Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картированные хромосомы Streptomyces antibioticus - продуцента олеандомицина с помощью слияния протопластов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Картированные хромосомы Streptomyces antibioticus - продуцента олеандомицина с помощью слияния протопластов"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕШЯ НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ М1КРОБЮЛОГ11 ТА В1РУС0Л0ГП Ы.Д.К.ЗАБ0Л0ТН0Г0

На правах рукопису

ЛУК'ЯНЧУК В1тал1й Владиславович

КАРТУВАННЯ ХРОМОСОКИ БТЯШОЖСЕЗ Ш1В10Т1Си2 - ПРОДУЦЕНТА ОЛЕАНДОМ1ЦИНУ ЗА ДОПОИОГОЮ ЗЛИЛИ ПРОТОПЛАСТ IВ

03.00.07 - м1кроб1олог1я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття вченого ступеня кандидата б1олог!чних наук

ЮНВ - 1996

Дисертац1ею в рукопис.

Робота виконана у в1дд1л! генетики,..м1кроорган1зм1в 1нституту мжроб!ологП та в!русологП 1м. Д. К. Заболотного HAH Укра?ни.

Науковий кер1вник - доктор б!олог1чних наук, професор

пЫи шсщс^ША -и. и.

OPuiftHi опоненти - доктор С1олог1чних наук, професор

Малюта С. С.-

кандидат 61олог1чних наук Муквич М. С.

Пров1дна орган1вац1я - Кшвський Навдоналъний Ун1верситет

iM. Т. Г. Шевчекка

Захист в!дбудеться 16 жов'тня 1996 року о1000 годин1 на зас1данн1 Спец1ал1зовано1 вчено! ради Д 01.81.01 при 1нститут1 м!кроб1ологП та в1русолог!1 1м. Д. К. Заболотного HAH Украйни (252143, Ки1в 143, вул. Заболотного, 154, 1нститут м1кроб1оло-ri'i та вхрусологИ HAH Укра'1ни, зал зас!дань)

3 дисертац1ею можна ознайомитись в науков1й б1бл!отец1 1нституту м1кроб1ологП та в1русолог!Л HAH Украгни.

Автореферат роз1слано "_" _ 1996 р.

Вчений секретар СпещалХзовако! вчено'1 ради кандидат б1олог1чних наук

Пур1ш JI. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальрисгь теми : Важливим етапом генетичних дослхджень стрептом1цет!в стала розробка метод!в отримання, злиття i ре-генерацП протопласт1в. В1дсутн1сть у протопластов кл1тинно! ст1нки дозволяв проводите 'ix злиття i регенерац1ю, а також ге-нетичну трансформац1ю, трансфекц!ю 1 гЮридизацш у штам!в стрептом1цет!в, як! не мають або мають малоефективну систему кон'югатквного переносу генетичного матер1алу. Застосування метод!в отримання, злиття i регенерат I протопласт1в i подаль-шого генетичного анал!зу потомства допомогае не т1льки краще зрозум1ти шляхи биосинтезу 6iojtori4Ho-активних речовин, в тому числ! антибiотикхв, та ix генетичного контролю, але i дае мож-ливЮть одержання нових, г!бридних або модиф!кованих антиб!о-тик1в у випадку злиття протоплзст1в р1аних стрептом!цет!в-про-дуцент!в в1домих антиб!отик1в. 1нформац1Я про локал!зац1ю-ге-HiB бЮсинтезу антибготик1в, разом в методами послхдовного i локал!зованого мутагенезу, сприяе б!льш легк!й !золяцп мутан-т1в з р!зними блоками на шляху б!осинтезу антиб1отик1в. Знания про зчеплення ген!в б!осинтезу з певними хромосомними маркерами, вивчення нових комб1нац1й ген1в вхдкривають перспективу одерзхакня нових важливих метаболтв, перслективнних для застосування в медицин!, ветеринар!I i сгльському господарствх.

Одним ia важливих для медицини макрол!дних антиб1отик!в е олеандом1цин, промисловий продуцент якого Streptomyces antibiotlcus до цих nip систематично не досл1джувався з гене-тично! точки зору.

Кета i аавдання робота : Промети генетичне дослхдкення i побудувати попередню генетичну Kapiy Streptomyces antibioticus промислового продуцента олеандом!цику.

Для виконання робота необх1дно було вир1шити так i задач i:

1) гцд!брати оптимальн! умови одержання стаб!льних протоплас-tíb i 'ix регенерацП в м1цел1альщ кл!тини, провести злиття протопладт1в штам1в, що несуть р1вн1 генетичнг маркери, i вияенити генетичну природу одержаного потомства;

2) провести анал!а гашкндних рекомб1нант1в i встановити порядок розташування генетичних маркер1в на генетичнхй карт1, проанал1вувати гетероклони i встановити в1дстан1 в одиницях рекомб1нацП mík зчепленими генами на генетичн!й карт!.

3) з'ясувати HaaBHicTb плазм1д у Streptomyces antibioticus -продуцента олеандом1цину та провести рестрикц1йний анал1з тотально! ДНК штам1в промислових продуцент!в олеандом!цину;

4) з'ясувати MOJMHBicTb впливу плазм!ди pSQ1912-Ha б1осинтез антиб1отик1в Streptomyces antibioticus.

OCHOBHI ПОЛОЖЕНИЯ, ЩО ВИНОСЯТЬСЯ НА ЗАХИСГГ:

1. Побудована генетична карта Streptomyces antibioticus-продуцента олеандом!цину, яка мае 13 локус1в.

2. На основi анал1зу гетероклон!в Естановлено вхддал1 mík yciMa сус!дн1ми генетичними локусаш на карт1 хромосоми, загальна довжина яко! складае 215 одиниць рекомб!нацП.

3. Показано здатн1сть плазм!ди pSS1912 значно п1двищувати синтез антиб1отично! речовини оранжевого кольору з Rf 0,95 у трансформантiв S. antibioticus ЛС-ОЛ 1790, що може вказу-

- Б -

зати на регуляторну роль плазкйди в експресП ген1в синтезу антиС iотик!в у стрептом1цет1в.

Иаукова новизна.

Вперше побудована генегична карта Streptomyces antibiotlcus -пооп\шента олеанлом^шт/. на як1й ппатятгтянп 1Я .wwvr.iw Ня основ! аяал1зу гетероклонхв Есгановлено в1ддал! м!ж ус!ма су-с1дн1ми генетичними локусами на карт! хромосоми, загальна дов-жина яко! складае 215 одиниць рекомб!нацП.

В результат! проведеного рестрикц!йного анал!зу тотально! ДНК штамт е нрочг'слов гтродуцэнт!е сл9акдсм1цику St.rspt.oir.ycss gnt ibiot "icus показано наяBHlc^b ампл1ф!кованих повторив i в1дсутн1сть кореляцИ м1к к1льк1стю останн1х i антибютичною активн!стю цих штатв.

Встановлено здатн!сть плавм!ди pSGl9l2 значно п!двищувати синтез антиб!отично! речовини оранжевого кольору з Rf 0,95 у трансформанИв S. antibioticus ЛС-ОЛ 1790, що молсе вказуватк на регуляторну роль плазм!ди в експресх! ген1в синтезу анти-б!отик1в у стрептом!цет!в.

Практичне значения.

На генетичн!й карт! S. antibloticus-продуцента олеандом!-цину розташовано 13 генетичних локус!в, серед яких i локус olei, що в!дпов!дае за синтез олеандом!цину. 1нформац1я про локал!зад!ю ген!в бЮсинтезу антиб!отик!в разом з методами посл!довного 1 локал!зованого мутагенезу сприяють б!лыа лег-к!й !золяц!1 мутант1в з р1зними блоками на шляху б1осинтезу антиб!отик!в. Знання про зчеплення reHiB б1осинтезу з певними

- б -

хромосомними маркерами, вивчення нових комб1нац!й ген!в в!дк-ривають можлив1сть сдержанна нових важливих метабол!т!в, перспективних для застосування в медицин!, ветеринар!'! ! с!льському господарств!, за допомогою селекцп б!льш продук-тивних штам!в ! створення продуцент!в нових г!бридних антиб!-отик!в шляхом злиття протопласт!в.

Виявлена здатн!сть плазм!ди pSG1912 в!д!гравати регуляторну роль в експресП reHiB синтезу антиб!отюив у стрептом!цет1в.

Апробац1я робота. Матер!али дисертацП допов!далися i обговс рювалися на VI з'1зд! УТГ1С (Полтава,1992 р), на Перш!й генетич-Н1й конференц!! кра!н Балтики (В1льнюс, 1992), на I (Установчому) з'!зд! УМО (Одеса, 1994), на 9 Шжнародкому симпоз!ум! по б!оло-riï актином!цет!в (Москва, 1994).

Пу(Шкац1я результата робота. Основн! положения роботи вик-ладен! у 10 друкованих працях.

Структура та об'ем роботи. Дисертац1я складавться is вступу, огляд л!тератури, експершентально! частини, результате, ïx об-говорення, BHCHOBKiB та списку л1тератури, який включав 152 най-менування. Робота викладена на 155 стор!нках машинописного тексту i м!стить 21 малюнок та 23 таблиц!.

3 M I С Т РОБОТИ Огляд л1тератури, Викладен! сучасн1 дан! з питань гене-тично'1 рекомбшацП, структури хромосомно'! та плазмгднсн ДНК стрептом!цет!в. Розглянут! piBHi методи вивчення рекомбхнацН ! генетичного картування стрептом!цет!в, як! показали високу ефектившстъ при вивченн1 модельного лабораторного штаму Streptomyces coelicolor А3(2), дали можливютъ побудувати ге-

нетичн1 карти для в!дяосно велико! кш>кост1 вид1в роду Streptomyces. Наведен! приклади эастосування метод1в отриман-ня, злиття i регенерацН протопласт1в i подальшого генетичного анал1зу потомства, як! допомогають не т!льки краде зрозум1ти шляхи Сюсинтезу бюдог !чно- активних речовин в тому чксл! ан-тиб!отик1в, та ix генетичного контролю, але i дають иохжвють одержання нових, г!бридних або модиф1кованих антиб!отик1в у випадку злиття протопластов р1зних стрептом!цет1в-продуцент1в в1домих анти01отик!в.

Екслериыентальна частина. Матергали i методн. В робот1 використано 17 щтам!в Streptomyces antibioticus (табл-Nl). При картуванн! геному ви-користовувались генетично м1чен! шгами S.antibioticus з колек-ц11 Лешнградського технологi4Horo институту, одержан! п1д впливом н1трозогуан!дину, метил01урету i УФ-опром!нення, а тают гапло!дн1 рекомб!нанти, вид1лен1 нат теля злиття протопластов.

Середовища та умови культивування MiKpoopraHiBMiB тдби-ралися в!дпов1дно до задач експерименту, враховуючи потреСи м!кроорган1зм1в (Маниатис и др., 1984; Okanlshi et ai., 1974; Hopwood et ai., 1985).

Вид1лення плазм1дно1 та тотально! ДНК з кл1тин MiKpoopra-н1зм!в проводили за методами Б1рнбойма i Дол! та Кайзера (Birnboim and Doly, 1979; Kieser, 1984) , в як1 було внесено деяк! модиф1кац11. Розд1лення тотально! ДНК та 1'х рестрикцШ-них фрагмент!б, обробку ДНК ендонуклеазами рестрикцх! та л!гу-вання л!газою фага Т4 проводили зпдно кер1вництву Ман1ат1са (Маниатис и др., 1984).

TaG/sciH Uív Xapas-iepMcmsa ®eadB í.antibíotícus

wapnep

•íoho:'«:;

(ncTpíóa B v£jiTcpa>;

31

42

513

8-30

O-l i

x

qi -25 45-141 47-'10 4^-55

47~li5 ?'

11&51

rretl

ilvg tnri leui i Ivl roeil ífretl 1 i v£ niel niel niel

olel prol te el pcxl cytl irrí

r-. . r 1 - -

ere:

hisl leul

"' S;

niel r-eí; f.hfj npOTOTpOíC.

apOTCTCOS, npD?CTpC9j

Qil

M?TiOKla, Sjück y okhxceí a^ahrcmíusthy

ICCJieí-^n, IIpCVllH

TpeoHis, criKKicx't ¿o rerpacKíwlKy JI&KLIVÍH, liipVI^OKJiíH

í-aníh, ibítoskk

ísfeTlciiíH, TpeosiH Mí-i'icHlH, nyp;íK IscjiefiuHH, sajilE, np^ííK Híko?;w£mís, ricrrrjivra

HlKOTüíiáMís, iiefciKK

HlXC'VZK&éU, MdTÍOKÍH, TpeCtÜH BÍKÍÍHI!»"? ÍJIÍI "ejiesiú! npD5yueBTi2 cifcaHiCMluiíHy 80-103

irpoAya-íHT sao&KfiCMiüiHy 5oo oa''?-:;:

npo^viioH? cj:eáKM0t.'lu4Hy 1250 oi/iUi

rtpciyueH? cji3aii¿CMluifHy 2500 cn/M-"

nposvneHT ojieajííOMluiíKy 3200 oa/MJi

Одержання, злиття i регенерацш протолласпв стрептом1це-TiB, а також ïx трансформацию проводили за в!дпов!днимя методиками (Шевченко и др., 1984; Okanishi et al.,1974; Dagert, 1979; Hopwood et al., 1985).

Статистичний аналлз успадкування генетичних MapKepiB батьк!вських штам1в кащддками (сегрегантами) гетероклонгв проводили за загальнсприйнятою методикою (Hopwood, Sermonti, 1952).

Генетичний аналгз нащадк!в 1з злиття протопластхв проводили двома методами: неселективним i селективнкм анагагом спор колон^ регенерант1в, що виросли на повноц!нному середовищ. Се-лективний аная1з гашклдних рекомб1нант!в зд1йснювади за методикою, розробленою Хопвудом (Hopwood., 1959).

Досл1дження речовин з антиб!отичними властивостями проводили методами анал!тично! та препаративно! тонкошарово! хроматограф!! (Шаршунова и др., 1980). Б!оавтограф!ю отриманих тонкошарових хроматограм проводили за методам (Aszalos et al., 1968).

1. Генетичний aiiani3 гашнидних peKOMÔitiawriB.

Метод злиття протопласт!в мае ц!шп переваги в пор1внянн1 з класичними способами гекетичного обм1ну у прокар1от. Викорис-тання цього методу дозволяв зб1льшити частоту рекамб!нацП на KiJtbKa порядк1В, що особливо важливо при м!?«видсв!й г1бридиза-щД. При злитт! протопласт1в взаемод1ють noBHi геноми бать-KiBCbioix штам1в. Також вагаивим е те, що oOmîh при злитт1 протопласт !в не залежить в!д наявност! фертильних плазм1д.

Генетичний анал1з колош-й. регенератов на стаб1льн!сть ус-падкування ознак батьгавських шташв показав наявн1сть трьох

- 1U -

тип1в нащадк1в;нестаб1льних дигагаШв (гетераклок1в), стаб!ль-них гапло'1дних рекомб1нант!в i одного 1з батькхвських тип!в.

Нами було проведено ряд п'яти- i чотирьох факторних схрещу-вань. Анал1з одержаного потомства проводили за допомогою як селективного, так i неселективного анализу.

Генетичний анал!з регенератов 1з п'ятифакторного злиття протопласт1е 7 niel metí thrl X 112 ilvl hisl проводили за допомогою неселективного методу (табл. N2). Використання для анал!зу трьох критерив - град!енту частот алелей 1 мШмуму мкожинних кросинговер!в, а також адитивностх в1дстаней на ге-нетичнлй карт! - дало можливЮть встановити порядок розташу-вання генетичних маркеров визначено як: thrl-metl-nicl-ilvi-hisl (мал.1).

Генетичний анал18 регенерант!в is чотирьохфакторного злиття протопласт1в 47-10 niel hisl X 42 thrl tetl проводили неселек-тивним методом. Використання для анал!зу трьох критерПв -град1енту частот алелей i м!н1муму мнокинних кросинговер1в, а також адитивност! в1дстаней на генеитепй карт1 - дало мешга-в1сть встановити порядок розтаиування генетичних локус!в: thrl-nicl-hisl-tetl.

Генетичний анал!з регенерант!в is чотирьохфакторного злиття протопластов 42 thrl tetl X 31 metí olel проводили неселектив-ним методом. Зг1дко вищенаведених критерПв встановлено такий порядок розташування маркер!в в даному злитtí протопласт1в; thrl-metl-tetl-olel.

Генетичний анал1з регенерант1в 1з чотирьохфакторного злиття протопласт!в 32 ilv2 prol X 47-146 niel hisl проводили несе-лективним методом. Генетичн1 маркери розтшован! такому порядку: ilv2-prol-nicl-hisl.

Таблица N2. Неселективний а»ал1з регенератов 1з злиггя протопласт 1в 7 п1с1 тэ1:1 Онт! ж 112 Иу1 Ыя!

Генотипи К1льк1сть Кросинговер

рекомб1нант!в в район1 (Мал.М!)

п!с met Ни- 11у Мб 90 с,е

+ т^ !Ьг 11У ЫБ 3 Ь,е

п!с шеЬ + + 5 -

+ те! thг Ну + 3 Ь,с1

п!с те! !Ьг + 1)13 3 с1,е

+ те! !Ьг + + 39 Ь,с

+ те! + + + 1 а,Ь,с,е

+ + Ш- + + 8 а,с

гас + !Ьг + + 1 а,Ь

Сума

153

«1Г

Мал.1 • Розташування генетичних локуяв на йльцаий карт) геному ! вщстан! м!ж ними в одиницяхреюмбмвцн (Дан! ¡з табл.2).

- J.ÍC -

Генетичний анал1з регенерант!в is чотиръохфакторного злиття протопласт1в 47-146 niel hisl х 31-25 metl purl проводили несе-лективним методом. Порядок розташування генетичних меркер1в в даному злигг! встановлено як: hisl-purl-metl-nicl

Неселективний анал1з регенерант1в is чотирьохфакторного злиття протопласт1в 31-31 metl thrl X 513 leul pdxl показав такий порядок розташування генетичних маркер!в: thrl-metl-leul-pdxl.

Anani3 колонiй i3 5-факторного злиття протопласт1в штам1Е 7nicl metl thrl X 32 ilv2 prol проводили з допомогою селективного методу. Селективнши маркерами в даному анал!з1 були (nlc+ рго-ь). в результат! селективного анал!зу на основ! двох критерПв: град1енту частота алелей i мШмума множинних кро-синговер1в було встановлено такий порядок розташування цих маркер1в: nici-prol-ilv2-thrl-metl.

2. Генетичний анал1г гетероклон!в. Справжн1 гапло1дн1 рекомбЬ нанти генетично стаб!льн1 i, репродукуючись, дають в подалыю-му т1льки гапло1ди, тод1 як частково дипло!дн! кл1тини при наступай репл!кацП утворюють колонП гетероклон1в, що Mic-тять гапло!дн! спори як рекомб!нантних, так i батьк!вських форм, зв!дки й походить 1х назва (гетерогеии клони).

Шсля розс!ву на повнод!нне середовице спор однхе! колони гетероклону з'являеться потомство сегрегант1в, що в!др!зняеть-ся своими генотипами. Ця важлива особлив^ть гетероклон1в дозволяв вести прямий п!драхунок частот рекомб1нац1! ген1в.

Характерною особлив!сш майже кожного гетероклону у bcíx злиттях протопласт!в е порушення píbhoctí частот комплементар-них генотиШв, як це спостер!галося ранше в лабораторП Хоп-

вуда при кон'югацхйних схрешуваннях у S. coelicolor А3(2).

При анал1з1 гетероююн!в використовують tí caMi критерП картуванкя, що й при селективному aHaaisi гашклдних рекомб!-HaHTie, а також адитивнЮть в1ддалей на карт!.

В результат! анал1зу двох гетероклон!в, !зольованих is злиття протопластов 47-146 niel hisl х 8-36 ilvl cytl, були Таблиця КЗ. Анал1з гетеероклонхв (злиття протопласт1в 47-146 niel hisl s 8-38 ilvl cytl)

Генотипк Число Кросингсвер

сегрегаят!в cerperaHTis в район! (Мал.N2)

N5 N6

nic his + 9 1 -

+ + ilv cyt 0 11

nic his + cyt 1 0 ñj b

+ + ilv + 2 8

+ + + + 5 5 a, с

nic his ilv cyt 13 6

+ his ilv cyt 0 1 a, d

nic + + + 0 1

nic his ilv + 3 6 b, с

+ his ilv + 9 24 b. d

nic + + cyt 0 1

nic + Ilv cyt 0 1 c, d

+ his + + 39 8

+ his + cyt 3 1 a, b, c, d

Сума 84 74

- 14 -

his •"«

57 17

his

Ь

Мал.2.ГраД|'екги частот хромосомних алелей в сегрегангах гетероиош'в N5 i N6 i вщстат м1жними в одиницяхресомбшаци Í3злиття протопласпв 47-146 niel hisl х 8-36 ilvl cytl (flaHi ó табл.3. )

визначен! частоти (табл. N3) рекомб1над11 м!ж локусами hisl-cyti (29%) та ilvl 1 cytl (36%), а також м!ж hlsi-ilvl (46%) (мал.N2) .

Результата анал!зу трьох гетероклон1в, 1зольовашх is злиття протопласт1в 45-141 Ш2 proi х 47-146 niel hisl, Дали можлив1сть вирахувати частоти рекомб!нацП мiж локусами hisl i ilv2 (28%) та ilv2 i prol (22%), а також nícl-prol (58%) i mík

hisl-prol (39%).

/

1з анал!зу гетероклону, 1зольованого is злиття протоплас-tíb 47-146 niel hisl x 31-25 metí purl були встановлен! часто-

- J.U -

ти рекдаШнацП i зчеплення м!ж локусами hisl i purl (19%) та purl i metí (18%).

Результати анал1зу гетероклон!в, 1зольованих 1з злиття протопластхв 47-146 metí thrl х 8-36 niel leul, дали можли-в1сть визначити частоти реюомб1каци м!к локусами metí i thrl (12%) i niel-leul (46%).

la анал!зу гетероклону, !зольованого ia злиття протоплас-т1в 7 niel metí thrl x 32 ilv2 prol були встановлен! частоти рекомб1нацП i 8чеплення mík локусами prol-ilv2 (32%) та thrl-metl (10%), а також м1ж thrl-llv2 (3%), nicl-metl (57%).

JaHi одержан! в результат! анал!зу гетероклон!в п!дтвер-дили порядок локус1в на генеигайй картi хромосоми, Естановле-ний ран!ше за допомогою анал!зу гапло!дних рекомб!нант1в, а також дали можлив!сть визначити в!ддал! м1к генетичними маркерами в одиницях рекомб!нац11 i оцхкити загальну довжину карти хромосоми, яка складas 215 одиниць рекомб!нац!1 (Мал.З)

•7

Генетична карта хромосоми Streptomyces antibioticus продуцента олеандом1цину. В!ддал1 м!к хромо-сомними алелями дан1 в одиницях рекомб1-нацП. Точна лока-лiзaцiя маркер!в на заштрихованих д!-лянках нев1дома.

Мал.З.

olel

3. Ресгрюаййшй акал is.

Для встановлення наявност! нао!'£в позахромосомно! спадко-воет! у шгам!В S.antibioticus 11891, 1790, 32-280, 0Л-1, ОЛ-71, що мали р!зний ступ1нь антиб!отичного синтезу, було проведено вшЦлення плазм!дно1 ДНК виде назеденими методами. В досл!джуваних штам!в S. antibioticus 11891, 1790, 32-280, 0Л-1, ОЛ-71 позахромасомно! ДНК Hi одним is вищезгаданих метод1в нам не вдалося виявити. Як в1дома досить часто позахромосомна ДНК зустр!чавтьоя в кл1тинах Streptomyces з дуде низькою Koniräic-тю. Так, наприклад, встановлено, що екстрахромосомний елемент eSAl присутн1й в к1лькост1 одн1е! копII на хромосому в автономному стан! при нзявност1 150 коп!й 1нтегрованих в хромосому S.antibioticus 1607.

Проведений реотрикцшний анал!з тотальних ДНК вид!лених al niTaMiB 11891, 1790, 32-280, 0Л-1 i ОЛ-71 показав наявн1сть 5 сайт1в впхзнання для ендонуклеази Pst 1, 7 сайт1в для - Bam HI i 16 сайт!в для Sal6 1, (Мал. 4). КореляцП м!ж р!внем бюсин-тезу антибхотику даними штамами i к!льк1стю фрагмент!в, що ут-ворюються з тотально! ДНК п1сля обробки рестриктазами не було виявлено. Нами зроблено припущення, що наявн1 множинн! душй-кацП фрагмент!в кромосоми у ' штам1в S.antibioticus 11891, 1790, 32-280, ОЛ-i, ОЛ-71 належать "silent" генам.

f. •

îia;. 4. г-стрккц;йжй анал!з ю-тасько; ДИК dt&míb 3. anti blot leus,

i-ЛКК craíy i 1 C-3iK z-:s!r.y ЛС-ОЛ 179C

3-ЛНК ЯЕ-gSC

4-ДНК игам'/ 0Л- i

.'4' ОЛ-71

1 2

5

4. Транс$оркшИя протопластis S. antiMotíeus ЛС-ОЛ 17Ш aa доиошго» ДШ Ш!гзм!ди pS3 1012.

Штач S, antibioticus ЛС-ОЛ 1790 e н&високсактквяюг проду-ценюм олуандоьнпжу. ыя с-гагюгкть ¿я-ергс для вивч^нвл екс-npeci: ген!з плазмхд:; рЗЗ 1912, se тактроптать зиктеэ антиЗЮ-тика ~ол1кетадксЯ прироет (Лол-су:'. Л,Б. и др., Шя;. СекДлькя олеакпсмИшн такек заноситься до пол1кетдаи}: ан'Гиб1отих1в, 1дел робогк пелягзла г сб'елЕанн! 5 сдк!й кл1?яр.1 р!гн;к re-ais. :со мак>'л- в1дйся?яня до зюскитгзу исл1кетид1в, взаемод!я яких модаз прзнесг;: до поселения скнтегу вщомик aöo до У-Ео-реннл яовкх ая?кб1о1кчвк речевкн. В1д6и::.гу:й для далг'жгс дсс-

л1дження Ti з регенерант!в, що в1др1знялися 1нтенсивним темно-коричневим забарвленням i були оточен! ореолом п!гменту такого ж кольору. В контрольному досл1д! под1бних колокiü регенеран-т1в не спостер!галось. Було в!д1брано для подалыаого досл!д-ження тридцять таких колонш. У в!д1браних трансформант!в була виявлена плазм!дна ДНК з аналог!чною рухлив!стю. Дослгди показали, що антибютична активн!сть трансформант!в була набагато вищою Bifl активност! вих!дного штаму ЛС-ОЛ 1790.

Проводилося досл!дження хлороформ-адетонових екстракт1в S. antibioticus ЛС-OJI 1790 i трансформакт!в за допомогою ТШХ. Екстракц!ю антиб1отику 1з агарових культур проводили cyMinnm хлороформу i ацетону (2:1), в як!й антиб1отик добре розчиня-вться, наносили на пластинки Silufol UY 254 i висх!дну хрома-тограф!ю проводили в двох системах розчинник!в: хлороформ-ацетон (2:1) 1 бензол-етил-ацетат-ацетон-етанол (4:2:1:0,5). Було встановлено, що як в ЛС-ОЛ 1790 так i в трансформант!в основ-ний компонент екстракт!в в обох системах розчинник!в мае Rf-0,95. Антиб1отичну активн!сть хроматограф1чних пластинок проявляли методом б1оавтограф1!". Досл1ди показали, що компонент з Rf-0,95 мае найб1льшу антиб!отичну активн!сть. Ця речо-вина MiHHe св1й код!р в залежност! в!д pH середовища.

Було проведено спектрофотомегричне досл1дження антиб1оти-ка з Rf-0,95. Як видно на мал.5. речовини мають три максимуми поглинання при 416, 333 i 211 нм, як! не в1др1зняються м!ж собою у препарат!в рец!пхента ! трансформант!в.

1з даних досл1джень випливае висновок про позитивну ре-гуляторну роль ген!в плазм1ди pSG 1912, яка проявляемся в п!двищенн1 синтезу лсовто-коричневого антибютика трансформантами в пор1внянн! з вих!дним рецип!ентним штамом.

ПГП

350 400 ! 500 600 700 800

11111)11 I I I I I I I I I I I I I

Мал. 5. Спектри поглшання антиб!отично! речовини з г?г«0,95 рецип!ентюго №5) итаму 1 трансформанта (У4).

вксновки.

1. Процес генетично! рекомб!нацП при злитт! протопласт!в у Б1:гер1отусез апиМсИсиэ-продуцеята олеандомШну характеризуемся утвореяням двох тип!в рекомб1нантних структур: ста-бШних гашкЯдних рекомб!нант1в 1 нестаб!льних дипло!д!в, що дають початок гетероклонам.

2, Висока частота 1 р!эноман1тн1сть комплементариях гено-тип!в гапло1дних рекомб!нант!в при неселективному анал!з! ре-комб!нантного потомства св!дчить про повноцхнний внесок гене-тичного матер!аду обома батьками в склад эиготк, ш,о дозволяе в!дбуватися кросинговерам в кожн!й д1лянц! хромосоми на протяз! регенерацП злитих протопласт!в.

3. Сегреганти гетероклон1в представлен! вих!дними бать-

к!вськими генотипами i гапло'^ними рекомб!нантами, що дае мож-лив1сть безпосередньо ви8начити частоту рекомб1наци mík генами.

4. öa допомогою селективного i аеселективного аналхзу гап-лохдних рекомб!нант1в, в основу hkoío покладено град1ент частот алелей i критерхи м1н1мальних частот множинних кросингове-р!в, встановлено порядок порядок розм!щення генетичних локус1в на хромосомой карт! Streptomyces antibioticus.

5. На основi анал!зу гетероклок!в п!дтверджено порядок ге-híb, встановлений анал!зом гапло'Шв, i визначено вз.ддал! м!ж yciMa 13 генетичними локусами на карт! хромосоми, загальна довжина яко'1 складае 215 одиниць рекомб!нац1'í.

6. Рестрикц!йний анал!з тотально! ДНК п'яти штам!в промис-лового продуценту олеандом1цину з р!зною антиб!отичною активною показав наявн1сть однакових повторив, що м1стять 5 сай-TiB розр!зання для ендонуклеази Pstl, 7 сайт!в-для BamHI, 16 сайпв-для Sal Gl, св!дчить про генетичну спор!днен!сть дос-л!дкуваних штамгв i в!дсутн!сть кореляцИ mí« к1льк!стю сайт!в рестрикцП ендонуклеазами i аитибЛотичнсио активн!стю.

7. Показано здатн1ать пла8м!ди pS61912 значно пивишувати синтез антиб!отично! речовини оранжевого кольору a Rf 0,95 у трансформант1в S. antibioticus ЛС-ОЛ 1790, що може вказувати на регуляторну роль плазмхди в експресП ген!в синтезу антибхоти-к!в у стрептом!цет1в.

- 21 -

СПИСОК РОБ1Т, ОПУБЛ1КОВАННХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦ1*

1. Шевченко А. А., Лукьянчук В. В., Мацелюх В. В. Картирование хромосомы Streptomyces antibioticus с помощью слияния протопластов.// Микробиол. к,-1992.-54.-N 4.-С.57-64.

2. Лук'янчук В. В., Мацелюх Б. П. Генетичне вивчения Streptomyces antibioticus- продуцента олеандом!ци-ну.//М1кробЮл. ж.-1996.-54.-N 4.-С, 57-64.

3. Sedina S. А., Lukyanchuk V. V., Naumenko О. V., Kigel N. F., Matselyukh В. P. Formation of protoplast of lactic-acid and, bifidus bacteria.// М1кроб1ол. ж.-1996.-54.-N 4.-С.57-64.

4. Шевченко А. А. Лукьянчук В. В. Генетический анализ продуцента олеандомицина.//Тезисы докладов VII съезда украинского микробиологического общества. 1989.-й.1.- С. 37.

5. Shevchenko A. A., Lukyanchuk V, V. Genetic analysis of the producer of oleandomycine.//Theses of the VII National conference of producing and using of antibiotics,-

"Bulgaria.- 1990.- p. 13.

6. Лукьянчук В. В.Шевченко А. А. Рестрикционный анализ хромосомной ДНИ различных штаммов продуцента олеандомицина// Тезисы докладов YI Съезда УОГиС . Полтава, 1992.- С.126.

7. Лукьянчук В. В.Шевченко А. А. Рестрикционный анализ хромосомной ДНК продуцента олеандомицинаУ/Тезисы докладов VI Съезда всесоюзного генетического общества. 1992,- С. 99.

8. Matselyukh В, Shevchenko A, Lukyanchuk V. Genetic map of Streptomyces antibioticus- producer of oleandomycin.//Theses of the 9th International Symposium of the Biology of Actinomycetes.-Moscow.-1994.-p.111.

9. Eresko G. A., Shevchenko A. A., Lukyanchuk V. V., Sedina

S. A., Naumenko 0. V., Kigel N p. Properties lactic acid and bifidus bacteria variants, which where obtained after protoplast regeneration.//Theses of the 24 International Dairy Congress.- Australia.- 1994.- p. 87. 10. Плазмидный анализ стартовых культур лакто и бифидобакте-. рий. // Тези допов1дей Всеукра'1нсько'1 науково-технхчно! г роэроОки та впровадження технолог1й в харчову та переробн> пр0мисл0в1сть. ки1в.- 1995.- с. 167.

Lukyanchuk V. V. MAPPING OF CHROMOSOME OF STREPTOMYCES ANT IBIOTICUS-PWWCER OF OLEANDOMYCIN USING FUSION OF PROTOPLASTS

The Candidate Thesis for a Master's Degree, a Specialitv 03.00.07 - Microbiology- Institute of Microbiology anc Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1996. The material of 10 scientific publication on results of genetic analysis of progeny of protoplasts fusion of auxotrophic, antibiotic inactive and antibiotic-resistant Streptomyces antibioticus mutants is defended. Senetic analysis of progeny was conducted by two methods: analysis of haploid recombinants and analysis of heteroclones. Arrangements of 13 loci and linkage between the corresponding pairs of markers were result of progeny analysis. These data served as a basis for construction of the preliminary map of oleandomycin producer genome.

ЛУКЬЯШК в. в. КАРТИРОВАННЫЕ ХРОМОСОМЫ 5ТЯЕР10ШСЕ5 М!Т1В10Т1СиБ - ПРОДУЦЕНТА ОЛЕДНДОМИЦИНА С ПОМОЩЬЮ СЛИЯНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07. - микробиология, Институт микробиологии и вирусологии ш.д.к.заиияотжл'и пап окраины, Киев, 1996.

Защищаются 10 работ, которые содержат результаты генетического анализа потомства полученного при слиянии протопластов ауксот-рофных, антибиотиконеактивных и антибиотико устойчивых мутантов Б1гер1отусез апИЫо^сиБ. Генетический анализ потомства проводился двумя методами- анализом гаплоидных рекомбинантов и анализом гетероклонов. В результате анализа потомства определен порядок расположения 13 локусов и установлено сцепление между соответствующими парами маркеров. Эти данные явились основанием для построения предварительной карты генома продуцента олеандомицина.

Ключоы слова: стрептсшцеги, протопласти, злиття протопласт^, рестрикц!я, трасформащя, трансфзрманти, антиб1отик, тонкошарова хроматограф1я, ст!йк1сть до антибютик1в, антиб1о-тична д!я.