Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое изучение особенностей генома Streptomyces Bambergiensis

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое изучение особенностей генома Streptomyces Bambergiensis"

90-' ¿У

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

• СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕСОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

У'

У/

УДК 377.211ООН573.113

ЗОТЧЕВ С*Ггей Борисович

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ГЕНОМА БТКЕРТОПУСЕБ ВАМВЕЯН!ЕМ31Э

Спаитльность 03.00.19 - Гмтика

Автореферат диссертации на соискание умелой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 19ТО

ПЕГ!""-":' 1

• ■ МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

а. ь. ссср

•>ГДОЛ |

гспртм'1."! ;-:-

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 377.2110011373.113

ЗОТЧЕВ Сергей Борисович

МОЛЕКиЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ГЕНОМА STREPTOMYCES BAMBERGIENSIS

Специальность 03.00.13 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени канвиаата биологических наук

МОСКВА - 1990

Работа выполнена в секторе молекулярной генетики актиномицетов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов*

Научный руководитель!

кандидат биологических наук

старший научный сотрудник А.В.ОРЕХОВ

Официальные оппоненты!

доктор биологических наук Н.Д.ЛОМОВСКАЯ профессор

кандидат биологических наук Н.в.РЯВЧЕНКО старший научный сотрудник

Ведущее учреждений! Институт по изысканию новых антибиотиков АМН СССР.

Эанита диссертации состоится января 1991г. в

' ' часов на заседании специализированного ученого совета Д.025.01.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики. и селекции промышленных микроорганизмов по ларвсуг 113345, Москва, 1 Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИгенвтика.

Автореферат разослан

декабря 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Актиномицвты широко используются а промышленности как продуценты антибиотиков, ферментных препаратов и других биологически активных векеств. Изучение генетических особенностей актиномицетных штаммов является важным втапом на пути создания новых высокоактивных штаммов-продуцентов. Одними из наиболее современных методов, позволяющими получить информацию о структуре генома микроорганизмов являются молекулярно-генетические методы исследований. Основным достоинством таких методов является выявление связей между фенотипически тестируемыми мутациями и изменениями в геномной ДНК.

Штаммы Б^ерЪотусея ЬатЬегд1епв1а продуцируют фосфогликолипид-ный антибиотик моеномицин (Флааомицин), который /спешно применяет— ся за рубежом для профилактики и лечения инфекционных заболеваний у животных и птиц [НиЬег,1979]. К началу наших исследований в литературе не содержалось данных о генетических работах с этим акти-номицетом. В связи с возможной организацией производства моеноми-цина а СССР актуальными представлялись молекулярно-генетические исследования Б.ЬатЬегд1епя1>. Получение информации об особенностях генома данного актиномицета наряду с отбором различного рода мутантов с измененной продукцией антибиотика и их характеристикой представлялось необходимым условием для создания высокоактивного штамма-продуцента.

Цель работы и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение стабильности признака образования моеномицина штаммами Б. ЬатЬегд1епа1з, получение набора неактивных мутантов, выявление собственных плазмид и разработка методов введения экзогенной генетической информации. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи)

- сравнительное изучение стабильности признака антибиотикооб-раэования у двух штаммов З.ЬатЬегд1епз1в|

- скрининг собственных экстрахромосомных элементов у исследуемых штаммов и их изучение!

- разработка методов трансформации штаммов Б.ЬатЬегд1епв1з ДНК экзогенных плазмид.

Нагчная новизна работы. В процесс» сравнительного изучения двух штаммов Б.ЬатЬегд1епв1а показано, что они являются родственными, однако существенно различаются по стабильности признака образования моеномицина. и обоих штаммов отобраны мутанты с измененным признаком антибиотикообраэоаания.

Генетическими методами показано наличие ■ штаммах 5.ЬашЬвгд1-еп51в генетических элементов, обеспечивающих высокие частоты рекомбинации при скрециваниях. Методом пульс-злектрофореза показано наличие в исследуемых штаммах гигантских линейных плазмид размером от 50 тпн до 640 тпн. Показана возможность переноса генетической информации в процессе межвидового скрещивания между Б.ЬатЬегд1еп~ и Б.1±у1с)ап«. После такого скрещивания физически идентифицирована плазмида оВ1-1 размером 42 тпн, именная, по-видимому, линейную структуру и образовавшаяся в результате жсцизии из автономного репликона большего размера в геноме Б.ЬатЬегд1епя1«.

Разработана система введения генетической информации а изучаемые штаммы посредством трансформации акзогенными плазмидными ДНК. Показана высокая Эффективность трансформации протопластов З.Ьаш-Ьегд1епьХб ДНК трех векторных молекул. Обнаружен феномен генетической нестабильности признака антибиотикообразования при введении в штаммы Б.ЬашЬегд1епз1в ДНК плазмиды риЗЗО.

Практическая значимость работы. В работе получен ряд неактивных мутантов штаммов Б.ЬатЬегд1еп915, которые могут быть использованы а качестве реципиентов для клонирования генов, участвующих в биосинтезе моеномицина. Показано, что для дальнейших селекционных и генно-инженерных работ перспективным является штамм Б.ЬашЬегд!-ьпб15 37.2, т.к. он яаляется генетически стабильным по признаку антибиотикообразования.

Обнаружение высокой частоты рекомбинации по признаку антибиотикообразования при скрещиваниях открывает возможности для конъю-гативного переноса генов, участвующих в биосинтезе моеномицина, что может сыграть определенную роль в процессе создания высокоактивного штамма. Корреляция между наличием гигантских линейных плаэмиг и образованием антибиотика позволяет предположить участие таких элементов в биосинтезе моеномицина.

Показана принципиальная возможность переноса генетической ин-

Формации при межвидовом скрещивании S.bambergiensis с неродственным штаммом S.lividans. Новая плазмида, выделенная а ходе данной работы, по-видимому, может быть использована для создания новых векторных молекул для актиномицетов.

Разработана система высокоэффективной трансформации протопластов S.bambergiensis векторными молкулами ДНК актиномицетов, что открывает возможности для клонирования генов в данных штаммах.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит страниц машинописного текста, рисунков, таблиц. Библиография включает в себя литературный источник.

Апробация. Результаты работы докладывались на 1вм рабочем совещании стран СЭВ. по проблеме "Генная инженерия продуцентов антибиотиков" (Львов,1986), 7*"* Международном симпозиуме по биологии актиномицетов (Токио,198Q), 2~" Международном симпозиуме по микробной сверхпродукдии (Чешке Будежовице,1988), Международном симпозиуме по генетике стрептомицетов (Эрфурт,1990) и на 6°м Международном симпозиуме по генетике промышленных микроорганизмов (Страс-сбург,1990), а также на межлабораторных семинарах отдела генетики ВНИИгенетика (1985- 1990 гг.)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штамму. В работе использовали актиномицетные штаммы 5.bambergiensls S712 и SS00 иэ коллекции ВНИИгенетика, а также штаммы S.lividans ТК64 и S.lividans ZX7, любезно предоставленные про«. Д.А.Хопвудом (Англия). ытаммы S.bambergiensls FP8, FPB-1, FT24, FT24-1, FD1, FD2, FD3, FD4 и FD3 получили в процессе выполнения данной работы. В качестве моеномицин-чувствительной тест-культуры использовали штамм Bacillus сегеиз.

Плазмиды. В работа использовали плазмиды актиномицетов pVGlOl с геном tsr устойчивости к тиострептону [Бирюкова и др.,19353, pIJ3S0 с геном tsr [Kleser et al.,1982], pIJ943 с генами tsr и me 1 (тирозиназа) [Lydiate et al.,'1985]. Плазмиды PSB1, PSB2, PSB3, PSB4, pBLl и pBL2 были обнаружены и охарактеризованы в ходе данной работы.

Среды и условия аырацивания. Для выращивания штаммов S.bam-bergiensit» использовали среау Гауэе 1 [Ломовская и Емельянова, 1971] и R2YE CHopwood et а1.,1985]. Для выращивания штаммов S.11-vidans использовали агариэованную полноценную среду СР-6 СЛомовс-кая и Емельянова,1971] и R2YE. Отбор клонов S.bambergieneie, устойчивых к стрептомицину и рифампицину проводили на среде МП CHopwood et al.,19SS], содержащей 20 мкг/мл стрептомицина и S мкг/мл рифампицина.

Для выделения плаэмидной ДНК культуры выращивали в жидкой среде TSB ("Sigma",США).

Для определения уровня биосинтеза моеномицина актиномицетные штаммы выращивали в комплексной жидкой среде.

Обработка культур мут генами. Обработку культур ультрафиолетовым излучением проводили по известной методике CHopwood et al., 1985]. Для индукции мутаций бромистым этидием культуры выращивали на среде Гауре 1, содержащей S мкг/мл бромистого этидия.

Перед обработкой 1,2,7,8-дизпоксиоктаном споры актиномицета инкубировали на качалке в течение 3 ч в среде TSB ("Sigma", США) при 29"С и 220 об/мин. Затем в суспензию добавляли дияпоксиоктан до конечной концентрации 37. и инкубировали в течение 1 ч при тех же условиях.

Проведение скрещиваний. Скрещивание актиномицетных штаммов проводили на среде R2YE. Споровые суспензии скрещиваемых штаммов еысевапи на чашки Петри со средой R2YE и инкубировали при 29°С в течение 7 суток. Споры с чашек смывали стерильной дистиллированной водой и высевали на селективную среду для отбора, рекомбинантов.

Трансформация плаэмидной ДНК. Для получения протопластов актиномицетных штаммов культуры выращивали в среде YEME с добавлением глицина CHopwood et а1.,1983]. Лизис мицелия проводили при 30«"С ■ течение 90 мин в среде Р [Okanishi et al.,1973], содержащей 1 мг/мл лиэоцима. Регенерацию протопластов осуществляли на среде R2YE. Трансформацию протопластов актиномицетных штаммов проводили как описано ранге CHopuood et al.,1985].

Выделение плаэмидной и хромосомной ДНК. Препаративное выделение плаэмидной ДНК из штаммов актиномицетов проводили методами, описанными Hcpwood et al. (1985). Выделения плаэмидной ДНК pBLl проводили по модифицированной методике щелочного лизиса [Kiecer,

1984]. Модификация состояла в замена повторной обработки препарата нейтральным «снопом на добавление к раствору равного объема ЮМ |.1С1 с последующим удалением преципитата центрифугированием.

Выделение тотальных ДНК иэ штаммов 5Ъгер1отусев проводили по методикам, предложенным Нормоой еЬ а1.(19В5).

Рестрикционные эндонуклеаэы. Рестрикционные эндонуклеаэы производства НПО "Фермент" получали через Б.А. Ребентиша (ВНИИгенети-ка) и использовали а условиях, рекомендованных изготовителями.

Электрофорез ДНК в агарозных гелях. Электрофоретический анализ ДНК проводили в горизонтальных 0,72-1 V. агарозных гелях в буферах ТАЕ или ТВЕ [Норьоой еЪ а]., 1983]. Гели окрашивал!- в растворе, содержащем 0,3 мкг/мл бромистого этидия, в течение 30 мин.

Пульс-электрофорез иммобилизованных в агароэе тотальных ДНК актиномицетных штаммов проводили в 1У, агарозных гелях в буфере 0,ЭхТВЕ на аппарате "Диапульс" (НКПО "Диагностикум", СССР).

ДНК-ДНК гибридизация. НиК-трлнсляцию ДНК зонда проводили как описано у Млниатис и др.(19В4). Перенос ДНК иэ гелей на нейлоновые мембраны "Zeta-Probe" ("В1оИа<1", Австралия) проводили по известному методу [Маниатис и др.,1984]. ДНК-ДНК блот-гибридизацин) осуществляли по ранее описанной методике [Нормоос* е! а1.19ЭЭ]. Радиоавтограф получали путем экспонирования мембраны с рентгеновской пленкой марки РМВ при -70"С в течение 1-7 суток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительная характеристика штаммов 5.ЬатЬега¿епз1з.

При выращивании штаммов Э.Ьа*пЬегд1епз1в на твердой питательной среде обнаружили существенные различия в морфологии колоний двух штаммов, что позволило предположить наличие генетических особенностей, отличающих данные штаммы друг от друга. Одним иэ наиболее часто используемых методов, позволяющим не только определять степень родственности актиномицетных штаммов, но и выявлять изменения в геноме, является метод рестрикционных "фингерпринтоа" тотальных ДНК.

Иэ штаммов З.ЬатЬегд1епв1з Э712 и БВ00 выделяли тотальную ДНК, которую затем подвергали ферментативной обработке с помощью раз-

личнык эндонуклеаз. Наилучшие результаты, т.е. образование широкого спектра Фрагментов ДНК различной величины, получались при влек-трофорезе тотальных ДНК штаммов 8.ЬатЬегд1епг15, расщепленных зн-донуклеазами ВатН1, Вд1П, Крп1, PstI и Руи11.

Визуальный анализ рестрикционных "фингерпринтов" тотальных ДНК штаммов Б712 и 5ВОО позволил обнаружить ряд различий. Так, некоторые полосы на влектрофореграммах, соответствующие определенным Фрагментам ДНК, оказались более интенсивными у одного штамма гЮ сравнении с другим. Результаты сравнительного изучения "фингер"-принтов" представлены в табл.1.

Таблица 1. Различия в электрофореграммах тотальных ДНК штаммоЬ Б. ЬатЬегд1ег Б712 и Б800, обнаруженные методой

рестрикционного "фингерпринта".

Эндонуклеаза Полоса Интенсивность полосы на "фингерпринт*"

тпн ---------------------------

Б712 Б800

Ват Н1 8.8 +++ +.

7.6 +++ +

23.7 + +++

Вд1 II 6.6 . +++ +

4,3 + +++

8.2 +++ + P%t I 7.8 ? ++

6.2 +++ ?

Руи II 11.6 +++ +

10.9 +++ +

13.7 +++ +

Крп I 8.8 +■ +++

5.3 + +++

Примечания! (♦) - наличие полосы|

(?) - полоса не обнаруживается.

Таким образом показали, что рестрикционные "»ингерпринты" тотальных ДНК обоих штаммов сходны по большинству фрагментов, что позволяет говорить о близком родстве изучаемых штаммов. В то же время, обнаруженные различия позволяют предположить, что некоторые' участки генома у штаммов Э712 и 5800 организованы по разному. Этим, по-видимому, могут быть обусловлены наблюдаемые различия в морфологии колоний.

2. Изучение стабильности признака антибиотикообразования у штаммов З.ЬатЬего1еп»1в.

С целью сравнения штаммов 5.ЬатЬегд1епв1в Э712 и 5800 по признаку антибиотикообразования был проведен эксперимент по определению уровня биосинтеза антибиотика этими штаммами.

Рис.1. Гистограммы распределения уровней накопления антибиотика среди вариантов штаммов г.ЬатЬегд1епв1в 8712 и БВ00.

80

Количество вариантов 50

40

30

20

10 0

П 3712 Ш ЭвОО

Активность, ед/мл

По 100 клонов каждого штамма культивировали в комплексной жидкой питательной среде и определяли уровень накопления антибиотика в культуральной жидкости. Гистограммы распределения уровней накопления антибиотика штаммами S712 и S300 представлены на рис.1. Как видно из гистограмм, разброс значений антибиотической активности в потомстве штамма S800 значительно шире, чем в случае штамма S712.

Для изучения генетической стабильности признака антибиотикооб— раэования у штаммов S.bambergiensis провели эксперименты по обработке культур различными мутагенными «акторами, оказывающими дестабилизирующее действие на геном актиномицетов. В качестве таких «акторов использовали выращивание на среде с бромистым атидием, облучение ультрафиолетовыми лучами и протопластирование. Для контроля стабильности признака антибиотикообразования использовали естественные рассевы штаммов S712 и S800. Результаты проведенных экспериментов приведены в табл.2.

Таблица 2. Влияние мутагенных Факторов на изменчивость штаммов S.bambergiensis S712 и SS00.

Частота Частота

Выживаемость морфологических мутаций Ant-

Мутагенный мутаций

Фактор ______________________________________

S712 S800 S712 SB00

S712

SS00

ЭБ, 8,1- Ю-1 3,2-10-* 3,1-10-* 1,2-10"» <10"=» 4,9-10-»

5 мкг/мл

УФ, 3,0-10-» 2,2-10-» В.0-10-» 1,3-10-* <10"» 2,3-10-*

1200эрг/мм»

ПР

ЕР

1 1,0-10-* 4,3-10-» 3,0-10-» 7,3-10"»

1 1,0-10—» 3,0-10-=" <10"» 1,0-10-»

Примечанил» ЭВ - этидиум бромид| U0 - ультрафиолетовое иэлуче-Huej ЛР - протопластиров«нив| ЕР - естественный рассев,

Приведенные данные показывают, что потерю признака антибиоти-кообраэования с высокой частотой вызывают у штамма SBOO все использованные «акторы. Кроме того, мутанты Ant" возникают у данного штамма спонтанно с частотой IX. В случае же штамма S712 мутанты Ant- были отобраны только после протопластирования, другие обработки не приводили к возникновению неактивных мутантов. На основании полученных данных был сделан вывод о том, что признак образа" аания антибиотика у штамма S.bambergiensis 5ВОО гораздо более нестабилен чем у штамма S712. Масть мутантов Ant-, отобранных в ходе экспериментов, была использована в дальнейшей работе.

С целью обнаружить возможные перестройки в геномах мутантов Ant- S.bambergiensis S712 и SBOO тотальную ДНК, выделенную из таких мутантов расщепили эндонуклеазами и провели электрофорез полученных Фрагментов ДНК в агароэном геле. Всего таким способом у двух штаммов проанализировали по 7 мутантов Ant-, полученных после различных обработок. Однако, каких либо видимых изменений а тотальных ДНК мутантов по сравнению с .исходными штаммами не обнаружили.

Ытаммы S.bambergiensis S712 и S800, а также 4Ь неактивных мутантов проанализировали традиционными методами CHopwood et al., 1985] на предмет наличия в них плаэмидных ДНК. Ковалентно замкнутых кольцевых плаэмид в изучаемых штаммах не обнаружили. Отсутствие собственных ковалентно замкнутых кольцевых плаэмид у S.bambergiensis послужило причиной для разработки системы введения генетического материала в штаммы S.bambergiensis на основе гетерологич-ных плаэмид.

3. Разработка системы молекулярного клонирования для штаммов S.bamberolensls.

К моменту выполнения настоящей работы в литературе не содержалось данных о получении протопластов у S.bambergiensis и их трансФормации плазмидными ДНК. С целью определения оптимальных условий образования и регенерации протопластов S.bambergiensis провели ряд

экспериметов. В ходе исследований подобраны условия, описанные в разделе Материалы и методы, при которых у обоих штаммов образуются способные к регенерации протопласты а титре до 4-10" кл/мл. Такие результаты позволили приступить к изучению возможности введения в протопласты S.bambergiensis гетерологичных плазмидных ДНК. Культура S. bambergiensis оказалась чувствительной к тиострептону, что позволило использовать для трансформации векторные молекулы несущие ген tsr.

Трансформацию протопластов штаммов S.bambergiensis S712 и S800 плазмидными ДНК проводили по известной методике [Bibb et al.,19783 с использованием 2S7. раствора ПЭГ1000. Для трансформации протопластов изучаемых штаммов использовали плазмидные ДНК pVGlOl, pIJ350 и pIJ943. Все указанные плазмиды содержали ген устойчивости к тиострептону tsr и были сконструироеаны на основе трех различных репликонов актиномицетов.

В процессе работы получены транс«орманты обоих изучаемых штаммов всеми использовавшимися д/"я трансформации плазмидными ДНК. Показано, что плазмиды pVGlOl, pIJ3S0 и pIJ943 структурно стабильны в штаммах S.bambergiensis S712 и SQ00. Данные по эффективности трансформации протопластов штаммов S712 и S800 экзогенными плазмидными ДНК и стабильности наследования плаэмид приведены ■ табл.3.

Как видно из таблицы 3, протопласты изучаемых штаммов S.bambergiensis трансформируются ' плаэмидной ДНК с высокой Эффективностью. Кроме того, Эффективность трансформации для плаэмид разного размера (pIJ350 -4,1 тпн и pIJ943 - 20,6 тпн) примерно одинакова. Плазмиды pVGlOl и pIJ943 в неселективных условиях наследуются в штаммах S.bambergiensis более стабильно, чей pIJ350. Таким образом, в качестве векторных молекул для клонирования генов в S.bambergiensis могут быт<э рекомендованы плазмиды pVGlOl и pIJ943.

При изучении стабильности экзогенных плаэмид, введенных в штаммы S.bambergiensis S712 и S800 посредством трансформации, была отмечена сегрегация морфологических признаков в неселективных условиях среди потомства клонов трансформантов обоих штаммов, содержащих плазмиду pIJ350. Такого Эффекта не наблюдали, если в рассеье иепо/<ьэооались клоны штаммов S712 и SQ00, содержащие плазмиды piVGlOl и pi J943 .

Таблица 3. Эффективность трансформации протопластов штаммов S.bambergiensis ДНК экзогенными плазмидами и стабильность их наследования в трансформантах.

Стабильность наследования

Актиномицетный Плазмида Эффективность --------------------

штамм трансформации с без

селекцией селекции

S.barnbergiensis

S712 pVGlOl 2,4-10-* 1 9,9-10-»

S800 4,5-10"» 1 9,4-10-» S.barnbergiensis

S712 рЫЗЭО 3,7-10-» 1 7,6-Ю-1

SB00 3,2-10-» 1 7,8-Ю"1 S. barnbergiensis

S712 pi J943 2,9-10"» 1 9,9-10"»

S800 4,3-10"» 1 9,3-Ю"1

Примечание) для трансформации 2-10" протопластов использовали

1 мкг плазмидной ДНК.

Проверка потомства клонов S.barnbergiensis S712[plJ3303 и SB00 CpIJ330] на антибиотическую активность показала, что среди них содержится большое число вариантов Ant-. Частота возникновения таких вариантов в потомствах клонов S712CpIJ3303 и S800CplJ350] составила соответственно 1,6-10"» и 1,8"Ю-1. В потомстве трансформированных клонов обоих штаммов, содержащих плазмиды pVGlOl и pIJ943, а также лариантов после протопластирования не обнаружили отличий от потомства исходных штаммов в естестэенном рассеое.

Дальнейшее изучение влияния чкэогенных плазмид на стабильность признака антибиотикообразовгяия проводили на штамме 3800. Как показал анализ рассева клона S800CPIJ330], проведэнмл-о о несалек-тивных условиях, его потомство было гредстазпено 4 группами штаммов. различающихся по признаку антиеиотикообразоэания- и наличию плазмиды. Для дальнейшего изучения в»:5рали 20 аа^мантоо из потом-

стеа клон» гвООСр!¿330], мутанты Ап^-м потомства трансформантос Б800 • [рУЗЮЮ и &800С р!Л9433 , а также варианты из естественного рассева штамм« 5800. Перечисленные штаммы изучали на предмет стабильности наследования плазмид, антибиотической активности, наличия плаэмидной ДНК и перестроек ■ геноме. Результаты исследований отражены в табл.4.

Для вариантов РТЗ (АпЪ~Р-), РТ13, РТ14, ЯТ17 и РТ19 <Ап»:-Р~), излеченных от плазмиды рЫЗЗО естественным путем, показано, что антибиотическая активность у них не изменяется. Таким образом, Фенотипы указанных штаммов по-видимому обусловлена определенными изменениями в их геноме и не являются следствием наличия вкзогенной плазмиды. Попытки выделения из всех вариантов плазмидных ДНК отличных от введенных дали отрицательный результат.

Таблица 4. Изучение особенностей штаммов, отобранных из потомства клонов 5.Ьа1лЬегд1еП91в БВОО, трансформированных различными экзогенными плаэмидами.

Метод Антибиотическая Стабильность Штамм Фенотип получения активность, X наследования

от Б800 плазмиды

5800 РМ-Р^ РТ1 РТ2

РТЗ-РТ5 РТ6-РТ8 РТ9-РТ19 РТ22-РТ24

Ап^" Ап1" Ап^Р* АпЬ-Р-Ап^-Р* Ап1*Р" Ал1-Р-Ап^Р"

ЕР ЕР

ЕРТ рУ3101 ЕРТ рЮ943 ЕРТ рЫЗЗО ЕРТ рЫЗЗО ЕРТ р1Д330 ЕРТ риЗЗО

100 1-2 1 1

33-60 30-73 0,1-* < 0,1

9,9-10-* 9,3-10"*

9.7-10-*

9.8-10-*

Примечание! ЕР - естественный рассев{ ЕРТ - естественный рассев трансформанта) прочерк - плаэмида отсутствует. С целью обнаружить возможные геномные перестройки у изучаемых мутантов, тотальную ДНК всех штаммов, представленных в табл.4 исследовали методом "фингерпринта" с помоцью хндонуклеаз ВатН1, Крп1, Руц11 и Вд111. При электрофорезе расцепленных зндонук—

леааой BamHI тотальных ДНК мутантов FT22, FT23 и FT24 наблюдали отсутствие на электрофореграммах трех характерных для генома штамма дикого типа полос размером примерно 23 тпн, 32 тпн и 43 тпн. На "Фингерпринтах" тотальных ДНК этих вариантов, полученных с помощью зндонуклеазы PvuII отсутствовали четыре характерных полосы размером 9,5 тпн, 16 тпн, 20 тпн и 23 тпн. Приведенные данные позволили предположить наличие в геноме штаммов FT22, FT23 и FT24 обширной делеции размером не менее 50 тпн. Методом рестрикционного "фингер-принта" отличий в геномах других вариантов от штамма SB00 не обнаружили. Естественно, этот факт не может однозначно указывать на отсутствие перестроек в геномах изученных штаммов. Так, предполагаемая делеция в геномах штаммов FT22-FT24 не идентифицируется с помощью эндонуклеаэ Pstl, BgIII и Kpnl, что может объясняться насыщенностью делегировавших фрагментов ДНК участками расщепления данными Ферментами.

На основании полученных результатов предположили, что введение плазмиды pIJ350 необратимо дестабилизирует геном штамма S.bamber— giensis 5800, т.е. приводит к образованию истинных мутантов. Однако механизм генерации генетической нестабильности в штаммах S.bambergiensis при введении плазмиды pIJ330 остается неясным. Эксперименты по ДНК-ДНК гибридизации не выявили областей существенной гомологии между Тотальной ДНК штаммов S712 и S300 и ДНК плазмиды pIJ330. Тем не менее, нельзя исключать взаимодействие ДНК плазмиды pIJ330 с геномом S.bambergiensis.

Несмотря на то, что штамм S.bambergiensis S712 генетически более стабилен, чем штамм S800, введение плазмиды pIJ3D0 также приводит к его дестабилизации. В результате анализа потомства клона S712[pIJ350] показали картину сегрегации Фенотипов сходную с полученной для штамма S800CptJ330J. Рестрикционный анализ геномов неактивных мутантов, отобранных из потомства клона S712[pIJ350] позволил идентифицировать штакмы с делациями, затрагивающими по-видимому те же области генома, что и у мутантов FT22-FT24. Один из т»—. ких мутантоэ, FD1 (фенотип Ant-P"), был использован нами о дальнейшей работе по изучению особенностей генома S.bambergiensis.

Таким образом показали, что векторные молекулы pVGlOl и трансформируют протопласты штамкоа S.bambergiensis с высок-31't гл-Фектианостью. Данные плазмиды, по-видимому, могут испальзооаться

длл клонирования генов в в.ЬатЬегд1епв1в.

4. Обнаружение и изучение внехромосомных элементов Э.ЬатЬега!-еп51».

Хорошо известно, что присутствие конъюгативных плазмид в штаммах актиномицетов можат существенно повышать частоты рекомбинации при скрещиваниях [Нориоой еЪ а 1.,1983]. С целью проверки таким методом наличия а штаммах 8.ЬатЬегд1еп«1с половых «акторов провели межвидовые скрещивания с участием неактивных мутантов, у которых спонтанно были получены дополнительные мутации устойчивости к ан- . тибиотикам рифампицину и стрептомицину. Один из мутантов РР8-1, отобранный после регенерации протопластов у штамма 5712 имел фвно- . тип Аг^-Б^1-, другой мутант РТ24-1 был получен а ходе исследования влияния плаэмиды риЗЗО на стабильность штамма 5800 и имел Фенотип Аг^-Р^1".

Результаты скрещивания штаммов РР8-1 и РТ24-1 со штаммом 2712 (Ап^Б^"^^) и друг с другом приведены в табл 3.

Таб.3. Рекомбинация при скрещивании штаммов 5.ЬагоЬегд1еп«1в.

Скрещивание Титры родительских Частота

штаммов рекомбинации

S712 » FP0-1 1,7* 10т » Ь,0-Ю» 6,2-10~*

S712 * FT24-1 3,2*10* " 8,0-10» 4,8-10"»

FP3-1 * FT24-1 2,2-10* * 1,3-10» <10"»

Высокая частота рекомбинации по маркерам Ant и Str(Rif) при скрещивании штаммов 5.bambergiensi* свидетельствует в пользу наличия у данного актиномииета Фактора Фертильности.

Предположили, что мутанты S.bambergientis, содержащие однотипную дэлецию в геноме могут иметь измененный статус Фактора Фер—

тильности и, следовательно могут использоваться в качестве контроля для изучения Фенотипа "летального зигоэиса" (Ltz*), присущего большинству Факторов Фертильности актиномицетов. После мутагенеза штамма S.barnbergiensis S712 1,2,7,8-диэпоксиоктаном отобрали 4 варианта FD2 — FD3 , не синтезирующих антибиотик. Методом рестрикци-онного "Фингерпринта" показали, что мутанты FD2 - FD3 содержат делению в геноме, характерную для штаммов FT24 и FD1.

При совместном выращивании штаммов S712, SQOO и мутантов Ant-обнаружили проявление Фенотипа Ltz" на газонах штаммов FD2, FD3, FD4 и FD3, что укаэывло на присутствие факторов Фертильности в штаммах S712, S800, FT24 и FD1. По-видимому, в штаммах FD2, FD3, FD4 и FD5 такие элементы либо отсутствуют, либо подверглись определенным генетическим изменениям.

На рис. 2 представлены результаты пульс-электрофореза тотальной ДНК штаммов S712, FD1, FD2, FD3, FD4, FD5, S800 и FT24. Как видно из рисунка, в препаратах ДНК штаммов S712, S800 и FT24 содержатся гигантские линейные плазмиды < ГЯП) различного размера.

Рис.2. Пульс—влектрофореграммы тотальных ДНК штаммов S.bambei— giensis.

M «Т12 FD1 FM F03 F04 FDO «800 FTÎ4

>900 kb—

• 700 kb' 660 kb-

460 kb-370 kb-290 kb-260 kb-

Б штамме S712 обнаружена ГЛП размером примерно 643 тпн, обозначенная PSB1. утамм SBOO содержит две Г/1Г) размером примерно 370 тпн и 50 тпн, а штамм FT24 — одну ГЛП размером около 30. тпн. Эти плазмиды были обозначены соответственно PSB2, PSB3 и PSB4. В штаммах PD1-FDS ГЛП не обнаружили. Наличие в штаммах S.bambergiensis ГЛП коррелирует с данными по изучений Фенотипов Lti" у перечисленных штаммов. Исключением, однако, является штамм F01, проявляющий Фенотип Ltz", но не содержащий ГЛП. Такой Факт не позволяет сделать однозначный вывод о плазмидном статусе данного штамма.

Корреляция между рестрикционными "Фингерпринтами" тотальных ДНК и результатами пульс-электрофореза позволяет предположить, что характерные фрагменты GHK, отсутствующие в делеционных вариантах, ' входят в состав ГЛП. Хорошо прослеживается также корреляция между наличием в штаммах S.bambergiensie ГЛП и их способностью синтезировать моеномицин. Панине по скрещиванию маркированного штамма S712 с мутантом FD4 показывают, что признак антибиотикообразования способен с высокой частотой передаваться при коньмгации е бесплаз-мидный штамм. Появление в ргкомбинантном штамме ГЛП сопровождалось восстановлением способности к синтезу моеномицина.

3. Выделение и характеристика элемента oBLl.

Ввиду полученных генетических данных о наличии у S.bambergiensis фактора(ов), обеспечивающего высокую частоту рекомбинации при скрещиваниях и о присутствии ГЛП, которые могут играть роль такого Фактора, представляло интерес проверить возможность переноса генетического материала иэ данного актиномицета при межвидовом скрещивании. штамм S.bambergiensis S712 скрещивали со штаммом S.lividans ТК64 (фенотип Pro-Str"-). После селекции против донорного штамма на газоне штамма ТК64 обнаружили зоны Ltz", иэ центров которых изолировали 24 клона. По сравнению со штаммом ТК64, полученные клоны имели значительно измененную морфологию и сильно пигментировали. Сделали вывод о том, что отобранные штаммы образовались в результ тате переноса определенной генетической информации иэ штамма S. bambergiensls S712 в штамм S.lividans ТК64. Рестрикционные "фин-герпринты" ДНК рекомбинантных клонов не отличались от "фингерприн-

тов" ДНК штамма ТК&4.

Для дальнейшего изучения выбрали клон, обозначенный SBCQ, обладающий следующими фенотипами! Ltz"* на газсне штамма ТК64, Blue* (синтез темно-синего пигмента) и Spoi (сниженная по сравнению со штаммом ТК64 споруляция). В потомства клона SBC8 (проверено 830 колоний) обнаружили сегрегацию Фенотипов, представленную на рис 3.

Провели изучение проявления Фенотипов Ltz"* штаммов А, AI, В, С и С1 при совместном выращивании. Как оказалось, все штаммы-сегре-ганты, кроме AI, проявляют Фенотип Ltz"* на газоне штамма ТК64. Кроме того, штаммы В и С проявляют фенотип Ltz*" на газонах штаммов А, AI и С1. Эти результаты, позволили предположить, что в штаммах В и С содержатся по два Фактора с различающимися функциями Ltz. Штаммы А и С1 содержат, по-видимому, только по одному фактору с одинаковой функцией Ltz. Штамм AI потерял, вероятно, оба Фактора, определяющие Фенотип Ltz"".

Рис.3. Схема сегрегации Фенотипов в потомстве рекомбинантного клона S.llvldans SBC8.

Методом щелочного лизиса плаэмидную ДНК обнаружили только с штаммах В и С. Рестрикционное картирование не обнаружило различий в ДНК плазмид, выделяемых из штаммов данных штгмков. Размер пл^э-миды, обозначенной pBLl, подсчитанный как сумма величин орзгг.-и^—

тон, обраэующихся после расцепления эндонуклеаэами, составил около 42 тпн. ДНК генетического элемента рВ1_1 не отделялась от хромосомной «ракции при центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия. Этот факт заставил предположить необычную структуру элемента рВ1_1. Обработка ДНК рЕ1_1 проназой показала наличие белка, связанного со специфическим фрагментом рВ 1-1. Из-за присутствия белка такой фрагмент ДНК имел аномальную электрофоретическую подвижность в агарозном геле.

Плаэмиднан ДНК в штаммах А и С1 не идентифицировалась при влек-трофорезе и ее присутствие было показано лишь в результате трансФормации протопластов Б.1^1йапг ТК64. Данная плазмида была обозначена рВС2.

Как показали эксперименты по трансформации протопластов штамма Б.ЦуХбапв ТК64, ДНК рВЬ1 может трансформировать штамм с Эффективностью до 10"3. Провели изучение влияния белка на трансформирующую активность ДНК обнаруженных плазмид. В ходе эксперимента изучили эффективность трансформации протопластов штамма 8.1^1йапв 1X7 ДНК рВ1_1, рВ1.2 и р1Л94.Ч как до, так и после обработки проназой. Согласно полученным данным, обработка проназой приводит к существенному снижению трансформирующей активности ДНК рВ1.1 и практически не влияет на ДНК рВ1_2 и р1Л943.

С целью изучения конформации ДНК рВ1.1 провели изучение подвижности ДНК рВ1-1 в агарозном геле при пульс-электрофорезе. Как показали предварительные эксперименты, ДНК я кольцевой ковалентно жамкнутой Форме при пульс-электрофореэе мигрирует в геле медленнее, чем линейная форма. ДНК рБИ обнаруживается при пульс-электрофоре— зе в виде зоны, подвижность которой выше чем подвижность ДНК фага Д и ДНК ри943 в кольцевой форме, но ниже подвижности линеаризованной ДНК р 1 ¿943. Необходимо отметить, что подвижность ДНК рВ1-1 при использованных условиях электрофореза не зависела от наличия или отсутствия связанного с ней белка. Основываясь на данных о размере ДНК рВ1.1 предположили, что она имеет линейную конформацию. В то же время, ДНК РБ1_1 выделяется методом щелочного лизиса, преду полагающего цикл денатурацииЧренагурации для избирательного выделения кольцевой ковалентно замкнутой ДНК. Согласно нашему предположению, белок может быть связан с обеими цепями ДНК рВЬ1, благодаря чему полного расхождения нитей при денатурации не происходит

и ДНК рВИ може~г успешно ренатурироеать.

Провели рестрикционное картирование ДНК рВ1-1, причем обрабатывали эндонуклеазами как нативную ДНК рВ1_1, так и подвергнутую про-назной обработке. Было отмечено, что эндонуклеаза ХЬа1 имеет уникальный участок расщепления в ДНК рВ1_1, причем фрггмент размером 2,7 тпн входит в гель только после пронаэной обработки ДНК рВ1_1. По-видимому, такой «акт может объясняться тем, что белок связан с ДНК рВ1_1 вблизи одного из концов молекулы. Для построения более подробной рестрикционной карты рВ1_1 использовали эндонуклеазы Вд111, ЕсоЯ1 и ЕсоИУ. Интерпретация полученных данных привела к созданию гипотетической модели структуры ДНК элемента рВ1.1, представленной на рис 4.

Рис.4. Модель структуры злемента рВ1_1 в штаммах Б.11у1йап5.

белок

— 1 кЬ

С целью выяснения вопроса о происхождении элекента р01_1 провели эксперимент по Сауэерч-гибридиэации меченной <?С-"Р ДНК рВ1_1 с расцепленными ВятН1 тотальными ДНК штаммов З.ЬатЬегд1ег151з. На предмет наличия последовательностей гомологичных рВЬ1 изучали тотальные ДНК штаммов Б. ЬашЬагд1епв1» Б712, Г01, РС2-РГСЗ, Б800 и РТ24. Зоны гибрилизации ДНК зонда с тотальными ДНК штаммов Б7)2, 5800, Р01 и РТ24 не отличались 1руг от друга и, за исключением двух Фрагментов, полностью совпадали с зонами, соответствующими ВатН1—фрагментам ДНК рЗД.1. Эти данные позволили предположить, что элемент рВ1.1 образовался в результате эксцизии фрагмента ДНК из генома 5.ЬатЬегд1еп51а. Показано отсутствие последовательностей ДНК гомологичных рВ1-1 в геномах штаммов Я02-Р05, излеченных от ГЛП.

Для балев точной локализации элемента pBLl в геноме штаммов S.bambergiensis провели гибридизацию меченной об-ЗЯР ДНК pBLl с разделенными пульс-электрофорезом тотальными ДНК указанных выше штаммов. Обнаружили, что ДНК pBLl имеет строгую гомологию с некоторыми гигантскими линейными плазмидами в штаммах S.bambergiensis. В частности, ДНК pBLl гибридизуется с ДНК плазмиды PSB1 размером 640 тпн, присутствующей в штамме S712. Обнаружили гибридизацию ДНК pBLl с высокомолекулярной фракцией ДНК штамма FD1, что может указывать на локализацию элемента pBLl в хромосоме данного штамма. ДНК pBLl гомологична ДНК плазмид PSB3 и PSB4 (50 тпн), присутствующих соответственно в штаммах SB00 и FT24, но не имеет областей существенной гомологии с ДНК плазмиды PSB2 (370 тпн) иэ штамма S800.

В результате проделанной работы показали, что элемент pBLl образовался в результате эксциэии сегмента ДНК иэ гигантской линейной плазмиды S.bambergiensis. Наличие в ДНК pBLl уникального участка для расщепления эндонуклеазой Xbal возможно позволит использовать данную плаэмиду для со?йания актиномицетмых векторных молекул.

ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ стабильности признака образования антибиотика у штаммов S.bambergiensis S712 и S800. Показано, что данный признак гораздо более стабилен у штамма S.bambergiensis S712, чем у штамма SB00.

2. Разработана методика получения способных к регенерации протопластов штаммов S.bambergiensis. Показана эффективная трансформация протопластов штаммов S.bambergiensis ДНК плазмид pVGlOl, и pIJ943, которые могут использоваться в качестве векторов для клонирования ДНК в данных штаммах. В то же время, показана индукция нестабильности признака антибиотикообразования при введении в штаммы S.bambergiensis S712 и SBOO ДНК плазмиды pIJ350.

3. Проведены внутривидовые скрещивания штаммов S.bambergien-. sis, при этом показана высокая частота возникновения рекомбинан-тов. Такой факт позволил предположить наличие у S.bambergiensis генетического элемента, способного играть роль Фактора фертильнос-ти при скрещиваниях.

4. Методом пульс-электрофореза показано наличие в штаммах S•bambergiensis гигантских линейных плазмид размером от 50 тпн до 640 тпн. Получен ряд мутантов, излеченных от гигантских линейных плазмид, с помощь« которых показана корреляция между наличием плазмид и биосинтезом моеномицина у S.bambergiensis. На основании данных по внутривидовому скрещиванию сделано предположение о том, что гигантские линейные плазмиды могут содержать гены, участвующие в биосинтезе моеномицина.

3. Показан перенос генетического материала, определяющего фенотип "летального зигозиса", из штамма S.bambergiensis S712 в штамм S.llvidans ТК64 при межвидовом скрещивании. В рекомбинантном клоне идентифицировано два различных элемента, определяюцих фенотип "летального зигозиса". Один из этих элементов, обозначенный pBLl, был идентифицирован с помощью электрофореза.

6. Изучены особенности структуры и происходжения генетического элемента pBLl. Показано, что ДНК pBLl связана с белком, предложена гипотетическая модель конформации данного генетического элемента. Продемонстрировано происхождение элемента pBLl из генома S.bam-bergiensis S712. Продемонстрирована гомология ДНК pBLl с ДНК гигантских линейных плазмид, обнаруженных в штаммах S. bair.bergiensis.

. СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации.

1. ' Жданов В.Г., Зотчев C.B., Роэенфельд С.М. Разработка снстомы

трансформации для штамма-продуцента моеномицина Strept.omyc&s bambergiensia S712. V съезд ВОГиС, Москва, 1987г., с.36.

2. Зотчев C.B., Роэенфельд С.М., Жданов В.Г. Трансформация ллаз-мидной ДНК протопластов Streptomycea bambergiensi3. Антибиотики и химиотерапия, 1988, т.33, 3, с.200-203.

3. Зотчев С.Б., Орехов A.B., Роэенфельд С.М., Жданов В.Г. Влияние плазмиды pIJ330 на генетическую стабильность признака антибио-тикообраэования у Streptomyces bamberglensis. Антибиотики и химиотерапия, 178?, т.34, 3, с.180-186.

4. Зотчев С.В., Роэенфельд С.М. , Жданов В.Г., С=>ехов A.B. Обнаружение гигантских линейных плазмид в штаммах Streptomycss Ьэл-bergisnsia. Докл. Акад. Нагк СССР, 1с7?0, т.313, 1, с.205-203.

3. зотчев С.Б., Ровенаельд С.К., Ждано« В.Г., Орехов А.В. И»умание »ертильных свойств штаммов Streptomyces bambergiensisi внутри- и межвидовое скрещивания. Генетика, 1990, т.XXVI, 10, с.1760-1769.

6. Zotchev S.B., Orekhov A.V., Rosenfeld S.M., Zhdanov V.G. Induction by pIJ330 plasmid of genetic instability of antibiotic production in Streptomyces bambergiensis. 7*" Internet. Symp. on Biol, of Actinomycetes, May 1988, Tokyo, Japan, p.166.

7. Zotchev S.B., Orekhov A.V., Rosenfeld S.M., Zhdanov V.G. High frequency recombination in crosses between Streptomyces bambergiensis strains. 2"" Internet. Symp. on Overproduction. of Mlcrob. products, July 1988, Ceske Budejovice, Chechoslovakia, P.1S2.

6. Orekhov A.V., Zotchev S.B., Florova G.J., Gul'ko L.B., Rosenfeld S.M., Zhdanov V.G. Molecular genetic investigation of S.bambergiensis and S.fradiae strains, the producers of flavo-mycin and tylosin. Intern.Symp.Genet.Prod.Form.Streptomyces., May 1990, Erfurt, GDR, p.54.

9. Zotchev S.8., Rosenfeld S.M., Zhdanov V.G., Orekhov A.V. Identification of sex-factors after interspecific cross between Streptomyces strains. 6*K Intern.Symp.Genet.Industr.Microorg., August 1990, Strasbourg, France, p.232

Уазрешввтся к печати 23. II. 1990 ¡Заказ № HO ноябрь 1990г. Тирах 100

Ротапргагная Центроэнергочермета IIIII2, Москва, пр.з-да "Серп и юлот", 6