Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетические свойства Mg2+, АТФ-зависимого транспорта ионов Са во внутриклеточных структурах миометрия и влияние этанола на этот процесс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кинетические свойства Mg2+, АТФ-зависимого транспорта ионов Са во внутриклеточных структурах миометрия и влияние этанола на этот процесс"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

.... " г> А П

і:М 0

УДК 577.352.45:612.396.22

КІНЕТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ Мг2+,АТФ - ЗАЛЕЖНОГО ТРАНСПОРТУ ІОНІВ Са У ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИХ СТРУКТУРАХ МІОМЕТРІЯ ТА ІНІЛИИ ЕТАНОЛУ ІІЛ ЦЕЙ ПРОЦЕС

03.00.04 - біохімія

\ Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Папладіна НАН України.

Г - ' _

' _ \

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник "" КОСТЕРШ Сергій Олексійович, завідувач відділу біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор ^

ЗИМА Валентин Леонідович,

професор кафедри біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка \ч '■ ' _

- кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

ГІММЕЛЬРЕЙХ Ніна Германівна, завідувач відділу нейрохімії Інституту біохімії ' ім. О: В. Палладіна НАН України

Провідна установа - Інститут фізіології ім.О. О. Богомольця НАН України, --

; відділ фізико - хімічної біології клітинних мембран ,

. (м. Київ)

Захист відбудеться “ 29 ” січня 2001 року о 14 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ - ЗО, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімі ім.О.В.Палладіна НАН України (Київ, вул, Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий “ 27 ” грудня 2000 р. ^

Учений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук

7 КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Іонам кальцію належить важлива роль в активації скорочення гладеньких м’язів [Шуба и др.,1991; Horowitz et al.,1996; Smith et al., 1996; Somlyo ct al.,1998; Taggart ct al.,1998; Burdyga cl al., 1999].

Гладеньком’язові клітини (ГМК) матки є складною тензоелектричною системою, скоротлива активність якої контролюється чисельними факторами, а саме: статевими гормонами, гормонами гіпофіза, зокрема окситоцином, медіаторами, іонами, а також механічним розтягуванням [Остин и др.,1987; Wray et al., 1993; Szal et al.,1994; Sanborn et al.,1998; 2000].

Фундаментальне значення у забезпеченні внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу належить системам ішсншюіо та активного транспорту цього катіона [Kostyuk et al., 2000]. Серед останніх у гладеньких м’язах ідентифіковані М§2+,АТФ-залежні Са2+-транспортуючі системи, що локалізовані як у плазматичній мембрані (ПМ), так і у внутрішньоклітинних мембранних структурах - у мітохондріях (MX) та ендоплазматичному ретикулумі (ЕР) [Garfield et al.,1994; Kosterin et al.,1994; Taggart et al.,1998; Pozzan et al.,2000; Rizzuto et al.,2000; Sanborn et al.,2000]. Ізольовані MX міометрія здатні накопичувати іони Са із значною швидкістю, ці субклітинні структури мають велику кальцієву ємність [Костерин,1990; Gunter et al.,1994; Duchen et al.,1999; 2000; Pozzan et al.,2000], EP міоцитів матки циклічно звільняє та акумулює іони Са у процесі фармакомеханічного спряження, індукованого агоністами [Missiaen et al., 1991; Ber-ridge et a!.,1993; Shmigol et al., 1999; Corbet et al.,2000; Fu et аі.,2000]. Але слід зазначити, що відносний парціальний внесок систем акумуляції Са2+ у MX та ЕР міоцитів матки у забезпечення внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу остаточно не визначений. Значною мірою це пов’язано з відсутністю одержаних у біохімічних дослідах за однакових експериментальних умов порівняльних даних щодо кінетичних властивостей електрофоретичної Са2+-акумулюючої системи MX та Mg2+,ATO-3ane>KHo'i окситоцинчутливої кальцієвої помпи ЕР міометрія.

Встановлено, що внаслідок хронічного вживання алкоголю порушується Са2+-залежна скоротлива активність міокарда, скелетних, а також гладеньких м’язів, зокрема міометрія [Urbano-Marquez et al.,1989; Capasso et al., 1992; Lieber et al., 1995; Mitidieri et al., 1995; Pagala et al.,1995; Oba et al., 1997; Сударикова и др.,1999; Vasdev et al., 1999; Cofan et аі.,2000]. Останнім часом у багатьох країнах світу збільшується тенденція до алкоголізму [Lieber et аі.,1995;1997; Фридман и др.,1998; Добровольский и др.,1999; Шабанов,1999]. У випадку алкоголізму у жінок частішають (у 2 - 4 рази) такі патології, як спонтанні аборти, невиношування плода, передчасні пологи, слабість пологової діяльності, а також атонія, гіпотонус та гіпертонус міометрія [Лещинский,1983; Комиссарова и др.,1986; Фридман и др.,1998; Шабанов, 1999]. Слід зазначити, що етанол, якому притаманні ліпофільні та гідрофільні властивості, дуже добре проникає крізь слизові оболонки та біологічні мембрани. Вважають, що в основі дії етанолу на клітини та тканини є комплексний ефект: прямий вплив цього спирту на внутрішньоклітинні біохімічні та фізико-хімічні процеси, структурно-функціональні властивості біологічних мембран та опосередкований — через продукти метаболічного перетворення етанолу

[Goldstein ct al.,Ї981; Gandhi ct al., 1989; Rottcnberg ct al.,1992; Lieber ct al.,1995; Mi-tidiery et al.,1995; Ho et al.,1997; Cervino et al.,1998; Гулий,2000; Cofan et al.,2000; Oidc ct al.,2000].

Чисельні експериментальні дані свідчать про те, що за умов алкоголізму порушується регуляція концентрації Са2^ у клітинах скелетних м’язів [Cofan ct al.,1995; Oba et al.,1997; Nicolas et al.,1998; Cofan et al.,2000], синаптосомах [Messing et al.,1986; Davidson et al.,l988; Gandhi et al., 1989], а також у клітинах гладеньких м’язів [Johnson ct al., 1996; Zhang et al.,1997; Wakabayashi et al.,1998; Vasdev et аі.,1999]. Тому не можна виключати, що вищезазначені патології скоротливої функції матки у жінок, що зловживають алкоголем, значною мірою можуть бути пов’язані саме із порушенням внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу в міометрії. Отже, при вивченні біохімічних аспектів впливу споживання алкоголю на скоротливу функцію міометрія важливим є з’ясування молекулярних та мембранних механізмів дії етанолу на трансмембранне перенесення Ca2t у субклітинних структурах гладенького м’яза матки, зокрема в MX та ЕР.

Відповідно до вищезазначеного можна стверджувати, що порівняльне дослідження кінетичних властивостей Mg2+,ATФ-зaлeжниx Са2+-транспортуючих систем міоцитів - це одна із актуальних проблем сучасної біохімії гладеньких м’язів, а вивчення закономірностей впливу етанолу на трансмембранний обмін Са2+ у субклітинних структурах міометрія є необхідним для подальшого з’ясування біохімічних механізмів дії алкоголю на скоротливу функцію матки.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В.Папладіна НАН України (проблема "Біохімія тварин та людини”): тема 5, № 0194И013509 "Вивчення біохімічних механізмів регуляції концентрації Са2+ у гладеньком’язових клітинах та ролі систем енергозалежного транспорту цього катіона у контролі скорочення-розслаблення гладеньких м’язів" (І кв. 1994 - IV кв. 1998 р.); тема 5, № 0199И000270 "Вивчення біохімічних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньких м’язах та ролі систем енергозалежного транспорту Са2+ у забезпеченні цього процесу” (І кв. 1999 -IV кв. 2003 p.).

Мета та задачі дослідження. Метою цієї роботи було провести порівняльне дослідження кінетичних властивостей С а2+-а ку мул ю ю ч ої системи MX та Mg2+,ATO-3ane»Ho’i окситоцинчутливої Саг+-помпи ЕР міометрія щурів у контролі та за умов дії етанолу in vitro та in vivo (підгостре, гостре та хронічне введення етанолу тваринам).

Для досягнення зазначеної мети було сформульовано такі основні задачі:

1. Із використанням селективних інгібіторів енергозалежних Са2+-транспорту-ючих систем вивчити кінетичні властивості Са2+-акумулюючої системи MX та Са2+-помпи ЕР міоцитів матки.

2. Дослідити in vitro вплив етанолу та інших аліфатичних спиртів на Са2+-акумулюючу систему MX та Са2+-помпу ЕР клітин міометрія.

3. Провести порівняльне дослідження кінетичних властивостей Са2+-акумулю-ючої системи MX та Са2+-помпи ЕР клітин міометрія in vivo - за умов підгострого

га гострого введения розмішу етанолу тваринам, а також у разі ного хронічного :поживання.

4. Провести порівняльне дослідження впливу етанолу in vitro на Са2'-ікумулюючу систему MX та Са2+-помпу ЕР клітин міометрія за умов попереднього іідгосгрого та гострого введення розчину спирту тваринам, а також* у разі його фонічного споживання.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у дослідах, виконаних на :успензії клітин міометрія, попередньо оброблених розчином неіонного детергента цигітоніну з метою порушення бар’єрної функції ПМ, із використанням елективних інгібіторів енергозалежних Са2+-транспортуючих систем проведено порівняльне дослідження кінетичних властивостей процесу акумуляції Са2+ в MX га Мц2\ЛТФ-залежного окситоцинчутлипого накопичення Ca2+ п ЕР у контролі та за умов дії етанолу in vitro і in vivo (підгостре та гостре введення розчину етилового спирту тваринам, а також його хронічне споживання ними).

Під час вивчення порівняльної дії низькомолекулярних аліфатичних спиртів in vitro (0 - 10%) на акумуляцію іонів Са у MX та ЕР встановлено, що ефективність гальмівної дії спиртів на накопичення Са2+ як у MX, так і в ЕР відповідає такій послідовності: бутанол > пропанол > етанол > метанол. Загалом ця ефективність визначається типом транспортного процесу (електрофоретичне чи Mg2+,ATO-залежне накопичення Са2*') та (або) субклітинною мембранною структурою (MX чи ЕР), а також довжиною аліфатичного ланцюга.

Доведено, що як у контролі, так і за умов підгоетрого та гострого введення етанолу в організм, транспортна активність С а3 +- а ку му л ю ю ч ої системи MX значно домінує над такою, що властива Са2+-помпі ЕР. Проте у разі хронічного споживання етанолу таке домінування суттєво зменшується. При цьому значно порушується Са2+-транспортуюча функція як MX, так і ЕР.

За умов хронічного споживання етанолу втрачається чутливість М£2+,АТФ-залежної Са2+-помпи ЕР до гальмівної дії утеротонічного пептидного гормону окситоцину.

Одержані результати розширюють сучасні уявлення щодо біохімічних механізмів кальцієвого обміну в ГМК, властивостей локалізованих в них енергозалежних Са2+-транспортуючих систем та їхньої чутливості до дії етанолу.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлено, що суспензія міоцитів, попередньо оброблених розчином дигітоніну, є перспективною експериментальною моделлю для порівняльного дослідження кінетичних властивостей енергозалежних Са2+-транспортуючнх систем MX та ЕР міометрія, чутливості цих систем до дії ефекторів та фізико-хімічних факторів (селективні інгібітори, Са2+-преципітувальні аніони, іонофори, органічні розчинники тощо), а також фізіологічно активних речовин (окситоцин).

Одержані результати мають значення для подальшого розуміння порушення мембранних механізмів контролю внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу у міометрії та його скоротливої функції за умов зловживання алкоголем, розробки фармакологічних засобів спрямованої корекції активності Са2+-транспортуючих систем MX та ЕР міоцитів матки у випадку алкоголізму.

Окремі положення роботи можуть бути корисними при викладанні спеціальних курсів лекцій, що читаються на біологічних факультетах вищих навчальних закладів із біохімії м’язів, мембранології, нервово-м’язової фізіології.

Особистий внесок здобувача. Дисертантка особисто брала участь у створенні етанолзалежних моделей на щурах, одержувала суспензію ГМК матки щурів, фракцію MX міоцитів матки свиней, проводила досліди з вивчення акумуляції іонів Са в MX та ЕР клітин міометрія (деякі з таких експериментів виконано із співавторами, разом з якими було опубліковано наукові праці - к.б.н. Л.Г.Бабіч та к.б.н. С.Г.Шликовим), безпосередньо проводила кінетичний та статистичний аналіз фактичних результатів.

Дисертанткою самостійно здійснено аналіз відповідних літературних даних. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані науковим керівником -д.б.н. С.О.Костеріним. Аналіз власних результатів, їхнє узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків роботи проведено спільно із науковим керівником.

Всі розділи та автореферет дисертації написані дисертанткою самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладено в дисертації, були представлені на таких наукових конференціях: І з’їзд Українського біофізичного товариства, 1994 p., Київ, Україна; XII school on biophysics of membrane transport, 1994 p., Poland; II з’їзд Українського біофізичного товариства, 1998 p., Харків, Україна; "Membranes and Signalling", 2000 p, Київ, Україна. Результати експериментів також доповідались у 1998 - 2000 pp. на наукових семінарах відділу біохімії м’язів, розширеному засіданні відділів біохімії м’язів, регуляції обміну речовин, хімії та біохімії ферментів, біохімії ліпідів та засіданнях вченої ради Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України. Окремі експериментальні дані обговорювались у відділах біохімії та токсикології НДІ наркології, відділі серцево-судинної патології Російського кардіологічного науково-виробничого комплексу МОЗ РФ (Москва). Вибрані результати дисертаційної роботи апробовано на конкурсах молодих вчених Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України у 1999 p. (II місце) та 2000 p. (III місце).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та 3 тези доповідей на міжнародній та вітчизняних наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 155 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Методи досліджень”, чотири експериментальні розділи, в яких висвітлено результати досліджень та обговорення, “Заключний розділ”, “Висновки” та “Список використаних джерел”, який містить 250 посилань. Робота ілюстрована 26 рисунками та 3 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з двох розділів. Перший розділ присвячено опису систем енергонезалежного (пасивного) та енергозалежного (активного) транспорту Саг+ в ГМК матки, функціональної ролі цих систем, мембранних механізмів регу-

ляції концентрації іонізованого кальцію у клітинах гладеньких м’язів. У другому розділі представлено загальні уявлення щодо впливу етанолу на фізико-хімічні та метаболічні процеси в організмі, структурно-функціональні властивості біологічних мембран і обмін Са2+ у тканинах, а також безпосередньо на скоротливу функцію матки.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Суспензію міоцитів матки невагітних щурів, естрогенізованих за 16 год до забору тканини [їіао еі аі.,1986], одержували за допомогою методу [МоІІагсі еі аі.,1986] з деякими модифікаціями. Фракцію МХ одержували з міометрія свині, як описано раніше [Костерин и др.,1985]. Кількість білка визначали за методом Лоурі [Ьомту еі аі.,1951].

Функціональну активність електрофоретичної енергозалежної Са2+-транспор-туючої системи МХ та Г^2\АТФ-залежної Са2+-помпи ЕР тестували в експериментах, які було здійснено на суспензії міоцитів матки, оброблених розчином дигітоніну, що мали порушену бар’єрну функцію ПМ. Концентрація дигітоніну у стандартному середовищі інкубації (склад наведено у розділі ’’Результати дослідження та обговорення”) становила 0,01%. Доведено, що дигітонін у цій концентрації порушує цілісність ПМ, але не впливає на структурно-функціональні властивості внутрішньоклітинних кальцієвих пулів [Тізкит еі аі.,1985; Шлыков и др.,1997]. Енергозалежну акумуляцію Са2+ в ЕР пригнічували селективним інгібітором Са2+-помпи ЕР тапсигаргіном (100 нМ). Для пригнічення накопичення Са2+ у МХ використовували рутенієвий червоний (10 мкМ) чи азид натрію (10 мМ).

Енергозалежний транспорт Са2+ в ізольованих МХ та в МХ і ЕР міоцитів, оброблених розчином дигітоніну, досліджували за допомогою ізотопної методики з використанням 45Са2+. Акумуляцію Са2+ ініціювали внесенням у стандартне середовище інкубації аліквоти розчину АТФ (або Mg2*) чи суспензії клітин. Кількість Са2+ (пмоль/106 клітин), що надійшов до МХ та ЕР в енергозалежному процесі, обчислювали за різницею між загальним його накопиченням із стандартного середовища інкубації та адсорбцією із середовища інкубації, що не містило АТФ (або Мц2+). Транспортний процес зупиняли шляхом швидкого фільтрування інкубаційного середовища крізь мембранні фільтри ("Мііііроге", США або "Хіміфіл", Естонія, діаметр пор 0,45 мкм) під вакуумом. Радіоактивність фільтрів вимірювали за допомогою сцинтиляційного лічильника.

У дослідах, які були проведені із використанням чотирьох експериментальних моделей, досліджували вплив етанолу, що надходив в організм щурів, на акумуляцію іонів Са в МХ та ЕР міоцитів матки контрольних (модель І) та експериментальних (моделі И -IV) тварин.

Модель І (контроль). Використовували статевозрілих щурів (віком 2-3 міс.), які утримувались на стандартному раціоні віварію.

Модель II (підгостре введення етанолу). У цьому разі статевозрілим тваринам протягом 8 діб внутрішньочеревно вводили 20%-й розчин етанолу в дозі 1 мл на 100 г маси тіла на добу (1,63 г абсолютного алкоголю на 1 кг маси тіла) [Стогній та ін.,1989; Гулый и др.,1990; Люк и др.,1998]. У попередніх дослідах було доведено,

що введення фізіологічного розчину таким тваринам у тому самому режимі та об’ємі не впливає на активність Са2+-транспортуючих систем MX та ЕР.

Модель III (гостре введення етанолу). Статевозрілим тваринам одноразово внутрішньочеревно вводили 40%-й розчин етанолу в дозі 1 мл на 100 г маси тіла (3,3 г абсолютного алкоголю на 1 кг маси тіла) [Гулый и др.,1990; Люк и др.,1998; Селевич и др.,1999]. Попередньо було доведено, що введення фізіологічного розчину таким тваринам у тому самому режимі і об’ємі не впливає на активність внутрішньоклітинних Са2+-транспортук>чих систем ГМК.

Модель IV (хронічне споживання етанолу). Статевозрілі тварини протягом 11 місяців вживали 15%-й водний розчин етанолу в умовах примусової заміни води розчином спирту [Буров и др.,1985; Попова и др.,1986; Бардина и др.,1999]. При цьому не спостерігали водної депривації, тобто щури споживали достатню середньодобову кількість води. Доведено, що немає статистично вірогідних змін в активністі внутрішньоклітинних Са2("-транспортуючих систем міометрія щурів віком 12-13 місяців та 2-3 місяців (модель І, контроль).

Ефективність дії етанолу та інших аліфатичних спиртів на Са2+-транспортуіочі системи визначали за величиною уявної константи інгібування І0,5-такої концентрації алкоголів, за якої спостерігається гальмування акумуляції Са2+ на 50% відносно контрольного значення (за відсутності спиртів у середовищі інкубації).

Експериментальні дані оброблено загальноприйнятими методами кінетичного аналізу та варіаційної статистики [Кокунин, 1975].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

1. Вивчення кінетичних властивостей Са2+-акумулюючої системи MX та Са2+-помпи ЕР клітин міометрія з використанням селективних інгібіторів енергозалежних Са2+-транснортуючнх систем.

Фундаментальне значення у забезпеченні внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу та Са2+-залежного контролю скорочення-розслаблення міометрія належить енергозалежним Са2+-транспортуючим системам ПМ, MX та ЕР міоцитів [Kosterin et ah,1994; Smith,1996; Shmigol et al.,1999; Duchen,2000; Pozzan et al.,2000]. Властивості Са2+-транспортуючої системи MX міометрія можна успішно вивчати у дослідах із використанням цих ізольованих субклітинних структур [Kosterin et

ah,1994]. Однак вивчати властивості Са2+-помпи ЕР на фракції ізольованих мембранних везикул міометрія практично неможливо, оскільки Са2+-помпа ЕР міоцитів матки досить швидко інактивується під час препаративного одержання фракції мікросом [Grover et al.,1983; Kosterin et ah,1994]. Використання суспензії міоцитів, попередньо оброблених розчином дигітоніну з метою порушення бар’єрної функції ПМ, є адекватним для коректного сумісного тестування Са транспортуючих систем MX та ЕР міометрія саме за практично ідентичних експериментальних умов та природнього співвідношення сумарних об’ємів внутрішньоклітинних кальцієвих депо [Fiskum, 1985; Yamamoto et ah, 1986; Негруцкий, 1997; Шлыков и др.,1997].

ГМК матки, що оброблені розчином дигітоніну, мали здатність накопичувати 1900±450 пмоль Са2+/5 хв на 106 клітин (п = 3) із стандартного середовища

інкубації, що містило (мМ): 50 тріс-НСІ (рН 7,4, 37°С), 125 КС1, 25 №СІ, З ЛТФ, З сукципату натрію, З Г^СЬ, 2 фосфату капію та 10 мкМ (4,ІСа2‘ + 43Са2*). Інгібітори енсргозалсжного транспорту Са2+ у МХ - рутенієвий червоний (10 мкМ) та азид натрію ИаНз (5мМ) пригнічували акумуляцію Са2+ у суспензії ГМК (рис. 1).

в

Рис. 1. Типова концентраційна залежність впливу інгібіторів (І) акумуляції Са2+ у мітохондріях рутенієвого червоного (1) та азиду натрію (2) на енергозалежне включення Са2<~ у внутрішньоклітинні структури міометрія. Тут та на рис. 2-9 концентрація дигітоніну становила 0,01%.

' 0 3 4 5 ^[1], (М)

По-перше, інгібувальний вплив рутенієвого червоного на енергозалежну акумуляцію Са2+ в ГМК, оброблених розчином дигітоніну, був значно ефективнішим, ніж азиду натрію: значення уявної константи інгібування Іо,з становило 0,7 ± 0,3 мкМ та 1,1 ± 0,4 мМ відповідно. Тому у подальших експериментах для пригнічення акумуляції Са2+ в МХ, як правило, використовували рутенієвий червоний. Отже, ці результати свідчать про наявність у клітинах міометрія системи енергозалежної акумуляції Са2+, що локалізована в МХ. По-друге, інгібітори транспорту Са2+ у МХ- рутенієвий червоний та азид натрію - при використанні їх у насичувальних

концентраціях (10-100 мкМ та 10 мМ відповідно), остаточно не пригнічували • і~\ 2+ •

енергозалежну акумуляцію Са у мюцитах матки.

Резистентна до дії рутенієвого червоного та азиду натрію компонента включення Са2+ у міоцити стимулювалась оксалатом калію (10 мМ) - фактором збільшення кальцієвої ємності ЕР як із зростанням часу інкубації, так і концентрації Са2+-преципітуючого агента у середовищі інкубації. За умов наявності у середовищі інкубації азиду натрію (з метою пригнічення енергозалежної акумуляції Са2+ у МХ) рутенієвий червоний у широкому діапазоні концентрацій (ІО^-ІО*4 М) майже не впливав на стимульоване оксалатом накопичення Са2+ у міоцитах (рис. 2,графік 1). Селективний інгібітор Са2+-помпи ЕР тапсигаргін [Віап й аі.,1991; Ба§ага ^ аі., 1991; \УісЮте еі аі.,1992] у концентрації 100 нМ повністю пригнічував резистентну до дії рутенієвого червоного та азиду натрію оксалатстимульовану компоненту енергозалежної акумуляції Са2+ у суспензії ГМК (Рис.2, графік 2).

Таким чином, використання суспензії ГМК, оброблених розчином дигітоніну, за наявності селективних інгібіторів енергозалежного транспорту Са2+ дає можливість на одній моделі майже за однакових експериментальних умов тестувати

s

4h

Рис. 2. Типова концентраційна залежність впливу рутенієвого червоного (1) та тапсигаргіну (2) на стимульоване оксалатом калію Г^2+,АТФ-залежне включення Са2+ в ендоплазматичний ретикулум клітин міометрія.

1 та 2 - за присутності азиду натрію (10 мМ) та рутенієвого червоного (10 мкМ).

[тап с и гар гін]; (нМ)

6.5 4

■ lg [рутенієвий червоний]; (М)

та вивчати властивості двох внутрішньоклітинних Са2+-транспортуючих систем міоцитів матки. Перша - локалізована в MX, пригнічується рутенієвим червоним і азидом натрію, нечутлива до дії тапсигаргіну; друга — локалізована в ЕР, нечутлива до дії рутенієвого червоного та азиду натрію, потенціюється оксалатом і пригнічується тапсигаргіном.

2. Вивчення in vitro впливу етанолу та інших аліфатичних спиртів на енергозалежну акумуляцію іонів Са у внутрішньоклітинних структурах міометрія.

Аліфатичні спирти, зокрема етанол, часто використовують як фактор модифікації структурно-функціональних властивостей біомембран та мембранозв’язаних ферментів [Суковатая,2000; Слинченко и др.,1997; Cervino et аі.,1998]. Загалом, необхідність вивчення впливу аліфатичних спиртів, зокрема етанолу, на біологічні мембрани обумовлена трьома причинами. По-перше, такі дослідження сприяють з’ясуванню молекулярного механізму дії загальних анестетиків на структурну організацію та функціонування клітинних органел. По-друге, результати таких досліджень поширюють уявлення щодо загальних закономірностей модифікації функціональної активності мембранних білків хімічними та фізико-хімічними факторами. По-третє, етанол, як і інші органичні розчинники, використовуються для створення так званого "дизайну середовища" з метою вивчення структури та властивостей білкових молекул [Костерін,2000; Суковатая,2000]. Оскільки аліфатичні спирти добре проникають у клітини [Rottenberg et al.,1992; Lieber et al.,1995], то цілком ймовірно, що об’єктом їхньої неспецифічної дії на міоциги можуть безпосередньо бути і Са2^-транспортуючі системи, які локалізовані у субклітинних мембранних структурах.

З метою дослідження загальних закономірностей впливу аліфатичний спиртів

па спсргозалежний транспорт Са2+ у внутрішньоклітинних мембранних структурах міометрія було проведено порівняльне вивчення дії низькомолекулярних алкоголен in vitro на електрофоретичну Са2+-акумулюючу систему MX та Mg \АТФ-залежну Са2+-помпу ЕР міоцитів.

Вплив аліфатичних спиртів in vitro па систему акумуляції Са2* у MX (рис.З) та на Са2+-помпу ЕР міометрія (рис.4) характеризується неоднаковими концентрацій-

Рис. 3. Концентраційні залежності впливу аліфатичних спиртів на енергоза-лежну акумуляцію Са2* у мітохондріях клітин міометрія (п = 4).

1 ,2 , 3 та 4 -за присутності бутанолу, пропанолу, етанолу та метанолу відповідно. Тут та на рис. 4 за 100% прийнято контрольне значення акумуляції Са2+ за умов відсутності спиртів у середовищі інкубації.

1 2 3 lg [слирт]; мМ

«ими залежностями. Дійсно, у першому випадку для дії пропанолу, етанолу та метанолу, на відміну від дії бутанолу, властивий невеликий активаційний ефект на гранспорт Са2+ з наступним його пригніченням. У другому випадку для дії всіх аліфатичних спиртів типовими є монотонні концентраційні залежності гальмівного зпливу на акумуляцію Са2+. При використанні метанолу, етанолу, пропанолу та 5утанолу значення уявної константи гальмування транспортного процесу I0,j для

Рис. 4. Концентраційні залежності впливу аліфатичних спиртів на М§2+,АТФ-залежяу акумуляцію Са2+ в ендоплазматичному ре-тикулумі клітин міометрія

(Я = 4). #

1,2, 3 та 4 -за присутності бутанолу, пропанолу, етанолу та метанолу відповідно.

системи акумуляції Са2+ у MX відповідно становили: 2400 ± 250, 1560 ± 60, 230 ± 40 та 79 ± 30 мМ (л = 4). Значеня уявної константи гальмування I0.s транспортного процесу для системи акумуляції Ca2f в ЕР у разі використання метанолу, етанолу, пропанолу та бутанолу дорівнювали 1980 ± 70, 650 ± 30, 180 ± 50 та 58 ± 10 мМ, відповідно (п = 4).

Отже, здатність аліфатичних спиртів in vitro гальмувати акумуляцію Са2+ в MX та ЕР міоцитів матки задовольняє однаковій послідовності: бутанол > пропанол > етанол > метанол (рис.З, 4), та зростає із збільшенням кількості атомів вуглецю в молекулі аліфатичного спирту.

Проте система акумуляції Са2+ у MX (І0,5 = 1560 ± 60 мМ) вірогідно менш чутлива до гальмівної дії етанолу, ніж М§2+,АТФ-залежна Са2+-помпа ЕР (Г0,5 = 650±30 мМ).

Таким чином, загалом вищенаведені дані свідчать про те, що модифікувальний ефект низькомолекулярних аліфатичних спиртів in vitro на енергозалежну акумуляцію Са2+ у внутрішньоклітинних мембранних структурах гладенького м’яза матки визначається типом транспортного процесу (електрофоретичне накопичення Са2+ у MX чи М§2+,АТФ-залежний первинний активний транспорт Са2+ в ЕР) та (чи) субклітинною мембранною структурою (MX чи ЕР), а також залежить від довжини аліфатичного ланцюга в молекулі спирту.

3. Порівняльне дослідження кінетичних властивостей Са2+-акумулюючої системи MX та Са2+-помпи ЕР міометрія in vivo — за умов підгострого та гострого введення розчину спирту тваринам, а також у разі ного хронічного споживання.

З літератури відомо, що за умов хронічного надходження етанолу в організм збільшується вхід Са2+ у клітини серцевого, скелетного та гладенького м’язів. При цьому порушуються структурно-функціональні властивості MX [Rottenberg et

аі.,1992; Сударикова и др.,1997; Marcinkeviciute et al.,2000], спостерігаються морфологічні зміни на рівні ретикулума [Baruah et аі.,1988]. Порушення внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу, а також морфологічні, фізико-хімічні та біохімічні зміни у мембранах MX та ЕР можуть бути важливим етапом у розвитку патологічних процесів у разі хронічного алкоголізму [Montgomery et al.,1987; Nicolas et al.,1998; Сударикова и др.,1999; Nagy, 2000].

Було вивчено вплив підгострого, гострого та хронічного вживання етанолу щурами (моделі И, III та IV відповідно) на накопичення Са2* у MX та ЕР міоцитів матки (рис. 5 та 6).

У випадку всіх експериментальних моделей MX міометрія акумулювали іони Са зі стандартного середовища інкубації. Стаціонарний рівень акумуляції Са2+ у MX міоцитів матки встановлювався з п’ятої хвилини інкубації в усіх модельних експериментах (рис. 5).

ЕР клітин міометрія також накопичував іони Са зі стандартного середовища інкубації. Але кінетика Mg2+,ATO-3aneKHoi' акумуляції Са2+ в ЕР, на відміну від MX, характеризувалась лінійністю у часі протягом 10 хв інкубації, що можна пояснити наявністю у середовищі інкубації Са2+-преципітувального аніона оксалату, який добре проникає крізь ретикулярну мембрану та збільшує кальцієву ємність ретику-

Рис. 5 . Кінетика акумуляції Са2* у мітохондріях клітин міо-мстрія у разі попереднього введення розчину етанолу в організм.

1 - контроль (модель І) (п = 4); 2, 3 - підгостре (модель II) (п = 5) та гостре (модель III) (п = 7) введення етанолу відповідно;

4 - хронічне вживання алкоголю (модель IV) {п = 7)

t, хв

Рис. 6. Кінетика +,АТФ-залежної акумуляції Са2+ в ендоплазматичному ретикулу-мі клітин міометрія у разі попереднього введення розчину етанолу в організм.

1 - контроль (модель І) (п = 6);

2, 3 - підгостре (модель II) (п = 5) та гостре (модель III) (п = 7) введення етанолу відповідно;

4 - хронічне вживання алкоголю (модель IV) (и = 7).

лума внаслідок утворення кристалів оксалату кальцію (рис. 6).

За контрольних умов (модель І) значення початкової швидкості акумуляції Са2+ у МХ У0, яка кількісно характеризує транспортну активність Са2+-акумулюючої системи, становить 1324 ± 174 пмоль Са2+/хв на 106 клітин (п = 4). Ця величина у середньому в 1,1; 1,3 та 6,0 разів перевищує таку, що була встановлена для моделей підгострого, гострого та хронічного введення етанолу (моделі II, III та IV відповідно). Тобто, початкова швидкість акумуляції Са2+ у МХ вірогідно відрізнялась від контролю (р < 0,05) лише за умов хронічного вживання етанолу (рис. 7).

4

Рис. 7. Величини початкових швидкостей Уо акумуляції Са2+ у мітохондріях (МХ) та ендоплазматичному рстикулумі (ЕР) клітин міометрія у випадку моделей І - IV (п = 4 — 6). ■"відмінності між величинами початкових швидкостей акумуляції катіона вірогідні (р < 0,05) відносно контролю (модель І); ♦"“відмінності між величинами початкових швидкостей акумуляції катіона, що визначені для двох Са2+-транспортуючих систем у випадку однієї моделі, вірогідні (р < 0,05).

Значення початкової швидкості акумуляції Са2+ в ЕР (Уо) за контрольних умов (модель І) дорівнювало 181 ± 47 пмоль Са2+/хв на 106 клітин (п = 6). Ця величина в середньому в 1,7; 1,2 та 2,9 раза більша, ніж така, що встановлена для моделей підгострого, гострого та хронічного введення етанолу (моделі II, III та IV відповідно). У статистичному відношенні величина У0 акумуляції Са2+ в ЕР була вірогідно нижчою порівняно з контрольним значенням цього параметра лише за умов хронічного вживання алкоголю (модель IV) (рис. 7).

Стаціонарний рівень акумуляції Са2+ у МХ для контролю (модель І) становив 3091 ± 227 пмоль Са2+/5 хв на 106 клітин (п = 4), що в 1,2; 2,0 та 9,8 раза перевищував такий, який встановлено в експериментах для моделей II, III та IV відповідно. Тобто, стаціонарний рівень акумуляції Са2+ у МХ вірогідно відрізнявся від контролю (р < 0,05) в умовах гострого та хронічного введення алкоголю (моделі III та IV відповідно).

Мц2+,АТФ-залежна акумуляція Са2+ в ЕР контрольних тварин на п’ятій хвилині інкубації становила 960 ± 148 пмоль Са2+/106 клітин (п = 6), що перевищувало таку, яку встановлено у разі використання моделей И, III та IV у 1,3; 1,0 і 2,3 раза відповідно. Статистичний аналіз показав, що рівень акумуляції Са2+ у ретикулумі на п’ятій хвилині інкубації лише в умовах хронічного вживання алкоголю (модель IV) виявився вірогідно нижчим за контроль (модель І).

Таким чином, лише у випадку хронічного споживання етанолу (модель IV) спостерігаються статистично вірогідні зміни в акумуляції Са2+ у МХ та ЕР порівняно з контролем (модель І) як за початковою швидкістю транспорту цього

катіона (яка зменшувалась у 6,0 і 2,9 раза відповідно), так і за рівнем його накопичення протягом 5 хв (який зменшувався у 9,8 і 2,3 раза відповідно).

У порівняльному аспекті аналіз модельних даних, що отримані при вивченні впливу етанолу на акумуляцію Са2+ у внутрішньоклітинних структурах гладенького м’яза матки (наведено вище), дозволяє дійти такого висновку. У випадку контролю, підгострого та гострого введення етанолу в організм початкова швидкість Vo, а також величина акумуляції Са2+ у MX міометрія (на п’ятій хвилині інкубації) перевищують значення цих параметрів, що властиві для \^2*,АТФ-залежного транспорту Са2+ в ЕР, у середньому в 7,3; 11,4 і 7,9 раза (для V„) та 3,2; 3,5 і 1,8 раза (для накопичення Са + за 5 хв) відповідно. Таким чином, для моделей І - III спостерігається суттєве домінування Са2*-транспортуючої функції MX порівняно з ЕР як за активністю Са2+-акумулюючої системи, так і за кількістю накопичених іонів Са. Однак за умов хронічного споживання алкоголю домінувальна роль Са2+-транспортуючої системи MX стосовно Mg2^ATФ-зaлeжнoї Са2+-помпи ЕР у забезпеченні транспорту іонів Са у міоцитах практично зникає. Так, значення початкових швидкостей акумуляції Са2+ у MX і ЕР (рис.7) (V0)> як і рівень акумуляції Са2+ у MX і ЕР (на п’ятій хвилині інкубації), вірогідно не відрізняються одне від одного.

Як відомо, утеротонічна дія пептидного гормону окситоцину пов’язана з активацією рецепторкерованих Са2+-каналів ПМ та ЕР [Sanborn et al., 1998] на фоні часткового інгібування (на ЗО - 50%) MgJ+,ATФ-зaлeжнoї Са2+-помпи ПМ та ЕР [Шлыков и др., 1993; 1997], що зумовлює збільшення концентрації Са2+у міоцитах матки. У наших дослідах попередня обробка суспензії клітин міометрія розчином окситоцину (100 нМ) до внесення в середовище інкубації фактора порушення бар’єрної функції ПМ - дигітоніну (0,01%) як у випадку контролю (модель І), так і у

Рис. 8. Вплив розчину окситоцину (100 нМ) на початкову швидкість Vg Mg2\ATФ-зaлeжнoї акумуляції Са2+ в ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрія у випадку моделей І - IV (я = 4 - 6).

1 та 2 —за відсутності та в умовах попередньої обробки суспензії міоцитів розчином пептидного гормону відповідно;

“"відмінності між величинами початкових швидкостей акумуляції катіона V0 порівняно з контролем вірогідні (р<0,05) (модель І).

ы

випадку підгострого та гострого введення етанолу в організм (моделі II та Ш відповідно), приводила до зниження початкової швидкості V0 Mg2 \АТФ-залежної акумуляції Са + у ЕР у середньому в 1,7; 1,9 та 1,9 раза відповідно. За хронічного споживання етанолу (модель IV) гальмівний ефект окситоцину на параметр V0 майже не спостерігався (рис. 8).

Отже, за умов хронічного споживання етанолу щурами окситоцин не впливає на активність Са2+-помпи ретикулума міоцитів матки. Можливо, що втрата чутливості Са2+-помпи ЕР міометрія до гальмівної дії окситоцину в умовах хронічного споживання етанолу (рис. 8) є своєрідною компенсаторною реакцією, що запобігає збільшенню концентрації Са2+ у міоцитах матки на фоні суттєвого зниження Са2+-акумулюючої функції MX та ЕР.

4. Порівняльне дослідження опливу етанолу in vitro па Са2+-акумулюю'іу систему MX та Са2+-полшу ЕР міометрія за умов попереднього підгострого та гострого введення розчину спирту тваринам, а також у разі його хронічного споживання.

Деякі гладеньком’язові органи (насамперед, шлунково-кишкового тракту) в умовах споживання етанолу безпосередньо контактують із розчином спирту у досить високій концентрації, що перевищує таку у плазмі крові При вживанні алкоголю вагітною жінкою він накопичується у навколоплідній рідині [Clarke et al.,1986; Hayashi et al.,1991; Фридман и др.,1998; Шабанов, 1999]. Тому з огляду на високий рівень ліпофільності та водорозчинності етанолу, не можна виключати можливість його безпосереднього впливу на гладенькі м’язи матки. З метою вивчення закономірностей безпосереднього впливу етанолу на трансмембранний обмін Са2+ у внутрішньоклітинних мембранних структурах міометрія (у разі попереднього створення на тваринах етанолзалежних моделей) досліджували концентраційні залежності дії цього спирту in vitro на акумуляцію Са24" у MX та ЕР у випадку попереднього введення алкоголю в організм щурів. Дію етанолу оцінювали за параметром І0,5 (%)■

Рис.9. Значення коефіцієнта гальмування етанолом (Іо,5, %) акумуляції Са2+ у мітохондріях (МХ) (я = 4 - 6) та ендоплазматичному ретикулумі (ЕР) (и = 47) клітин міометрія за умов попереднього створення моделей І - IV.

*зміни статистично вірогідні відносно контролю (модель І) (р< 0,05).

Гальмівна дія етанолу на акумуляцію Са2* у MX міометрія за своєю ефективністю була практично однаковою для моделей І - III. Значення уявної константи гальмування І05 становило: 9,1 ± 0,4%, 8,4 ± 0,3% та 8,3 ± 0,7% відповідно (рис. 9). Але для моделі IV цей показник був суттєво нижчим (4,0±0,6%), що вірогідно відрізнялось від контролю та свідчило про збільшення чутливості цієї транспортної системи (майже у 2 рази) до гальмівного впливу етанолу in vitro за умов попереднього хронічного споживання етанолу тваринами. Значення уявної константи гальмування І0і5 у випадку ЕР для моделей I, II, III та IV дорівнювало: 3,8± 0,2 %, 2,8 ± 0,2 %, 2,5 ± 0,2 % та 2,3 ± 0,3 % відповідно. Тобто, чутливість Са2+-помпи ретикулума до пригнічуючої дії етанолу in vitro практично однакова для всіх етанолзалежних моделей (II - IV), але вона більша, ніж у контролі (модель І).

Таким чином, у випадку хронічного споживання етанолу (модель IV) чутливість Са2+-акумулюючих систем MX та ЕР до дії етанолу in vitro вірогідно збільшується відносно контролю (модель І). Проте для всіх моделей ця чутливість Са2+-помпи ЕР завжди більша, ніж Са2+-акумулюючої системи MX (рис. 9).

ВИСНОВКИ

1. У комплексних модельних дослідженнях, що були виконані на суспензії міоцитів, оброблених розчином дигітоніну, проведено порівняльне вивчення кінетичних властивостей Са2+-транспортуючих систем мітохондрій та ендоплазматичного ретикулума міометрія. Вперше досліджено вплив етанолу за умов in vitro та in vivo на Mg2+,ATФ-зaлeжнe накопичення іонів Са у внутрішньоклітинних структурах гладенького м’яза матки. Доведено, що хронічне споживання етанолу призводить до суттєвого гальмування акумуляції іонів Са у мітохондріях та ендоплазматичному ретикулумі міометрія.

2. Із використанням селективних інгібіторів активного транспорту іонів Са, Са2+-преципітуючого аніона оксалату та Са2+-іонофору у міоцитах матки ідентифіковані дві внутрішньоклітинні Mg2+,ATФ-залежні Са2+-транспортуючі системи: нечутлива до дії тапсигаргіну, яка пригнічується рутенієвим червоним та азидом натрію і локалізована у мітохондріях; і нечутлива до дії рутенієвого червоного та азиду натрію, яка пригнічується тапсигаргіном, потенціюється оксалатом, частково інгібується окситоцином та локалізована в ендоплазматичному ретикулумі.

3. Ефективність гальмівної дії низькомолекулярних аліфатичних спиртів in vitro на Mg2+,ATФ-зaлeжнy акумуляцію іонів Са як у мітохондріях, так і в ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрія, задовольняє послідовності: бутанол > пропанол > етанол > метанол. Ступінь гальмування акумуляції Са2+ аліфатичними спиртами визначається типом транспортного процесу (електрофоретичне накопичення чи М§2+,АТФ-залежний первинний активний транспорт Са2+) та (або) субклітинною мембранною структурою (мітохондрії чи ретикулум) і залежить від кількості атомів вуглецю у спиртовій молекулі.

4. Транспорт іонів Са у мітохондріях менш чутливий до гальмівної дії етанолу in vitro, ніж акумуляція цих іонів в ендоплазматичному ретикулумі: значення І0.5 становить 1560 ± 60 та 650 ± ЗО мМ відповідно.

5. За умов контролю, підгострого та гострого введения етанолу в організм щурів початкова швидкість Г^3\АТФ-залежної акумуляції іонів Са у мітохондріях клітин міометрія суттєво перевищує значення цього параметра, встановленого для ендоплазматичного ретикулума (в середньому в 7, 11 та 8 разів відповідно). У випадку хронічного вживання етанолу (15%) це домінування у накопиченні Са2ь значно зменшується, при цьому суттєво порушується Са2+-транспортуюча функція як мітохондрій, так і ендоплазматичного ретикулума.

6. За умов попереднього хронічного вживання 15% розчину етанолу щурами, на відміну від попереднього підгострого та гострого введення його в організм, значно зростає чутливість Са2+-акумулюючої системи мітохондрій міоцитів матки до гальмівної дії етанолу in vitro відносно контролю (в середньому в 2 рази). У випадку ендоплазматичного ретикулума клітин міометрія чутливість Са2+-помпи до пригнічуючої дії етанолу in vitro практично однакова для всіх етанолзалежних моделей та більша, ніж у контролі.

7. У випадку хронічного вживання 15% розчину етанолу щурами, на відміну від контролю, підгострого та гострого введення етанолу в організм, втрачається чутливість Мд2+,АТФ-залежної кальцієвої помпи ендоплазматичного ретикулума клітин міометрія до інгібуючої дії окситоцину.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Борисова Л.А., Костерин С.А. Энергозависимый транспорт Са2* во внутриклеточных структурах гладкой мышцы//Биохимия. -1994.-59,№8.-С. 1218-1229.

2. Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Борисова Л.А., Слинченко Н.Н., Браткова Н.Ф., Костерин С.А. Влияние этанола на активность энергозависимых Са2+ - транспортирующих систем клеток миометрия//Укр.биохим.журн. - 2000. - 72, № 1. — С. 32 - 41.

3. Борисова Л.А., Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Костерин С.А. Сравнительное исследование влияния алифатических спиртов на энергозависимую аккумуляцию ионов Са во внутриклеточных мембранных структурах гладкой мыш-цы//Укр.биохим.журн. - 2000. - 72, № 2. - С. 28 - 35.

4. Борисова Л.А., Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Костерин С.А. Аккумуляция ионов Са во внутриклеточных структурах миометрия крыс при подостром, остром и хроническом введении этанола//Укр.биохим.журн. - 2000. — 72, № 3. - С. 44 - 55.

5. Бабіч Л.Г., Шликов С.Г., Борисова Л.А., Костерін С.О. Енергозалежна акумуляція Са2+ у внутрішньоклітинних пулах пермеабілізованих міоцитів матки. Збірник тез І з’їзду Українського біофізичного товариства, Київ, 1994 р., С. 31.

6. Babich L.G., Shlykov S.G., Borisova L.A., Kosterin S.A. Energy - dependent transport of Ca2* in the intracellular structures of the smooth muscle. Proc. XII school on biophysics of membrane transport, Poland, 1994, P. 195.

7. Шликов С.Г., Бабіч Л.Г., Борисова Л.А. Регуляція енергозалежного накопичення Са2* у ендоплазматичному ретикулумі міометрія фізіологічно-активними речовинами. Збірник тез II з’їзду Українського біофізичного товариства, Харків, 1998, С. 121.

АНОТАЦІЯ

Борисова JI.A. Кінетнчні властивості М»2+,АТФ-залежного транспорту іонів Са у внутрішньоклітинних структурах міометрія та вплив етанолу на цсіі процес. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2000.

Дисертація присвячена порівняльному дослідженню кінетичних шіастішостей Са2+-транспортуючнх систем мітохондрій та ендоплазматичного ретикулума гладеньком’язових клітин матки.

На суспензії міоцитів, попередньо оброблених розчином днгітопіну, вивчено вплив етанолу in vitro та in vivo на системи енергозалежної акумуляції іонів Са у внутрішньоклітинних структурах міометрія.

В процесі вивчення порівняльної дії етанолу та інших низькомолекулярних аліфатичних спиртів in vitro виявлено, що ефективність їхньої гальмівної дії на акумуляцію іонів Са в мітохондріях і ендоплазматичному ретикулумі визначається типом транспортного процесу, субклітинною мембранною структурою і залежить від кількості атомів вуглецю в молекулі спирту.

Доведено, що як у контролі, так і за умов підгострого та гострого введення етанолу в організм, транспортна активність Са2+-акумулюючої системи мітохондрій значно домінує над такою, що властива Са2+-помпі ендоплазматичного ретикулума. Проте у разі хронічного споживання етанолу де домінування суттєво зменшується. При цьому значно порушується Са2+-транспортуюча функція як мітохондрій, так і ендоплазматичного ретикулума, та втрачається чутливість Са2+-помг.и ретикулума до інгібувальної дії утеротонічного пептидного гормону окситоцину.

Одержані результати розширюють сучасні уявлення щодо біохімічних механізмів контролю кальцієвого обміну у гладеньком’язових клітинах та властивостей локалізованих в них енергозалежних Са2+-транспортуючих систем.

Ключові слова: етанол, гладенькі м’язи, міометрій, мітохондрії,

ендоплазматичний ретикулум, Са2+-помпа.

АННОТАЦИЯ

Борисова JI.A. Кинетические свойства Mg2+,AT®-3aBiiciiMoro транспорта ионов Са во внутриклеточных структурах мнометрия и влияние этанола на этот процесс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертационная работа посвящена сравнительному исследованию кинетических свойств Са2+-транспортирующих систем митохондрий и эндоплазматического ретикулума гладкомышечных клеток (миоцитов) матки. Впервые изучено влияние этанола in vitro и in vivo на М^.АТФ-зависимое накопление ионов Са во внутриклеточных структурах миометрия.

С использованием селективных ингибиторов энергозависимого транспорта Са2* в миоцитах матки идентифицированы две М^+,АТФ-зависимые Са2*-транспортирующие системы. Одна из них нечувствительна к действию тапсигаргина, угнетается рутениевым красным и азидом натрия и локализована в митохондриях. Другая нечувствительна к действию рутениевого красного, угнетается тапсигаргином, потенциируется оксалатом, частично ингибируется окснтоцином и локализована в эндоплазматическом ретикулуме.

При сравнительном исследовании влияния этанола и других низкомолекулярных алифатических спиртов in vitro на Mg2"*", АТФ-зависимое накопление Са2+ в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме установлено, что степень ингибирования аккумуляции Са2+ определяется: типом транспортного процесса (электрофоретическое накопление или первичный Мц2+,АТФ-зависимый активный перенос Са2+), субклеточной мембранной структурой (митохондрии или ретикулум) и зависит от количества атомов углерода в молекуле спирта. При этом транспорт Са2+ в митохондриях менее чувствителен к ингибирующему действию этанола, чем в эндоплазматическом ретикулуме.

Изучение действия этанола in vivo на системы энергозависимого транспорта Са2+ в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме миоцитов матки показало, что только в случае хронического потребления животными 15%-го раствора спирта, в отличие от контроля, подострого и острого его введения в организм, практически исчезает доминирование аккумуляции Са2+ в митохондриях над накоплением этого катиона в эндоплазматическом ретикулуме (тестируется как по начальной скорости, гак и по уровню аккумуляции Са2+ за 5 мин). При этом существенно нарушается Са2+-транспортная функция обеих внутриклеточных структур.

В условиях хронического потребления животными этанола теряется чувствительность М^+,АТФ-зависимого Са2+-насоса эндоплазматического ретикулума к ингибирующему действию окситоцина, что может быть своеобразным компенсаторным механизмом, препятствующим увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ на фоне сниженной Са2+-аккумулирующей способности митохондрий и эндоплазматического ретикулума миоцитов матки.

Показано, что в условиях предварительного хронического введения этанола животным in vivo статистически достоверно, относительно контроля, увеличивается чувствительность Са2+ -транспортирующих систем обеих внутриклеточных структур к действию этанола in vitro.

Полученные результаты имеют значение для дальнейшего понимания биохимических механизмов регуляции концентрации Са2+ в гладкомышечных клетках, особенностей нарушения этих механизмов при злоупотреблении алкоголем. Накопленные экспериментальные данные перспективны для развития исследований по разработке методов фармакологической коррекции активности Са2+-транспортирующих систем митохондрий и эндоплазматического ретикулума миоцитов матки при алкоголизме.

Ключевые слова: этанол, гладкие мышцы, миометрий, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, Са2+-насос. •,

SUMMARY

Borisova L.A. Kinetic properties of Mg2*,ATI’-dependcnt Ca2+ transport in the intracellular structures of myometrium and the ctlianol cffect on it. - Manuscript.

The PhD thesis in biology by speciality 03.00.04 - biochemistry. O.V.Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Scicnccs of Ukraine, Kyiv, 2000.

The dissertation is devoted to the comparative investigation of kinetic properties of Ca2+-transporting systems of mitochondria and the endoplasmic reticulum in uterus smooth muscles cells. The effect of ethanol on the energy - dependent Ca2* accumulation in the myometrial intracellular structures in vivo and in vitro has been investigated. Using the uterus digitonin - pretreated myocytes suspension in identical experimental conditions we could study the kinetic properties of Ca2*-transporting systems.

The comparative study of low-molecular aliphatic alcohols in vitro has shown that their inhibiting effect on Ca2+ accumulation in the mitochondria and endoplasmic reticulum is governed by the type of transporting process, the origin of Ca2+-transporting system, and depends on the alcohol’s carbon atoms amount.

Subacute and acute ethanol application makes the transporting activity of mitochondria CaJ+-accu»iulating system in organism considerably superior to that of Ca2+-pump in endoplasmic reticulum. But in chronic ethanol consumption the Ca2+ uptake prevalence in mitochondria above the Ca2+ uptake in endoplasmic reticulum has disappeared, and Ca2+-transporting function in both the mitochondria and endoplasmic reticulum is strongly violated. The chronic ethanol consumption entails losing oxytocin caused inhibition of the Ca2*-pump in the endoplasmic reticulum.

Thus obtained results are of considerable generalization for smooth muscles, and broaden the contemporary view on the control of biochemical mechanisms of smooth muscles calcium metabolism and the properties of the energy-dependent Ca2+-transporting systems of their cells.

Key words: ethanol, smooth muscles, myometrium, mitochondria, endoplasmic reticulum, Ca2+-pump.