Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

Орлова, Дарья Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии"

На правах рукописи

Орлова Дарья Юрьевна

4857587

КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ И ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ

03.01.02 - биофизика

2 О ОПТ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Красноярск-2011

4857587

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения РАН Научный руководитель: доктор физико-математических наук

профессор

Мальцев Валерий Павлович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

профессор

Барцев Сергей Игоревич

доктор физико-математических наук профессор

Мешалкин Юрий Петрович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт

цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск)

Защита состоится "29" ноября 2011 г. в 10°° на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики Сибирского отделения РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, д. 50 стр. 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института Биофизики Сибирского отделения РАН. Автореферат разослан " 4" октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Л.А. Франк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Исследование поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий представляет собой одно из основных направлений развития современной иммунологии, клеточной и молекулярной биологии, а также представляет интерес для биофизики в целом.

В настоящее время изучение защитной реакции организма на инфекции (бактериальные, вирусные, грибковые или паразитарные) становится всё более актуальным. Любая макромолекула, чуждая организму, может вызвать защитную реакцию - иммунный ответ. Взаимодействие типа лиганд-рецептор играет ключевую роль в иммунитете, являясь основой распознавания "свой-чужой" на молекулярном и клеточном уровне. Такой тип взаимодействия важен для различных биологических процессов. Например, передача сигналов от окружающей среды клетки в ее внутреннюю часть происходит путём лиганд-рецепотрного взаимодействия белков с сигнальными молекулами.

В последние годы с разработкой новых экспериментальных методов появляется все больше экспериментальных работ, посвященных исследованию кинетики взаимодействий типа лиганд-рецептор. Для исследований поверхностных лиганд-рецепторных взаимодействий проточная цитометрия выгодно отличается от других методов, так как позволяет исследовать кинетику связывания лиганда с рецептором на поверхности одиночных клеток. Для исследований лиганд-рецепторного взаимодействия внутри живых клеток широко применяется метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания с использованием технологии конфокальной сканирующей микроскопии. Однако, для количественных кинетических исследований белковых взаимодействий типа лиганд-рецептор в сильно неоднородных средах (например, в ядрах клеток) эти методы до настоящего времени не были развиты.

Актуальность данной работы определяется методами и объектами исследования.

С одной стороны, существует проблема интерпретации кинетических измерений, проводимых в реальном времени на проточном цитометре, так как при этом разные клетки популяции измеряются в разное время и только однократно. Для решения проблемы интерпретации данных кинетических измерений на проточном цитометре в 2000 году был разработан метод временной эволюции функций распределений для моделирования кинетики лиганд-рецепторного взаимодействия, однако, не был доведён до практического применения в случае низкой и средней величины аффинности лиганда к рецептору. В данной работе предложено развитие такого метода для случая низкой и средней аффинности лиганда к рецептору. Рассмотрение кинетических данных для лиганд - рецепторного взаимодействия, полученных с помощью проточного цитометра, с точки зрения временной эволюции распределения клеток по интенсивности флуоресценции даёт возможность получить подробную информацию о распределении клеточной популяции по числу поверхностных рецепторов, а также о константах скорости ассоциации и диссоциации на единичном рецепторе. Объектом исследования в данном случае является специфические обратимые лиганд-рецепторные реакции. Важность

исследований обоснована фундаментальной ролью данных процессов в нормальной жизнедеятельности биологического организма.

Целью данной диссертационной работы является исследование поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии на нейтрофилах человека и в фибробластах мышиных эмбрионов, соответственно. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Усовершенствовать методику исследования связывания растворенных лигандов с низкоаффинными поверхностными рецепторами клетки, используя математическую модель, учитывающую гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов.

2. С использованием усовершенствованной методики охарактеризовать нейтрофилы человека по количеству поверхностных рецепторов FcyRIIIb и по скоростям прямой и обратной реакций «лиганд-клеточный рецептор».

3. С использованием метода сканирующей проточной цитометрии исследовать светорассеивающие свойства нейтрофилов человека, а именно: измерить зависимость дифференциального сечения рассеяния от угла рассеяния.

4. Разработать метод анализа кинетики восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания для сильно неоднородных сред с оценкой количественных параметров динамики белков в ядрах живых клеток.

5. Исследовать диффузию гетерохроматиновых негистоновых белков семейства НР1 в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов и кинетику реакции их взаимодействия с три-метштрованным гистоновым белком НЗ.

Научная новизна работы определяется следующими наиболее значимыми результатами:

Усовершенствована методика исследования связывания низкоаффинных растворенных лигандов с поверхностными рецепторами клетки, учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов, что позволяет оценивать значения констант скорости прямой и обратной реакций лиганд-рецепторного взаимодействия, а также определять абсолютное распределение рецепторов в клеточной популяции.

Проведена расширенная характеризации нейтрофилов человека по свойствам поверхностных рецепторов FcyRIIIb методом проточной цитофлуорометрии с определением константы скорости реакции «лиганд-клеточный рецептор», константы скорости обратной реакции, распределения клеток по количеству рецепторов.

Впервые развит метод определения константы эффективной диффузии молекул лигандов в среде с неоднородным распределением сайтов связывания (рецепторов) без нахождения полного решения исходной системы дифференциальных реакционно-диффузионных уравнений.

Практическая ценность работы связана с развитием потенциала метода проточной цитометрии для исследования обратимых лиганд-рецепторных взаимодействий на поверхности биологических клеток и метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания для исследования сильно неоднородных сред. В частности, разработанные методы позволяют проводить более полную характеризацию биологических клеток по поверхностным и внутриклеточным рецепторам, а именно: определять константу скорости реакции «лиганд-клеточный рецептор», константу скорости обратной реакции, коэффициент эффективной диффузии, а также распределение клеток по количеству рецепторов. Это является диагностически важным:

- для иммунологического анализа клеток;

- в исследовании внутриклеточных процессов;

- при разработке новых лекарственных препаратов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Усовершенствованная методика исследования связывания растворенных лигандов с низкоаффинными поверхностными рецепторами клетки, учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов, позволяет оценивать значения констант скорости прямой и обратной реакций лиганд-рецепторного взаимодействия, а также определять абсолютное распределение рецепторов в клеточной популяции.

2. Значения констант скорости ассоциации и диссоциации одиночной лиганд-рецепторной пары «ЮЗ ^М - ИсуМНЬ» равны к+=(7.5±1.0)х10"16 см3/с и к-=(2.1±0.8)х10"3 1/с, соответственно. Среднее количество поверхностных рецепторов РсуШПЬ на нейтрофилах человека варьируется от пациента к пациенту от 0.5х105 до Зх105.

3. Константа эффективной диффузии молекул лигандов в среде с неоднородным распределением сайтов связывания (рецепторов) может быть определена без нахождения полного решения исходной системы дифференциальных реакционно-диффузионных уравнений.

4. Средние значения констант эффективной диффузии белка НР1а в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов 8иу39Ы/2+/+ и 8иу39Ь1/2-/- равны (5.7 ± 0.8) хЮ"8 см2/с и (4.9 ± 0.4) хЮ"8 см2/с, соответственно. После обработки клеток трихостатином А, вызывающим ацетилирование гистонов на всем протяжении геномной ДНК, среднее значение константы эффективной диффузии белка НР1а в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов 8ш/39Ы/2+/+ и 8иу39Ь1/2-/- равно (3.9 ± 0.6)-10"8 см2/с и (3.4 ± 0.3)-10~8 см2/с, соответственно.

Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены в 5 публикациях реферируемых журналов, включенных в прилагаемый перечень. Содержание диссертации докладывалось на международных конференциях: по биологическим и экологическим наукам (Египет, Хургада, 13-16 марта 2008 г.), "Использование ГМО в научных исследованиях" (Чехия, Брно, 8-9 апреля 2010 г.) на XXV конгрессе международного общества развития цитометрии, 18АС (США,

Сиэтл, 8-12 мая 2010 г.), "Эпигенетика" (Чехия, Брно, 22 - 25 ноября 2010 г.), "Динамика систем внутриклеточной связи" (Швейцария, Энгельберг, 15-19 мая, 2011 г.), а также на научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН, Институте биофизики Чешской академии наук и Институте клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации. Основное содержание изложено в 5-и статьях в рецензируемых журналах, а также в тезисах международных конференций.

Личный вклад. Все приведённые в работе результаты получены либо самим автором, либо при его непосредственном участии.

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 201 наименование. Диссертация изложена на 114 страницах, включает 7 таблиц, 32 рисунка и одно приложение.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, определены цель и задачи работы, сформулированы основные положения, выносимые на защиту, и дано краткое описание диссертации по главам.

Первая глава является обзором научной литературы, посвященной исследованию кинетики поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий.

В разделе 1.1 кратко описаны типы клеточных рецепторов, которые можно разделить на два основных класса - мембранные (поверхностные) рецепторы и внутриклеточные рецепторы.

В разделе 1.2 представлено краткое описание морфологии нейтрофилов и их основных функций.

Раздел 1.3 посвящен использующимся в настоящее время экспериментальным методам исследования взаимодействия лигнад-рецептор на поверхности живых клеток с акцентом на методы, позволяющие проводить кинетические исследования.

Наиболее распространенными экспериментальными методиками являются радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноагглютинация, поверхностный плазмонный резонанс, техника полного внутреннего отражения, проточная цитометрия. Проточная цитометрия выгодно отличается от других методов, так как позволяет исследовать кинетику связывания лиганда с рецептором на поверхности одиночных клеток. С применением проточных цитометров возникает задача повышения информативности измерения одиночных клеток за короткое время ее нахождения в зоне регистрации. Кроме того, существует проблема интерпретации кинетических измерений, проводимых в реальном времени на проточном цитометре, так как при этом разные клетки популяции измеряются в разное время и только однократно. Для решения проблемы интерпретации данных кинетических измерений на проточном цитометре в 2000 году был разработан метод временной эволюции функций распределений для моделирования кинетики лиганд-рецепторного взаимодействия, однако, не был доведён до практического применения в случае низкой и средней величины

аффинности лиганда к рецептору. В данной диссертации предложено развитие такого метода для случая обратимого лиганд - рецепторного взаимодействия.

В разделе 1.4 показано, что при моделировании процессов происходящих в ядре живой клетки необходимо учитывать неоднородность и мобильность структуры ядра. Такое понимание ядерной динамики возникло в результате развития новых in vivo микроскопических методов с использованием неинвазивного мечения белков флуоресцентными маркерами, такими как зеленый флуоресцентный белок (GFP). Эти методы открыли совершенно новые способы исследования локализации белков в ядре. Кроме того, использование GFP позволило исследовать динамические процессы, включая лиганд-рецепторные взаимодействия внутри клеток. Наиболее широко используемым методом в настоящее время является FRAP (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания).

В разделе 1.5 представлено краткое описание структуры хроматина -комплекса ДНК и связанных с ней белков. Хроматин находится внутри ядра клеток эукариот и входит в состав нуклеоида у прокариот. Именно в составе хроматина происходит начальный этап реализации генетической информации, а также репликация и репарация ДНК. Структура генома и экспрессия генов зависят от функциональной активности множества белков, ассоциированных с хроматином. Механизмы взаимодействия этих белков с хроматином в интактных клетках до сих пор остаются не раскрытыми. Подход, основанный на объединении конфокальной микроскопии, метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и кинетического моделирования, позволяет количественно определять основные биофизические параметры (коэффициент диффузии, константу скорости) динамики хроматин-связанных белков в живых клетках. Это в свою очередь поможет проанализировать механизмы взаимодействия таких белков с хроматином в естественных условиях более детально.

Раздел 1.6 посвящен описанию структуры белка гетерохроматина НР1 и его функциональных особенностей. Heterochromatin protein 1 (НР1) является "держателем" гетерохроматина — транкрипционно молчащей, конденсированной ДНК, которая обычно ассоциирует с центромерными областями. Различают три изоформы НР1: а, Р, у. Члены семейства НР1 характеризуются наличием двух консервативных доменов: N-концевой хромодомен и С-концевой теневой хромодомен, разделенных линкером переменной длины. Классическая модель функциональной активности НР1 - связывание с модифицированными гистонами посредством хромодомена и взаимодействие с другими белками посредством теневого домена.

Долгое время гетерохроматин рассматривался как инертный, высоко конденсированный и недоступный для транскрипционных факторов домен, в котором белок НР1 играет роль "клея" и является иммобильным. Однако эксперименты, проведённые на живых клетках с помощью метода FRAP показали, что НР1 не стабильно привязан к перицентрическому гетерохроматину, является мобильным и формирует стабильный, активно обновляемый компартмент. Таким образом, динамические свойства НР1, возможно, имеют решающее значение в создании постоянно обновляемой, но в целом стабильной, архитектуры хроматина.

В разделе 1.7 представлены экспериментальные методы исследования взаимодействия лиганд-рецептор врнутри живых клеток, а также охарактеризованы

различные математические модели, описывающие мобильность молекул внутри биологических клеток.

Можно выделить три группы современных подходов, которые используют для исследования динамики флуоресцентно меченых молекул внутри живых клеток. Первая группа основана на локальном фотообесцвечивании (фотоактивации) флуоресценции и дальнейшем наблюдении пространственного распределения сигнала во времени. Такой подход лежит в основе методов: FRAP (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания), непрерывного фотообесцвечиваня (CP -continuous photobleaching) или потери флуоресценции в процессе фотообесцвечивания (FLIP - Fluorescence Loss in Photobleaching) и фотоактивации (PA - Photoactivation). Эти методы позволяют интерпретировать динамические измерения макромолекул с точки зрения химической кинетики.

Вторая группа использует интенсивность флуктуации сигнала флуоресценции молекул, пребывающих и покидающих фокальный объём (для конфокального микроскопа). Во флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS - Fluorescence correlation spectroscopy) такие флуктуации оцениваются с помощью автокорреляционного анализа. Третья группа основана на измерении транслокации индивидуальных частиц со временем. Такие методы представляют собой прямой способ измерения диффузионного перемещения и взаимодействия с сайтами связывания интересующей молекулы. Однако, они зачастую ограничены относительно коротким периодом наблюдения (< 1 сек.), за который сигнал флуоресценции может быть зафиксирован и лишь небольшое количество траекторий записано для дальнейшего анализа.

В настоящее время метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) является широко используемым подходом для исследования динамики макромолекул в живых клетках. Этот метод используется для изучения многих аспектов клеточной биологии, включая скорости молекулярной диффузии и движения молекул, структуру хроматина, транскрипцию, мобильность мРНК, передачу сигналов, динамику цитоскелета, пузырьковый транспорт, клеточную адгезию и митоз. Типичный FRAP эксперимент - это обесцвечивание флуоресцирующих молекул в небольшой области исследуемого образца при кратковременном облучении интенсивным лазерным излучением (т.е. необратимое фотообесцвечивание) и наблюдение процесса восстановления флуоресценции данной области за счёт диффузии необеспеченных молекул.

Количественный анализ экспериментальных данных по FRAP, как правило, основан на аппроксимации экспериментальной кривой восстановления флуоресценции конкретной математической моделью. Такой подход требует знания математического решения исходных дифференциальных уравнений (с несколькими переменными, в частных производных) в каждом конкретном случае с учетом начальных и граничных условий FRAP. Однако, существует фундаментальная проблема применения такого подхода для неоднородных сред (например, ядер клеток), где получить соответствующее математическое решение практически невозможно в силу неизвестного неоднородного пространственного распределения сайтов связывания.

Альтернативный подход, развиваемый в данной работе, основан на новом методе обработки видео-FRAP измерений, разрешённых по пространственным

координатам и по времени (получаемых с конфокального лазерного сканирующего микроскопа). При этом метод не требует знания соответствующего математического решения исходных дифференциальных уравнений, не зависит от геометрии области выжигания, профиля выжигающего луча лазера и пространственного распределения сайтов связывания.

Во второй главе кратко описаны экспериментальные установки, которые были использованы в данной работе: сканирующий проточный цитометр (СПЦ), который позволяет измерять индикатрису - зависимость интенсивности рассеянного света от угла рассеяния; проточный цитометр FACS Calibur и конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп Leica TCS SP5.

Технология сканирующей проточной цитометрии совместно с методами решения обратной задачи светорассеяния позволяет получать информацию о морфологии клетки из индикатрисы светорассеяния. Таким образом, измерение и обработка индикатрис светорассеяния от клеток позволяет не только дифференцировать клетки крови, но и характеризовать эти клетки, а именно определять их размер, форму и структуру. В качестве экспериментальной установки для определения дифференциального сечения рассеяния нейтрофила был использован СПЦ.

В качестве экспериментальной установки для исследования лиганд-рецепторного взаимодействия на поверхности биологических клеток был использован проточный цитометр стандартной конфигурации FACSCalibur, Becton Dickinson, USA.

В качестве экспериментальной установки для исследования лиганд-рецепторного взаимодействия внутри ядер живых клеток был использован конфокальный лазерно - сканирующий микроскоп Leica TCS SP5. Изменения, происходящие в клетках и их структурах во времени, можно исследовать и на обычных микроскопах, снабжённых видеосистемой. Но лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (JICKM) позволяет получать серии изображений с высоким пространственным разрешением. Кроме того, благодаря наличию лазеров и системы сканирования можно осуществлять не только регистрацию временных изменений, но и осуществлять воздействие на клеточные структуры лазерным излучением. Вышеперечисленные особенности JICKM позволяют с лёгкостью реализовьгаать FRAP измерения.

Также в данной главе представлены методики кинетических экспериментов по исследованию лиганд-рецепторных взаимодействий и методика по выделению нейтрофилов из периферической крови.

В третьей главе в разделе 3.1 представлена разработанная ранее модель связывания растворенных лигандов с клеткой, учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов и описывающая процесс через состояния клетки. Эта модель позволяет описать кинетику не только средних величин, но и самой функции распределения по количеству рецепторов, которая может быть измерена непосредственно в ходе эксперимента. В данной работе впервые была применена такая математическая модель для обработки кинетики лиганд - рецепторного связывания в случае низкоаффинных рецепторов, для которых наличие реакции диссоциации не может быть проигнорировано. Для математической обработки кинетики обратимого лиганд - рецепторного связывания

были использованы следующие уравнения: Л

У\.2=:

, Ко К

1 + — + —

¿о К у

\ К

1 + —+—

ч ¿0 у

-4 —

К =

Где _у(/) - среднее число занятых рецепторов на клетке; ¿Л - объемная концентрация лиганд-рецепторных комплексов в среде; - кинетические

константы взаимодействия лиганда с единичным рецептором; Ьй -концентрация

антител; -полное число рецепторов в единице объёма (свободные и занятые); с -концентрация клеток; К — константа равновесия реакции.

В разделе "результаты" данной главы продемонстрировано применение математической модели в случае обратимого лиганд — рецепторного взаимодействия для описания экспериментальных данных, получаемых во время цитофлуориметрических измерений. Для наглядности результаты нелинейной регрессии приведены на примере одного из пациентов на Рис. 1. Из обработки данных по всем пациентам (одновременно для четырёх пациентов при трёх разных концентрациях антител) были определены константа скорости ассоциации и аффинность (обратная константа равновесия), среднее число рецепторов на нейтрофиле для каждого пациента (Таблица 1).

Как показано в Таблице 1 среднее количество поверхностных рецепторов на нейтрофилах варьируется от пациента к пациенту (от 0.5 х 105 до 3 х 105), также как и асимметрия распределений по числу рецепторов (от 0.5(±0.2) до 0.3(±0.1)). В то время как коэффициент вариации (т.е. отношение стандартного отклонения к среднему значению) меняется в довольно узком диапазоне (от 0.20(±0.1) до 0.27(±0.1)). Это приводит к мысли о том, что потенциально асимметрия распределения может быть более чувствительным диагностическим параметром, нежели коэффициент вариации. Возможно, что в скором будущем эти параметры будут добавлены в список стандартных диагностических параметров.

Хочется отметить, что в проточной цитометрии клетки разделяют по интенсивности прямого и бокового светорассеивания, а также по флуоресценции специфических маркёров на их поверхности. Для эффективного разделения клеток по светорассеянию необходимо использовать адекватную оптическую модель конкретной клетки, в частности для учёта её абсолютного сечения светорассеяния.

Время, мин.

Рис. 1. Кинетика средней флуоресценции нейтрофилов одного из пациентов.

Таблица 1. Результаты теоретической обработки экспериментальных данных

Пациент № Среднее число рецепторов на клетке п, 105 Отн. дисперсия Коэфф. асимметрии Константа скорости прямой реакции К, 10"16, см3 с Константа скорости обратной реакции , 1 к.,Ш\ -с

1 2.4±0.3 0.20±0.1 0.3±0.1

2 0.53±0.05 0.26±0.1 -0.010±0.003 7.5±1.0 2.1±0.8

3 3.3±0.6 0.29±0.1 -0.5±0.2

4 2.5±0.3 0.27±0.1 0.020±0.0б

Поэтому в рамках данной диссертационной работы было измерено сечение рассеяния нейтрофила, что позволило приступить к созданию оптической модели клетки. Предложена оптическая модель нейтрофила, использованная для расчёта абсолютного дифференциального сечения рассеяния методом дискретных диполей.

На Рис. 2 представлены абсолютные сечения рассеяния модели нейтрофила (слева) и экспериментально измеренных клеток (справа). Экспериментально и теоретически полученные абсолютные сечения нейтрофила демонстрируют хорошее согласие, что позволяет сделать вывод об адекватности, предложенной нами оптической модели нейтрофила.

Рис. 2 Дифференциальное сечение рассеяния оптической модели нейтрофилов для различных наборов параметров (слева). Дифференциальное сечение рассеяния для характерных нейтрофилов четырёх различных пациентов (справа).

Таким образом, результаты, приведенные в настоящей главе, позволяют установить границы возможности в характеризации нейтрофилов с помощью проточной цитометрии. Следующие характеристики популяции нейтрофилов могут быть измерены: среднее значение размера нейтрофилов, степень вариации нейтрофилов по размеру, среднее количество рецепторов на мембране нейтрофилов, константы прямой и обратной реакций взаимодействия лиганд-рецептор для популяции нейтрофилов.

Четвёртая глава посвящена разработке метода лазерной сканирующей микроскопии для исследования кинетики обратимого лиганд-рецепторного взаимодействия в среде с неоднородным распределением сайтов связывания. А именно, был разработан FRAP метод для неоднородных сред. Для этого мы

использовали общепринятый вид дифференциальных уравнений двумерной

диффузии для лиганд-рецепторного типа связывания:

кв

д( дх2 ду1

ПА

— = -k.AF + к В dt

(2)

SB 8t

- k+AF - к В

где х и у пространственные переменные; t время, F концентрация свободного (несвязанного) белка; А концентрация свободных сайтов связывания (рецепторы); В концентрация связанного белка (комплексов лиганд - рецептор); к+ константа скорости ассоциации, к. константа скорости диссоциации.

Подчеркнем, что, в отличие от общепринятых моделей FRAP, пространственное распределение мест связывания в нашей модели считается неоднородным, то есть концентрация А является функцией пространственных переменных, как и все другие концентрации в уравнении (2).

В данной работе уравнение (3) было использовано для обработки экспериментальных видео-FRAP данных, измеренных с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Количество кадров, р, в обработке данных варьировалось для оценки погрешности Deff (как стандартная ошибка среднего).

{G(p)-G( 0))

(3)

Экспериментальные функции S(t) и G(t) можно вычислить непосредственно из экспериментальных видео-FRAP данных, но невозможно получить эти функции теоретически, если пространственное распределение сайтов связывания неизвестно. Таким образом, стандартная схема обработки экспериментальных данных методом нелинейной регрессии с использование аналогичной теоретической зависимости с целью получения искомого коэффициента эффективной диффузии в данном случае неприменима. Однако, при произвольном пространственном распределении мест связывания, можно получить коэффициент эффективной диффузии Deg

n D

Deff =-= , где

ff 1 + £

(4)

путём сравнительного анализа экспериментальных функций S(t) и G(t) учитывая теоретическое соотношение между ними (уравнение (5)). Основная трудность состоит в наличии шума в экспериментальных данных, так как это снижает точность расчёта производной экспериментальной функции G(t) по времени. Вместо того,

чтобы вычислять производную, мы предлагаем провести интегрирование (что является более стабильным по отношению к шуму) уравнения (5) по времени (с переменным верхним пределом, р), что привело к уравнению (3) для йф

Ag(0 = 7^5(0-

dt 1 + К

(5)

Также в рамках данной главы приведена проверка разработанного метода на простых (без сайтов связывания) и сложных (неоднородных по распределению сайтов связывания) средах.

s я fc cf

et 8. о

HP1 a

a 'ISA

HP1P

♦ISA +ISA

Suv39h

HP1r

11 ! «ISA

-TSA

TunHPI

LMNA

*= 5

О «

<s>

f o.

HP1«

+ ♦ ; -

HTSA <iSA

HPIp

■•TSA

I I : I 3

5 I ; 5

Тип HP1

НР1Г

—

»ISA *1SA

Рис. 3. Результаты применения FRAP метода для исследования динамики белков НР1 (а,р,у) в ядрах живых клеток. Средние значения (точки) и стандартные ошибки среднего ("усы") коэффициента эффективной диффузии, измеренного для различных изоформ белка НР1 в клетках типа Suv39h (А) и Lmna (Б). Где ++ дикий тип клеток (эмбриональные мышиные фибробласты); - нокаутные клетки по Suv39hl/2 (А) или по Lmna (Б). Числа под средними значениями означают количество обработанных клеток. +TSA - клетки, измеренные через 2 часа после добавления трихостатина А.

Для примера показаны результаты применения разработанного FRAP метода для исследования динамики белков НР1 (а,(3,у) в ядрах живых клеток (Рис. 3, А и Б). Была проведена трансфекция белками HP1-GFP (HP la, HPip, и HPly) эмбриональных мышиных фибробластов (MEFs) от нокаутных мышей типа Suv39hl/2" и Lmna" и соответствующих мышей дикого типа (wt). Следует отметить, что в отличие от стандартных FRAP методов, была обесцвечена большая область (примерно половина) ядра клетки (Рис. 4), так как предложенный в данной работе метод FRAP применим в рамках диффузионно-доминирующей модели, когда

Рис. 4 FRAP анализ хроматин - связанных белков. Кадры распределения HPip - GFP белка в MEF клетках были получены до фотообесцвечивания и вовремя восстановления флуоресценции после выжигания примерно половины ядра клетки. Кадры сняты в указанное время (?) после окончания выжигания.

время ассоциации GFP-меченного белка гораздо меньше времени необходимого для диффузии белка в обесцвеченную область.

Основное преимущество предложенного FRAP метода заключается в том, что он позволяет количественно описывать одновременно и диффузию и лиганд -рецепторное взаимодействие молекул (определять коэффициент эффективной диффузии) в среде с неоднородным распределением сайтов связывания, не требуя при этом аналитического решения реакционно-диффузионных дифференциальных уравнений. Использование относительно большой области фотообесцвечивания позволяет расширить границы применения эффективно-диффузионного подхода на исследование медленных лиганд - рецепторных взаимодействий, которые не могут быть количественно описаны в диффузионном пределе с помощью обычных FRAP методов (фотообесцвечивание малой области исследуемого объекта). Такой метод является особенно полезным инструментом при исследовании высоко неоднородных сред, например, ядро живой клетки, для которых невозможно получить аналитическое решение реакционно-диффузионных дифференциальных уравнений в силу неизвестности математической функции пространственного распределения неоднородностей.

[ Метод, предложенный в данной работе, не зависит от геометрии области

фотообесцвечивания, от профиля луча лазера, от пространственного распределения мест связывания, а также от положения объекта исследования в наблюдаемом фрейме. Поэтому, такой подход может быть легко адаптирован для исследования, например, около сотни клеток за час при использовании FRAP метода в режиме

I одна клетка на фрейм. Это позволит набирать надёжную статистическую экспериментальную выборку за относительно небольшой промежуток времени.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ:

1. Исследована кинетика связывания растворенных лигандов с низкоаффинными поверхностными рецепторами нейтрофилов человека. С помощью усовершенствованной методики решения обратной задачи биокинетики оценены значения констант скоростей прямой и обратной реакций взаимодействия лиганда с рецептором FcyRIIIb, которые для одиночной лиганд-рецепторной пары «1D3 IgM-FcyRIIIb» равны fc=(7.5±1.0)xl0"16 см3/сек и ¿=(2.1±0.8)х10"3 l/ceK, соответственно.

2. Определено абсолютное распределение рецепторов FcyRIIIb в клеточной популяции нейтрофилов человека. Показано, что их среднее количество варьируется у пациентов от 0.5*105 до 3><105 на клетку.

3. Впервые измерена зависимость дифференциального сечения рассеяния от угла рассеяния для нейтрофилов человека. Для объяснения данных экспериментов предложена сферическая оптическая модель нейтрофила, учитывающая влияние на процесс светорассеяния сегментированности ядра и зернистости цитоплазмы.

4. Константа эффективной диффузии молекул лигандов в среде с неоднородным распределением сайтов связывания (рецепторов) может быть определена без нахождения полного решения исходной системы дифференциальных реакционно-диффузионных уравнений.

5. Среднее значение константы эффективной диффузии белка HP 1а в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов Suv39hl/2+/+ и Suv39hl/2-/- равно (5.7 ± 0.8) xl О"8 см2/с и (4.9 ± 0.4) хЮ"8 см2/с, соответственно. После обработки клеток трихостатином А, вызывающим ацетилирование гистонов на всем протяжении геномной ДНК, среднее значение константы эффективной диффузии белка НР1а в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов Suv39hl/2+/+ и Suv39hl/2-/- равно (3.9 ±

0.6.-10'8 см2/с и (3.4 ± 0.3)-10"8 см2/с, соответственно.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Д.Ю. Орлова, М.А. Юркин, К.А.Семьянов, В.П.Мальцев, Оптические свойства гранулярных клеток крови: нейтрофилы. Вестник НГУ, Серия: Физика. Том 2 (4), с. 83-87,2007.

2. D.Yu. Orlova, М.А. Yurkin, A.G. Hoekstra, and V.P. Maltsev. Light scattering by neutrophils: model, simulation and experiment. Journal of Biomedical Optics. Vol. 13(5), 054057, pp.1-7,2008.

3. E. Bartova, A. Harnicarova Horakova, R. Uhlirova, I. Raska, G. Galiova, D. Orlova, S. Kozubek. Structure and epigenetics of nucleoli in comparison with non-nucleolar compartments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Vol. 58(5), pp. 391 - 403, 2010.

4. D. Yu. Orlova, E. Bartova, V. P. Maltsev, S. Kozubek, and A. V. Chernyshev. A nonfitting method using a spatial sine window transform for inhomogeneous effective-diffusion measurements by FRAP. Biophysical Journal. Vol. 100(2), pp. 507 - 516,2011.

5. D. Yu. Orlova, V. I. Borisov, V. S. Kozhevnikov ,V. P. Maltsev and A. V. Chernyshev, Distribution function approach to study the kinetics of IgM antibodies binding to FcyRIIIb (CD 16b) receptors on neutrophils by Flow Cytometry. Journal of Theoretical Biology. Vol.290, pp. 1-6,2011.

Орлова Дарья Юрьевна

КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ И ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ

МИКРОСКОПИИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Формат 60x84/16 Тираж 100 экз.

Подписано в печать 28.09.2011

Усл. печ. л. 1 Заказ № 87

Отпечатано на полиграфическом участке Института катализа СО РАН 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Орлова, Дарья Юрьевна

Введение.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1. "Лиганд" и "рецептор". Типы клеточных рецепторов.

1.2. Характеристика нейтрофилов. Поверхностные рецепторы.

1.3. Экспериментальные методы исследования взаимодействия лиганд -рецептор на поверхности живых клеток.

1.4. Ядро - динамичная среда.

1.5. Структура хроматина. Краткое описание.

1.6. Белок гетерохроматина НР1.

1.7. Экспериментальные методы исследования взаимодействия лиганд-рецептор внутри живых клеток.

Глава 2 Материалы и методы.

2.1. Сканирующий проточный цитометр.

2.2. Пробоподготовка нейтрофилов для измерения на СПЦ.

2.3. Проточный цитометр FACS Calibur.

2.4. Постановка кинетического эксперимента по исследованию поверхностных лиганд-рецепторных взаимодействий.

2.5. Основные компоненты конфокального микроскопа Leica TCS SP5.

2.6. Постановка кинетического эксперимента по исследованию внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий.

2.6.1. Плазмиды.

2.6.2. Клеточные культуры и трансфекция.

2.6.3. Тестовый раствор.

2.6.4. FRAP-протокол.

Глава 3 Исследование поверхностных лиганд-рецепторных взаимодействий.

3.1. Теория.

3.1.1 Формулировка физической модели.

3.1.2. Кинетическая схема процесса лиганд-рецепторного связывания.

3.1.3. Приближение непрерывной функции распределения.

3.1.4. Зависимость констант скоростей реакции от количества посадочных мест

3.1.5. Распределение клеток по количеству занятых рецепторов.

3.2. Результаты.

3.2.1. Определение абсолютного дифференциального сечения светорассеяния нейтрофила.

3.2.1.1. Чувствительность и разрешающая способность СПЦ.

3.2.1.2. Оптическая модель и дифференциальное сечение рассеяния нейтрофила

3.2.2. Чувствительность проточного цитометра FACS Calibur.

3.2.3. Исследование кинетики лиганд - рецепторного взаимодействия на мембранах нейтрофилов.

3.2.4. Определение размера сайта связывания для 1D3 IgM моноклональных антител на FcyRIIIb рецепторе.

3.3. Обсуждение результатов.

Глава 4 Исследование внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий.

4.1. Метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания.

4.1.1. Общая формулировка.

4.1.2. Кинетическая схема процесса.

4.2. Результаты.

4.2.1. Разработка нового FRAP метода для неоднородных сред.

4.2.2. Апробация метода на простых системах.

4.2.2.1. Проверка метода на примере ядер живых клеток.

4.2.2.2. Проверка метода на FITC-HSA в растворе глицерин/вода.

4.2.2.3. Проверка метода на GFP-HP1 в ядрах живых клеток, используя различные позиции области фотовыжигания.

4.2.2.4. Проверка метода на GFP-HP1 в ядрах живых клеток, используя различные размеры области фотовыжигания.

4.2.3. Исследование мобильности гетерохроматиновых белков.

4.3. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии"

Актуальность. Исследование мембранных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий представляет собой одно из основных направлений развития современной иммунологии, клеточной и молекулярной биологии, а также представляет интерес для биофизики в целом.

Известно, что все биологические молекулы в клетке - нуклеиновые кислоты, белки и т.д. - синтезируются в строго определенных местах и затем перемещаются к «месту назначения», где они должны выполнить свою специфическую функцию. Перенос макромолекул зачастую происходит за счет диффузии. Однако в сильно неоднородных средах (например, клеточное ядро) процесс диффузии может значительно усложняться наличием обратимого лиганд-рецепторного взаимодействия макромолекул с сайтами связывания. Поэтому для исследований мобильности белков важно совместно рассматривать оба процесса: диффузию и обратимое лиганд -рецепторное взаимодействие.

В последние годы с разработкой новых экспериментальных методов (таких как, иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноагглютинация, проточная цитометрия и т.д.) появляется все больше экспериментальных работ, посвященных исследованию мобильности белков и кинетики взаимодействий типа лиганд-рецептор. Проточная цитометрия выгодно отличается от других методов, так как позволяет исследовать кинетику связывания лиганда с рецептором на поверхности одиночных клеток. Для исследований лиганд-рецепторного взаимодействия внутри живых клеток наиболее широко применяются метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и количественная флуоресцентная лазерная конфокальная сканирующая микроскопия. Однако, для количественных кинетических исследований белковых взаимодействий типа лиганд-рецептор в сильно неоднородных средах (например, в ядрах клеток) эти методы не были развиты.

Актуальность данной работы определяется методами и объектами исследования.

С одной стороны, существует проблема повышения информативности кинетических измерений биологических процессов на поверхности клеток с помощью проточной цитометрии. Такая проблема решается в данной работе развитием методической базы, основанной на технологии проточной цитометрии с измерением динамики функций распределений. Объектом исследования в данном случае являются специфические обратимые лиганд-рецепторные реакции. Важность исследований обоснована фундаментальной ролью данных процессов в нормальной жизнедеятельности биологического организма.

С другой стороны, существует проблема корректного определения количественных параметров (коэффициент диффузии, константы скорости ассоциации и диссоциации) динамики молекул в среде с неоднородным распределением связывающих центров (например, ядро живой клетки) методом восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (Fluorescence recovery after photobleaching -FRAP). Такая проблема решается в данной работе созданием метода для анализа кинетики восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания для сильно неоднородных сред с оценкой количественных параметров динамики молекул. Объектом исследования являются белки, вовлеченные в процессы транскрипции и трансляции, формирование и поддержание конденсированного хроматина и стабильности генома, а также участвующие в репарации двухцепочечных разрывов ДНК. А именно, в рамках данной работы исследована динамика гетерохроматиновых белков HPla, HPlß, HPly.

Цель:

Исследовать поверхностные и внутриклеточные лиганд-рецепторные взаимодействия с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии на нейтрофилах человека и в фибробластах мышиных эмбрионов, соответственно.

Задачи:

2. С использованием усовершенствованной методики охарактеризовать нейтрофилы человека по количеству поверхностных рецепторов РсуЫПЬ и по скоростям прямой и обратной реакций «лиганд-клеточный рецептор».

3. С использованием метода сканирующей проточной цитометрии исследовать светорассеивающйе свойства нейтрофилов человека, а именно: измерить зависимость дифференциального сечения рассеяния от угла рассеяния.

5. Исследовать диффузию гетерохроматиновых негистоновых белков семейства НР1 в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов и кинетику реакции их взаимодействия с три-метилированным гистоновым белком НЗ.

На защиту выносятся следующие положения:

2. Значения констант скорости ассоциации и диссоциации одиночной лиганд-рецепторной пары «ШЗ ^М - РсуШПЬ» равны А^=(7.5±1.0)х10~16 см3/с и к. =(2.1±0.8)х10"3 1/с, соответственно. Среднее количество поверхностных рецепторов БсуМИЬ на нейтрофилах человека варьируется от пациента к пациенту от 0.5><105 до ЗхЮ5.

4. Средние значения констант эффективной диффузии белка НР1а в ядрах о фибробластов мышиных эмбрионов 8иу39Ь1/2+/+ и 8иу39Ь1/2-/- равны (5.7 ± 0.8) хЮ~ см2/с и (4.9 ± 0.4) х10"8 см2/с, соответственно. После обработки клеток трихостатином А, вызывающим ацетилирование гистонов на всем протяжении геномной ДНК, среднее значение константы эффективной диффузии белка НР1а в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов 8иу39Ь1/2+/+ и 8иу39Ь1/2-/- равно (3.9 ± 0.6)-10"8 см2/с и (3.4 ± о л

0.3)-10" см/с, соответственно.

Практическая и теоретическая ценность. Проведенная работа позволила развить потенциал метода проточной цитометрии для исследования поверхностных обратимых лиганд-рецепторных взаимодействий и метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания для сильно неоднородных сред. Практическая ценность настоящей работы определяется использованием полученных результатов:

- для иммунологического анализа клеток;

- в исследовании внутриклеточных процессов;

- при разработке новых лекарственных препаратов.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения РАН совместно с Институтом биофизики Чешской академии наук и Институтом клинической иммунологии СО РАМН.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 201 наименование. Диссертация изложена на 114 страницах, включает 7 таблиц, 32 рисунка и приложение. Первая глава представляет собой литературный обзор, посвященный экспериментальным методам исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий, а также, математическим моделям, описывающим мобильность макромолекул внутри биологических клеток. Во второй главе описаны материалы и методы, использованные в данной работе. В третьей главе рассмотрено исследование обратимых поверхностных лиганд-рецепторных взаимодействий. Четвёртая глава посвящена исследованию обратимых лиганд-рецепторных взаимодействий внутри ядер живых клеток.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Орлова, Дарья Юрьевна

Основные результаты работы докладывались на:

1. Международной конференции по биологическим и экологическим наукам (Египет, Хургада, 13-16 марта 2008 г.);

2. Международной конференции "Использование ГМО в научных исследованиях" (Чехия, Брно, 8-9 апреля 2010 г.);

3. XXV конгрессе международного общества развития цитометрии, ISAC (США, Сиэтл, 8-12 мая 2010 г.);

4. Международной конференции"Эпигенетика" (Чехия, Брно, 22 - 25 ноября 2010 г.);

5. Международной конференции "Динамика систем внутриклеточной связи" (Швейцария, Энгельберг, 15-19 мая, 2011 г.);

6. Научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Россия, Новосибирск, 2008 - 2011), Институте биофизики Чешской академии наук (Чехия, Брно, 2009 - 2011) и Институте клинической иммунологии СО РАМН (Россия, Новосибирск, 2009). и опубликованы в следующих работах: статьи в реферируемых изданиях:

2. D.Yu. Orlova, М.А. Yurkin, A.G. Hoekstra, and V.P. Maltsev. Light scattering by neutrophils: model, simulation and experiment. Journal of Biomedical Optics. Vol.

13(5), 054057, pp. 1-7, 2008.

3. E. Bartova, A. Harnicarova Horakova, R. Uhlirova, I. Raska, G. Galiova, D. Orlova, S.

Kozubek. Structure and epigenetics of nucleoli in comparison with non-nucleolar compartments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Vol. 58(5), pp. 391 - 403, 2010.

5. D. Yu. Orlova, V. I. Borisov, V. S. Kozhevnikov ,V. P. Maltsev and A. V. Chernyshev,

Distribution function approach to study the kinetics of IgM antibodies binding to FcyRIIIb (CD16b) receptors on neutrophils by Flow Cytometry. Journal of Theoretical Biology. Accepted. DOI: 10.1016/j.jtbi.2011.08.026.

Избранные тезисы в сборниках конференций:

1. D. Orlova, Е. Bartova, A. Harnicarova Horakova, Study on chromatin dynamics in living cells by the use of confocal microscopy and FRAP technique. Student scientific conference for students working with genetically modified organisms (GMOs), Brno, Czech Republic, April 8-9th, p. 64, 2010.

2. A.V. Chernyshev, D.Yu. Orlova, V.I. Borisov, V.S. Kozhevnikov, V.P. Maltsev, Time evolution of the cellular fluorescence distribution in dynamic flow cytometry: theoretical modeling and experimental verification for the kinetics of 1D3 IgM monoclonal antibodies binding to Fey Rib receptors (CD 16b) on neutrophils. XXV Congress of the International Society for Advancement of Cytometry, Seattle, Washington, USA, May 8-12, p. 184, 2010.

3. Darya Yu. Orlova, E. Bartova, V.P. Maltsev, S. Kozubek, and A.V. Chernyshev, A nonfitting FRAP method for two-dimensional effective diffusion measurements based on laser-scanning microscope. COST action TD09/05 Epeginetics-Bench to Bedside, Brno, Czech Republic, November 23-24, p. 58, 2010.

4. Darya Yu. Orlova, E. Bartova, V.P. Maltsev, S. Kozubek, and A.V. Chernyshev,

Development of nonfitting FRAP method for inhomogeneous media: application for study mobility intranuclear proteins in living cells. EMBO conference series on systems dynamics and intracellular communication SPATIAL 2011, Engelberg, Switzerland, May 14-19, p. 85, 2011.

Заключение

В первой части данной работы исследовалась кинетика обратимого лиганд -рецепторного взаимодействия в гетерогенной системе, а именно на поверхности живых клеток. Для исследования использовался метод проточной цитометрии. Экспериментально исследована кинетика связывания флюоресцеин-меченых мышиных моноклональных антител с поверхностными рецепторами FcyRIIIb нейтрофилов человека.

Теоретический анализ кинетики лиганд - рецепторного взаимодействия был сфокусирован на задаче описания экспериментальных данных, получаемых в проточной цитометрии, то есть на описании временной эволюции распределения по флуоресценции. Применена математическая модель обратимого процесса образования комплекса «лиганд-поверхностный рецептор клетки», использующая понятие функции распределения клеток по количеству рецепторов, то есть учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов. Модель использует весь набор экспериментальных данных, получаемых в кинетическом эксперименте на проточном цитометре, и позволяет оценить влияние гетерогенности клеточной популяции на кинетику процесса.

В рамках второй части данной работы был разработан новый метод FRAP для определения эффективной диффузии молекул в неоднородной среде. Этот метод основан на GFP технологии, пространственных измерениях, использующих видео-FRAP метод, лазерно-сканирующую конфокальную микроскопию и анализ результатов с использованием математической модели, которая отражает реальную ситуацию во многих случаях. Такой подход расширяет область применения количественного FRAP анализа для неоднородных сред. Наш метод был успешно применён для исследования внутриядерной диффузии и лиганд - рецепторных взаимодействий в живых клетках, экспрессирующих белок HP1-GFP. Полученные значения коэффициента эффективной диффузии находятся в хорошем согласии с известными литературными данными.

Проведенная работа позволила развить потенциал метода проточной цитометрии для исследования мембранных обратимых лиганд-рецепторных взаимодействий и метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечиванния для сильно неоднородных сред. Выводы

1 Исследована кинетика связывания растворенных лигандов с низкоаффинными поверхностными рецепторами нейтрофилов человека. С помощью усовершенствованной методики решения обратной задачи биокинетики оценены значения констант скоростей прямой и обратной реакций взаимодействия лиганда с рецептором FcyRIIIb, которые для .одиночной лиганд-рецепторной пары «1D3 IgM - FcyRIIIb» равны fcf=(7.5±1.0)><10"16 см3/сек и /t=(2.1±0.8)*10"3 1/сек, соответственно.

2 Определено абсолютное распределение рецепторов FcyRIIIb в клеточной популяции нейтрофилов человека. Показано, что их среднее количество варьирует у пациентов от 0.5x105 до 3x105 на клетку.

3 Впервые измерена зависимость дифференциального сечения рассеяния от угла рассеяния для нейтрофилов человека. Для объяснения данных экспериментов предложена сферическая оптическая модель нейтрофила, учитывающая влияние на процесс светорассеяния сегментированности ядра и зернистости цитоплазмы.

4 Константа эффективной диффузии молекул лигандов в среде с неоднородным распределением сайтов связывания (рецепторов) может быть определена без нахождения полного решения исходной системы дифференциальных реакционно-диффузионных уравнений.

5 Среднее значение константы эффективной диффузии белка HP la в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов Suv39hl/2+/+ и Suv39hl/2-/- равно (5.7 ± 0.8) х10"8 см2/с и (4.9 ± 0.4) х10"8 см2/с, соответственно. После обработки клеток трихостатином А, вызывающим ацетилирование гистонов на всем протяжении геномной ДНК, среднее значение константы эффективной диффузии белка HPla в ядрах фибробластов мышиных эмбрионов Suv39hl/2+/+ и Suv39hl/2-/- равно (3.9 ± 0.6)-10"8см2/с и (3.4 ± 0.3)-10"8см2/с, соответственно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Орлова, Дарья Юрьевна, Новосибирск

1. http://ilch.vsmu.edu.ua/students/biochem/sbors/sbor gormons rus.pdf

2. Manson M.D., Armiiage J.P., Hoch J.A., Macnab R.M. Bacterial locomotion and signal transduction. // Journal of Bacteriology 1998. - V.180. - P. 1009-1022.

3. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Москва.: Фаир-пресс, 1999. - 720 с.

4. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. Санкт-Петербург.: "Наука", 1999.-Т. 1.-231 с.

5. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы I-II. Санкт-Петербург. «Наука», 2000.-231 с.

6. Суровцев И.В. Исследование кинетики образования поверхностных комплексов антиген-антитело с помощью сканирующего проточного цитометра. Новосибирск, 2003.

7. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, Москва.: "Мир", 1994. - Т.1.- 517 с.

8. Bongard P. Ligand-receptor interactions. // Rep. Prog. Phys. 1999. - V.62. - P. 921-968.

9. Van Oss C.J. Précipitation and agglutination. // J. Immunoassay 2000. - V.21. - P. 143164.

10. Mogokolsirichaikul D., Tarnchompoo В., Ratanabanangkoon K. Development of a latex agglutination inhibition reaction test for amphetamines in urine. // J. Immunol. Meth. 1993. -V.157. - P. 189-195.

11. Ellis R.W., Sobanski M.A. Diagnostic particle agglutination using ultrasound: a new technology to rejuvenate old microbiological methods. // J. Med. Microbiol. 2000. - V.49. -P. 853-859.

12. Vinuesa J.L.O., Bolivar J.A.M., Peula J.M., Alvarez RH. A comparative study of optical techniques applied to particle enhanced assays of C-reactive protein. // J. Immunol. Meth. -1997.-V.205.-P. 151-156.

13. Olson W.A., Spitznagel T.M., Yarmush M.I. Dissotiation kinetics of antigen-antibody interactions: studies on a panel of anti-albumin monoclonal antibodies. // Mol. Immunol. -1989. V.26. - P. 129-136.

14. Mason D.W., Williams A.F. The kinetics of antibody binding to membrane antigens in solution and at the cell surface. // Biochem. J. 1980. - V.187. - P. 1-20.

15. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова E.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва.: Высшая школа, 1991. - 288 с.

16. Петров Р.В. Иммунология. Москва.: Медицина, 1987. - С. 51-62.

17. Bonifacino J.S., Paladini А.С. Effect of the incomplete separation of bound and free ligand on binding experiments. // Anal. Biochem. 1981. - V.l 18. - P. 213-220.

18. Storch M.J., Marbach P., Kerp L. A time-resolved fluoroimmunoassay for human insulin based on two monoclonal antibodies. // J. Immunol. Meth. 1993. - V.157. - P. 197-201.

19. Chan S.S., Arndt-Jovin D.J., Jovin T. Proximity of Lectin receptors on the cell surface measured by flurescence energy transfer in a flow system. // J. Histochem. Cytochem. 1979. -V.21.-P. 55-64.

20. Tron L., Szollosi J., Damjanovich S. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surface. // Biophys. J. 1984. - V.45. - P. 939-946.

21. Zuber E., Rosso L., Darbouret В., Socquet F., Mathis G., Flandrois J.-P. A descriptive model for the kinetics of a homogeneous fluorometric immunoassay. Hi. Immunoassay -1997.-V.18.-P. 21-47.

22. Ball R.C., Weitz D.A., Witten T.A., Leyvraz F. Universal kinetics in reaction-limited aggregation. // Phys. Rev. Let. 1987. - V.58. - P. 274-277.

23. Wiltzius P. Hydrodynamic behavior of fractal aggregates. //Phys. Rev. Let. 1987. - V.58. -P. 710-713.

24. Nakamura M., Ohshima H., Kondo Т. Aggregation behavior of antibody-carrying latex particles. // J. Colloid Interface Sci. 1992. - V.154. - P.393-399.

25. Thompson J.C., Graig A.R., Davey C.L., Newman D.J., Londsdale M.L., Busher W.J., Nagle P., Price C.P. Kinetics and proposed mechanism of the reaction of an immunoinhibition, particle-enhanced immunoassay. // Clin. Chem. 1997. - V.43. - P. 23842389.

26. Quesada M., Puig J., Delgado J.M., Peula J.M., Molina J.A., Higaldo-Alvarez R. A simple kinetic model of antigen-antibody reactions in particle-enhanced light scattering immunoassays. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 1997. - V.8. - P. 303-309.

27. Laurenzi I.J., Diamond S.L. Monte Carlo simulation of the heterotypic aggregation kinetics of platelets and neutrophis. //Biophys. J. 1999. - V.77. - P. 1733-1746.

28. Long M., Goldsmith H.L., Tees D., Zhu C. Probabilistic modeling of shear-induced formation and breakage of doublets cross-linked by receptors-ligand bonds. //Biophys. J. -1999.-V.76.-P. 1112-1128.

29. Schuck P. Use of surface plasmon resonance to probe the equilibrium and dynamic aspects of interactions between biological macromolecules. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997. - V.26. - P. 541-566.

30. Karlsson R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. // Anal. Biochem. -1994.-V.221.-P. 142-15,1.

31. Sadana A., Chen Z. Influence of non-specific binding on antigen-antibody kinetics for biosensor applications. // Biosensors & Bioelectronics 1996. - V.l 1. P. 17-33.

32. Balgi G., Leckband D.E., Nitsche J. Transport effects on the kinetics of protein-surface binding. // Biophys J. 1995. - V.68. - P. 2251-2260.

33. Sadana A. A single- and dual fractal abnalysis of antigen-antibody binding kinetics for different biosensors application. // Biosensors & Bioelectronics 1999. - V.14. - P. 515-531.

34. Liebert R.B., Prieve D.C. Species-species long range interaction between receptors/1 igand pairs. //BiophysJ. 1995. - V.69. - P. 66-73.

35. Thompson N.L., Axelrod D. Immunoglobulin surface-binding kinetics studied by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. // BiophysJ. 1983. - V.43. -P. 103-114.

36. Starr Т.Е., Thompson N.L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy: combined surface reaction and solution diffusion. // BiophysJ. 2001. - V.80., -P. 1575-1584.

37. Стейнкамп Дж. Цитометрия в потоке (обзор). // Приборы для научных исследований 1984.-N9-С. 3-34.

38. Кравацкий Ю.В., Полетаев А.И. Двухпараметрический флуоресцентный анализ хромосом человека в потоке. Количественная обработка. //Биофизика 1998. - Т.43. - С. 264-275.

39. Melamed M.R., Lindmo T. Flow Cytometry and Sorting, Mendelson M.L. (eds.). New York: Wiley-Liss, 1990. - 824 P.

40. McCarthy D.A., Macey M.G. Cytometric analysis of cell phenotype and function. -Cambridge University Press, 2001. 413 P.

41. Labus J.M., Petersen B.H. Quantitation of human anti-mouse antibody in serum by flow cytometry.// Cytometry 1992. - V. 13. - P. 275-281.

42. Sklar L.A., Finney D.A., Oades Z.G., Jesaitis A.J., Painter R.G., Cochrane C.G. The dynamics of ligand-receptor interactions. //J. Biol. Chem. 1984. - V.259. - P. 5661-5669.

43. Sklar L.A., Edwards B.S., Graves S.W., Nolan J.P., Prossnitz E.R. Flow cytometric analysis of ligand-receptor interactions and molecular assemblies. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2002. - V.31. - P. 97-119.

44. Зенин B.B., Аксенов Н.Д., Шатрова A.H., Клопов Н.В., Крам Л.С., Полетаев А.И. Устройство для предобработки образца при анализе методом цитометрии в потоке. // Биофизика 1999. - Т.44. - С. 303-312.

45. Tenbaum S, Baniahmad A. Nuclear receptors: structure, function and involvement in disease.//Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1997- V.29.-P. 1325-1341.

46. Розен В.Б., Смирнов A.H. Рецепторы и стероидные гормоны Москва: изд-во МГУ, 1981.-312 с.

47. Carlstedt-Duke J., Eriksson Н., Gustafsson J.-E. (eds). The steroid/thyroid hormone receptor family and gene regulation Basel: Birkhauser Verlag,. 1989. - 260 P.

48. Freedman, L.P. (ed.) Molecular biology of steroid and nuclear hormone receptors, Birkhauser Boston, 1998. - 209 P.

49. Misteli T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. // Science 2001. - V.291. - P. 843-847.

50. Phair, R.D., Misteli T. High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus. // Nature 2000. - V.404. - P. 604-609.

51. Rippe K. Dynamic organization of the cell nucleus. // Curr Opin Genet Dev. 2007. -V.17.-P. 373-380.

52. Lippincott-Schwartz J., Patterson G.H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. // Science. 2003. - V.300. - P. 87-91.

53. Tsien R.Y. The green uorescent protein. // Annu Rev Biochem. 1998. - V.67. - P. 509544.

54. Reits E.A., Neefjes J.J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. // Nat Cell Biol. 2001. - V.3. - P. E145-E147.

55. Pederson T. Diffusional protein transport within the nucleus: a message in the medium. // Nat Cell Biol. 2000. - V.2. - P. E73-E74.

56. Seksek O., Biwersi J., Verkman A.S. Translational diffusion of macromolecule-sized solutes in cytoplasm and nucleus. // J Cell Biol. 1997. - V.138. P. 131-142.

57. Beaudouin J., Mora-Bermudez F., Klee T., Daigle N., Ellenberg J. Dissecting the contribution of diffusion and interactions to the mobility of nuclear proteins. // Biophys J. -2006.-V.90. P. 1878-1894.

58. Carrero G., Crawford E., Hendzel M.J., de Vries G. Characterizing fluorescence recovery curves for nuclear proteins undergoing binding events. // Bull Math Biol. 2004. - V.66. P. 1515-1545.

59. Carrero G., Crawford E., Th'ng J., de Vries G., and Hendzel M.J. Quantification of protein-protein and protein-DNA interactions in vivo, using fluorescence recovery after photobleaching. // Methods Enzymol. 2004. - V.375. - P. 415-442.

60. Hinow P., Rogers C.E., Barbieri C.E., Pietenpol J.A., Kenworthy A.K., DiBenedetto E.The DNA binding activity of p53 displays reaction-diffusion kinetics. // Biophys J. 2006. -V.91.-P. 330-342.

61. Halford S.E., Marko J.F. How do site-specific DNA-binding proteins find their targets? // Nucleic Acids Res. 2004. - V.32. - P. 3040-3052.72. van Holde K., Zlatanova J. Scanning chromatin: a new paradigm? // J Biol Chem. 2006. -V.281.-P. 12197-12200.

62. Farla P., Hersmus R., Trapman J., Houtsmuller A.B. Antiandrogens prevent stable DNA-binding of the androgen receptor. // J Cell Sci. 2005. - V.l 18. P. 4187-4198.

63. McNally J.G., Muller W.G., Walker D., Wolford R., Hager G.L. The glucocorticoid receptor: rapid exchange with regulatory sites in living cells. // Science 2000. - V.287. - P. 1262-1265.

64. Sprague B.L., Muller F., Pego R.L., Bungay P.M., Stavreva D.A., McNally J.G. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. // Biophys J. 2006. - V.91. P. 1169-1191.

65. Perlmann Т., Eriksson P., Wrange O. Quantitative analysis of the glucocorticoid receptor-DNA interaction at the mouse mammary tumor virus glucocorticoid response element. // J Biol Chem. 1990. - V.265. P. 17222-17229.

66. Ridgway P., Almouzni G. Chromatin assembly and organization. // J Cell Sci. 2001. -V.114. - P. 2711-2712.

67. Karpova T.S., Chen T.Y., Sprague B.L., McNally J.G. Dynamic interactions of a transcription factor with DNA are accelerated by a chromatin remodeller. // EMBO Rep. -2004. V.5. - P. 1064-1070.

68. Guigas G., Weiss M. Sampling the cell with anomalous diffusion the discovery of slowness. // Biophys J. - 2008. - V.94. - P. 90-94.

69. Minton A.P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes? // J Cell Sci. 2006. - V.l 19. - P. 2863-2869.

70. Saxton M.J. Chemically limited reactions on a percolation cluster. // The Journal of Chemical Physics. 2002. - V.l 16. - P. 203-208.

71. Zhou H.-X., Rivas G., Minton A.P. Macromolecular crowding and confinement: biochemical, biophysical, and potential physiological consequences. // Annu Rev Biophys. -2008.-V.37.-P. 375-397.

72. Wolffe A.P. Nucleosome positioning and modification, chromatin structures that potenilate transcription. // Trends Biochem. Sci. 1994. - V.l9. - P. 240-244.

73. Jenuwein Т., Allis C.D. Translating the histone code. // Science 2001. - V.293. - P. 1074-1080.

74. Thiagalingam S., Cheng K.H., Lee H.J., Mineva N., Thiagalingam A., Ponte J.F. Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2003.-V.983.-P. 84-100.

75. Turner B.M. Cellular memory and the histone code. // Cell 2002. - V.l 11. - P. 285-291.

76. Braunstein M., Sobel R.E., Allis C.D., Turner B.M., Broach J.R. Efficient transcriptional silencing in Saccharomyces cerevisiae requires a heterochromatin histone acetylation pattern // Mol. Cell Biol. 1996. - V.l6. - P. 4349-4356.

77. Лавров C.A., Кибанов M.B. Некодирующие РНК и структура хроматина. // Успехи биологической химии 2007 - Т.47. - С. 53-88.

78. Tsukada Y., Fang J., Erdjument-Bromage H., Warren M.E., Borchers C.H., Tempst P., Zhang Y. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins. // Nature -2006-V. 439.-P. 811-816.

79. Ebert A., Schotta G., Lein S., Kubicek S., Krauss V., Jenuwein T., Reuter G. Su(var) genes regulate the balance between euchromatin and heterochromatin in Drosophila. // Genes Dev. 2004. - V. 18. - P. 2973-2983.

80. Schotta G., Ebert A., Dorn R., Reuter G. Position-effect variegation and the genetic dissection of chromatin regulation in Drosophila. // Semin. Cell Dev. Biol. 2003. - V.14. -P. 67-75.

81. Czermin B., Schotta G., Hulsmann B.B., Brehm A., Becker P.B., Reuter G., Imhof A. Physical and functional association of SU(VAR)3-9 and HDAC1 in Drosophila. // EMBO Rep. 2001. - V.2. - P. - 915-919.

82. Schotta G., Ebert A., Krauss V., Fischer A., Hoffmann J., Rea S., Jenuwein T., Dorn R., Reuter G. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing. // EMBO J. 2002. - V.21. - P. 1121-1131.

83. Min J., Zhang Y., Xu R.M. Structural basis for specific binding of Polycomb chromodomain to histone H3 methylated at Lys 27. // Genes Dev. 2003. - V.17. - P. 18231828.

84. Fischle W., Wang Y., Jacobs S.A., Kim Y., Allis C.D., Khorasanizadeh S. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains.//Genes Dev.-2003. V.17. - P. 1870-1881.

85. Brehm A., Tufteland K.R., Aasland R., Becker P.B. The many colours of chromodomains. // Bioessays 2004. - V.26. - P. 133-140.

86. Akhtar A., Zink D., Becker P.B. Chromodomains are protein-RNA interaction modules. // Nature 2000. - V.407. - P. 405^109.

87. Bannister A.J., Zegerman P., Partridge J.F., Miska E.A., Thomas J.O., Allshire R.C., Kouzarides T. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. // Nature 2001 - V.410. - P. 120-124.

88. Shareef M.M., Badugu R., Kellum R. HP1/ORC complex and heterochromatin assembly. // Genetica 2003. - V.l 17. - P. 127-134.

89. Seum C., Pauli D., Delattre M., Jaquet Y., Spierer A., Spierer P. Isolation of Su(var)3-7 mutations by homologous recombination in Drosophila melanogaster. // Genetics 2002. -V.161.-P. 1125-1136.

90. Pirrotta V., Poux S., Melfi R., Pilyugin M. Assembly of Polycomb complexes and silencing mechanisms. // Genetica 2003. - V.l 17. - P. 191-197.

91. Simon J.A. Polycomb group proteins Quick Guide. // Curr. Biol. - 2003. - V.13. - P. R79-80.

92. Pirrotta V. Chromatin complexes regulating gene expression in Drosophila. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1995. - V.5. - P. 466-472.

93. Chanas G., Lavrov S., Iral F., Cavalli G., Maschat F. Engrailed and polyhomeotic maintain posterior cell identity through cubitus-interruptus regulation. // Dev. Biol. 2004. -V.272. - P. 522-535.

94. Ringrose L., Rehmsmeier M., Dura J.M., Paro R. Genome-wide prediction of Polycomb/Trithorax response elements in Drosophila melanogaster. // Dev. Cell 2003. -V.5.-P. 759-771.

95. Negre N. Hennetin J., Sun L.V., Lavrov S., Bellis M., White K.P., Cavalli G. Chromosomal distribution of PcG proteins during Drosophila development. // PLoS Biol. -2006. V.4. - P. el70.

96. Sewalt R.G., Kwaks T.H., Hamer K., Otte A.P. Biochemical analysis of mammalian polycomb group protein complexes and the identification of genetic elements.that block polycomb-mediated gene repression. // Methods Enzymol. 2004. - V.377. - P. 282-296.

97. Pasini D., Bracken A.P., Helin K. Polycomb group proteins in cell cycle progression and cancer. // Cell Cycle 2004. - V.3. - P. 396-400.

98. Zhang H., Azevedo R.B., Lints R., Doyle C., Teng Y., Haber D., Emmons S.W. Global regulation of Hox gene expression in C. elegans by a SAM domain protein. // Dev. Cell -2003. V.4. - P. 903-915.

99. Reyes J.C., Grossniklaus U. Diverse functions of Polycomb group proteins during plant development. // Semin. Cell Dev. Biol. 2003. - V.14. - P. 77-84.

100. Chan S.W., Henderson I.R., Jacobsen S.E. Gardening the genome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana. // Nat. Rev. Genet. 2005. - V.6. - P. 351-360.

101. Liu K., Wang Y.F., Cantemir C., Muller M.T. Endogenous assays of DNA methyltransferases: Evidence for differential activities of DNMT1, DNMT2, and DNMT3 in mammalian cells in vivo. // Mol. Cell Biol. 2003. - V.23. - P. 2709-2719.

102. Zemach A., Grafi G. Methyl-CpG-binding domain proteins in plants: interpreters of DNA methylation. // Trends Plant. Sci. 2007. - V. 12. - P. 80-85.

103. Fatemi M., Wade P.A. MBD family proteins: reading the epigenetic code. // J Cell Sci. -2006. V.l 19. - P. 3033-3037.

104. Wade P.A. Methyl CpG-binding proteins and transcriptional repression. // Bioessays -2001.-V.23.-P. 1131-1137.

105. Hediger F. Gasser S.M. "HP1: don't judge the book by its cover" // Curr. Op. Genet. Dev. 2006. - V.16. - P. 143-50.

106. Richards E.J., Elgin S.C. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: Rounding up the usual suspects. // Cell 2002. - V. 108(4). - P. 489-500.

107. Ringrose L., Paro R. Epigenetic regulation of cellular memory by the polycomb and trithorax group proteins. // Annu Rev Genet. 2004. - V.38. - P. 413^43.

108. Schubeler D., Scalzo D., Kooperberg C., van Steensel B., Delrow J., Groudine M. Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster: a link between transcription and replication timing. // Nat. Genet. 2002. - V.32. - P. 438-442.

109. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S. Intercalary heterochromatin and genetic silencing. // BioEssays 2003. - V.25. - P. 1040-1051.

110. Hiragami K., Festenstein R. Heterochromatin protein 1: a pervasive controlling influence. // Cell Mol Life Sci. 2005,. - V.62. - P. 2711-2726.

111. Cheutin T., McNairn A.J., Jenuwein T., Gilbert D.M., Singh P.B., Misteli T. Maintenance of stable heterochromatin domains by dynamic HP1 binding. // Science 2003. -V.299.-P. 721-725.

112. Festenstein R., Pagakis S.N., Hiragami K., Lyon D., Verreault A., Sekkali B., Kioussis D. Modulation of heterochromatin protein 1 dynamics in primaiy mammalian cells. // Science 2003. - V.299. - P. 719-721.

113. Henzler-Wildman K., Kern D. Dynamic personalities of proteins. // Nature 2007. -V.450.-P. 964-972.

114. Axelrod D., Koppel D.E., Schlessinger J., Elson E., Webb W.W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. // Biophys. J. 1976. - V.16. -P. 1055-1069.

115. Peters R., Peters J., Tews K.H., Bahr W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. // fiiochem. Biophys. Acta 31974. - V.67. - P. 282294.

116. Cole N.B., Smith C.L., Sciaky N., Terasaki M., Edidin M., Lippincott-Schwartz J. Diffusional mobility of golgi proteins in membranes of living cells. // Science 1996. -V.273.-P. 797-801.

117. Cutts L.S, Roberts P.A., Adler J., Davies M.C., Melia C.D. Determination of localized diffusion coefficients in gels using confocal scanning laser microscopy. // J Microscopy -1995.-V.180.-P. 131-139.

118. Peters R., Brunger A., Schulten K. Continuous fluorescence microphotolysis: A sensitive method for study of diffusion processes in single cells. // Proc Natl Acad Sci USA -1981.-V.78.-P. 962-966.

119. Wachsmuth M., Weidemann T., Muller G., Hoffmann-Rohrer U.W., Knoch T.A., Waldeck W, Langowski J. Analyzing intracellular binding and diffusion with continuous fluorescence photobleaching. // Biophys. J. 2003. - V.84. - P. 3353-3363.

120. Lippincott-Schwartz J., Altan-Bonnet N., Patterson G.H. Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells. // Nat Cell Biol Suppl 2003. - P. S7-14.

121. Haustein E., Schwille P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. // Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2007. - V.36. - P. 151-169.

122. Wachsmuth M., Caudron-Herger M., Rippe K. Genome organization: Balancing stability and plasticity. // Biochim Biophys Acta. 2008. - V. 1783. - P. 2061-2079.

123. Li G.W., Elf J. Single molecule approaches to transcription factor kinetics in living cells. // FEBS Lett. 2009. - V.583. - P. 3979-3983.

124. Siebrasse J.P., Grunwald D., Kubitscheck. U. Singlemolecule tracking in eukaryotic cell nuclei. //Anal Bioanal Chem. 2007. - V.387. - P. 41-44.

125. Scholz M., Gross-Johannbocke C., Peters R. Measurement of nucleocytoplasmic transport by fluorescence microphotolysis and laser scanning microscopy. // Cell. Biol. Int. Rep. 1988. - V. 12. - P. 709-27.

126. Koppel D.E., Axelrod D., Schlessinger J., Elson E.L., Webb W.W. Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility. // Biophys. J. 1976. - V. 16. - P. 1315-1329.

127. Dundr M., Hoffinann-Rohrer U., Hu Q., Grummt I., Rothblum L.I., Phair R.D., Misteli T. A kinetic framework for a mammalian RNA polymerase in vivo. // Science 2002. -V.298.-P. 1623-1626.

128. Shav-Tal Y., Darzacq X., Shenoy S.M., Fusco D., Janicki S.M., Spector D.L., Singer R.H. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. // Science 2004. - V.304. - P. 1797-1800.

129. Shaw S.L., Kamyar R., Ehrhardt D.W. Sustained microtubule treadmilling in Arabidopsis cortical arrays. // Science 2003. - V.300. - P. 1715-1718.

130. Howell B.J., Moree B., Farrar E.M., Stewart S., Fang G., Salmon E.D. Spindle checkpoint protein dynamics at kinetochores in living cells. // Curr. Biol. 2004. - V.14. - P. 953-964.

131. Patterson G.H., Knobel S.M., Sharif W.D., Kain S.R., Piston D.W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. // Biophys. J. -1997. V.73. - P. 2782-2790.

132. Partikian A., Olveczky B., Swaminathan R., Li Y., Verkman A.S. Rapid diffusion of green fluorescent protein in the mitochondrial matrix. // J. Cell. Biol. 1998. - V.140. - P. 821-829.

133. Adams C.L., Chen Y.-T., Smith S.J., Nelson W.J. Mechanisms of epithelial cell-cell adhesion and cell compaction revealed by high-resolution tracking of E-cadherin-green fluorescent protein. // J. Cell. Biol. 1998. - V.142. - P. 1105-1119.

134. Houtsmuller A.B., Vermeulen W. Macromolecular dynamics in living cell nuclei revealed by fluorescence redistribution after photobleaching. // Histochem. Cell. Biol. 2001. -V.115.-P. 13-21.

135. Sprague B.L., McNally J.G. FRAP analysis of binding: proper and fitting. // Trends Cell Biol. 2005. - V. 15. - P. 84-91.

136. Kao H.P., Abney J.R., Verkman A.S. Determinants of the translational mobility of a small solute in cell cytoplasm. // J. Cell Biol. 1993. - V.120. - P. 175-184.

137. Verkman A.S. Diffusion in cells measured by flourescence recovery after photobleaching. In: Marriott G. and Parker I., editors. Biophotonics, Part A: Methods in Enzymology. New York.: Academic Press, 2003. - V. 360. - P. 635-648.

138. Carrero G., McDonald D., Crawford E., de Vries G., Hendzel M J. Using FRAP and mathematical modeling to determine the in vivo kinetics of nuclear proteins. // Methods -2003.-V.29.-P. 14-28.

139. Blonk J.C.G., Don A., Van Aalst H., Birmingham J.J. Fluorescence photobleaching recovery in the confocal scanning light microscope. // J. Microsc. 1993. - V.169. - P. 363374.

140. Braeckmans K., Peeters L., Sanders N.N., De Smedt S.C., Demeester. J. Three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching with the confocal microscope. // Biophys. J. 2003. - V.85. - P. 2240-2252.

141. Lopez A., Dupou L., Altibelli A., Trotard J., Tocanne J. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. // Biophys. J. 1988. - V.53. - P. 963-970.

142. Wedekind P., Kubitscheck U., Heinrich O., Peters R. Line-Scanning microphotolysis for diffraction-limited measurements of lateral diffusion. // Biophys. J. 1996. - V.71. - P. 16211632.

143. Kubitscheck U., Wedekind P., Peters R. Three-dimensional diffusion measurements by scanning microphotolysis. // J. Microsc. 1998. - V.192. - P. 126-138.

144. Periasamy N., Verkman A.S. Analysis of fluorophore diffusion by continuous distributions of diffusion coefficients: Application to photobleaching measurements of multicomponent and anomalous diffusion. // Biophys. J. 1998. - V.75. - P. 557-567.

145. Lele T.P., Ingber D.E. A mathematical model to determine molecular kinetic rate constants under non-steady state conditions using fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). // Biophys. Chem. 2006. - V.120. P. 32 - 35.

146. Kang M., Kenworthy A.K. A closed-form analytic expression for FRAP formula for the binding diffusion model. // Biophys. J. 2008. - V.95. - P. L13-L15.

147. Tsay Т., Jacobson K.A. Spatial Fourier analysis of video photobleaching measurements, principles and optimization. // Biophys. J. 1991. - V.60. - P. 360-368.

148. Berk D.A., Yuan F., Leunig M., Jain R.K. Fluorescence photobleaching with spatial Fourier analysis: measurement of diffusion in light-scattering media. // Biophys. J. 1993. -V.65.-P. 2428-2436.

149. Mueller F., Wach P., McNally J.G. Evidence for a common mode of transcription factor interaction with chromatin as revealed by improved quantitative fluorescence recovery after photobleaching. // Biophys. J. 2008. - V.94. - P. 3323-3339.

150. Jonsson P., Jonsson M.P., Tegenfeldt J.O., Hook F. A method improving the accuracy of fluorescence recovery after photobleaching analysis. // Biophys. J. 2008. - V.95. - P. 53345348.

151. Строкотов Д.И. Изучение характерных особенностей морфологии лимфоцитов по светорассеянию. Новосибирск, 2006. - 43 с.

152. Thurau A.M., Schylz U., Wolf V., Krug N., Schauer U. Identification of eosinophils by flow cytometry. // Cytometiy 1996. - V.23. - P. 150-158.

153. Феофанов А.В. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия с возможностью спектрального анализа в биологических исследованиях. // Успехи биологической химии 2007. - V.47. - Р. 371-410.

154. Ivanov K.L., Lukzen N.N. Diffusion influenced reactions of particles with several active sites. // The Journal of Chemical Physics - 2008. - V.128. - P. 155105.

155. Колесникова И.В. Исследование формы тромбоцитов с помощью сканирующей проточной цитометрии. Новосибирск, 2006. - 35 с.

156. Maltsev V.P., Semyanov К.A. Characterisation of bio-particles from light scattering, inverse and II 1-posed problems series. Utrecht.: VSP, 2004. - 135 P.

157. Soini J.T., Chernyshev A.V., Hanninen P.E., Soini E., Maltsev V.P. A new design of the flow cuvette and optical set-up for the Scanning Flow Cytometer. // Cytometry 1998. -V.31.-P. 78-84.

158. Hoekstra A., Maltsev V.P., Videen G., (eds.). Optics of Biological Particles. -Netherlands.: Springer Dordrecht, 2007. - 284 P.

159. Yurkin M.A. Discrete dipole simulations of light scattering by blood cells. PhD thesis. -Amsterdam.: University of Amsterdam, 2007.

160. Dunn A.K. Modelling of light scattering from inhomogeneous biological cells. In: Hoekstra A.G., Maltsev V.P., and Videen G., (eds.). Optics of Biological Particles, London.: Springer, 2006. - P. 19-29.

161. Bainton D.F. Neutrophilic leukocyte granules: from structure to function. // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. - V.336. - P. 17-33.

162. Zharinov A.E., Tarasov P.A., Shvalov A.N., Semyanov K.A., van Bockstaele D.R., Maltsev V.P. A study of light scattering of mononuclear blood cells with scanning flow cytometry. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transf. 2006. - V.102. - P. 121-128.

163. Dunn A., Richards-Kortum R. Three-dimensional computation of light scattering from cells. // IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 1996. - V.2. - P. 898-905.

164. Bjerrum O.W. Human neutrophil structure and function with special reference to cytochrome b559 and beta 2-microglobulin. // Dan. Med. Bull. 1993. - V.40. - P. 163-189.

165. Brederoo P., van der Meulen J., Mommaas-Kienhuis A.M. Development of the granule population in neutrophil granulocytes from human bone marrow. // Cell Tissue Res. 1983. -V.234.-P. 469-496.

166. Siiman O., Burshteyn A., Concepción O., Forman M. Competitive antibody binding to soluble CD 16b antigen and CD 16b antigen on neutrophils in whole blood by Flow Cytometry. // Cytometry 2001. - V.44. P. 30-37.

167. Sklar L.A., Finney D.A. Analysis of ligand-receptor interactions with the fluorescence activated cell sorter. // Cytometry 1982. - V.3. - P. 161-165.

168. Williams Т.Е., Nagarajan S., Selvaraj P., Zhu C. Concurrent and independent binding of Fcg receptors Ha and Illb to surface-bound IgG. // Biophys. J. 2000. - V.79. P. 1867-1875.

169. Temkin S.I., Yakobson B.I. Diffusion-controlled reactions of chemically anisotropic molecules. // Phys. Chem. 1984. - V.88. - P. 2679-2682.

170. Burshtein A.I., Doktorov A.B., Morozov V.A. Contact reactions of randomly walking particles. Rotational averaging of chemical anisotropy. // Chem. Phys. 1986. - V.104. - P. 1-18.

171. Лолор-младший Г., Фишер Т., Адельмаи Д., (ред.) Клиническая иммунология и аллергология. Москва.: "Практика", 2000.

172. Ibrahim М., Gongwei Z., Junjie Z. Determination of diffusion coefficients of proteins by flow injection analysis and its application to estimation of molecular masses of proteins. // Instrumentation science and technology 1998. - V.26. - P. 333-341.

173. Brenner H. Coupling between the translational and rotational brownian motions of rigid partieles of arbitrary shape. // J. Colloid. Interface Sci. 1967. - V.23. - P. 407-436.

174. Bongrand P. Ligand-receptor interactions. // Rep. Prog. Phys. 1999. - V.62. - P. 921968.

175. Bulinski J.C., Odde D.J., Howell B.J., Salmon E.D., Waterman-Storer C.M. Rapid dynamics of the microtubule binding of ensconsin in vivo. // J. Cell Sci. 2001. - V.l 14. - P. 3885-3897.

176. Coscoy S., Waharte F., Gautreau A., Martin M., Louvard D., Mangeat P., Arpin M., Amblard F. Molecular analysis of microscopic ezrin dynamics by two-photon FRAP. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V.99. - P. 12813-12818.

177. Sprague B.L., Pego R.L., Stavreva D.A., McNally J.G. Analysis of binding reactions by fluorescence recovery after photobleaching. // Biophys. J. 2004. - V.86. - P. 3473-3495.

178. Saltzman W.M., Radomsky M.L., Whaley K.J., Cone R.A. Antibody diffusion in human cervical mucus. // Biophys. J. 1994. - V.66. - P. 508-515.

179. Phiilles G.D.J. Translational diffusion coefficient of macroparticles in solvents of high viscosity. // J. Phys. Chem. 1981. - V.85. - P. 2838-2843.

Информация о работе

Орлова, Дарья Юрьевна
кандидата физико-математических наук
Новосибирск, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы