум во всех вариантах и эффективность поглощения СО2 в течение КЦ меняется. При этом в условиях низкой и повышенной концентрации 02 в среде , максимум поглощения СО2 опережает максимум выделения О2. Т.е. в течение КЦ фотосинтетический коэффициент СО2/02 меняется. В случае контрольного варианта этот коэффициент также меняется, поскольку после 3 ч КЦ поглощение СО2 все время падает, тогда как выделение 02 после 5 ч КЦ увеличивается.

0 1 2 3 4 5 Ь 7 8 9 10 II I:

8ш т ачш шданого цкш о)

Рис. 11. Динамика удельной скорости поглощения С02 в течение клеточного цикла в зависимости от содержания 02 в среде. Обозначения как на рис.1.

4 5 6 7 8 9 10 II 12 ВРЕНЯ ОТ НАЧАЛА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (Ч)

Рис. 12. Динамика удельной скорости выделения 02 в течение клеточного цикла в зависимости от содержания 02 в среде. Обозначения как на рис.1.

а s

ВРЕМЯ ОТ НАЧАЛА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА СЧ)

Рис. 13. Накопление сухой массы клеток Chlorella sp.K в клеточном цикле при ризличной концентрации 02 в куль-туральной среде. Обозначения те же, что на рис. 1.

Изменение фотосинтетического коэффициента в КЦ может быть использовано для регулирования газового состава при регенерации атмосферы в замкнутых системах жизнеобеспечения с использованием микроводорослей.

8. Интенсивное культивирование Chlorella sр.К. в модуле крупнотоннажного трубчатого фотореактора.

Полученные в работе данные свидетельствуют об увеличении длительности КЦ и снижении'прироста биомассы при высоких концентрациях кислорода в куль-туральной среде. В то же время, для массового культивирования микроводорослей наиболее широко используются фотореакторы трубчатого типа, в которых длина трубы достигает 100 и более метров. Можно ожидать, что за счет фотосинтетического выделения кислорода концентрация 02 в таких реакторах достигает высоких значений и вызывает снижение их продуктивности. Для изучения действия кислорода на продуктивность при массовом культивировании микроводорослей мы ис-следовали закономерности накопления кислорода в культуральной среде и роста Chlorella sp.K в модуле промышленного реактора трубчатого типа с объемом суспензии 70 л. и длиной трубы 60 м.

Для культивирования использовали стандартную среду Тамийя, освещение реактора - круглосуточное от 10 ламп'ДНаТ-400, средняя интенсивность освещения на светоприемной поверхности реактора - 70 Вт-м . Скорость движения суспензии по трубе - 1,1 м с"'.

Измерения концентрации кислорода в суспензии показали, что в установившемся режиме (через 8-10 ч культивирования) концентрация растворенного кислорода достигала 50-80% (в зависимости от стадии культивирования и плотности клеток в культуре), скорость прироста сухой массы при этом составила 0.5 г л"1 сут"' (рис. 14). После включения сконструированного дегазирующего устройства (рис.14, стрелка) , которое позволило снизить концентрацию растворенного в культуральной среде 02 до 25-45%, скорость накопления сухой массы клеток возросла до 2 г л*'сут"' (рис. 14). Использование ультразвукового излучателя для десорбции О2 не влияло на концентрацию растворенного в среде 02.

В предварительных опытах, проведенных в культуральных сосудах объемом 200 мл для выяснения действия ультразвука на жизнедеятельность клеток, было показано, что ультразвук благоприятно действует на клетки при малых плотностях культуры (рис.15). При этом на начальном этапе культивирования скорость роста клеток увеличивалась от 1.2 до 2 раз (в разных опытах). С увеличением плотности суспензии разница в скоростях накопления биомассы уменьшалась. В трубчатом фотореакторе применение ультразвука не действовало на скорость накопления биомассы клеток в первые 2-е суток культивирования. Возможно в этом случае не хватало удельной мощности ультразвука и поэтому мы не смогли обна-

5

В

О 50 ЮО 150 200 2 SO ЗОО

ВРЕМЯ <Ч)

Рис. 14. Влияние растворенной в культуральной среде 02 на накопление сухой массы клеток Chlorella sp.K при культивировании в трубчатом полупромышленном культиваторе.

1 - концентрация растворенного в культуральной среде 02;

2 - сухая масса клеток.

Стрелка - момент включения дегазирующего устройства.

I 1 контроль

—3 опыт

42

ВРЕМЯ (Ч)

Рис.15. Действие ультразвука на накопление сухой массы клеток при выращивании в культуральных сосудах. Начальная плотность 15 мг-л .

В

о. в

О 2 А 48 72 96 120 144

ВРЕМЯ 14)

Рис. 16. Действие ультразвука на накопление сухой массы клеток при выращивании Chlorella sp.K в полупромышленном трубчатом реакторе. 1-е ультразвуком; 2 - без ультразвука.

ВЫВОДЫ:

ружить увеличение скорости роста биомассы. Однако, через 2.5 суток у культуры выращиваемой без ультразвука наблюдалось замедление накопления сухой массы клеток (рис.16, кривая 2). При атом конечная макси-мальная плотность в этих условиях не превышала 9-9.5 г-л"1. В то же время в варианте, где культура в течение всего времени выращивания подвергалась действию ультразвука, замедление накопле-ния биомассы не наблюдалось до 5 суток и конечная плотность культуры составила 1213 г-л"1.

1. На синхронной культуре Chlorella исследовано действие различных концентраций кислорода в культуральной среде на особенности клеточного цикла развития и выявлено влияние кислорода на процессы газообмена, роста биомассы, развития фотосинтетического аппарата и метаболизма клеток.

2. Показано, что при низкой концентрации Оъ в среде (4-7%) длительность клеточного цикла не изменяется. Удельная скорость выделения 02 значительно выше, чем в нормальных условиях, а накопление сухой массы клеток и удельная скорость поглощения С02 сопоставимы с нормальными условиями (21-24% 02 в среде). Рассогласование в процессах выделения кислорода и накопления сухой массы объясняется более высокой восстановленностыо материала клеток, о чем свидетельствует рост относительного содержание жирных кислот и хлорофилла.

3. При высокой концентрации 02 в культуральной среде увеличивается длительность клеточного цикла и замедляется рост сухой массы клеток по срав-

нению с нормальными условиями; одной из причин удлинения клеточного цикла и замедления накопления сухой массы клеток является задержка формирования фотосинтетического аппарата клеток, о чем свидетельствует смещение на более поздние стадии клеточного цикла максимумов соотношения хл а/хл b и накопления жирных кислот, связанных с функционированием фотосинтетического аппарата клеток. Удельная скорость выделения 02 в этих условиях в начале и в конце клеточного цикла ниже, чем в нормальных условиях; удельная скорость поглощения С02 ниже до 5 ч клеточного цикла, т.е. практически весь световой период роста клеток;

4. Обнаружены периодические изменения по клеточному циклу скорости поглощения 02 при переходах свет-темнота при низкой и высокой концентрации 02 в культуральной среде, что, по-видимому, связано с авторегулированием в этих условиях энергетических потребностей клетки на разных стадиях ее развития.

5. Показана возможность использования зависимости скорости выделения кислорода от его содержания в культуральной среде и изменения в клеточном цикле фотосинтетического коэффициента для активного управления газовым составом в замкнутых системах жизнеобеспечения.

6. Изучена динамика накопления кислорода в модуле промышленного реактора трубчатого типа и показано, что основной причиной, снижающей продуктивность, является высокая концентрация кислорода в суспензии.

7. Усовершенствовано дегазирующее устройство трубчатого фотореактора, что позволило значительно снизить концентрацию растворенного кислорода в суспензии и почти в 4 раза повысить его продуктивность.

8. Обнаружено стимулирующее действие ультразвука (240 кГц) на рост микроводорослей.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Акыев А.Я., Цоглин Л.Н. Влияние кислорода на клеточный цикл Chlorella //Тез. докл. и сообщ. межд. конф. "Фотосинтез и фотобиотехнология" - Пущино -1991.-С. 128 *

2. Акыев А.Я., Цоглин Л.Н. Влияние кислорода на 02-газообмен и на рост биомассы клеток в цикле развития Chlorella //Физиология растений. 1992. Т.39. Вып.З. С.495

3. Semenenk.0 V.E., Tsoglin L., Baculin V., Akiyev A. Population age structure when unicellular algae are cultivated.//1st European Workshop on microalgal biotechnology: Algology. Potsdam: Printexpress К. Beyer. 1992. P. 82.

4. Akiyev A., Rogova N.. Tsoglin L. Influence of oxygen on the cell development in synchronous culture of Chlorella sp.//6th International Conference on Applied Algology. Ceske Budejovice, Czech Republic. 1993. P.l 10

5. Рогова Н.Б.,Акыев А.Я., Цоглин Л.Н. Влияние повышенной концентрации кислорода на накопление биомассы и жирнокислотный состав клеток Chlorella в цикле развития.// Тез. докл. III Всероссийского съезда физиологов растений. С-Петербург. 1993. С. 196.