Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Катализируемый цитохромом Р-450 синтез иммуногенных конъюгатов окисленных метаболитов 3,4-бензпирена с белками

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Катализируемый цитохромом Р-450 синтез иммуногенных конъюгатов окисленных метаболитов 3,4-бензпирена с белками"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

УДК 612.014.1:591.436 На правах рукописи

Лисицына Вера Борисовна

КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ЦИТОХРОЫОМ Р-450 СИНТЕЗ ИММУНОГЕНШХ КОНЬЮГАТОВ ОКИСЛЕННЫХ МЕТАБОЛИТОВ 3,4-БЕКЗПЙРЕНА С БЕЛКАМИ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена на кафедре биохимии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета.

Научный руководитель: академик РАМН, профессор АРЧАКОВ Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор НИКОЛАЕВ Александр Яковлевич,

доктор медицинских наук, профессор ЗТЕШЕВ Борис Сергеевич.

Ведущая организация - Московский медицинский стоматологический институт им.Н¿А.Семашко.

Защита диссертации состоится ..............1993 г.

в 14 час. на заседании специализированного Ученого Совета К 084 14 05 РГМУ по адресу: 117437, Москва, ул.Островитянова, I.

Автореферат разослан ................1993 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета,.

кандидат медицинских наук КЛУШШ1А Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАКОТН

Актуальность проблемы.

Цитохром P-450-содержащая монооксигеназная система мшсросом печени является ключевой ферментной системой, отвечающей за окисление низкомолекулярных чуяеродных соединений, с последующим удалением их метаболитов из организма экскреторными органами [Archakov A.I. & Bachxnanova G.I., 1990; Parke et al., 1991]. В связи с вазмостыз реакций гидрокеилирования, протекающих с участием цитохрома Р-450, исследователями уделяется большое внимание искусственным системам, позволяющим моделировать реакции микрссомального окисления. Обычно в этих системах в качестве косубстрата применяется нэ hadph, а гидроперикись кумила (ГПК) илл перекись водорода (HgOg), что позволяет использовать содержащийся в них активный кислород для непосредственного окисления низкомолекулярных субстратов [Метелица Д.И., 1982; Карузина H.H. я соавт., 1983; Archakov A.I. & Bachmanova _ G.I., 1990].

Наряду с хорошо изученной детоксицирувдей функцией монооксигеназной системы, было установлено,- что в процессе окисления возможно образование высокотоксичных промежуточных метаболитов, способных ковалентно связываться с биомакромолекулами (нуклеиновыгя! кислотами, белками, а также с фосфолишадшм бислоем мембран) [Арчаков А.И. и соавт, 1980; Ковалев И.Е., Полевая O.D., 1985; Gliiete, 1974, Lutz, 1979; Catkins, 1990; Johnson, 1992; L'urrau et al,1992]. Особенно хорошо этот процесс изучен на примере полициклических ароматических углеводородов, в частности 3,4-бензпирена [Nebert et al., 1982].

Ковалентпая модвфякация реакционноспособными метаболитами низкомолекулярных соединений биомакромолекул . может приводить к мутагенезу, канцерогенезу, некрозу тквней и' развитию других патологических состояний ÎAmôs et al., 1975; Nebert & Jensen, 1979; НШег & Miller, 1982; Cuengerioh et al.,1990; Miles & Wolf, 1991; Eberhart et al.,1992). Так например, в случае ковалентной модификации метаболитами низкомолекулярннх соединений водорастворимых белков образуется конъюгированный антиген, который, попадая в кровь, индуцирует, согласно теории Лацдптейнера [Land3teiner, 1936], синтез антител, специфичных к

низкомолекулярной детерминанте. Протекание подобной реакции в организме экспериментальных кивотных било продемонстрировано в работе Арчакова А.И. и соавт. [1980]. Как следствие зтого процесса возможно возникновение аллвргичеасих заболеваний.

Вместе с тем, необходню отметить, что в процессе такой модификации также возможно изменение иммунологических свойств высокомолекулярного соединения, что вызовет индукцию синтеза антител, специфичных к модифицированному макроносителю. Цэль и задачи исследования.

Целью данной работа явилось получение конъюгатов продуктов окисления 3,4-бензпирена с Оелками, катализируемое цитохромом Р-450, с последующим анализом иммуногенности образующихся конъюгированных антигенов.

Эта цель предусматривает решение следующих задач:

1. Сравнение скоростей окисления 3,4-Сензпирена (БП) микротомами контрольных и индуцированных животных в полной и шунтированных системах.

2. Сравнение скоростей окисления 3,4~0«нзпирена в микросомах и монооксигенззных растворимых реконструированных системах (РРС) при использовании в качестве косубстратов NADPH, ГПК и Н202.

3. Нахоадениа условий наиболее интенсивного . ковалентного связывания метаболитов 3,4-бензпирена с кроличьим сывороточным альбумином (КСА).

4. Синтез конъюгатов метаболитов БП с КСА и БП с микросомольной фракцией печени кролика (МК^р), катализируемый цитохромом Р-450, в присутствии косубстрата,' при которог. наблюдается наиболее интенсивное связывание мотаболито! 3,4-бенэпирена с КСА.

5. Определение иммуногенности конъюгатов матаболито£ 3,4-Сензшрена с КСА или микросомами кролика по появлению i циркулирующей крови как антител к 3,4-бензпирену, так i лимфоцитов, несущих на своей поверхности рецепторы, связывании» БП.

6. Выявление антител к высокомолекулярному носителю (КСА ковалентно модифицированному метаболитами БП.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В результате проведенных экспериментов но изучени

г

скорости окисления Б!1 юифосомвми различных типов индукций и в РРС, а также исходя из данных по измерению копало итого связывтпш метаболитов БП с КСА, показано, что БП относится к грушо субстратов, механизм окяслсшя которых различен в шунтированных системах и в полном монооксигеназной цикле. Показано,' что максимальное количество метаболитов БП, связиващихся с альбумином, наблюдается гфи добавлении в среду инкубации микросом печени кроликов, индуцированных 3-метилхолантреном (ЮС), а в качестве кофактора - MADPH.

Выявлено, что иммунизация кроликов коваленогносвязанными конъюгатами БП-КСА и БП-МККр приводит к появлению антител,' специфичных к БП не только в крови животных, но и на лимфоцитах.

Установлено, что при иммунизации кроликов ковалентносвязан-ными конъюгатами БП-КСА или БП-МК^, синте зированными в микросомальной монооксигеназной системе, наблюдается синтез антител, не только к низкомолекулярной детерминанте» но и к аллогенному высокомолекулярному носителю (альбумину), модифицированному продуктами окисления БП.

Основная часть работы представляет интерес в понимании функциональной роли цигохрома Р-450 печена животных и человека. Экспериментальные подхода данной работа в настоящее время применяются в ряде лабораторий, занимающихся исследованием микросомальной монооксигеназной системы печени и окислением ксенобиотиков, а также в иммунологических лабораториях. Результаты работы используются в учебном процессе в спецкурсах на кафедре биохимии медико-биологического факультета РГМУ..

Апробация диссертации. Результаты исследований были доложены на Всесоюзных конференциях "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среда" (Новосибирск, 1987), "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), на 7-ой Международной конференции "Biochemistry & Biophysics of Cytochrome P-450; Structure St Function, Bioteohnologioal & Ecolofical Aspects" (Москва, 1991), а также на совместном заседании учебно-научного комплекса кафедры биохимии МВФ 2-го МОЛКЙ им.Н.Й.Пирогова и института биологической и медицинской химии АМН СССР (26 июня 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 .печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 1йб

страницах машинописного текста, включая 12 рисунков и 12 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспериментальной части с результатами исследования,, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фракцию МК получали из гомогената печени беспородных кроликов-самцов методом дифференциального центрифугирования.

Концентрацию цитохроыа Р-450 определяли по методу Отита и Sato [1964], белка по методу lowry et al. [1951].

Выделение кроличьего сывороточного альбумина проводили методом гель-фильтрации [Остэрман Л.А., 1985].

Препараты очищенных цитохромов Р-450 - 2В4, 1À2, а также KADPH-цитохроы P-450-редуктаза были любезно предоставлены препаративной группой НИЛ экологии, токсикологии и метаболизма лекарствеиных препаратов при кафедре биохимии МВФ Р1Т.1У (к.б.н.Коэном Я.М. и сотр.).

Реконструкцию РРС проводили по . методу Archakov A.I.& Baohmanova G.I. 11990].

Скорость гидроксилирования ВП определяли по убыли флуоресценции зтого субстрата [Yang & Kicha, 1978] на спектрофлуориметра Baird Nova (Англия).

' Реакцию ковалентного связывания метаболитов БГ1, а также определение количества метаболитов БП, ковалентно связавшихся с высокомолекулярным носителем проводили по методу, описанному Арчаковым А.И. и соавт. 11980).

Иммунизацию животных ковалентносвязанными конъюгатами БП-КСА и БП-МК^ проводили, как описано ранее IКовалев И.Е., Полевая O.D., 1981]. -

Количество лимфоцитов и антител периферической крови, специфически связывающих БП и КСА, определяли по методу, описанному Чередеевым A.H. (I976J.

Иммунный ответ кроликов на введение конъюгированного антигена БП-КСА определяли по реакции пассивной гемагглютинации (Говалло В.И., 1967].

Статистическую обработку результатов проводили по критерию I Сгыэдента [Рокпцкий П.Ф., 1973]. Достоверными считали результаты пр:{ р<0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнительный анализ скоростей реакции окисления 3,4-бензпирбпа в нпсросомах в полной НАПРН-зависимой и шунтированных поронсвдазшх системах

На первом этапа бия проводе» сравнительный анализ скорости* 0;С!СЛ9ШШ БП кикросомакл индуцированных и квиндуцировашщх ЗЯШОТ1ШХ в полной и шунтированных системах. При изучении скорости ншрн-зависпшго окислания БП контрольными микросомами (Кщ) (Рис.1, кривая I), а тангэ шпсросомами, выделенными из печени шгоотшх, предварительно получавших фенобарбитал (ФБщ) (Рис.1, кривая 2) или 3-1'атилхолантреп (МХщ) (Рис.1, кривая 3),. было установлено, что наиболее активными при окислении БП оказались МХ^ (Рис.1, кривая 3).

Аналогичные эксперименты были проведены при использовании в качество косубстрата ГПК (Ряс.2) и 1у>2 (Рис.3). В этих случаях достоверных различий в скорости окисления БП контрольными и индуцированными мякросомамя но наблюдалось.

На рисунках 1,2,3 приведены наиболее типичные кривые окисления БП пра добавлении в среду инкубации шшрн, ГПК или Н2О2 в присутствии контрольных кикросом и минросом различных типов индукции.

Полученные результаты подтварвдавтся данными по измерению начальных скоростей НАОРН-, ГПК- и }^02-зависимого окисления 3,4-бензпирена, в пересчете на мг белка, контрольными микросомами и микросомами, выделеинши из животных, предварительно получавших фенобарбитал (4Б) пли З-мвтилхолантрен (МХ) (Табл.1). Хорошо видно, что максимальная скорость окисления БП наблюдается в том случае, когда в среде инкубации присутствуют микросомы, выделенные из кивотных, получавших МХ, а в качестве кофактора используется наври.

Иные выводы о скорости окисления БП ?дакрссомами различных типов индукции можно сделать, сравнивая скорость окисления БП в

Рисунок I

Окисление 3,4-бензпирена контрольными м индуцированными микросомами в присутствии МБРН

Примечание: I - Кщ, 2 - ФВщ, 3 -МХщ* инкубационная смесь, объемом 0,7 мл, содержала 50 мМ Ка-фосфагный буфер (рН 7,4), 0,035 мг Овлка микросом. 1,1 мкМ раствор БП; реакцию инициировали добавленгем 0,04 мМ ыш>н. '-относительные единицы флуоресценции.

Рисунок 2

Окпслошю 3,4-бенгшфзна контрольными и индуцированными •кикросомами в присутствии ГПК

¡Зржэчзтв: I - К^, 2 - 3 -ИХ.^; инкубационная смесь, объемом 0,7 мл, содержала 50 иМ Пан£осфатный буфер (рН 7,4), 0,035 мг белка гякросо!,?, 1,1 мкМ раствор БП; реакцию инициировали добавлением 0,2 мМ ГПК. Относительные едашаэ флуоресценции.

Рисунок 3

Окисление 3,4-Оензпирена контрольными и индуцированными минросомами в присутствии ^02

Примечание: I - К^, 2 - 3 инкубационная смесь,

объемом 0,7 мл, содержала 50 мМ Иа-фосфатный буфер (рН 7,4), 0,035 мг белка макросом, 1,1 мкМ раствор БП; реакцию инициировали добавлением 3 мМ "^относительные единицы флуоресценции.

Таблица I

Окисление 3,4-бензпирена контрольными и индуцированными ыикросомами в присутствии НН)РН, ГПК и Н^

скорость окисления 3,4-бензпирена нмоль БП х мг белка~*х мин

Содержание цитохромэ Р-450 нмоль/мг белка

Вид индукции

-I

НАСРИ

ГПК

1 "2°2

% ®шс

0,8±0,1 4,4±0,7 4,7±0,8 2,340,6 Б,ПО,9 4,941,6 в,6±0,6 5,2±0,9 3,7±0,7

0,5±0,2 1,5±0,2 1,1*0,1

Примэчоше: инкубационная смесь, объемом 0,7 мл, содержала 60 мМ йа-фзсфатшй буфер <рН 7,4), 0,035 иг белка микросом, 1,1 мкЦ раствор БП; реакцию инициировали добавлением 0,04 НАОРН, ИЛИ 0,2 м!1 ГПК, ИЛИ 3 и!1 Н^. '

Таблица 2

Окисление 3,4-Оэнзпирена контрольными в индуцированными шкросомаия в присутствии шэтв, ГПК и

Вид ИНДУКЦИЯ скорость окисления ш шюль БП х пмоль дат.Р-450"] -I ■х мин

• ИАИРЯ ГПК ¥>2

1СМК 1,6*0,6 8,8±3,1 9,411,9

% 1,5±0,2 3,4±0,4" • 3,3±1,0

6,520,5 4,7±1,0 3,4Ю,8

Примечание: инкубационная смэсь, объемом 0,7 мл, содержала 50 мМ

На-фосфатный буфер (рК 7,4), 0,035 от белка микросом, 1,1 мкМ раствор БП, реакцию инициировали добавлением 0,04 мы НАВРИ, или 0,2 мМ ГПК, или 3 мМ Я^. ,

пересчете на нмоль цитохрома Р-450 (Табл.2). Если сравнивать КАВРН-зависимое окисление БП, то оказывется, что достоверных различий между скоростью окисления БП контрольными микросомами и микросомами, выделенными из животных, получавших ФВ, нет. Скорость окисления БП микросомами, выделенными из животных, получавших МХ, выше в 4 раза, чем в контрольных микросомах. При ГПК- и ^02-зависимом окислении 3,4-бензпмрена наблюдается обратное соотношение. Нет достоверных различий в скорости окисления БП в случае использования макросом, выделенных из животных, получавших ФБ или ИХ, а скорость окисления БП контрольными микросомами в 2-3 раза выше.

Следует также отметить характерную особенность в соотношении скоростей ыаврн-, ГПК- и {^(^-зависимого окисления БП в присутствии контрольных микросом и микросом печени животных, получавших ФБ. Как в пересчете на ыг белка (Табл.1), так и на нмоль цитохрома Р-450 (ТаОл.2), скорость окисления БП была выше при добавлении в среду инкубации ГПК или Н^ по сравнению со скоростью окисления этого субстрата при использовании в качестве донора электронов набрн.

Обратное соотношение скоростей окисления БП при добавлении в среду инкубации различных косубстратов наблюдается в присутствии микросом, выделенных из животных, получавших МХ.

Экспериментальные данные позволяют сделать вывод максимальная скорость окисления БП в пересчете на мг белка (Табл.1) наблюдалась при использовании микросом, выделенных из животных, предварительно получавших МХ в присутствии ИАОРН, а в пересчете на нмоль цитохрома Р-450 - контрольных микросом при добавлении ГПК или

Результаты, полученные с использованием контрольных микросом и микросом с индукцией цитохромов Р-450 2В4 и 1А2, свидетельствуют о различных механизмах окисления БП в микросомалышх монооксигеназных и шунтированных системах.

Окисление 3,4-Оензпирена в монооксигеназных растворимых реконструированных системах '

Для подтверждения вывода, сделанного в предыдущей главе, представляло интерес выяснить, соотношения скоростей окисления

БП в монооксигеназных растворимых реконструированных системах, содержащих различные цитохромы Р-450 в присутствии nadph, гпк и HgOg. PPC представляют собой системы, включающие в себя высокоочицегаше препараты цитохромов Р-450 2В4 или 1А2, NADPH-специфичный флаюпротеид и неионный детергент эмульген 913. IBaohmanova G.I. et al., 1986; 19S7]).

Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют, прежде всего, о возможности гидроксилирования БП в РРС, содержащих как 2В4, так и 1А2. Хорошо видно, что скорость окисления этого субстрата при использовании различных косубстратов на порядок, ниже, чем в цитохром P-450-зависимой системе, локализованной в мембране макросом.

Рассматривая соотношения скоростей окисления БП при кикросокальном окислении и в РРС, следует отметить, что также, как и в мжросомах, скорость окисления БП в РРС неодинакова в присутствия различных косубстратов. Как и в микросомальной фракции, индуцированной MX, наибольшая скорость окисления ЕП наблюдается в РРС, содерзащэй 1А2, при использовании в качестве косубстрата ffADPH. Скорости окисления БП микросомами, индуцированными ®3 или MX, при использовании ГПК или HgOg, одашакова. В РРС, содержащей 2В4, при чспользовании в качестве косубстрата ГПК, скорость окисления БП в 2,3 раза больше по сравнению с РРС, содержащей 1А2. В случае использования в этих системах в качестве косубстрата HgOj наблюдается иная картина. РРС, содержащая 2В4, окисляет БП со скорость» в 1,5 раза меньшей, чем РРС, содеряазая 1А2..

. Следовательно, результаты, полученные в опытах по изучению скоростей окисления БП в РРС при использовании различных косубстратов в сравнении с микросомами, подтверждают предположение о различных механизмах окисления БП в полной и шунтированных системах.

Ковалентное связывание метаболитов 3,4-бензпирена о КСА в полной монооксигеназной и шунтированных системах

Одной из основных задач данного исследования являлось создание оптимальных условий для синтеза конъюгатов . БП с биомакромолекулами. Вследствие этого, были проведены

Окисление 3,4-бензпирена в полной микросомальной моноосигенвзноЯ системе, шунтированных системах и в монооксигеназных растворимых реконструированных системах

Скорость окисления 3,4-бензпирена нмоль БП х нмоль цит.Р-450_1х мин-1

Косубстрат Микросомы

®%к

NABPH I,5г0,2 6,0±0,5

ГПК 3,5±0,4 4,7±1,0

f^Og 3,4±I,0 3,4î0,8

РРС

2В4 1А2

0,3t0,I 0,6i0.02

0,9i0,I 0,4i0,10

0,4±0,I 0,6*0,03

l

%

Примечание: инкубационная смесь, объемом 0,7 мл, содержала 50 мМ ка-фосфатный буфер (рН 7,4), 0,035 мг белка макросом (0,07 нмоль цит.Р-450 ДЛЯ МК^ и 0,042 нмоль цит.Р-450 для МК|дг) или (в случае РРС) 0,07 нмоль 2В4 или 0,042 нмоль 1А2, 1,1 мкЫ раствор БП; РРС содержали 0,025 % эмульген 913: реакцию инициировали добавлением 0,04мМ kadph (в случае РРС в среду инкубации добавляли nadph-зависимую цитохром Р-4Б0 редуктазу в молярном соотношении: 2В4 О А2):NADJPH-зависимая цитохром Р-450 редуктаза:эмульген 913 = 1:1:200), или 0,2 Ш ГШ, или 3 Mil HgOg. При окислении БП в РРС в отсутствие неионного детергента эмульгена 913 (система используемая в качестве контроля для этих экспериментов) каталитическая активность изолированных форм цитохрома Р-450 не наблюдалась.

Ковалентное связывание метаболитов (14с]-3,4-бензпирена с альбумином в полной монооксигвназной и шунтированных системах в присутствии микросом, выделенных из животных, получавших

3-М9 тилхолантрен

Количество метаболитов [14С]-3,4-бензгшрен8,

Косубстрат ковалентно связавшихся с КСА

нмоль БП / мг белка х час

MADPH 50 ± 0,6

ЧЪ 30 t 0,2

ГПК 20 ± 0,2

Примечание: инкубационная смесь, объемом 0,5 мл, содержала 50 мМ ' Na-фюсфатный буфер (рН 7,4), 150 мМ КС1, 0,6 мМ EDTA, 10~4М (7,10"14С]-3,4-бензпирена, 0,5 % КСА, 1,5 мг белка микросом; реакцию инициировали добавлением 3 мМ NADPH, или 0,2 мМ ГПК, или 3 Л Kj02.

эксперимента по изучению ковалентного связывания продуктов окисления БП с КСА в присутствии набрн, ГПК или Н^. При атом в смесь инкубации добавляли микросомы, при которых наблюдалась максимальная скорость окисления БП, т.е. микросомы с индуцированным цитохромом Р-450-1А2, специ£ичиым для окисления ПАУ.

Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что больше всего метаболитов БП способно ковалентно связываться с альбумином в присутствии наорн . При использовании в качестве косубстрата Н^ наблвдается уменьшение количества продуктов окисления БП, ковалентно связавшихся с КСА в 1,7 раза, а ГПК в 2,5 раза. Это согласуется с результатами экспериментов по исследованию скорости окисления БП микросомами с индуцированной арнлпщроксилазой. Как в пересчете на мг белка (табл.1), так и в пересчете на нмоль цитохрома Р-450 (табл.2) наблюдается уменьшение скорости ГШ- и Й^-зависимого окисления БП по сравнению с его гшэРН-зависиим окислением в 1,3 раза и в 1,8 раза, соответственно.

Отсутствие корреляции между количеством метаболитов БП, ковалентно связавшихся с КСА и скоростью окисления . БП в присутствии х лзрн, ГПК или Н^02 может быть связано с уменьиеннем доли высокоактивных продуктов окисления БП, образующихся в шунтированных системах.

Следовательно, сравнительный анализ количества ковалентно-связашшх метаболитов БП с КСА со скорстью ошсления Ш в полной и шунтированных системах еще раз свидетельствует в пользу предположения о различных механизмах окисления БП при использовании в качестве косубстратов НАБРН, ГПК и

Таким образом, исходя из полученных данных, представленных в настоящей главе и, учитывая результаты экспериментов, описанных в предыдущее главах, для синтеза конъюгатов метаболитов БП с биомакромолекулвш, с целью изучения индукции антител как против низкомолекулярной детерминанты, гак и против высокомолекулярнога носителя, наиболее целесообразно использование микросш. выделенных из животных, предварительно получавших МХ при добавлении в среду инкубации в качестве кофактора 1Ш)РН.

Образование антител к 3,4-бензпирену в ответ на введение животным конъюгатов БП с КС А или БП с Шип.

Появление антител, способных связывать БП, на лимфоцитах и в сыворотке крови кроликов, регистрировали через 2 и 4 месяца после иммунизации животных конъюгатами БП-КСА или БЛ-МККр, синтезированными с помощью цитохром Р-450-зависимой юнооксигеназной системы. При изучении БП-связывающей способности лимфоцитов периферической крови измерял! количество связанного [14С]БП ЛИМфОЦИТЕМИ кивотных опытной и контрольной групп (табл.5,6). У трех из четырех иммунизированных конъюгатом БП-КСА и у двух из четырех иммунизированных конъюгатом БП-МККр кроликов выявлено достоверное увеличение связывания БП лимфоцитами. Отсутствие иммунного ответа на данное соединение у некоторых кивотных обусловлено, по-видимому, хорошо известным широким варьированием реакции иммунизированных животных на введете конъюгировешшх антигенов [Ковалев И.Е., Полевая О.Ю., 19851.

Аналогичные результаты наблюдались после иммунизаци животных конъюгатом БП-МККр и при выявлении антител к БП в сыворотке крови животных (табл.7,8). В этих экспериментах увеличение способности сыворотки крови сязывать БП было обнаружено у тех же животных.

На основании тестирования способности лимфоцитов периферической крови и сыворотки крови связывать [14С]БП, можно сделать заключение о том, что ковалентное связывание БП с аллогенным альбумином кролика и мембранами эндоплазматического ретикулума, происходящее в микросомальной системе окисления, приводит к формированию конъюгированных антигенов.

Образование антител к КСА при введении кроликам коныогага БП с КСА, полученного при окислении БП.

Как уже предполагалось ранее, ковалентное связывание низкомолекулярного соединения с биомакромолекулами альбумина может вызывать ковалентную модификацию последнего, что, в свою очередь, приведет к изменению его структуры с возможным появлением новых антигенных детерминант.

3,4-бевзпирен-связываодие свойства лимфоцитов периферической крови животных, иммунизированных коныогатом БП-КСА

Иммунизация коныогатом БП-КСА Количество связавшегося [*4с]-БП, %

Через 2 месяца после иммунизации Через 4 месяца после иммунизации

1 2 3 4 Контроль I Контроль II 39,04077 ....... 33,541,9. 59,941,91 49,842,3 39,3±1,1 37,5±0,9 ...... 47,1Ш,Ь, 72,740,5! 71,541,7* 38,7±1,3 39,8±1,1

Примечание: Результаты представлены в %% по отношению к общему количеству внесэнной в пробу метки; контроль 1-интактные животные; контроль и-швотшв, которым вводили не связанный с белком БП в смеси с НСА в дозе, соответствующей содержанию этих компонентов в конъюгаге БП-КСА; приведены средние величины со стандартной ошибкой; »-соответствует статистически достоверным различиям между опытными и контрольными группами (р<0,05).

Таблица 6

3,4-бенз1шрен-связивающие свойства лимфоцитов периферической крови животных, иммунизированных коныогатом Й1-МКК1)

Иммунизация конъюгатом БП-МККр Количество связавшегося [14с]-БП, X

Через 2 месяца после иммунизации Через 4 месяца после иммунизации

1 2 3 4 Контроль I Контроль II 46,541,3« 49,040,7! 46,641,0" 39,3±0,Г 39.341.1 39.341.2 45,340,8, 52,Ш,б! 52,Ш,8 41,541,4 38,741,3 38,140,8

Примечание; Результаты представлены в %% по отношению к общему количеству внесенной в пробу метки; контроль 1-интактные. животные; контроль 1Г-животные, которым вводили не связанный с белком БП в смеси с в

дозе, соответствующей содержанию этих компонентов в конъюгате БП-МККп; приведены средние величины со стандартной ошибкой; «-соответствует статистически достоверным различиям мевду опытными и контрольными группами (р<0,05).

Связывание 114с]-3,4-бепзшгрена сывороткой крови кроликов, иммунизированиях кояыогатом ЕП-КСА

йялунизация конъюгатом БП-КСА Количество связавшегося [14с]3,4-0ензгшрена, %

До иммунизации Чэроз 2 месяца Через 4 месяца после иммунизации после иммунизации

1 2 3 4 8,6±0,5 8,610,3 9,4Ю,4 9,011,3 8,110,3 13,110,3* 13, НО,7 10,4±2,7 8,110,4» 13,9Ю,4, 25,4±0,2

Примечание: Результаты представлены в %% по отношению к общему количеству внесенной в пробу метки; контроль приведены средние величины со стандартной ошибкой; * -соответствует статистически достоверным различиям мэзду опытными и контрольными группами (р<0,05).

Таблица а

Иммунизация конъюгатом вп-мкКт5 Количество связавшегося (14СЬБП, %

До иммунизации через 2 месяца через 4 месяца после иммунизации после иммунизации

I- 2 3 А 6,710,8 7,6Ю,4 8.2Ю.4 8,310,2 8,110,3. 10,910,8 9.210.3 7.410.4 8,4Ю,3, 11,110,5, 12,610,3 8,410,4

Примечание: Результаты представлены в %% по отношению к общему количеству внесенной в пробу метки; контроль приведет средние величины со стандартной ошибкой; * -соответствует статистически достоверным различиям между опытными и контрольными группам (р<0,05).

В связи с этим, представляло интерес выяснить возшгнэсть развития у животных иммунного ответа не только на гаптон (3,4-бензпирен), но и на аллогешшй кроличий альбугсш при иммунизации кроликов ковалентшсвязанным копъвгатом 3,4-бензпирвн-кроличий сывороточный альбумин, синтезированным в микросомальной монооксигеназной системе печени кроликов.

С этой целью проводилось определение уровня антител к альбумину в сыворотка крови кроликов при их шаугозации ковалентносвязанным конъюгатом, содержащим штабодиты 3,4-бвнзпирена и аллогенный кроличий альбумин, синтезированным в микросомальной системе окисления. Из рисунка 4 видно, что после введения конъюгата БП-КСА у подвергавшиеся иммунизации кшотнше наблюдалось появление антител в сыворотка крови к альбушзу. Пра этом, интенсивность синтеза антител, а также срои! шс появления очень индивидуальны и, вероятно, связаны с особенностью шмунноа системы конкретного организма. Так например, у первого и второго кроликов появление антител, связывающихся с альбуьашоы, фиксировалось на протяжении всех сроков эксперимента (7-ой, 30-ый и 45-ый день).

Следует отметить, что на 45 день эксперимента уровень антител против высокомолекулярного носителя у первого кролика несколько уменьшался, у второго кролика оставался не том же уровне. У третьего животного уровень антител возрастал лиаь на 45-ый день после введения конъюгата БП-КСА. Развитие иммунной реакции по отношению к КСА у четвертого кролика во все сроки не наблюдалось.

Таким образом, реакция иммунной системы может развиваться нэ только на низкомолекулярную детерминанту, как было установлено ранее, но и на саму, ковалентно модифицированную кэтаболитама пизкомолекулярного соединения, биомакромолекулу. При этом особенно важно подчеркнуть, что биомакромолекула (в нашем случае альбумин) является аллогешой.

Приобретение новых антигенных свойств биомэкромолекулой в результате ее ковалентной модификации метаболитами низкомолекулярных соединений может лежать в основе одного из объяснений механизма постоянного обновления в организме биомакромолекул этого типа.

Следовательно, учитывая результаты собственных исследований,

о

к

гт

3 4

3 4

1 2

- СП

30

45

3

4

__I

г (сутки)

Рисунок 4

Титры, антител к кроличьему сывороточному альбумину в сыворотке крови кроликов, иммунизированных коньюгатом 3,4-бензпирен~КСА, в реакции пассивной гемагглютинащш

Примечание:'-разведение сыворотки; К-контроль-животные, которым вводили не связанный с белком БП в смеси с КСА, в дозе, соответствующей содержанию этих компонентов в коиыогате БП-КСД; I,2,3,4-животные, которым вводили конъюгат БП-КСА.

Рисунок 5

Возможные пути превращения субстратов в гидроксилазном цикле

Путь I - образование основного продукта реакции гидроксилиро-вания (ЮН) из исходного субстрата (Ш) 1Арчаков А.И.,1975; Рагк,19791; путь 2 - взаимодействие реакционноспособного интермедиата (Н1) с ферментами второй фазы метаболизма низкомолекулярных соединений, увеличивающих гидрофильность онисляемого субстрата [1п^е1тап-Зш2йЬегй, 1980]; пути 3,4 -взаимодействие либо ЙН, либо ВД с цитозолышм рецептором, оквзавающим воздействие на АН-локус ДНК (МеЪегг et а1., 1982); путь 5 - образование из И реакционноспособного метаболита ИМ, ковялентно взаимодействующего с биомакромолекулой [АгсЬакоу АЛ. & Вач1гтапоуа 0.1., 19901

общепринятую схему микросомалыюго окисления низкомолекулярных соединений (рис.5, по данным Ковалева И.Е., Полевой О.Ю. [19851: Hebert et ai.[19821; Archakov A.I. Se Baohroanova G.I., [1990}) можно дополнить еще одним звеном, свидетельствующим об инактивации в процессе реакций гадроксшшрования, протекающих с участием цитохрома Р-450, не только низкомолекулярных соединений, но и биомакромолекул (рис.5, путь 5, выделенное пунктирной рамкой; объяснение остальных путей см. в подписях к рисунку).

Автор выраяает благодарность за методическую помощь при определении антител к 3,4-0ензпирену и альбумину сотрудникам лаборатории ишунофармакологии НПО "Биотехнология" (руководитель д.м.н., проф.Ковалев И.Е.) к.м.н.Шипулиной Н.В. и к.б.н.Томилиной Н.Ю.

вывода

1. Сравнительный анализ скоростей окисления 3,4-Сепзтфэна в полной и шунтированных ».шкросомалышх системах, расггоришх реконструированных системах с уровнем ковалентного связывания метаболитов БП с КСА показал, что окисление БП в полной системе н шунтированных системах происходит по различным нэханизысм.

2. Максимальноо количество метаболитов БП, ковалентно связавшихся с КСА, наблюдается в присутствии микросог.!, выделенных из животных, получавших МХ и при использовании в качестве косубстрата ыаюрн.

3. Иммунизация кивотных конъвгаташ 3,4-бенз1шрен-кроличяй сывороточный альбумин и 3,4-бензпирвн-кроличьи микросош, синтезированными в микросомальной монооксигеназной системе, приводит к образованию антител, связывающих 3,4-бензпирен как в сыворотке крови, так и на лимфоцитах, выделенных из периферической крови.

4. В сыворотке крови кроликов обнаружено появление антител к ковалентно модифицированному кроличьему сывороточному альбумину после иммунизации животных коныогатом 3,4-бензщрвн-кроличкй сывороточный альбумин, синтезированиям в микросомальной монооксигеназной система.

СПИСОК ПУБЛИКАЦЙ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жирнов Г.Ф., Лисицына В.Б., Томилина Н.Ю. Сравнительный анализ реакций гидроксилированмя 3,4-бензпирена (БП) при ШШ-завискмом окислении и в модельных системах. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды". Новосибирск, 1987, с.57.

2. Ковалев И.Е., Шипулшга Н.В., Томилина Н.Ю., Жирнов Г.Ф., Лисицына В.Б. Синтез конъюгированного антигена Оенз(а)гшрен-¡сроличий сывороточный альбумин в системе цитохрома Р-450 и изучение его способности индуцировать иммунный ответ на бенз(а)пирен у кроликов. Тезисы докл.Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды". - Новосибирск, 1987, с.103.

3. Жирнов Г.Ф., Лисицына В.Б., Шипулина Н.В., Томилина Н.Ю.-, Ахицкий Г.Ю. Кодификационные изменения альбумина в реакциях микросомального окисления. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". - Ялта, 1989, с.247.

4. Шипулина Н.В., Ковалев И.Е., Жирнов Г.Ф., Лисицына В.Б. Иммунохимические механизмы регуляции активности цитохрома Р-450 печени. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". - Ялта, 1989, с.267.

5. Лисицына В.Б., Рунова D.H., Жирнов Г.Ф., Ладыгина В.Г. Окислоило ксенобиотиков микросомами печени крыс и человека. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". - Ялта, 1989, с.337.

6. Шипулина Н.В., Томилина Н.Ю., Жирнов Г.Ф., Лисицына В.Б., Ковалев И.Е., Арчаков А.И. Иммунный ответ на Оензо(а)пирен у кроликов, иммунизированных конъюгатом бензо(а)пирен-альбумин, синтезированным в микросомальной монооксигеназной системе печени. Биохимия, 1989, т.54, с.1254-1257.

7. Zhirnov G., Lisitsyna V., Sevrukova I., Shipulina N. 3,4-benzpyrene oxidation in soluble reconstituted monooxygenase system and microsomes. Abstracts of 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Struoture & Function, biotechnological & ecological aspects". Moscow, 1991, p.63.

8. Zhimov G., liaitsyna V., Shipulina N.. Tomilina N., Kovalyov I, The comparison of immunogenig properties of the formed with the participation or cytochrome P-450 conjugates of 3,4-benzpyrene-albur.in and 3,4-benzpyrene-mioroeomea. Abstracts of 7-th international conference "Bioouemistry & Biophysics of oytoohrorae P-450: Struoture & Funotion, biotechnologioal & eoological aspects". Moscow, 1991, p.64.

9. Zhirnov G., Lisitsyna V., Shipulina H., Tomilina H., Kovalyov I. The immunogenic properties of the 3,4-benzpyrene-albumin conjugate with is synthesized in the microsomal monooxygenase Bystem. Abstracts of 7-th. international conference "Bioohemistry : & Biophysics of oytochrome P-450; Structure & Funotion, bioteohnological & ecological aspects". Moscow, 1991, p.64.

10. Zhimov 0., lisitsyna V., Sevrukova I., Shipulina H. 3,4-benzpyrene oxidation in soluble reconstituted monooxygenase eyeteni and microsomes. Proceedings of 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Structure & Function, biotechnologioal & ecological aspeota". (¿obcow, 1991, p. 183-185.

11. Zhimov u., lisitsyna V.,. Shipulina N., Tomilina N. The immunogenio properties of the 3,4-benzpyrene-albumin conjugate cynthesized in the rabbit microsomal monooxygenase system. Proceedings of 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Structure & Funotion, bioteohnological & ecological aspects". Woscow, 1991, p.186-188.

12. Zhimov 0., Xisiteyna V., Shipulina H., Tomilina N. The immunogenic properties of the conjugate 3,4-benzpyrene with albumin or miorosotnes. Proceedings of 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; structure & Function, biotechnologioal & ecological aspects", jjosoow, 1991. 4>-lB9-l91-