Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Катализируемый нитохромом Р-450 синтез иммугенных конфентратов окисленных метаболитов 3,4-бензпирена с белками

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Катализируемый нитохромом Р-450 синтез иммугенных конфентратов окисленных метаболитов 3,4-бензпирена с белками"

ШЯ1СТЕРСТВ0 ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДЛРСТВИШЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

УДК 612.014.1:591.436 На правах рукописи

Лисицына Сора Борисовна

КЛТАГ,^11РУЕ"!!П 1ГЛТОХГ0!'О!1 Р-150 СИНТЕЗ тШЮГЕННЫХ ИЕГТ-ГАТОВ ОШ:а.ЧШШ ?СТАБОтПОВ 3,4-БЕШПИРЕНЛ С БЕЛКАМИ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на сопскагага ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена на кафедре биохимии шдико-Оиологичаского факультета Российского государствешюго медищшского университета.

Научный руководитель: академик РАМН, профессор АРЧАКОВ Алэксандр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор НИКОЛАЕВ Александр Яковлевич,

доктор медицинских наук, профессор УТЕШЕВ Борис Сергеевич.

Ведущая организация - Московский медицинский стоматологический институт им.Н.А.Семашко.

Защита диссертации состоится "____"..............1993 г.

в 14 час. на заседают специализированного Ученого Совета К 084 14 05 РГМУ по адресу: 117437, Москва, ул.Островитянова, I.

Автореферат разослан "____и................1993 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета,

кандидат медицинских наук КЛУШШ1А Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проб л g im.

Цитохром P-450-содаржащая монооксиге'назная система микросом печени является ключевой ферментной системой, отвечающей за окисление- низкомолекулярних чужеродных соединений, с последующим удалением их метаболитов из ' организма экскреторными органами [Arohakov A.I. & Bachmanova 0.1., 1990; Parke et al., 1991]. В связи с важностью реакций гидроксилирования, протекающих с участием цитохрома Р-450, исследователями уделяется большое внимание искусственным системам, позволяющим моделировать реакции микросомального окисления. Обычно в этих системах в качестве косубстрата применяется не nadph, а гидроперикись кумила (ГПК) или перекись водорода (Hg02), что позволяет использовать содеряшвдйся в них активный кислород для непосредственного окисления низкомолекулярных субстратов [Метелица Д.И., 1982; Карузина И.И. и соавт., 1933; Arohakov A.I. & Baohmanova _ G.I., 1990].

Наряду с хорошо изученной детоксицирувдей функцией монооксигеназной система, было установлено,- что в процессе окисления возиояно образование высокотоксичных промежуточных метаболитов, способных ковалентно связываться с биомакромолекулами (нуклеиновыми кислотами, белками, а также с фосфолишщшм бислоем мембран) [Арчаков А.И. и соавт, 1980; Ковалев И.Е., Полевая О.Ю., 1985; Glllete, 1974, butz, 1979; Batkine,1990; Johnson,1992; Uurrau et al,1992]. Особенно хорошо этот процесс изучен на примере жшщиклических ароматических углеводородов, В частности 3,4-09нзпирена [Hebert et al., 1982].

Ковалентная модификация реакционносшсобными метаболитами низкомолекулярных соединений биомакромолекул . может приводить к мутагенезу, канцерогенезу, некрозу тканей и развитию других патологических состояний [Araos et al., 1975; Nebert & Jensen, 1979; Miller«: Miller,1982; Guengerioh et al.,1990; Milea & Wolf, 1991; Eberhart et al.,1992]. Так например, в случае ковалентной модификации метаболитами низкомолекулярных соединений водорастворимых белков образуется конъвгированный антиген, который, попадая в кровь, индуцирует, согласно теории Ландитейнера [Landsteiner, 1936], синтез антител, специфичных к

низкомолекулярной детерминанте. Протекание подобной реакции в организме экспериментальных кивотккх было продемонстрировано в работе Арчакова А.И. и соазт. [1980). Как следствие этого процесса возможно возникновение аллергических заболеваний.

Вместе с тем, необходимо отметить, что в процессе такой модификации также возможно изменение иммунологических свойств высокомолекулярного соединения, что вызовет индукцию синтеза антител, специфичных, к модифицированному макроносителю. Цель и задачи исследования.

Целью данной работы явилось получение конъюгатов продуктов окисления 3,4-Оензпирена с белками, катализируемое цитохромом Р-450, с последующи анализом иммуногенности образующихся конгюгкрованных антигенов.

Эта цель предусматривает решение следущих задач:

1. Сравнение скоростей окисления 3,4-Оензпирена (БП) микросомами контрольных и индуцированных животных в полной и шунтированных системах.

2. Сравнение скоростей окисления 3,4-бензгшрена в микросомах к монооксигеназных растворимых реконструированных системах (РРС) при использовании в качестве косубстратов NADPH, ГШ и Н202-

3. Нахождение условий наиболее интенсивного ковалентногс связывания метаболитов 3,4-бонзгшрена с кроличьим сивороточнш альбумином (КСА).

4. Синтез конъюгатов метаболитов БП с КСА и БП < мик'росомольной фракцией печени кролика (МК^,), катализирует! цитохромом Р-450, в присутствии косуОстрата, при которо! наблюдается наиболее интенсивное связывание мотаболито: 3,4-бензпирена с КСА.

5. Определение иммуногенности конъюгатов метаболита 3,4-бензпирена с КСА или микросомами кролика по появлению циркулирующей крови как антител к . 3,4-бвнзпирену, так лимфоцитов, несущих на своей поверхности рецепторы, связывании БП.

6. Выявление антител к высокомолекулярному носителю (КСА ковалентно модифицированному метаболитами БП.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В результате проведенных экспериментов по изучен*

скорости окисления БП микросомами различных типов индукций и в РРС, а также исходя из датшх по измерению коваленткого связывания мотаболитов БП с КСЛ, показано, что БП относится к группе субстратов, механизм окисления которых различен в туптщюватшх системах к в полном шнооксигагазном цикле. Показано,' что максимальное количество мотяоолитов БП, связывающихся с альбумином, наблюдается при добавлении в среду инкубации микросом печени кроликов, индуцированных З-метилхолантреном (MX), а в качестве кофактора - NADPH.

Выявлено, что иммунизация кроликов коваленотиосвязанными конъюгатами БП-КСА и БП-МККр приводит к появлению антител,' специфичных к БП не только в крови животных, но и на лимфоцитах.

Установлено, что при иммунизации кроликов ковалентносвязан-ными конъюгатами БЯ-НСА или БЛ-МККр, синтезированными в микросомальнойг монооксигеназной системе, наблюдается синтез антител, не только к низкомолекулярной детер/янанте, но и к аллогенному высокомолекулярному носителю (альбумину), модифицированному продуктами окисления БП.

Основная часть работы представляв? интерес в понимании функциональной роли цитохрома Р-450 печени животных и человека. Экспериментальные подхода данной работа в настоящее время применяются в ряде лабораторий, занимающихся исследованием микросомальной монооксигеназной системы печати и окислением ксенобиотиков, а также в иммунологических лабораториях. Результаты работы используется в учебном процессе в спецкурсах на кафедре биохимии медико-биологического факультета РГМУ..

Апробация диссертации. Результаты исследований были доложены на Всесоюзных конференциях "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды" (Новосибирск, 1987). Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, IS89), на 7-ой Международной конференции "Biochemistry & Biophyaioa of Cytochrome P-450; Structure & Function, Biotechnological & Ecolofical Aspects" (Москва, 1991), а также на cobmscthom заседании учебно-научного комплекса кафедры биохимии МВФ 2-го МОЛГМИ им.Н.И.Пирогсва и института биологической и медицинской химии АМН СССР (26 июня 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем работа. Диссертация излокена на 126

страницах машинописного текста, включая 12 рисунков и 12 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспериментальной части с результатами исследования,, обсувдешя полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фракцию МК получали из гомогената печени беспородных кроликов-самцов методом дифференциального центрифугирования.

Концентрацию цитохрома Р-450 определяли по методу Отита и Sato [1964], балка по методу Lowry et al. [I95IJ.

Выделение кроличьего сывороточного альбумина проводили методом гель-фильтрации [Остерман л.А.. 19851.

Препараты очищенных цитохромов Р-450 - 2В4, 1Á2, а также NADPH-цитояром P-450-редуктаза были любезно предоставлены препаративной группой НИЛ экологии, токсикологии и метаболизма лекарственных препаратов при кафедро биохимии МВФ PIW (к.б.н.Коеном Я.М. и сотр.).

Реконструкцию РРС проводили по . методу Arohakov A.I.& Baohmanova G.I. [1990].

Скорость гидроксширования БП определяли по убыли флуоресценции этого субстрата [Yang «с Kicha, 1978] на спектрофлуориметре Baird Nova (Англия).

* Реакцио ковалентного связывания метаболитов БИ, а также определение количества метаболитов БП, ковалентно связавшихся с высокомолекулярным носителем проводили по методу. описанному. Арчаковым А.И. и соавт. [1980].

Иммунизацию животных ковалентносвязанными конъюгатами БП-КСА и БП-МК^р проводили, как описано ранее [Ковалев И.Е., Полевая О.Ю., 1981].

Количество лимфоцитов и антител периферической крови, специфически связывающих БП и КСА, определяли rio методу, описанному Чэредеевым А.Н. [1976].

Иммунный ответ кроликов на введение конъюгированного антигена БП-КСА определяли по реакции пассивной гемагглютинации [Говалло В.И., 1967].

Статистическую обработку результатов проводили по критерию t Стъюдента [Рокицкий П.Ф., 1973]. Достоверными считали результаты прй р<0,05.

основные результаты исследования

Сравнителышй анализ скоростей реакции окисления 3,4-Сензпирена в микросомах в полюй НАИРН-зависимой и шунтированных пероксидазннх системах

На первом этапа бил проведен сравнительный анализ скорости* окисления БП шжросомами индуцированных и неиндуцировашшх гзшотннх б полной п шунтированных системах. При изучении скорости НАИРИ-38еиш.юг0 окисления БП контрольные мшфосомами (к^да) (Рис.Г, кривая I), а так® иикросомами, выделенными из печени птотных, предварительно получавших фенобарбитал (РисЛ,

кривая 2) иля 3-штнлхолзнтрвн (МХщ) (Рис.1, кривая 3),. было установлено, что наиболее активными при окислении БП оказались МХцл (Рис.1, кривая 3).

Аналогичные зкспэршгэнты были проведены при использовании в качестве косубстрата ГПК (Рис.2) я Е^ (Рис.3). В этих случаях достоверных различна в скорости окисления БП контрольными и индуцпрованшшй шпсросомача нэ наблюдалось.

На рпсупяах 1,2,3 приведены наиболее типичные кривые окисления БП при добавлении в среду инкубации иабрн, гпк или ^Оз в присутствия контрольных юпсросом и микросом различных типов индукции.

Полученные результаты подтверждаются данными по измерению начальных скоростей ШШРН-, ГПК- и ^02-зависимого окисления 3,4-бензппрена, в пересчете на мг белка, контрольными микросомами и иикросомаш, выдаленишла из отвотных, предварительно получавших фенобарбитал (СБ) ала 3-метвлхолантрен (МХ) (Табл.1). Хорошо видно, что максимальная скорость окисления БП наблюдается в том случае, когда в среде инкубации присутствуют микросомы, выделенные из гивотшх, получавших МХ, а в качестве кофактора используется НА0РЯ.

Иные вывода о скорости окисления . БП микросомами различных типов индукции колю сделать, сравнивая скорость окисления БП в

100

I (Ш1П)

Рисунок I

Окисление 3,4-бензпирена контрольными и »шифрованными микросомаыи в присутствии ыаЬРН

Примечание:

I - К«*. 2 - ФВцш, 3 -Шу^; инкубационная смесь, объем® 0,7 мл, содержала 50 мМ на-«осфи«шй буф>р (РН 7,4), 0,035 мг белка микросом. 1,1 мкМ раствор БП; реакцию инициировали добавлением 0,04 мМ ЫАШ>Н. '-относительные единицы флуоресценции.

Рисунок 2

Окисление 3,4-бензпирона контрольный! и индуцированными шкросомаш в присутствии ГПК

(Зрзгечаяге: I - Кщ, 2 - 3 инкубационная смесь,

объемом 0,7 мл, содержала 50 мМ иа-фосфатный буфер (рК 7,4), 0,035 иг белка рликросом, 1,1 мкМ раствор БП; реакцию инициировала добавлением 0,2 мМ ГПК. '-относительные одштаг» ©дуорасцэндаш.

Рисунок 3

Окисление 3,4-Оензпирена контрольными и индуцированными микросомами в присутствии ^О^

Примечание: I - Кщ, 2 - 3 -МХ^.; инкубационная смесь,

объемом 0,7 мл, содержала 50 мМ Ыа-фосфатшй буфер (рН 7,4), 0,035 мг белка микросом, 1,1 мкМ раствор БП; реакцию инициировали добавлением 3 мМ "^-относительные единицы флуоресценции.

Таблица I

Окисление 3,4-<5ензпирена контрольными и индуцированными микросомами в присутствии ыаорн, гпк и н^

Вид индукции скорость окисления 3,4-бензпирена нмоль БП х мг белка~*х мин"1 содержание цитохрома Р-4Би нмоль/мг белка

НАОРН ГПК Ч>2

0,820,1 4,4*0,7 4.7*0,8 0,5*0,2

®ик 2,3£0,6 Б.ГЮ.Э 4,9*1,6 1,5*0,2

«и 6,6*0,6 5,2*0,9 3,7*0,7 1,1*0,1

Примечание: инкубационная смесь, объемом 0.7 мл, содержала 50 Ш Па-фосфатшЭ буфер (рй 7,4), 0,035 иг белка макросом, 1,1 нкМ раствор БП; реакцию инициировали добавлением 0,04 Ш НАВРН, ИЛИ 0,2 йД1 ГПК. или 3 Ш 1^02- "

Таблица 2

Окисление 3,4-бензпирена контрольными и индуцированными ИШфОСОШМИ В Присутствии МАВРН, ГПК И Н^

Вид индукции скорость окисления ш нмоль БП х нмоль цит.Р-450-1х мин-1

• напри ГПК

'"ж 1,6*0,6 8,8*3,1 9,4*1,9

®Нж 1,5*0,2 3,4*0,4 • 3,3*1,0

Щт 6,5*0,5 4.7*1,0 3.4*0,8

Примечание: хшубациояная смесь, объегюм 0,7 мл, содержала 50 мМ ¡7а-фосфагннй буфер (рН 7,4), 0,035 мт бежа микросом, 1,1 мкЫ раствор БП, реакции инициировали добавлением 0,04 Ш НАВРИ, или 0,2 Ш ГПК,-или 3 мМ Н^. ,

пересчете на нмоль цитохрома Р-450 (Табл.2). Если сравнивать ыабрн-зависимоа окисление БП, то оказывется, что достоверных различий мекду скоростью окисления БП контрольными микросомами и микросомами, выделенными из животных, получавших СБ, нет. Скорость окисления БП микросомами, выделенными из животных, получавших МХ, выше в 4 раза, чем в контрольных микросомах. При ГПК- и ^О^-зависшом окислении 3,4-бензпирена наблюдается обратное соотношение. Нет достоверных различий в скорости окисления БП в случае использования микросом, выделенных из животных, получавших ФБ или МХ, а скорость окисления БП контрольными микросомами в 2-3 раза выше.

Следует также отметить характерную особенность в соотношении скоростей маврн- , ГПК- и ^02-зависимого окисления БП в присутствии контрольных микросом и микросом печени животных, получавших ФБ. Как в пересчете на ыг белка (Габл.1), так и на нмоль цитохрома Р-450 (Табл.2), скорость окисления БП была выше при добавлении в среду инкубации ГПК или Н2О2 по сравнению со скоростью окисления этого субстрата при использовании в качестве донора.электронов набрн.

Обратное соотношение скоростей окисления БП при добавлении в среду инкубации различных косубстратов наблюдается в присутствии микросом, выделенных из животных, получавших мх.

Экспериментальные данные позволяют сделать вывод максимальная скорость окисления БП в пересчете на мг белка (Табл.1) наблюдалась при использовании микросом, выделенных из животных, предварительно получавших МХ в присутствии Иаорн, а в пересчете на нмоль цитохрома Р-450 - контрольных микросом при добавлении ГПК или

Результаты, полученные с использованием контрольных микросом и микросом с индукцией цитохромов Р-450 2В4 и 1А2, свидетельствуют о различных механизмах окисления БП в макросомальных монооксигеназных и шунтированных системах.

Окисление 3,4-бэнзпирена в монооксигеназных растворимых реконструированных системах

Для подтверждения вывода, сделанного в предыдущей главе, представляло интерес выяснить, соотношения скоростей окисления

БП в монооксигеназных растворимых реконструированных системах, содержащих различные цитохромы р-450 в присутствии nadph, гпк и KgOg. PPG представляют собой системы, включающие в себя высокоочвденше препараты цитохромов р-4бо 2в4 или 1а2, НАСРН-специфгашй фдавопротеид и неиошшй детергент эмульген 913. tBaohmanova O.I. at al., 1986; 1987]).

Денные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют, прежде всего, о возможности гвдроксилирования БП в РРС, содержащих как 2В4, так и 1А2. Хорошо видно, что скорость окисления этого субстрата при использовании различных косубстратов на порядок, гошз, чем в цитохром P-450-зависимой системе, локализованной в мембране макросом.

Рассматривая соотношения скоростей окисления БП при кикросомальном окислении и в РРС, следует отметить, что также, как п в (.спфосомах, скорость окисления БП в ррс неодинакова в присутствии различных косубстратов. Нак и в микросомальной фракции, индуцированной MX, наибольпая скорость окисления БП ноблвдаэтся а РРС, содержащей 1А2, при использовании в качестве косубстрата NADPH. Скорости окисления БП микросомами, пвдуцированннш ФБ или Ж, при использовании ГПК или HgOg, одинаковы. В РРС, содерзащей 2В4, при ^пользовании в качестве косубстрата пж, скорость окисления БП в 2,3 раза больше по сравнению с РРС, содержащей 1А2. В случае использования в этих системах в качестве косубстрата Hg02 наблюдается иная картина. РРС, содергащая 2В4, окисляет БП со скоростью в 1,5 раза меньшей, чем РРС, содержащая 1А2..

Следовательно, результаты, полученные в опытах по изучению скоростей окисления БП в РРС при использовании различных косубстратов в сравнении с микросомами, подтвервдают предположение о различшх механизмах окисления БП в полной и шунтированных системах.

Ковалентное связывание метаболитов 3,4-бензпирена с КСА в полной монооксигеназной и шунтированных системах

Одной из основных задач данного исследования являлось создание оптимальных, условий для синтеза конъюгатов . БП с Оиомакромолэкулами. Вследствие этого, были проведезш

Окисление 3,4-0ензпирена в полной микросоыальноЯ ыоноосигеназной системе, шунтированных системах и в моноаксигрназных растворима реконструированных системах

Скорость окисления 3,4-бензпирена нмоль БП х нмоль цит.Р-450_1х мин"1

КосуОстрвт

мшфосомы

ФБМК

РРС

2В4

1А2

NADPH ГПК

И2°2

1,5*0,2 3,5±0,4 3,4±I,0

e.OiO.s 4,7tl,0 3,4±0,8

0,3±0,I 0,9i0.I 0,4±0,I

0,6*0,02 0,4*0,10 0,610,03

Примечание: инкубационная смесь, объемом 0,7 мл, содержала 50 мМ Na-фэсфатный буфер (pH 7,4), 0,035 мг белка макросом (0,07 нмоль цит.Р-450 для MKœ и 0,042 нмоль ЦНТ.Р-450 для MKjyß) или (в случае РРС) 0,07 нмоль 2В4 ИЛИ 0,042 нмоль Ш, 1,1 мкМ раствор БП; РРС содержали 0,025 % амульген 913; реакции инициировали добавлением 0,04Ш NADPH (в случае PFC в среду инкубации добавляли üADPH-зависшую цитохром Р-450 редуктаэу в молярном соотношении: 2В4 О А2):МАРРН-зависимая цитохром Р-450 редуктаза:эмульген 913 - 1:1:200), или 0,2 мМ ГТЖ, или 3 мМ HgOg. При окислении БП в РРС в отсутствие неионного детергента эмульгена 913 (система используемая в качестве контроля для этих экспериментов) каталитическая активность изолированных форм адтохрома Р-450 не наблюдалась.

Ковалэнтиов связывание метаболитов (14с]-3,4-бензпирена с альбумином в полной монооксигеназной и шунтированных системах в присутствии микросом, выделенных • из животных, получавших

3-метилхолантрен

Количество метаболитов [14с]-3,4-б9нзгшрена,

Косубстрат ковалентно связавшихся с КСА

нмоль БП / мг белка х час

HADPH 50 ± 0,6

«2°2 30 ± 0,2

ГПК 20 t 0,2

Примечание: инкубационная смесь, объемом 0,5 мл, содержала 50 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7,4), 150 мМ КС1, 0,6 мМ EDTA, 10"4М [7,I0-14С)-3,4-бензпирена, 0,5 % КСА, 1,5 мг белка микросом; реакцию инициировали добавлением 3 мМ MADPH, или 0,2 мМ ГПК, или 3 MM H^Og.

эксперименты по изучении ковалентного связывания продуктов окисления БП с КСА в присутствии ИАПРН, ГШ или Н^. При этом в смесь инкубации добавляли микросомы, при которых наблюдалась максимальная скорость окисления БП, т.е. микросома с индуцированным цитохромом Р-450-1А2, специфичным для окисления ПАУ.

Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что больше всего метаболитов БП способно ковалентно связываться с альбумином в присутствии юшрн. При использовании в качестве косубстрата Н^ наблюдается уменьшение количества продуктов окисления БП, ковалентно связавшихся с КСА в 1,7 раза, а ГПК в 2,5 раза. Это согласуется с результатами экспериментов по исследованию скорости окисления БП микросомами с индуцированной арилгидроксилазой. Как в пересчете на иг белка (табл.1), так и в пересчете на нмодь цитохрома Р-450 (табл.2) наблюдается уменьшение скорости ГПК- и ^02-завигавлого окисления БП по сравнению с его гшя?н-завис яшм окислением в 1,3 раза и в Г.8 раза, соответственно.

Отсутствие корреляции между количеством метаболитов БП, ковалентно связавшихся с КСА и скоростью окисления. БП в присутствии . «грн, ГШ£ или Е^О^ может Сыть связано с уменьшением доли вцсокоактагвных продуктов окисления БП, образующиеся в шунтированных системах.

Следовательно, сравнительный анализ количества ковалентно-связанных метаболитов бп с КСА со скорстыо окисления БП в полной и шунтированных системах еще раз свидетельствует в пользу предположения о различных механизмах окисления БП при использовании в качестве косубстратов 1Ш)рн, ГПК и

Таким образом, исходя из полученных данных, представленных в настоящей главе и, учитывая результаты экспериментов, описанных в предыдущих главах, для синтеза коньюгатов метаболитов БП с биомакромолекулами, с целью изучения индукции антител как против нмзкомолекулярной детерминанты, так и против высокомолекулярного носителя, наиболее целесообразно использование микросш. выделенных из животных, предварительно получавших ЫХ при добавлении в среду инкубации в качестве кофактора наерн.

Образование антител к 3,4-Сензшрену в ответ на введение животным конъюгатов БП с КСА или БП с МК^.

Появление антител, способных связывать БП, на лимфоцитах и в сыворотке крови кроликов, регистрировали через 2 и 4 месяца посла иммунизации животных коныогатами БП-КСА или БП-МККр, синтезированными с помощьп цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы. При изучении БП-связывавдеЙ способности лш.фядатов периферической крови измеряли количество связанного [14с]БП лимфоцитами животных опытной и контрольной груш (табл.5,6). У трех из четырех иммунизированных конъюгатом БП-КСА и у двух пз четырех иммунизированных конъюгатом БП~МККр кроликов выявлено достоверное увеличение связывания БП лимфоцитами. Отсутствие иммунного ответа на данное соединение у некоторых зхивотных обусловлено, по-видимому, хорошо известным широким варьированием реакции иммунизированных животных на введение ко1гьюгированных антигенов {Ковалев И.Е., Полевая О.Ю., 1985).

Аналогичные результаты наблюдались после иммунизаци животных конъюгатом БП-МККр и при выявлении антител к БП в сыворотке крови иивотшх (табл.7,8). В этих экспериментах увеличение способности сыворотки крови сязывать БП было обнаружено у тех же животных.

На основании тестирования способности лимфоцитов периферической крови и сыворотки крови связывать (14С]БП, мокно сделать заключение о том, что ковалентное связывание БП с аллогенным альбумином кролика и мембранами эндоплазматического ретикулума, происходящее в микросомальной системе окисления, приводит к формированию коныогированшя антигенов.

Образование антител к КСА при введении кроликам конъюгата БП с КСА, полученного при окислении БП.

Как уже предполагалось ранее, ковалентное связывание низкомолекулярного соединения с биомакромолекулами альбумина может вызывать ковалентную модификацию последнего, что, в свою очередь, приведет к изменению его структуры с возможным появлением новых антигенных детерминант.

3,4-бензпирев-связыващие свойства лимфоцитов периферической крови швотшх, иммунизированных конъюгатом БП-КСА

Иммунизация конъюгатом БП-КСА Количество связавшегося [ С]-БП, *

Через % месяца посла иммунизации Через 4 месяца после иммунизации

1 2 3 4 Контроль I Контроль II .................39,1*1) ,7 33,5*1,9, 59,9*1,9" 49,8*2,3 39,3*1,1 37,5*0,9 72,7*0,5! 70,0*0,1, 71,5*1,7 38,7*1,3 39,8*1,1

Примечание: Результаты представлены в %% по отношению к общему количеству внесонной в пробу метки; контроль 1-интактныэ животные; контроль и-животныэ, которин вводили не связанный с белком ВП в смеси с НСА в дозе, соответствующей содержанию этих компонентов в конъюгате ВП-КСА; приведены средние величины со стандартной ошибкой; «-соответствует статистически достоверным различиям мевду опытными и контрольными грушами (р<0,05).

Таблица 6

3,4-бвнзпирен-связывакзщие свойства лимфоцитов периферической крови животных, иммунизированных конъюгатом Ш-МК»_

Иммунизация конъюгатом БП-МККр Количество связавшегося {А4с]-БП, %

Через 2 месяца после иммунизации Чероз 4 месяца после иммунизации

1 2 3 4 Контроль 3 Контроль II 4Ь,Ь*1,3, 49,0*0,7, 46,6*1,0 39,3*0.1 39,3*1,1 39,3*1,2 45,3*0,8, 52,1*1,5* 52,1*1,8 41,5*1,4 38,7*1,3 38,1*0,8

Примечание: Результаты представлены в %% по отношению к общему количеству внесенной в пробу метки; контроль 1-интактные животные; контроль и-животные, которым вводили не связанный с белком БП в смеси с Щ/п в дозе, соответствующей содержанию этих компонентов в конъюгате БП-МККг,; приведены средние величины со стандартной ошибкой; »-соответствует статистически достоверным различиям между опытными и контрольными группами (р<0,05).

Связываний [14С1-3,4-Сензттрона сывороткой крови кроликов, иммунизированных. коныогатом БП-КСА

Иммунизация коныогатом БП-КСА Количество I связявпегося {141 с]3,4-бензпнрена, %

До одмушзвцш Через 2 месяца Через 4 месяца после иммунизации после иммунизации

1 2 3 4 8,6*0,5 8,6*0,3 9,4*0,4 9,0*1,3 8,1*0,3 9,0*0,8, 13,1*0,з! 13,1*0,7 10,4*2,7 8,1*0,4, 13,9*0,4! 25,4*0,2

Примечание: Результаты представлена в %% по отношению к общему количеству внесенной в пробу метки; контроль приведены средние величшш со стандартной одшокой; * -соответствует статистически достоверным различиям мвзду опытными и контрольными группа',гл (р<0,05).

Таблица 8

Связывание {14с]~бензпирена сывороткой крови кроликов, иммунизированных коныогатом БП-МК|,0

Иммунизация конъюгатом БП~МККр Количество связавшегося 1 14С]-БП, %

До иммунизации через 2 месяца после иммунизация через 4 месяца после иммунизации

I- 2 3 4 6,7*0,8 7,6*0,4 8,2Ю,4 8,3*0,2 8,1*0,3, I0,9*0,8 9,2*0,3 7,4*0,4 8,4*0,3, п,1±о.5: 12,6*0,3 8,4*0,4

Примечание: Результата; представлены в %% по отношению к общему колпеству внесенной в пробу метки; контроль приведены средние величины со стандартной ошибкой; » -соответствует статистически достоверным различиям мезду опытными и контрольными группам! (р<0,05).

В связи с этим, представляло интерес выяснить еозмоеность развития у животных иммунного ответа не. только на гаптен (3,4-бензпирен), но и на аллогенный кролкч!5й альбумин при иммунизации кроликов ковалентносвязашшы конъюгатом 3,4-бвнзшрен-кроличий сывороточный альбумин, синтезированным в микросомальяой монооксигеназной системе печени кроликов.

С этой целью проводилось определение уровня антител к альбумину в сыворотке крови кроликов при их иммунизация ковалентносвязанным конъюгатом, содержащим метаболита 3,4-бензпирвна и аллогенный кроличий альбумин, синтезированным в микросомальной системе окисления. Из рисунка 4 видно, что после введения конъюгата ЕП-КСА у подвергавшихся иммунизации «явотных наблюдалось появление антител в сыворотке крови к альбумину. При этом, интенсивность синтеза антител, а также сроки их появления очень индивидуальны и, вероятно, связаны с особенностью кьмунной системы конкретного организма. Так например, у первого и второго кроликов появление антител, связывающихся с альбумина«, фиксировалось на протяжении всех сроков эксперимента (7-ой, 30-ый и 45-ый день).

Следует отметить, что на 45 день эксперимента уровень антител против высокомолекулярного носителя у первого кролика несколько уменьшался, у второго кролика оставался вв том же уровне. У третьего животного уровень антител возрастал лиаь аа 45-ый день после введения конъюгата БП-КСА. Развитие икмунной реакции по отношению к КСА у четвертого кролика во все сроки не наблюдалось.

Таким образом, реакция ишунной системы может развиваться не только на низкомолекулярную детерминанту, как было установлено ранее, но и на саму, ковалентно модифицированную ыатаболитема низкомолекулярного соединения, биомакромолекулу. При этом особенно важно подчеркнуть, что биомакромолекула (в нашем случае альбумин) является аллогешой.

Приобретение новых антигенных свойств биомакромолекулой в результате ее ковалентной модификации штаболнтамн низкомолекулярных соединений может лакать в основе одного из объяснений механизма постоянного обновления в организма биомакромолекул этого типа.

Следовательно, учитывая результаты собственных исследований.

ю

'од г

1 2

2

К

3 4

.СП ..СП-

К

3 4 К

Г~П I-1 „

30

45

г (сутки)

Рисунок 4

Титры- антител к кроличьему сывороточному альбумину в сыворотке крови кроликов, иммунизированных коныогатом 3,4-бензпирен-КСА, в реакции пассивной гемагглютинации

Примечание: ""-разведение сыворотки; К-контроль-животные, которым вводили не связанный с белком БП в смеси с КСА, в дозе, соответствующей содержанию этих компонентов в конъюгате БП-КСА; 1,2,3,4-животные, которым вводили кснъюгат БП-КСА.

Рисунок 5

Возможные пути превращения субстратов в гидроксилазном цикле

Путь I - образование основного продукта реакции гидроксилиро-вания (нон) из исходного субстрата (RH) [Арчаков А.И.,1975; Park,1979I; путь 2 - взаимодействие реакционноспособного интермедиата (RI) с ферментами второй фазы метаболизма низкомолекулярных соединений, увеличивавших гидрофильность окисляемого субстрата [Ingelmaa-Sunüberg, 1980]; пути 3,4 -взаимодействие либо ш, либо RI с цитозольным рецептором, оказаващим воздействие на AH-локус ДНК [Nebert et al.f 1982]; путь 5 - образование из RI реакционноспособного метаболита RM, ковялентно взаимодействующего с биомакромолекулой [Archakov A.I. & Baohmanova G.I., 1990)

общепринятую схему микросомального окисления низкомолекулярных соединений (рис.5, по данным Ковалева И.Е., Полевой О.Ю. [1985); Nebert et ai.Î1982]; Archakov A.I. & Baohmanova G.I., [1990]) можно дополнить еще одним звеном, свидетельствующим об инактивации в процессе реакций гидроксилирования, протекающих с учвстием цитохрома Р-450, не только низкомолекулярных соединений, но и биомакромолекул (рис.5, путь 5, выделенное пунктирной рамкой; объяснение остальных путей см. в подписях к рисунку).

Автор выражает благодарность за методическую помощь при определении антител к 3,4-бензпирену и альбумину сотрудникам лаборатории иммунофармакологии НПО "Биотехнология" (руководитель д.м.н., проф.Ковалев И.Е. ) к.м.н.lliimyлиной Н.В. и к.б.н'.Томшшной Н.Ю.

вывода

1. Сравнительннй анализ скоростей окисления 3,4-бензпнрена в полной и шунтированных шкросомалышх системах, раствориыых реконструированных системах с уровнем ковалентного связывания метаболитов БП с КСА показал, что окисление БП в полной системе и шунтированных системах происходит по различным механизмам.

2. Максимальное количество метаболитов БП, ковалентш связавшихся с КСА, наблюдается в присутствии микросом, выделенных из животных, получавших МХ и при использовании в качестве косубстрата иаорн.

3. Иммунизация животных конызгатамя 3,4-бензпирен-кроличий сывороточный альбумин и 3,4-бенэпирен-кролнчьи микросомы, синтезированными в микросомальной монооксигеназной системе, приводит к образованию антител, связывающих 3,4-бензпирен как в сыворотке крови, так и на лимфоцитах, выделенных из переферической крови.

4. В сыворотке крови кроликов обяарукено появление антител к ковалентэ модифицированному кроличьему сывороточному альбумину посла иммунизации животных коетыогатом 3,4-бензщрвн-кроличий сывороточный альбумин, слнтэзированшм в микросомальной монооксигеназной системе.

СПИСОК ПУБЛИКАЦЙИПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жирнов Г.Ф., Лисицына В.Б., Томилина H.D. Сравнительный анализ реакций гидроксилирования 3,4-бензпирена (БП) при НАДФН-зависимом окислении и в модельных системах- Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среда". Новосибирск, 1987, с.57.

2. Ковалев И.Е., Иипулша Н.В., Томилина Н.Ю., Жирнов Г.Ф., Лисицына В.Б. Синтез коныогированного антигена бенз(а)пирен-кроличий сывороточный альбумин в системе цитохрома Р-450 и изучеш!в его способности индуцировать иммунный ответ на бенз(а)пирен у кроликов. Тезисы докл.Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды". - Новосибирск, 1987, с.103.

3. Жирнов Г.Ф., Лисицына в.Б., Шипулина Н.В., Томилина Н.Ю., Ающкий Г.Ю. Модификационные изменения альбумина в реакциях микросомзльного окисления. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". - Ялта, 1989, с.247.

4. Шипулина Н.В., Ковалев И.Е., Жирнов Г.Ф., Лисицына В.Б. Иммунохимические механизмы регуляции активности цитохрома Р-450 печени. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". - Ялта, 1939, с.267.

5. Лисицына В.Б., Рунова Ю.Н., Жирнов Г.Ф., Ладыгина В.Г. Окисление ксенобиотиков микросомами печени крыс и человека. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". - Ялта, 1989, с.337.

6. Шипулина Н.В., Томилина Н.Ю., Жирнов Г.Ф., Лисицына В.Б., Ковалев И.Е., Арчаков А.И. Иммунный ответ на <5ензо(а)шрен у кроликов, иммунизированных конъюгатом <5ензо(а)пирен-альбумин, синтезированным в микросомальной монооксигеназной системе печени. Биохимия, 1989, т. 54, с.1254-1257.

7. Zhirnov С., lisitsyna V., Sevrukova I., Shipulina N. 3,4-benzpyrene oxidation in soluble reconstituted monooxygenase system and microsomes. Abstracts of 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Struoture Se Function, bioteohnological & ecological aspects". Moscow, 1991, p.63.

8. Zhirnov G., Lisitsyna V., Shipulina N., Tomilina fl., Kovalyov I. Tho comparison of imtnunogenig properties Of the formed with the participation of oytochromo P-450 conjugates of 3,4-benzpyrene-albumin and 3,4-benzpyrene-mloro8QmeB. Abstraats of 7-th international oonferenoe "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Struoture & Funotion, biotechnologioal & eoological aspects", Moscow, 1991, p.64.

9. Zhirnov C., LiBiteyna V., Shipulina N., Tomilina H., Kovalyov I. The immunogenic properties of the 3,4-benzpyrene-albumin conjugate with is synthesized in the microsomal monooxygenasa system. Abstracts of 7-th international oonferenoe "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Struoture & Function, biotechnologioal & ecological aspects". Uosoow, 1991, p.64.

10. Zhirnov G., Msitsyna V., Sevrukova I., Shipulina N. 3,4-benapyrene oxidation in soluble reconstituted monooxygenase system and miorosomes. Proceedings of 7-th international oonferenoe "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Structure & Function, biotechnologioal & eoologioal aspects". Moscow, 1991. p.183-185. -

11. Zhirnov v.., lisitsyna V., Shipulina K-, Tomilina N. The immunogenic properties of the 3,4-banzpyrene-albumin conjugate cynthesized in the rabbit microsomal raonooxygenase system. Proceedings of 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Struoture & Function, bioteohnological & ecological aspects". Moscow, 1991, p.186-188.

12. Zhirnov G., lisitsyna V., Shipulina N.. Tomilina N. The immunogenic properties of the conjugate 3,4-benzpyrene with albumin or microsomes. Proceedings of 7-th international conference "Biochemistry & Biophysics of cytoohrome P-450; {Structure & Function, biotechnologioal & eoological aspects". {ÎOBOOW, 1991« JMÛ9-Ï91 -

2-4