Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов HERV-K (HML-2) и L1

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов HERV-K (HML-2) и L1"

Учреждение Российской Академии Наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Александрова Елена Александровна

Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов НЕИУ-К (НМЬ-2) и Ь1.

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2011

2 9 СЕК 2011

4854956

Работа выполнена в группе геномного анализа сигнальных систем клетки Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Буздин Антон Александрович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Крамеров Дмитрий Александрович доктор биологических наук Калмыкова Алла Ивановна Ведущая организация:

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится «12» октября 2011 года в И) часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7 г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «/&> сентября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

_----------

доктор физико-математических наук В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Мобильные генетические элементы составляют значительную часть геномов большинства эукариот. Они занимают свыше 50% ДНК человека, тогда как последовательностям экзонов функциональных генов принадлежит лишь 3-5% генома. Ретроэлементы (РЭ), считаются единственной транспозиционно активной группой мобильных элементов млекопитающих. Их распространение происходит в результате обратной транскрипции РНК-матрицы с образованием кДНК-копии элемента, которая затем интегрируется в новое место генома. РЭ делят на две группы: LTR-содержащие и LTR-не содержащие ретроэлементы (LTR - Long Terminal Repeat). Эндогенные ретровирусы (ЭРВ) и LINE-элементы (Long Interspersed Nuclea Elements, LINE) принадлежат группам содержащих и не содержащих LTR РЭ соответственно и являются автономными мобильными элементами (т.е. кодируют белки, необходимые для обратной транскрипции и встраивания в геном).

ЭРВ имеют строение, аналогичное строению обычных ретровирусов и, как считается, представляют собой остатки активных миллионы лет назад ретровирусов, закрепившихся в геноме путем инфицирования клеток зародышевой линии. В геномах ЭРВ представлены провирусами, а также одиночными LTR. LTR ЭРВ содержат функциональные энхансеры, промоторы и сигналы полиаденили-рования. Семейство ЭРВ HERV-K (HML-2) уникально тем, что содержит человек-специфические элементы (чсЭРВ), а также является одним из самых биологически активных ретровирусных семейств генома человека.

Ретротранспозоны LINE являются наиболее многочисленной группой автономных мобильных элементов в геномах млекопитающих. Так, например, в геноме человека ретротранспозоны LINE-1 (L1) представлены более чем 500.000 копий, занимающих -17% геномной ДНК. Полноразмерный L1 имеет длину 6-7 тысяч пар оснований и состоит из 5'-нетранслируемой области (5' НТО) и двух открытых рамок считывания (ОРС). Транскрипция мРНК L1 управляется уникальным внутренним промотором РНК-полимеразы II расположенным в 5'НТО ретротранспозона. Механизм действия этого промотора пока остается неясным.

РЭ являются важнейшими регуляторами структуры и функции геномов, поэтому разработка новых методов поиска транскрипционно-активных РЭ, анализ их промоторной активности в контексте геномного окружения, а также ис-

3

следование структурной организации их промоторов являются важными и актуальными задачами современной молекулярной биологии.

Цели и задачи исследования

Целями данной работы являлось детальное изучение транскрипционной активности человек-специфичных ЭРВ, а также исследование уникального внутреннего промотора ретротранспозона LI. Были поставлены следующие задачи:

1. разработать метод полногеномной идентификации транскриптов, промоторами которых служат геномные повторы, с его помощью осуществить полногеномное картирование транскрипционно-активных чсЭРВ.

2. провести сравнительный анализ промоторной активности чсЭРВ в двух типах тканей - нормальной и соответствующей ей раковой.

3. картировать точку начала транскрипции в составе LTR чсЭРВ.

4. при помощи метода делеционного картирования выявить участки 5' НТО LI, имеющие наибольшие влияние на промоторную активность ретротранспозона.

5. определить положение точек начала транскрипции в 5' НТО LI с делети-рованным «минимальным промотором».

Научная новизна и практическая ценность работы.

Разработан метод полногеномной идентификации транскрипционно-активных повторяющихся элементов - GREM (англ. Genomic Repeat Expression Monitor - GREM). Метод GREM применим как для качественной, так и для количественной оценки промоторной активности исследуемой группы повторяющихся элементов.

С использованием GREM впервые проведено полногеномное картирование промоторно-активных чсЭРВ и показано, что по крайней мере 50% чсЭРВ являются транскрипционно активными. Выявлено снижение активности 3'-провирусных чсЭРВ в случае их расположения в непосредственной близости от генов или в интронах генов. Показана повышенная транскрипционная активность 5'-провирусных LTR чсЭРВ по сравнению с одиночными и 3'-провирусными LTR независимо от ткани.

Проведено картирование альтернативной, отличающейся от канонической, точки начала транскрипции в LTR чсЭРВ. Показано преимущественное исполь-

зование найденной точки начала транскрипции для экспрессии генов провируса чсЭРВ.

С использованием метода делеционного картирования показано, что наиболее важным регуляторным участком 5' НТО Ы является область +390...+526, а не «минимальный промотор», как считалось ранее. Проведено картирование точки начала транскрипции в 5' НТО с делецией «минимального промотора» Ы и показано, что в этом случае происходит смещение старта транскрипции с +1 нуклеотида 5' НТО в её 3'- конец или в самое начало ОРС1 Ы. Сделано предположение о роли внутренней области 5' НТО Ы в инициации транскрипции, что может способствовать пониманию механизмов инициации транскрипции не содержащих ТАТА-бокс промоторов.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III международной конференции, посвященной Н.В. Тимофееву-Ресовскому «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Украина, Алушта, 9-14 октября 2010 г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 2 тезиса докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 101 странице машинописного текста, содержащих 26 рисунков, и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 153 ссылки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. I. Полногеномная идентификация транскрипционно активных чсЭРВ и анализ их промоторной активности.

Доля чсЭРВ, составляет -5% от общего количества человек-специфических последовательностей, образованных внедрениями ретроэлемен-тов. К настоящему времени известно 134 чсЭРВ, что составляет небольшую фракцию (-7%) от общего количества эндогенных ретровирусов семейства HERV-K. Представители этой группы мобильных элементов сохранили не только свою транскрипционную активность, но и, возможно, способность к инфицированию клеток человека. Для полногеномного картирования транскрипционно-активных чсЭРВ, нами был разработан метод полногеномного поиска промо-торно-активных повторяющихся последовательностей (GREM - Genomic Repeat Expression Monitor).

1.1. Метод GREM.

В основе метода GREM лежит гибридизация суммарного пула 5'-концевых фрагментов кДНК с полногеномным пулом последовательностей, фланкирующих исследуемую группу повторяющихся элементов. Основными стадиями метода GREM, изображенного на Рис.1, являются: (I) синтез библиотек полноразмерных кДНК, содержащих специфические олигонуклеотидные последовательности на 5'концах, (И) селективная ПЦР-амплификация фланков повторяющегося элемента, (III) гибридизация кДНК с фланкирующми повтор последовательностями и последующая ПЦР-амплификация гетеродуплексов «геномная ДНК - кДНК». В подписи к рис. 1 дано более детальное описание метода.

Этот поход комбинирует преимущества методов 5'RACE (rapid amplification of 5' cDNA ends) и гибридизации нуклеиновых кислот в растворе и основан на следующем принципе: в случае, когда геномный повтор является промотором, инициация транскрипции происходит внутри последовательности элемента, а следовательно, такие транскрипты содержат фрагмент последовательности ретроэлемента на 5' конце. Это утверждение справедливо для LTR ретровирусов, а также для элементов LINE и SINE. Метод является как качественным, так и количественным, поскольку доля мРНК, промотором которой служит отдельно взятый элемент, прямо пропорциональна количеству тэгов в получаемой библиотеке гетеродуплексов.

si

I

__________________________I

"П

Наскво« траискркбкру«мык LTR (обратная орда, ктацхя) fÀ—^XZNvXZV^sy-^

Синтез кДНЕС

А АЛ АЛЛ hf. -

тттттт

т Обработка Л/«/

ну^е , -

Геномная ДНК

Пр овирус

Одиночный LXR

Обработка Alul, лигировакие адаптера А1 селективная амплификация » ™ п , 3' фланков LTR LTR fori А2

I Обработкануклеаэой I ЕхоШ для создания 5'-LTR fori вступающих концов А2

| Смешивание, денатурация, гибридизация

"П

Насквозь-транскрибируемый LTR, ТТТТТТ нет ПЦР-амплификации

| Заполнение концов ДНК, ПНР с . праймерами A2+CS

I

I Nested ПЦР с праймерами A4+LTR for2

гтя fori A-aN.

Клонирование и секвенирование ПЦР-продуктов

Рис.). Схематическое изображение метода GREM, примененного для поиска промогорно-активных чсЭРВ. (Стадия I) синтез двухцепочечной кДНК с использованием олиго(ёТ)-затравки на матрице образцов мРНК из тканей, в которых изучается экспрессия повторяющегося элемента. На этой стадии происходит присоединение маркерной последовательности нуклеотидов (CS) к 5' концам кДНК (являющимся точками начала транскрипции) по механизму "cap-switch". Полученная таким образом кДНК затем обрабатывается эндонуклеазой рестрикции, не имеющей сайтов узнавания в повторяющемся элементе (для ЧС LTR удовлетворяющей всем необходимым требованиям оказалась рестриктаза Л1иГ). Эта процедура позволяет избежать амплификации последовательностей, содержащих насквозь транскрибированные LTR в прямой ориентации. (Стадия II) Полногеномная амплификация последовательностей геномной ДНК, фланкирующих исследуемый повтор с 3'- конца, после чего проводится обработка ампликонов экзонуклеазой ЕхоШ для получения выступающих 5'-концевых последовательностей. (Стадия III) Гибридизация меченой с 5' конца кДНК с ампликонами геномной ДНК. Полученные в результате гибридизации выступающие одноцепочечные фрагменты ДНК достраивают ДНК-полимеразой, после чего проводится nested ПЦР-амплификация гибридов (тэгов) с праймерами на фланкирующий геномную ДНК адаптер (А2) и на 5'-концевую маркерную последовательность кДНК (CS).

Важным преимуществом метода GREM является то, что в результате его применения происходит селективная амплификация только гетеродуплексов и не происходит амплификации дуплексов кДНК, не относящихся к экспрессии

повторов или содержащих насквозь прочитанные повторяющиеся элементы. Также не происходит и амплификации гетеродуплексов, содержащих насквозь прочитанные повторы. Это достигается введением стадии обработки кДНК час-тощепящей эндонуклеазой рестрикции (см. Стадия II на Рис.1), в результате которой происходит расщепление двуцепочечных молекул кДНК, синтезированных на матрице насквозь прочитанных транскриптов, в том числе и в 5'-фланкирующей области исследуемого повтора. Этот шаг позволяет значительно снизить уровень фоновых последовательностей в получаемых библиотеках.

Для исследования промоторной активности чсЭРВ в качестве эндонуклеа-зы рестрикции был использован фермент Alul, не имеющий сайтов узнавания в последовательности LTR чсЭРВ. Чтобы подтвердить правомерность использования Alul в этих целях, был проведен анализ баз данных транскрибируемых последовательностей человека, среди которых было найдено 38 транскриптов, содержащих насквозь прочитанные чсЭРВ, лишь 4 из которых находились в прямой ориентации. Моделирование "in silico" рестрикции этих транскриптов эндонуклеазой Alul показало, что эта стадия способна полностью предотвратить появление таких транскриптов в библиотеках GREM.

Конечным результатом применения метода GREM является набор ампли-фицированных гетеродуплексов или ELT тэгов (англ. ELT - expressed LTR tag), каждый из которых содержит З'-концевой фрагмент LTR, участок геномной ДНК, фланкирующий LTR с 3'-конца, и последовательность искусственно введённого олигонуклеотидного адаптора. Для определения профиля экспрессии исследуемого повтора, проводят клонирование и секвенирование полученных ELT тэгов.

Разработанный метод GREM был применен для полногеномной идентификации промоторно-активных чсЭРВ, LTR которых характеризуются высокой идентичностью нуклеотидных последовательностей (в среднем 98,1%), а -90% из них являются человек-специфичными. Для исследования были выбраны две ткани, взятые у одного и того же пациента: паренхима яичка и семинома, представляющие собой нормальную ткань и соответствующее ей злокачественное новообразование. Обе ткани содержат клетки зародышевого пути человека.

Надо заметить, что в отсеквенированных библиотеках ELT однозначное картирование транскрипционно-активных LTR было возможно только в случае транскрипции с одиночных или З'-провирусных LTR. Точное картирование геномного расположения 5'-провирусных LTR невозможно в связи с тем, что по-

следовательности генов провируса, транскрибируемые с них, многократно повторяются в геноме человека и высоко идентичны между собой (Рис.2).

Транскрипция

Одиночный LTR \ 5' LTR

—

Уникальная геномная ДНК

Рис.2. Схематическое изображение одиночного (слева) и провирусных (справа) LTR. Транскрипция с 5' провирусного LTR приводит к образованию мРНК вирусных генов, тогда как экспрессия с 3' провирусного или с одиночного LTR приводит к транскрипции уникальных геномных последовательностей, фланкирующих LTR с 3' конца.

1.2. Картирование точки начала транскрипции в составе чсЭРВ.

При помощи метода 5' RACE нами были с точностью до нуклеотида картированы точки начала транскрипции для пяти случайно взятых одиночных чсЭРВ, являющихся промоторно-активными в нормальной паренхиме яичка человека по результатам GREM. Во всех случаях транскрипция LTR была вызвана собственной промоторной активностью LTR, что является подтверждением применимости метода GREM для поиска промоторно-активных повторов. Оказалось, что точка начала транскрипции совпадает для всех пяти проанализированных элементов и находится в положении 816 консенсусной последовательности LTR чсЭРВ, опубликованной A.A. Буздиным и др. в 2003г. В этой консенус-ной последовательности были найдены две предполагаемые базовые регулятор-ные элементы, типичные для промоторов эукариот: (1) последовательность ААТАААТ, напоминающая ТАТА-бокс (консенсусная последовательность ТАТА(А/Т)А(А/Т)), расположенная в положении -20 от точки начала транскрипции и (2) инициаторная последовательность CTCA<+1)GA, расположенная в точке начала транскрипции (консенсусная последовательность YYCA(+I)RR). Кроме того, выше точки начала транскрипции были найдены еще два дистально расположенных предполагаемых промоторных элемента: последовательность GACACATCC, сходная с консенсусной последовательностью контролирующего промотор гена бета-глобина элемента (ATGCAAAT) в положении -57 и предполагаемый сайт связывания фактора транскрипции OTF-2 - ATGCAAAG (консенсусная последовательность ATGCAAAT) в положении -122 (Рис. 3). Вероятно, найденная нами точка начала транскрипции соответствует промотору, контролируемому вышеуказанными регуляторными элементами.

Поскольку картированная нами точка начала транскрипции не являлась канонической, интересно было узнать, используется ли она для транскрипции

генов провируса HERV-K, которая начинается с 5' концевых LTR и обуславливает экспрессию вирусных генов. Для выяснения этого вопроса, были сконструированы праймеры на последовательность LTR, расположенные на минимально возможном расстоянии выше или ниже картированной точки начала транскрипции (LTRfor4 и LTRfor3 соответственно) (Рис.3Б). Эти праймеры в паре с праймером на последовательность вирусного гена gag (праймер Gag) были использованы для ОТ-ПЦР на образцах кДНК, синтезированных на матрице РНК из нормальной паренхимы яичка с использованием случайных гексамерных праймеров в качестве затравки. После электрофореза продуктов ОТ-ПЦР, ото-

А

Потенциальный TATA бокс: ТСААТ.4ААТА. fnr: CTCAGA

GACACATCC 1 Транскрипция

ATGCAAAGQ '

.Одиночный LTR

из

Продукты ОТ-ПЦР: з,

3.Провирусный LTR

Картированная точка начала транскрипции

\

ОТ-ПЦР: 2l 24 27 3Q 33 36 циклы

Вирусный ген Gag ■

-«'Sag

LTRfc»-4 t_

<"Gag

Нет амплификации

В

Фрагмент LTR, достаточный для инициации транскрипции ||

Рис.3. Картирование точки начала транскрипции в последовательнсти ЬТИ. (А) 5' концевые последовательности кДНК были получены в результате ПЦР амплификации с праймером С8 на 5' конец кДНК и уникальными геномными праймерами в. Картирование проводилось на консен-сусную последовательность ЧС ЬТЯ НЕЯУ-К (НМЬ-2). Курсивом изображены регуляторные последовательности, предположительно принимающие участие в регуляции транскрипции с данного промотора. (Б) Определение точки начала транскрипции в провирусном ЬТИ., проведенное с помощью метода ОТ-ПЦР, схема которого изображена на рисунке. (В) Выравнивание фрагмента ЬТЯ -300 п.н., имеющего промоторную активность согласно результатам экспериментов с экспрессией репортерного гена и консенсусной последовательности ЬТЯ чсЭРВ.

бранных по истечении разного количества циклов реакции (21, 24, 27, 30, 33, 36 циклов) в агарозном геле, были видны полосы, соответствующие ПЦР-продуктам ожидаемой длины, причем в случае ОТ-ПЦР с праймером, лежащим ниже точки начала транскрипции, ПЦР-продукт появлялся на 6 циклов раньше.

Эти результаты позволяют предположить, что инициация с найденной точки начала транскрипции для одиночного LTR используется для экспрессии провирус-ных генов в -64 раза чаще других точек начала транскрипции. Несмотря на то, что согласно результатам ОТ-ПЦР транскрипция генов провируса начинается преимущественно с картированного нами участка, выше него могут быть расположены другие точки инициации транскрипции, например, каноническая точка

начала транскрипции.

Интересным является тот факт, что картированная нами точка начала транскриции находится на самом 3'-конце участка LTR R, т.е. в результате транскрипции с LTR в синтезированной мРНК отсутствует область R. В классической модели жизненного цикла ретровируса инициация транскрипции происходит на границе областей U3 и R, в результате чего последовательность элемента R является 5'-концевой в новосинтезированных мРНК провируса. Такой способ транскрипции является необходимым для осуществления жизненного цикла ретровируса, поскольку он обеспечивает возможность переключения обратной транскриптазы с одной матрицы на другую в ходе синтеза полноразмерной кДНК ретровируса. Изменение же точки начала транскрипции с канонической на картированную нами альтернативную приводит к образованию транс-криптов ЭРВ, непригодных для использования в нормальном жизненном цикле ретровируса.

1.3. Применимость метода GREM для количественного анализа промотор-

ной активности LTR.

Как уже было сказано, метод GREM может быть применен для количественной оценки уровня экспрессии чсЭРВ. Для того чтобы подтвердить этот факт экспериментально, методом ОТ-ПЦР был измерен уровень экспрессии транс-криптов, промотором которых служит LTR, после чего было проведено сравнение полученных результатов с частотой встречаемости ELT тэгов в библиотеке GREM. ПЦР-амплификация проводилась с парами праймеров, один из которых был специфичен к 3' концевой последовательности LTR и направлен в окружающую LTR область генома, тогда как другой праймер был специфичен к фланкирующей LTR уникальной геномной последовательности, располагающейся на расстоянии 70-300 п.о. от 3' конца LTR, и направлен в сторону LTR. Уровень транскрипции измеряли относительно уровня транскрипции гена домашнего хозяйства - гена бета-актина АСТВ. Для 20 проанализированных чсЭРВ, частота встречаемости ELT линейно коррелировала с уровнем транс-

крипции, измеренным с помощью ОТ-ПЦР. Коэффициенты корреляции для библиотек GREM из паренхимы и семиномы составляли 0,91 и 0,89 соответственно, что позволило сделать вывод о том, что метод GREM применим как для качественной, так и для количественной оценки промоторной активности исследуемой группы повторяющихся элементов.

Г.4. Поиск промоторно-активных чсЭРВ.

Из полученных в результате использования метода GREM библиотек ELT было отсеквенировано по 500 клонов для каждой ткани. Для анализа были взяты 395 и 419 качественно прочитанных клонов для паренхимы яичка и семиномы соответственно. В результате было показано, что из -150 представителей чсЭРВ, 78 (-50%) являются промоторно активными хотя бы в одной из тканей. Количественное содежание ELT для многих отдельно взятых LTR в значительной мере различалось в нормальной и опухолевой тканях. Многие LTR имели низкий уровень экспрессии, в связи с чем они были представлены небольшим количеством ELT тэгов в отсеквенированных библиотеках ELT. Другие же, наоборот, проявляли высокий уровень транскрипционной активности и были представлены повышенным количеством ELT (10 и выше). Для семи одиночных чсЭРВ и для фракции 5' провирусных LTR частота встречаемости ELT различалась в 5 раз и выше между библиотеками ELT паренхимы яичка и семиномы. Из них 5' прови-русные LTR и четыре одиночных LTR проявляли повышенный уровень экспрессии в семиноме, тогда как три оставшихся LTR были оверэкспрессированы в паренхиме яичка. Для пяти одиночных и 5'-провирусных LTR полученные результаты были проверены методом ОТ ПЦР на матрицах кДНК паренхимы яичка и семиномы с использованием уникальных геномных праймеров, специфичных к фланкирующим LTR последовательностям. Для всех пяти LTR наблюдалась корреляция уровней транскрипции, определенных на основании результатов ОТ-ПЦР с результатами, полученными на основании анализа относительного состава ELT. Для двух оставшихся LTR, проявляющих значительную тканеспеци-фичность согласно результатам GREM, было проблематично сконструировать уникальные геномные праймеры, поскольку эти LTR были фланкированы геномными повторами. Ранее было установлено, что экспрессия генов провируса, промотором которых служит 5' LTR, происходит предпочтительно в терминальных опухолевых тканях, то есть в опухолях клеток зародышевой линии. Это подтверждается и полученными нами результатами, согласно которым экспрес-

сия с 5'-провирусного ЬТО в семиноме приблизительно в 6 раз превышает экспрессию в нормальной паренхиме яичка.

Анализ промоторной активности чсЭРВ в зависимости от геномного окружения. Для проведения этого анализа, все чсЭРВ были картированы в геноме с помощью сервера UCSC human genome browser. В зависимости от расстояния до ближайшего известного гена или картированной кДНК, чсЭРВ были разделены на 4 группы, схематически изображенные на Рис.4А: группа I расстояние от гена до элемента (D) >35 т.п.н. (80 элементов); группа II 35 т.п.о.? D> 5 т.п.о. (24 элемента); группа III элементы находятся либо в интронах генов, либо на расстоянии D<5 т.п.о. (40 элементов) и группа IV, элементы которой находятся в экзонах известных генов или картированных кДНК, транскрибируемых не с промотора LTR (12 элементов). Подробная информация о геномной локализации LTR, соседних генах и картированных кДНК, размещена в формате MS Exel в Интернет:

http://www.thescientificworld.com/supplements/2007.270/Buzdin_031307_SuppTable

l.xls

Л

Группы LTR в зависимости от положения относительно генов или известных кДНК Группа I

Расстояние от гена до LTR>35 т.п.н.

Ген

г^^ч _^^П

575иГ ' SSwuT

Группа II

Расстояние от гена до LTR 5-35 т.п.н. Ген

_EnmJZL—^_

" IS Тяж. } гая /»г* лГт на

Группа III

LTR расположен либо в нитроне гена, либо на расстоянии <5 т.п.н. от гена

_pfe^_

Jtb* Sin«

Группа IV с .

LTR расположен в экзоне гена, транскрибируемом С ~

не с промотора LTR . .Ингрон = j j j III IV

J ' Группа LTR

Рис.4. Доля промоторно-активных LTR в зависимости от геномного окружения. (А) Все чсЭРВ были разделены на 4 группы в зависимости от расстояния до известных генов -группы I, II, III, IV (детали см. в тексте). (Б) Диаграмма изображает долю LTR, промоторно-активных хотя бы в одной из двух тканей. (В) Диаграмма изображает долю LTR, промоторно-активных как в паренхиме яичка, так и в семиноме.

Промоторно-актшные LTR хотя бы в одной из тканей

ä в

<5 и»

I -

L ■■ I

I II III IV

Группа 1TR

Промоторно-активные LTR как в перенайме, тяк н в семиноме

f

ig ,0°

Для каждой из четырех групп LTR был проведен анализ промоторной активности, результаты которого представлены на диаграммах, изображенных на рис.4Б и 4В. На рис.4Б показана доля промоторно-активных LTR чсЭРВ по крайней мере в одной из двух тканей. Поскольку каждая группа характеризуется разным количеством элементов, то для сравнения нами использовались нормированные на количество элементов в группе величины (количество промоторно-активных элементов отдельно взятой группы делилось на суммарное количество элементов этой группы). Из диаграммы видно, что доля промоторно-активных элементов в группе I мала (34%), тогда как для элементов группы II она выше в 1,8 раз и составляет 63%. Для LTR, находящихся в непосредственной близости от генов или в интронах генов (группа III) это значение было еще немного выше (68%). И, наконец, самая высокая доля промоторно-активных LTR (75%) была получена для элементов, находящихся в экзонах генов (группа IV).

Диаграмма, изображенная на рис.4В, отражает распределение элементов, функционирующих в качестве промоторов в обоих типах исследуемых тканей -нормальной паренхиме и семиноме. Доля таких "повсеместно" транскрибируемых LTR была соответственно 10, 29, 20% для групп I, II, III, тогда как для группы IV это значение было гораздо больше значений для остальных групп -67%, выделяя ее на общем фоне.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы: (1) ген-богатые области генома характеризуются наиболее высоким содержанием промоторно-активных LTR; (2) эти значения достигают максимума для элементов группы IV, т.е. в тех случаях, когда чсЭРВ частично или полностью перекрывается с экзонной последовательностью в составе гена; (3) LTR, относящиеся к группе IV чаще всего используются в качестве промоторов в обеих тканях. Такая ярко выраженная промоторная активность LTR группы IV может быть связана с лучшей доступностью этих элементов для факторов транскрипции.

Анализ промоторной активности чсЭРВ в зависимости от геномного окружения и статуса LTR. Был проведен количественный анализ промоторной активности индивидуальных и 3' - провирусных LTR в зависимости от их принадлежности к группам I-IV. 5'-провирусные LTR, как уже упоминалось ранее, не поддаются детальному исследованию, поскольку невозможно идентифицировать, какие именно из LTR являются промоторно-активными. Относительная сила промоторов чсЭРВ каждой группы вычислялась как отношение двух вели-

чин: (1) относительной доли ELT отдельно взятой группы (с I по IV) в суммарном пуле ELT всех групп (за вычетом 5' провирусных LTR) и (2) доли чсЭРВ этой группы (за вычетом 5' провирусных LTR) среди чсЭРВ всех групп (также за вычетом 5' провирусных LTR).

2S 20 15 10 5 0 -

23.52 ±12.70

0.40 0.20 ±0.12 tf.03

Пареихима яичка

133 0.30 0.42 1-Я Ш А29 ±015 ±0.07

Семинома

II III

Группа LTR

±253

0.12 0.17 ±004 ±0.02

3.17J ±1 74:

IV

0.48 0.38 ±011 ±0.16 ■

II III

Группа LTR

>3 Ц 66, и

ÜJ

IV

Рис.5. Относительная промотоная сила 3' провирусных (обозначены серым цветом) и индивидуальных (обозначены черным цветом) LTR, сгруппированных в зависимости от расстояния до генов (группы I-IV, детальное описание см. в тексте). (А) Паренхима яичка; (Б) семинома.

Результаты анализа промоторной активности чсЭРВ изображены на рис.5. Из диаграмм видно, что З'-провирусные LTR проявляют сходный характер транскрипции в обеих тканях: представители группы I имеют низкий уровень транскрипции в обоих случаях, для элементов группы II эти значения сильно возрастают (наблюдается увеличение уровня транскрипции в -30-60 раз), элементы группы III (как и элементы группы I) проявляют достаточно низкий уровень транскрипции и, наконец, группа IV характеризуется повышением уровня транскрипции в -2-2,5 раза. Для индивидуальных LTR эти профили выглядят по-другому: элементы группы I проявляют низкую промоторную активность, элементы групп П и III - умеренную и, наконец, максимальная промоторная активность наблюдается для одиночных LTR группы IV, расположенных в экзонах генов (их промоторная активность в 4-6 раз выше промоторной активности элементов группы III).

На основании полученных результатов, можно предположить, что происходит избирательное подавление транскрипции 3'-провирусных LTR в случае, когда они располагаются в ген-богатых областях. Надо отметить, что относительные силы промоторов как индивидуальных, так и 3' провирусных LTR группы III были значительно ниже относительной силы промоторов LTR группы II в нормальной ткани (паренхиме яичка). Это также может быть связано с существованием клеточных механизмов избирательной супрессии "лишних" промо-

торов, находящихся в интронах генов или в непосредственной близости от них. Такой способ регуляции экспрессии LTR может служить для минимизации возможных разрушительных эффектов фоновой транскрипции, таких как экспрессия антисмысловых РНК, способных оказывать влияние на нормальную экспрессию генов по механизму РНК-интерференции. Поскольку -90% расположенных в интронах генов чсЭРВ находятся в обратной ориентации по отношению к направлению транскрипции гена, транскрипция с этих элементов может привести к образованию пула регуляторных интерферирующих РНК. Также было проведено разделение всех LTR на три группы в зависимости от их статуса (индивидуальные, 3'- или 5'-провирусные LTR) и сравнение их промо-торной активности между собой. Среднее значение относительной силы промоторов группы чсЭРВ вычислялось как отношение следующих величин: (1) доля ELT выбранной группы LTR от общего числа всех ELT и (2) доля чсЭРВ анализируемой группы в общем количестве чсЭРВ. Из результатов, предоставленных на Рис. 6, следует, что средние значения промоторной силы индивидуальных и З'-провирусных LTR были практически одинаковыми для обеих тканей, тогда как сила промоторов 5'-провирусных LTR в паренхиме яичка в -2.5 раза превышала силу промоторов З'-провирусных и индивидуальных LTR и в -5 раз - в семиноме. Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными о повышенном уровне экспрессии генов провирусов HERV-K (HML-2) в клетках раковых опухолей зародышевого пути. В связи с этим, можно предположить, что последовательности провирусов содержат некоторые до сих пор не охарактеризованные регуляторные элементы, находящиеся в «теле» провируса ниже последовательности LTR, которые обеспечивают повышенный уровень экспрессии 5' провирусных LTR, особенно в семиноме.

о Паренхима ■ Семинома

2.5

0.5

1.5

2

0.36 0.37

±0 03 ±0 03

1.93 |±0.41

0.25 0.37

±0.05 ±0.08

Рис.6. Сравнение относительной силы промоторов индивидуальных, 5'- и З'-провирусных ЬТЯ. Серые и черные столбцы представляют относительную силу промоторов ЬТ11 в паренхиме яичка и семиноме соответственно.

Одиночный 5'-провирусный i'-проЕирусный

LTR

LTR

LTR

) 'сны

Паренхима инчка

ш

Б

ялчм далу»

Ш'Ш ■■••

/1Л7>■!, ИЛИИ / г.,»рп 7.М-432 ннпимнк:

Л'/.ГЛММ

ял гш'х.\/л»'.ч

ШШ1. С'м/зч

-Актин

С'смииома

Гены 1.ТК

-та

Щ») ^ IЛ И XI.

Сумма провируспых 5' ЦТЛ

ПН 145 1.ГИ 1:ч. 1« - I ГК 81), 11)8, 111, 134

.S7.iV.JS .•гам »яп и-/т:с

11.Г:1\)Г,. Sl.lt С1М7.. (ъ,г/:и

1.1К 155 ОТ 115, 138 ■!Ш% 1ГИ131, М1 --1.ТО 140, 152

1.таб:

шсм.1ххж:

ЫМИ'ЧчгПЧ. 1.11'Ш.

лпл'.Ч я,с:яи да-/« (.;п<74

пронирус 5* Ш1

I 1')'■>

I I ц Ы( 1.1 К 155 1 Тк 80. 11.1

" 1.ТИ 11'), 144

ПК |2<>, 144 1.™ 115 ■0.01% ПК!,1 108. 131. ' 1.ГК 100

Рис.7. Сравнение уровней транскрипции некоторых генов человека и ЫЯ. Значения относительных уровней транскрипции случайно выбранных чсЭРВ и располагающихся радом с ними генов были измерены методом ОТ ПЦР, за 100% взят уровень транскрипции гена бета-актина. (А) Паренхима яичка. (Б) Семинома.

Был проведен сравнительный анализ промоторной активности ЬТЯ, расположенных вблизи генов, с уровнями экспрессии этих генов. Для этого была проведена серия ОТ-ПЦР с праймерами на последовательности экзонов генов. Всего были проанализированы уровни экспрессии 16ти случайно выбранных генов, расположенных вблизи промоторно-активных чсЭРВ. (Рис. 7). Для разных чсЭРВ, частота встречаемости транскриптов могла различаться в -1000 раз, причем уровень экспрессии некоторых из них был сопоставим с уровнем экспрессии гена домашнего хозяйства бета-актина АСТВ, взятого за 100%. Какой-либо ярко выраженной корреляции между уровнями транскрипции генов и соседних с ними ЬТЯ получено не было.

II. Роль внутренней области 5' НТО ретротранспозона Ы и его «минимального промотора» в эффективной инициации транскрипции.

Транскрипция ретротранспозона 1Л человека управляется необычным внутренним промотором РНК-полимеразы II, расположенным в его длиной 5' НТО. Детально механизм действия этого внутреннего промотора пока не изучен, однако к настоящему моменту уже описаны некоторые структурные и функциональные характерные черты промотора Ы. Так, например, для Ы человека было

показано, что первые 668 п.о. его 5' НТО являются наиболее важным участком для обеспечения промоторной активности 5' НТО. Эта область содержит сайты связывания различных факторов транскрипции, способных регулировать экспрессию L1 различными способами. В 1990 году Г. Сверголдом были проведены эксперименты, согласно которым делеция 5'-концевого участка длиной -100 п.о. приводит к полной потере промоторной активности 5' НТО. Кроме того, было обнаружено присутствие функциональных сайтов связывания факторов транскрипции YY1 и RUNX3 в положениях +13...+21 и +83...+101 соответственно, что послужило косвенным доказательством правоты наблюдений Сверголда и позволило предположить, что внутренний промотор L1 расположен в первых 100 п.о. его 5' НТО, названных впоследствии «минимальным промотором».

Однако были опубликованы и некоторые противоречащие этим результатам сообщения, в которых было сделано предположение о том, что 5'-концевой сайт связывания YY1 не является необходимым для эффективной транскрипции и что остальная часть 5' НТО также способна значительно повлиять на промо-торную активность L1. Кроме того, было показано что внутренняя область 5' НТО человеческого L1 (область с +100 по +668 п.о.), также содержит многочисленные функциональные сайты связывания различных факторов транскрипции таких как SOX11 (в положениях +472...+477 и +572...+577), RUNX3 (+526...+508) и р53 (+452...+466), действующих в качестве активаторов транскрипции.

В 2007 г. И.А. Оловниковым и др. была опубликована статья, в которой было продемонстрировано, что 5' НТО L1 человека в отсутствие 5'-концевой области, все еще способна обеспечивать эффективную транскрипцию репортер-ного гена во временно трансфецированных клетках человека. Эти результаты не согласуются с общепринятой теорией о том, что присутствие 5'-концевого участка 5' НТО L1 человека длиной -100 п.о. критически важно для промоторной активности L1. В сотрудничестве с авторами этой статьи, нами была проведена серия дополнительных экспериментов для прояснения механизма функционирования промотора L1 и детального исследования влияния различных участков 5'НТО на эффективность транскрипции L1.

II.1. Влияние делеиий в 5' нетранслируемой области ретротпанспозона L1 на изменение промоторной активности 5' НТО.

Для анализа промоторной активности 5' НТО L1 человека in vivo, нам был любезно предоставлен набор генетических конструкций, содержащих различные

делеционные варианты 5' НТО. Эти конструкции были созданы на основании коммерческой плазмиды рвЬЗ и непосредственно за последовательностью 5' НТО с делециями или без, содержат репортерный ген люциферазу светлячка (Рис.8). В совокупности, делеции перекрывают область 5' НТО Ы с +1 по +887 нт., тогда как длина всего 5' НТО составляет 907 п.о. Клетки линий НЕК 293 и МТега2Я)1 были временно трансфецированы вышеупомянутыми конструкциями в паре с нормализационным вектором рСМ\Мас2, содержащим репортерный ген бета-галактозидазу под контролем промотора цитомегаловируса и необходимым для минимизации ошибок, вызванных различиями в эффективности трансфекции. Для анализа промоторной активности делетантов 5' НТО, для каждой из конструкций были проведены измерения уровней люминисценции лю-циферазы, после чего полученные результаты были нормализованы на уровень активности бета-галактозидазы. Значения, полученные для конструкций с делециями, были затем нормализованы на значение, полученное для конструкции, содержащей полноразмерный 5' НТО Ь1.

Клеточная линия >)Тега2ЛЭ1 была выбрана для проведения экспериментов, поскольку ранее она была успешно использована для функциональных тестов по изучению 5' НТО Ь1, а также в ней экспрессируются эндогенные 1Л. Клеточная линия НЕК293 была выбрана в качестве альтернативной.

Согласно результатам проведенных экспериментов, делеция 5'-концевого участка 5' НТО Ы длиной 98 п.о., являющегося «минимальным промотором» и «крайне важного» для промоторной активности, приводит лишь к 1.3- и 2.4-кратному снижению промоторной активности 5' НТО Ы в клетках НЕК293 и МТега2ЛЭ1 соответственно (Рис.8Б). Кроме того, транскрипционная активность отдельно взятого «минимального промотора» (конструкция Ы Д( 133-887)) была достаточно низкой и составила лишь 24 и 30% от промоторной активности полноразмерной 5' НТО в клетках ЫТега2/01 и НЕК293 соответственно. Наибольшее падение промоторной активности наблюдалось для конструкции, содержащей делецию внутренней области 5' НТО 390-526 (конструкция Ь1Д(390-526)), промоторная активность которой составила 29 и 28% от активности полноразмерной 5' НТО в клеточных линиях МТега201 и НЕК293 соответственно. Подтверждением этих результатов служит еще и то, что промоторная активность конструкции ЫД(1-386) была в 11 и 8.5 раз выше по сравнению с промоторной активностью конструкции ЫД(1-664) в клетках ЫТега2/'01 и НЕК293 соответственно.

A sv«

5' НТО 1.1 __^ BQJWlA)

—' ' I ■ l]_Щг_У

Б

Bmvp ___________________

11« —, ......................................(] I

I Ii(l-m> ----1 -J. -e^-g- . I Q I

J.lA(I[U-3J6i-----------1 =

-- 'и. . . .. ■----—jj I

Ш(вМв)-t—I — - ■ ------

LIA(«7-M?j............. ■ ii

LlAiliSSS^ I-------------

LlA(l 1S6: —------

Lli(J-664j ------

0 OJ 0,4 0,6 0,* Ifi ]2 Luc/Gal □ KEK293 ■ NTera2/Dl

Рис.8. Влияние делеций в 5' НТО на эффективность транскрипции ы по результатам измерений люминисценции репортерного белка люциферазы. А - Схематический вид конструкции Llvvt, содержащей полноразмерную 5' НТО L1. Б - Схематическое изображение конструкций, полученных на базе конструкции Llwt (слева); относительные значения активности люциферазы в лизатах трансфецированных клеток (справа), нормализованные на уровень экспрессии бета-галактозадазы. Уровень активности полноразмерной 5' НТО взят за единицу.

Для того подтверждения результатов, полученных на основании измерений активности репортерного белка люциферазы, были проведены измерения уровней экспрессии мРНК этих же репортерных генов с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени. Как и в предыдущем эксперименте, уровень экспрессии мРНК гена люциферазы был нормализован на уровень экспрессии мРНК бе-та-галактозидазы, а относительная активность полноразмерной 5'НТО была взята за 1. В общем и целом, результаты, полученные с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени аналогичны полученным на основании измерений уровней экспрессии репортерных белков (Рис.9). Так, собственная промоторная активность «минимального промотора» в обеих клеточных линиях была невысокой (38 и 23% для клеток НЕК293 и ЫТега2/01 соответственно), а делеция области, соответствующей «минимальному промотору» приводила к 3.8 и 2.2-кратному снижению транскрипционной активности в клетках НЕК293 и ЫТега2/Б1 соответственно. Снижение же промоторной активности в результате делеции внутренней области с 390 по 526 нт. было 4.8 и 5.5-кратным для тех же клеточных линий соответственно. Эти результаты подтверждают важность присутствия внутренней области (390-526) для транскрипционной активности промотора, содержащегося в 5' НТО Ы человека и противоречат сложившемуся на сегодняшний день мнению о ключевой роли «минимального промотора». Различия в активного

5' НТО LI

Вектор ____

Llwt -.-

ЫД(1-98) - в

1ЛД(103-38б)--сэ

1ЛД(390 526) -1-

ИД(527-б62)___

1.1Д(667-887) -.-

ЫД(Ш-887)--с=ь

О 0.2 0,4 0,6 0,8 1,0 U Luc/Gal □ HEK29S Щ NTera2/Dl

Рис.9. Влияние делеций в 5' НТО на эффективность транскрипции L1 по результатам измерений количественного содержания мРНК репортерного гена. В левой части рисунка схематически изображены конструкции, содержащие пошаговые делеции в 5' НТО L1. В правой части рисунка приведены результаты измерений количества мРНК репортерного гена люциферазы. Уровень активности полноразмерной 5' НТО взят за единицу.

сти одних и тех же участков 5' НТО, наблюдаемые для использованных в эксперименте клеточных линий, могут быть объяснены ткане-специфичностью регуляции промотора L1.

Н.2. Картирование точек начала транскрипции в конструкциях, содержащих 5' НТО L1 с делецией «минимального промотора».

Поскольку конструкция с делецией области (1-98) 5' НТО L1 человека не содержит обычной для L1 точки начала транскрипции, расположенной в положении + 1 5' НТО, было интересно узнать, что же происходит с точкой начала транскрипции в отсутствие «минимального промотора». Для ответа на этот вопрос был применен улучшенный метод 5' RACE, использующий лигирование РНК-адаптора - 5'-RLM-RACE (RNA Ligase Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends).

Для этого клетки были трансфецированы конструкцией ЫД(1-98), после чего было проведено выделение тотальной РНК из клеток. Метод 5'-RLM-RACE был применен для определения точек начала транскрипции мРНК, кодирующих репортерный белок люцеферазу. Полученные ампликоны были клонированы, после чего было отсеквенировано по двадцать индивидуальных клонов для каждого типа клеток. Полученные последовательности были картированы на 5'-концевую часть L1 человека, в результате чего были определены точки начала транскрипции.

Местоположения точек начала транскрипции в последовательности Ы различались для разных клеточных линий (НЕК293 и МТега2Л}1) (Рис.10). В клетках НЕК293, были найдены две различных точки начала транскрипции, располагающиеся в непосредственной близости друг от друга в положениях +932 и +936, что соответствует положениям +12- и +16 п.о. от начала ОРС1 Ы соответственно. Что касается результатов, полученных для клеточной линии 1ЧТега2/Е)1, то в этом случае был идентифицирована единственная точка начала транскрипции для всех отсеквенированных клонов. Она находится в положении +786 3'-концевой области 5' НТО Ы.

ТНТ, картированная в клетках ТНТ, картированные в клетках лннни МТега2®1 линии НЕЮ 93

ССААСАОАССГ АААСАСААСАвАААА

-ч—

+1 +100 +200 +300 +400 +500 +600 +700 +800

5' НТО ДГ1-98) Шрвые 45

1 ' Ы ОРС1

Рис.10. Картирование точки начала транскрипции в конструкции Ы Д(1-98) в клетках линий НЕК293 и МТега2/01. Схематическое изображение области 5' НТО, которую содержали конструкции, Делеция первых 98 п.о. в 5' НТО изображена пунктирной линией. Оставшаяся часть 5' НТО изображена сплошной черной линией. Шкала на последовательности 5' НТО показывает положения нуклеотидов с +1 с интервалами в 100 п.о. Местоположение картированных ТНТ показано стрелками.

На основании полученных результатов, можно сделать предположение о том, что роль первых 100 п.о. 5' НТО Ы человека, заключается в связывании факторов транскрипции, которые взаимодействуют с пре-инициационным комплексом и ответственны за точную инициацию транскрипции с +1 нуклеотида последовательности Ы. В случае же 5' НТО с делецией «минимального промотора», происходит смещение точек начала транскрипции в ниже расположенные области Ь1.

выводы

1. Разработан новый метод полногеномной идентификации промотор-но-активных повторяющихся элементов (ОЯЕМ).

2. Для двух типов тканей - паренхимы яичка и семиномы было проведено полногеномное картирование промоторно-активных человек-специфичных эндогенных ретровирусов, в результате которого было показано, что по крайней мере 50% человек-специфичных эндогенных ретровирусов (чсЭРВ) обладают промоторной активностью в тканях человека.

3. Было проведено картирование альтернативной точки начала транскрипции в чсЭРВ, с которой в большинстве случаев происходит инициация транскрипции.

4. В результате анализа промоторной активности чсЭРВ в зависимости от геномного окружения и от статуса ЬТК было показано, что:

а) ген-богатые области генома характеризуются наиболее высоким содержанием промоторно-активных чсЭРВ.

б) промоторная активность З'-провирусных чсЭРВ снижена в случае ин-тронного расположения ЬТЛ.

в) 5'-провирусные ЬТЯ имеют более высокую промоторную активность по сравнению с индивидуальными и З'-провирусными ЬТ11.

5. Транскрипционная активность чсЭРВ не коррелирует с уровнем экспрессии соседних с ними генов.

6. Наиболее важной областью, ответственной за промоторную силу 5'НТО Ы, является внутренний участок +390...+526, а не первые 100 пуклеоти-дов, как считалось ранее.

7. Выдвинута гипотеза о том, что основная роль «минимального промотора» 5'НТО Ы заключается в позиционировании точки начала транскрипции.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Публикации в научных журналах:

1. Е. Kovalskaya, A. Buzdin, Е. Gogvadze, Т. Vinogradova, Е. Sverdlov. Functional human endogenous retroviral LTR transcription start sites are located between the R and U5 regions. Virology, 2006, Mar 15; 346(2):373-8

2. A. Buzdin, E. Kovalskaya-Alxandrova, E. Gogvadze, E. Sverdlov. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 2006 May 12; 34(9):e67

3. A. Buzdin, E. Kovalskaya-Aleksandrova, E. Gogvadze, E. Sverdlov. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA. J Virol, 2006, Nov; 80(21):10752-62

Публикации в научных книгах:

A. Buzdin, М. Suntsova, О. Bantysh, Е. Aleksandrova, A. Zabolotneva, Е. Gogvadze, and N. Gaifullin. Елава №23 в книге «Radiobiology and environmental security», eds. C.E. Mothersill, V. Korogodina and C.B. Seymour. Springer, 2001 ISBN 978-94-007-1999-6 (PB) p: 269-297

Материалы российских и международных научных конференций:

1. Е. Gogvadze, Е. Kovalskaya, A. Buzdin, Т. Vinogradova, Е. Sverdlov. Mapping of transcriptional start site within solitary and proviral HERV-K LTRs. 20th IUBMB International congress of biochemistry and molecular biology and 11th FAOBMB congress, 2006, Kyoto, Japan

2. E. Aleksandrova, S. Dmitriev, A Buzdin. Functional characterization of the transcriptional regulatory elements in human retrotransposons HERV-K (HML-2) and LI. Ill International conference "Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution", 2010, Alushta, Ukraine.

Подписано в печать 5.09.2011 г. Формат 60x84/16. Заказ №60. Тираж 100 экз. П.л 1.5. Отпечатано в РИИС ФИАН с оригинал-макета заказчика 119991 Москва, Ленинский проспект, 53. Тел. 499 783 3640