Кардиомиоциты системы генерации и проведения импульсов: особенности пролиферации в процессе развития и при патологии сердца

Ерохина, Инэса Лазаревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кардиомиоциты системы генерации и проведения импульсов: особенности пролиферации в процессе развития и при патологии сердца
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Кардиомиоциты системы генерации и проведения импульсов: особенности пролиферации в процессе развития и при патологии сердца"

} п

ИНСТИТУТ цитологии РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

На правах рукописи УДК 576.353:611.018.63

ЕРОХИНА

Инэса Лазаревна

КАРДИОМИОЦИТЫ СИСТЕМЫ ГЕНЕРАЦИИ И ПРОВЕДЕНИЯ ИМПУЛЬСОВ: ОСОБЕННОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ И ПРИ ПАТОЛОГИИ СЕРДЦА

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена в Лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. Я. Бродский; доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор А. Л. Поленов; доктор медицинских наук, академик РАЕН, профессор В. Н. Швалев.

Ведущее учреждение: НИИ экспериментальной медицины РАМН.

Защита состоится «/3 » //"А-Е-^Д^ 1992 г. в «// » ча-

сов на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан « 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук Л. Н. Писарева

(С) Институт цитологии РАН

су:, ■•."•• ЬПШШЕКА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопрос о закономерностях пролиферации и ее связи с процессами! дифференциации остается одним из [ентралышх: в биологии клетки. По характеру взаимосвязи этих :роцессов сердечная мышца принципиально отличается от соматических мышц (Румянцев, 1382). В миогенезе и при регенерации последах дифференциация и пролиферация взаимно исключают друг друга, г синтезируют ДНК. и делятся только недифференцированные клетки идиобласты или сателлита). Напротив, мышечные клетки сердца, • юдержшдае миофпбриллы, способны синтезировать ДНК и делиться ттозом. • .

До конца 70-х годов в большинстве кардиологических работ [рояифзративное поведение клеток в процессе развития и при пато-гогии миокарда рассматривалось баз учета гетерогенности его клэ-•очного состава. Вместо с тем о ранних стадий кардиогенеэа кроме шоцитов рабочего миокарда (РМ) яелудочна и предсердия дифференцируются миоцитц так называемой "проводящей" системы (ПС) сердца, 1ашмающпэ относительно небольшой объем миокарда и специализиру-нщеся не на сокращении, как рабочие миоцитн, а, как и нейроны, [реимуществанно на генерации и проведении, импульсов. Миоциты ПС сличаются от рабочих миоцитов по морфологическим, злектрофизио-гогическш, цитохимическим, ишуноцигохяшческш и другим харак-'еристикаы. Полагают, что миоциты ИЛ и ПС развиваются как раз-игчныв клеточные популяции. В свою очередь популяция миоцитов ПО гарфологическл и функционально не однородна и состо::т из-, несколь-лх субпопуляций клеток. Импульс к сокращению генерируется в • ;энгральной зона оиюатриального узла (СА7), образованной кдет- ■ :оми-водителями ритма, и по проводящие внутрипредсердпш волокнам ¡ередается к атриовеятрикудярюму узлу (АВУ), далее к пучку Гиоа ГШ) и его ножкам и через их. периферические разветвления к рабо-[им. миоцитам желудочка. Миоциты всех отделов ПС имеют плохо раз-,игый сократительный аппарат , но при это« сохраняют основные юртн мышечных клеток. Морфологические отличия миоцитов ПС от щоцитов РМ особенно резко выражены в сердце копытных, в то время :ак у грызунов, на которых выйолнена экспериментальная часть нас-■ояшей работы, четко различимы лишь САУ, АВУ и ПГ (си.: Тгиех,

Bmythe, 1965; challice, 1971). Миоцити ПС сердца человека занимают промежуточное положение мекду эпши двумя крайними группами.

После доказательства совместимости процессов пролиферации в дифференциации в миоцитах. желудочка и предсер^яр возник вопрос,в какой степени ают вывод относится к мышечным клеткам EG сердца. К началу настоящей работы деление клеток НО было совершенно не исследованной, областью клеточной кардиологии. В многочисленных; • работах со амбркологическому происхождении и развитию отделов 1Ш в ультраструктуре ее клеток большинство авторов или вообще не ' упоминали о делении клеток или обращали внимание на отсутствие митозов не только на постнаталышх, но и на имбрионалышх стадиях развития (walls, 1947; Field, 1951; Kui», 1954;Robb, 1965), Митоз как очень редкое явление отмечали в единичных работах (Duckworth, 1952; Foragren et el., 1980). Некоторые авторы видели в ПС клетки о дауыя и более ядрами и, не обнаруживая митозов, обсуждали возможность амитозов ( Field, I95I;HintzscbB, . 1354;Muiü", 1954). Несмотря на почти цолное отсутствие митозов ., клетки ПС, в частности клетки Пуркинье из концевых разветвлений ПГ, рассматривались как своего рода камбий для обновления ÍM . -(Hudgson, field, 1973). Оставалась неясным, объясняется ли дефицит данных о делении клеток ПС недостаточный вниманием к этой проблема или ушаывае! на принципиальное различие пролифератявного поведения (механизма и/или скорости деления клеток) миоци-тов ПС и РЫ. .

Вопрос о том, в какой степени миоциты ПС могут обновляться, представляет инзерес дан клинической кардиологии, поокольку-оот-рые я хронические болезни сердца часто сопровождаются метаболическими, функциональными и морфологическими изменениями миоцитов Ш, включая дегенерацию и некроз клеток ( Elias et al., 1982; Павлович и др., 1987, 1989; Шаров, Толоколышков, ISS7), что мо, хм быть причиной различных типов аритмий и' нарушений.проводшоо-тк при патологии сердца { Davles at al., 1983); К началу настоя. щай. работы о способности шоцитов ПС к реактивной пролиферации было известно очень мало. Имелись лишь данные о величине пролифа-ратшзного пула для ыиоцитов атриовентрикулярного (АВ) отдела ПС

ри инфаркте миокарда у взрослых: крыс (Eumyantaev.Kasaem, Г976). овершешю не исследованной была способность к реактивной про-иферации (полишюидизации) миоцитов ИС сердца человека, харак-ерной особенностью которого является прогрессивное накоплена полиплоидных ядер в миоцитах РМ желудочка и предсердия в ормальнош кардиогенезе и при гиперфункции ( Sandritter, Scoma-zoni,l964; Pfifczer, Capurso, 1970 ;Adler, Friedburg, 1986 и др. }.

■Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследо-ании особенностей пролиферации и дифференциации миоцитов ИС в равнении о миоцитами РМ нелудочка и предсердия в развивающемся патологически измененном сердце. В задачи работы входило:

1. Исследовать ультраструктуру клеток ПС в фазах синтеза НК и митоза.

2. Изучить кинетику нролиферативной активности миоцитов ПС а пре— и'постнатальных стадиях, кардиогенеза.

• 3. Сравнить интенсивность синтеза РНК и белка в миоцитах 3 и РМ.

4i Исследовать способность миоцитов ПС к реактивному аинте-у ДНК при экспериментальной патологии сердца грызунов.

5. Сопоставить содержание ДНК в ядрах, миоцитов ПС и РМ при лителыгой гиперфункции сердца человека.

Научная новизна и практическая ценность"работы. Впервые по-азано, что характер взаимосвязи процессов пролиферации и диффе-знцлации в кардиомиоцитах. ПС и РМ идентичен. IIa примера миоци-зв С¿У развивавшегося сердца мыши методом электронной микроскопа и электронномикроскопической авторадиографии показано, что шатки ПС,содержащие миофибрилли,. синтезируют ДНК и делятся ти-1чншл митозом. Но число включающих, %-тимидин (%-Т) ядер мио-itob в САУ в 3-4 разя ника, чем в желудочке и предсердии. Мор-)логически недифференцированные клетки"типа миобластов на обнажены. Впервые описана ультраструктура специализированных мио-ГЕов ПС во всех фазах митоза. При митозе типичных клеток САУ | • гофибриллы, несмотря на низкую степень дифференциации, распа-датоя на пучки шгафиламентов*вследствие резорбции z-даоков. установление- структуры мкофйбрилл происходит только в поздней . ¡ло'фазе - о. -фазе. Эти данные подтверждают и расширяют пред-

ставлеше о поведении сократительного аппарата кардиошоцитов во время митоза, составленное на основании изучения РМ (Румянцев, 1982).

Впервые дана количественная оценка пролиферативной актив-, ности шюцитов разных отделов ПС в сопоставлении с миоцитами' РМ в процессе кардиогенеаа. Наиболее резкие различия по интенсивности пролиферации ыеаду миоцитами ПС. и Р1Л тлеются на пре-натальных стадиях-, развития ыши, кролика и морской свинки. По-, казано, что в разливающемся сердце динамика индексов синтезируш-адос ДНК и штотичёоки делящихся шоцитоп в разных отделах ПС различна. Разными методами получены дангша о продолжительности фаз митотического цикла в миоцитахПС. Показано, что в развивающемся сердце мши длительность митотического цикла и его фаз в шиоцитах ПС и ЕМ сходна и сходным образом увеличивается в этш отделах, в течение кардаогенеза. Сделан вывод о том, что различи? мевду ПС и РМ по кодексам меченных ®Н-Т ядер объясшшгсй в осно! нош меньшей фракцией, пролиферярующих клеток в ПС- Показано, что интенсивность синтеза РШС и белка в кле'псах разных отделов ПС на исследованных стадиях раавития мши ндае, чем в рабочих мио-цктах.

Впервые получены данные о способности к реактивному синтез} ДНК миоцитов разных отделов ПС рри патологии сердца. Показана, что при экспериментальном инфаркте:миокарда у'крыс индекс кумулятивно ыёченных ядер ыиоцигов в ПС достоверно' увеличивается только в АВУ и ПГ у взрослых кивотных. Обнаружено, что в сердце человека в отличие от низкого уровня шюидности ядер в мио-цнтах узлов НС.1 ядра клеток Пурюшье дистаяьных разветвлений ПГ имеют. высокий уровень плоидности. Впервые показана (совместно с Е.Ы,Антипановой) для шоцитов АВУ сердца человека корреляция между числом-телец полового хроматина С телец Барра) в ядрах и уровнем их плоидности, что косвенно свидетельствует о том, что в миоцигах ПС, как и в миоцигах РА1, имеет место истинная поли-илоидизация ядер (умножение Есего генома). ■ .

Научно-практическое значение работы заключается в том, что .'полученные данные расширяют основные представления о проли^а-тявном поведении различных 'типов кардипмиоцитов в развивающемся

I патологически измененном сердца. Разнообразие пролгпзратщ!-гого поведения карлпомкоцитов дол:шо учитываться специалистами з области молекулярной и клеточной кардиологии. Дашшо о проли-Зерагивных возможностях мпоцитов разных отделов ПС продетавлгаот нггерес для клинической кардиологии.

Положения диссертации, которые шносягся на залкту.

1. В ПС, коле и в Рл, процесса пролиферации и дпщеранциацли ¡овмещшотся в одних и тех г.с клетках. 3 СЛУ в синтез ДНК и в профазу митоза вступают июцати, шлекчие ту лш саму» ульграсх-г зуктуру, что и мпоциты в других фазах клеточного цикла, что мзволяет.заключить, что СЛУ растет подобно РМ (Румянцев, 1962), г. е. за счет пр6ли'7оращш самих дг4*}.эрз!пдарувдихся мшочша исток. Во время митоза, начаиая с пропетафазы, шмфибрилли в лиоцптах СЛУ распадается на беспорлдочно разбросанные пучки .шофнлакентов в результате зрековноЗ резорбции г-дяоков подобно сому, что наблюдается при катоза м^юда(ференцировапнцх. рабочих, .шоцитов (Румянцев, 1982), .

2. На большинства про- и постнатальннх стадий развития "мы-зи индексы елнтозлрущих ДНК и делвдпхвя митозом шоцитов, а тах-10 интенсивность синтеза РНК и белка в нет, во всех отделах ПС цгае, чем в-РГЛ. Длительность кигогпческого цикла и его фаз в .шоцитах ПС и Р;л сходна и увеличивается в процесс« кардиогенеаа. Различия между ПО и РЛ по индексам меченных ядер объясня-атся менкиой фракцией пролиферируюцпх клеток в ПС.

3. В исследованных вариантах, экспериментальной и клинической патологии способность к реактивному синтезу ДНК (полиплоиди-эации) выражена в различной степени в мкоцигах разных отделов ПС. 1ри инфаркте миокарда'у молодых и взрослых крис и после инъекций мопротеренола крцеам и мшаы в ПС наиболее высокие абсолютные значения индексов кумулятивно меченных. ®Н-Т ядер имеют ыпоциты ШУ й проксимальной части ПГ. Четкая активация вступления этих; меток в синтез ДНК'по сравнению о контролем наблюдается только три инфаркте миокарда у взрослых крыс. 1

При гиперфункция сердца ¡человека ядра шоцитов САУ и АВУ не вовлекаются в интенсивную полиплоидизациш, как зто тлеет место з клеткал Еуркипье из ПГ и его дистальннх разветвлений и в

- а -

миоцитах желудочка и предсердия. В миоцитах узлов ПС преобладают диплоидные- ядра, доля тетраллоидных; адер незначительна; уровень плоидности ядер не зависит от степени гипертрофии сердца. Напротив, ядра миоцитов Пуркинье из ПГ и его дистальных отделов в гипертрофированных сердцах тлеют высокий уровень плоидности. Данные о корреляции между числом конденсированных. Х-хрошсом (телец полового хроматина) и содержанием ДНК в ядрах миоцитов АВУ сердца человека являются косвенным свидетельством того, что и в миоцитах ПС, жак и в миоцитах РМ, имеет место истинная полиплоадизация адер, которая сопровождается умножением всего • набора хромосом. ~

Апробация работы. Материалы диссертации были дрложены на:' Всесоюзной конференции "Проблемы биологии развития" (Москаа, 1970); У111 и X Всесоюзных съездах анатомов, гистологов и эмбриологов (Ташкент,' 1974; Винница," 1986); И Всесоюзной школе по проблемам биологической подаикности-(Ленинград, 1979); Всесоюзно симпозиума по сравнительной электрокардиологии (Сыктывкар, 1979) XI. Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Таллин, 1979); X и XIII Конгрессах международного общества по изучению сердца (Москва, i960; Эга Арбор, США, 1989); У1 Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1981); II и III Всесоюзных симпозиумах советской секции ШИС "Метаболизм , структура и. функция сердечной клетки" (Ташкент, 1983; Баку, 1986)'; Конференции "Макромолекулы и функционирование клетки" (Ереван, 1986); ХУ1 и ХУП Конгрессах общества гистохимиков Германии (йена, 1988; Потсдам,' 19Э1);.на заседаниях Ленинградского отделения ВЮАГЭ, на научных конференциях Института "цитологии АН СССР и других.

Объем и структура работы. Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного.доклада, обобщающего результаты, изложенные в 41 публикации в отечественных и международных изданиях.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материал. Синтезы ДНК, РНК и белка в миоцитах в кардаогенез в основном исследовали на мшах линий C57bi и СЗНА (около 40Ö животных). Небольшие серии опытов были поставлены на кроликах .

' (13 животных) и морских свинках (9 животных). Способность миоцитов к реактивному синтезу ДНК исследовали: I) при экспериментадь

ом инфаркте, миокарда у молодых и. взрослих крыс Вистар (51 кри-ы), 2) после ¡шъекцлй изопротеренола взрослым крысам Виотар 14 крыс) и взрослил мышам линии CC57W (24 мши), 3) при гиперфункции сердца человека. Инфаркт миокарда левого желудочка вн-ываля перевязкой левой коронарной артерии. В качестве контроля :спользовата неоперировгштпс и ложнооперированпых крыс. Две :нъекции ь-изопротеренола делали с интервалом 24 ч в дозе ¡5 мг на I кг веса тела. Содержание ДНК в ядрах миоцигов сердца ¡еловека определяли на аутопоийном материале, полученном не . [озднео чем через 24 ч после смерти от 12 пациентов обоего пола: IT 3 пациентов в возрасте 6.5 мес, 31 года и 36 лет, не отрадав-шх болезнями сердца (вес сердца 34 г, 240 г и 260 г, отношение ¡еса сердца к весу тела - 0.4I-Q.47), и от 10 пациентов, в возрао-■е 4.5 мес (I) и 29-70 лет (9), имеющих различную степень гипер-'рофии сердца (вес сердца 80 г и 4ЕО-780 г, отношение веса сердца к весу тола - 0.50-1.<16) вследствие врожденных и приобретении пороков сердца или пгпертензии II-III степени.

Электронную микроскопию применяли для исследования ультра-¡трукгуры миоцигов в интерфазе и митозе. Материал фиксировали. í,5¡£--hhm глутаральдегидом на веронал-ацетатном или какодилатном 5уфера с. дофнксацией IJá-шм oso^ п заливали в аралдит. Контрастирование проводили уранил-ацэтатом и цитратом свинца. Для пред-трительной ориентации использован! полутонкие срезы, окрашенные .'.етнлековш синим. Тонкие срезы изучали в электронном микроскопе JEN-? А илилзм -I00C.

Электронномикроскопкчоскую авторадиографпв применяли для юследования ультраструктуры сннтезйрукщих. ДИК клеток. За I, 24. i 48 ч до фиксации материала беременным мышам вводили ®Н-Т (сп. акт. 740 ГБк/ммоль, СССР) в дозе 1850 кБк на I г веса тела. Автографы готовили путем нанесения на стекла со срезами фотоэмульсии типа М или Iiford L-ч- (Larra,Droz, 1970) и через 2-6 мес ]роявляли амидоловым или фенндоновым проявителем (Гайер, 1974),

Методом светомикроскопической авторадиографии определяли: зледующиа показатели: I) индексы меченых ядер после однократных янъекций 31!-Г .за' 1-3 ч до фиксаций для изучения динамита синтеза ЦНК-в кардиогенезе грызунов; 2) процент меченых митозов через

разные сроки после введения Н-Т для определения параметров клеточного цикла в кардкогекезе мши по катоду меченых митозов ( ОиааЫйг, Shorman, 1959); 3) интенсивность метки на ядро через

I и 48 ч посла введения Н-Т для оценки длительности меточного цикла в кардиогенезе мши по методу "разведения" метка; 4) индексы кумулятивно печеных ядер после 2-4-крагных введений ®Н-Т. бе-ремзнкш живогнш (с интервалами 6-7 ч) пли после Ю- к 50-крат-

них введений Н-Т (с интервалами! 12 ч) аквоткш посла рождения, с целью пометить все клыки, синтезирующие ДНК, в кардиогенезе и при оксперкиектальной патологии (о 3-х суюк посла операции или через I ч после 2-й инъекция изоиротаренола); последнюю инъекции делали за I ч до фиксации; Ь) индекса меченых ядер после однократных шъекций А4С-тимидпиа t^C-Т) и "%-Т для оценки продо:кителыюс:ги фазы синтеза ДИК п кардиогенезе мыши по методу двойной мет:.-си ( Schuitze et al., 1976); б) интенсивность

Q О "

метки Н-уридшщ и Н-леицкиа для изучения синтеза РНК и белка в кардиогенезе мши.

■Изотопы вводшш подкожно в следующих'дозах. (сп.акт. 740 ГБк/ылоль, СССР) вводили однократно или повторно беременным . ' животным в дозе XII кБк на I г веса тела, кивотнш после ровде-ния - в доза 37 кБк на I г веса тела. В опытах с двойной меткой .^С-Т Con.акт. 1.85 ГБк/кмоль, СССР) вводили беременнш мышам в

дозе 24 кБк на I г веса тела, мышатам - в дозе 12 кБк на I г -не-

оа твла. Через 4 ч (за I ч до фиксации) вводили Н-Т беременным мышам в доза IS6Q кБк на I г Беса тела, мышатам - в дозе SSQ кБк на I г веса теха. Дозы изотопов' в опытах с двойной меткой били

взяты в соотношении 1:80 (Schuitze et al., 1976), Н-уридин (qn. акт. 629 ГБк/ммоль, СССР) и 3Н-лейцин (сп, акт. 1406. ГБк/ммоль,Англия) вводили однократно за I ч до фиксации беременным мышам в дозе 74 кБк на I г веса тела, мышатам - в дозе 37 кБк на I г ■ веса тела.

Материал.фиксировали в жидкости Карнуа, зализали в парафин и готовили серийные срезы толщиной .5 мкм. На срезы наносили нид-.кую эмульсию типа Р или М (СССР).'Для выявления одновременно л матки 4С~Т и %-Т готовили автограф с двойным слоем эмульсии • (см.: Ерпхипа, 1987). Перед нанесением эмульсии часть препаратов

зарабатывали диастазой в точение I ч при 37°С и проводили ШШ-реакцию, при которой хоропо окрягапвается сарколемма. Индексы каченных %-Т и делящихся митозом ядер определшш при подсчете па менее 1000 ядер в каждой зоне. Для каждой точки кривых меченых митозов учитывали 30-100 митозов, включая поздние профазы и средние телофазн. В опытах с "разведением" метки число зерен серебра подсчитывали над 50 ядрами. lía автографах с двойной меткой анализировали 1000 ядер и определяли: I) индекс ядер, меченных только %-Т, 2) индекс ядер,- моченных только ^С-Т, 3)индекс ядер, имеющих двойную метку. Длительность фазы s рассчитывали по формула для популяций, находящихся в стационарном состоянии С Korr et al., ' 1973J, и по формуле для экспоненциально растущих популяций ( Knolle, 1984). На срезах, меченных %-уридином, определяли: I) процент меченых ядер при подсчете ECO ядер,

2) среднее число зерен серебра на ядро при-подсчете 100 ядер,

3) концентрацию метки (среднее число зерен серебра на условную единицу площади ядер и цитоплазмы) в 200 миоцитах. После обработки РНК-азой срази полностью теряли метку ^Н-уридина. На срезах, меченных ®Н-лейцшгом, подсчитывали число зерен серебра в 20 полях площадью 180 мкм^.

Цитофотомегрия. Содержание ДНК в кардиомиоцитах человека определяли на срезах, что связано с трудностью достаточно чистого выделения миоцитоа ПС из окружающих тканей РМ для получения диссоциированных клеток или давленных препаратов. Образцы ткани фиксировали в жидкости Карнуа, заливали з парафин, готовили срезы толщиной 12 мкм и окрашивали по Фельгвну. Дтл идентификации мис-цктов ПС каждый Ю-Й серийный срез из блоков, содержащих ПС, окрашивали гематокенлшюм-зозиногл или азуром Ii-эозином. Для фотометрии использовали ядра, лежащие в продольных волокнах в тоще срезав. Содержание ДНК в 200 ядрах миэцптов из какдой зоны ' определяли на сканирующем микроокопе "Ыорфоквант" (Карл Цейс, Йена). Число ядер различных классов пловдности оценивали по гистограммам. За границу классов принимали середину метду двумя пиками числа ядер, соответствующими содержанию ДНК 2с, 4с, 8с и более. Незначительную долю ядер с промежуточными значениями распределяли поровну между двумя соседними классами.

Светомикроскопическ.ую и электронномикроскопичсскуп цигохимк применяла для выявления общей холинэстеразы и специфической холикэсгеразы (ацетилхолинэстеразы) по методу Карновского (см.: laiiep,' 1274). -

При статистической обработке данных -определяли средоеа арифметическое значение и его ошибку. Значимость различий сравниваемых величий оценивали с помощью t-критерия Стьюданта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУДЦЕНИЁ

I. ОСОБЕННОСТИ ДШШНЦИАЦИИ И ЛРОЛШШЦИИ ШЮЦЖОВ ПРОВОДЯЩЕЙ СИСТЕМЫ (ПС) СЕРДЦА В КАРДГОГЕШЗЕ ГРЫЗУЮВ

В сердце грызунов основниа отделы ПС (САУ, АВУ и ПГ) на серийных срезах достаточно хорошо различаются по.локализации и морфологическим особенностям клеток. САУ хорошо виден у впадения верхней полой ванн в правое предсердие и имеет 'вид четко ограниченного скопления плотно упакованных мелких клеток с большой центральной артерией. АВУ выделяется как более светлое пятно, чем окружающий РМ, в. нижней части мажпредоердной перегородки. От АВУ, как хорошо ввдно на серийных срезах, начинается ГШ, который проходит в верхнюю часть ыежжелудочковой перегородки и расщепляется. там на левую и правую ножки. Миоциты САУ, АВУ и Щ? в сердце, грызунов мельче по размерам, чем соседние'рабочие миоциты. Миоциты дисгашшх отделов ПГ (клетки Пуркшье) в сердце грызунов морфологически на отличимы от окружающих рабочих миоцитов.

САУ, АВУ и ПГ особенно четко различаются после проведения реакции на суммарную и специфическую холинэстеразы. При визуальной оценка интенсивности реакций отделы сердца распределяются в следующем порядке: АВУ и ПГ САУ келудочек предсердие. I.I. Ультраструктура синтезирующих ДНК и делящихся митозом миоцитов СДУ ШбТЩрНОВ мми Эта часть работы была выполнена на СЛУ, так как этот отдел ПС легко локализовать, а его миоциты по ультраструктуре резко отличаются от окружающих рабочих миоцитов предсердия, Последйие у Хб-Ш-суточных эмбрионов мши содержат многочислонные миофиб-.ршиш, специфические предсердиие гранулы, десмосомы и ноксусы. Напротив, характерной чертой типичных миоцитов САУ.праабладищих

з центральной зоне узла, является относительная бедность орга-геллами, особенно миофиламентагди, и почти полное отсутствие зпециТпчзских. гранул. Типичные миоцитн СЛУ (пеисмзкерннз ¡слатки, клетки-водители ритма) представляют собой мелкие клетки неправильной формы с длилпши отростками. Обычно ггаоцктн плотно упакованы о группы, окру?яенные общей базальной мембраной и разделенные прослойками соединительной ткани. Ядра округлые или овальные, светлые, а тогааш слоем гранулированного периферического хроматина и рдеют одно-два хорошо развитых ядрышка;рибосомы на внешнзЛ ядерной мембране немногочисленны. Креме типичных узловых клеток на-периферии САУ присутствуют так называемые "переходные" клетки, которые'по ультраструкгуре занимают промежуточное положение медзду рабочими и типичными узловыми миоцит&ми. Переходные клеисл цилиндрические по форма, с длинными.тонкими ориентированными вдоль продольной оси клетки мпофибрпллаш, более дифференцированными V многочисленными, чем в централышх узловых клетках. В срезах САУ нередко встречаются немиелинизированные нервные волокна. Иногда модно видеть тесный контакт мышечных клеток с нервными оглнчагидап, содержащими мелкие плотные митохондрии: ,фила-менты, микротрубочки я обильные пузырьки. По интенсивности реакций на специфическую и неспецифическую холинэстеразу клетки САУ распределяются в следующем порядке: нервные окончания переходные клетки -> тшичные узловые метки. В мыпечннх метках наиболее интенсивная реакция наблюдается над миофибриллами и митохондриями, слабее - над. ядрами и саркоплазмагической сетью.

. Включение %-Т в миоцигы САУ. На электронномикроскоплческих автографах в СЙУ 16- и 18-суточных эмбрионов мыши через I ч после . инъекции "Н-Т метится'5,8 а А.А% ядер в типичных узловых миоци-тах,что в 3-4'раза меньае,чем'в рабочих миоцитах желудочка и предсердия. Через 24 и 48 ч после инъекции %-Т число меченых типичных миоцитов.увеличивается в 2-4 раза. Это сопровождается появлением гетерогенности'ядер по интенсивности метки. Число меченых ядер в переходных миоцитах через I, 24 и 48 ч после инъекции почти в 2 раза больше, чем в типичных узловых миоцитах. •

Ультраструктура меченых И немеченых миоцитов САУ в интерфаза. Через I ч после" инъекции 3Н-Т меченые миоциты предположительно

находятся в Б-фаэе или в самом начале а^-фазы, немеченые — в

- или в средней-поздней а2-фазе митотического цикла. Меченш и немеченые мкоциты 16-18-суточных эмбрионов мши по ультраструк туре цитоплазматическюс органелл отличаются мало. Большинство меченых типичных узловых миоцигов имеет редкие беспорядочно' ориентированные. тонкие миофибриллы, чаще занимающие парануклеар-ное положение. Толщина миофибрилл вариир^ет. Миофилаыенты не всегда имеют гексагональную упаковку. Как правило,, различимы . только А-, I- и '¿-диски, г-дискц таких плохо развитых миофиб-рилл редко образуют тонкие линии, часто утолщены или тлеют форму округло-овальных, одиночных или двойках, пятен, принимая на протяжении одной миофибриллы разный вид. В клетках обычно' присутствуют неорганизованные в саркоыеры филаменты, различающиеся по диаметру: толстые (15 юл), тонкие (7 нм) и промекуточ-ные (8-11 ил), а г.'акне комплексы из толстых, гонких фильментов, одиночных рнбосоы и венчикообразных полисом. Большие спиральные полисош встречаются редко. Нередко можно видеть саркомзры, дифференцирующиеся в связи с материалом й-дискрз, прилежащим■к сарколемме. По степени дифференциации плохо развитого миофибри-. ллярного аппарата клетки САУ 16-18-суточных эмбрионов мыши сопоставимы с миацигаки налудочка 12-13~суточиых эмбрионов (Румянцев, 1982), В отличие от миоцитов САУ миоциты желудочка и предг-сердия 16-18-с уточ!шх эмбрионов шиш имеют многочисленные миофибриллы с упорядоченной ультрасгруктурой.

Митохондрии немногочисленные, скругже или овальные, с небольшим числом, криат. Около миофибрилл можно вНдеть каналы, а под сарколеммой - плоские терминальные цистерны саркоплаэмати-• ческой сети. Степень развития гранулярной эндоплазматическоЯ сети варьирует от одиночных коротких каналов до пакетов из 2-4-х штук на срез. Аппарат Гольдаи выражен относительно хорошо и состоит из плоских цистерн, различного размера вакуолей"и небольших пузырьков. Многочисленные светлые и темные пузырьки видны и вне зоны аппарата Гольдаи, в том числа и в контакте с сарколеммой; _ последнее указывает на, интенсивный окзо- к эидоцитоз. Встречаются такке окаймленные пузырьки (сои(.ос1 уез!е1ев ) и единичные лизосомо-подобные образования (200-400 им в диаметре) с галоген-

ил мелкозернистым содержимым. Специфические гранулы, сходнне с редсердннми, в меченых и немеченых узловых миоцитах единичны. I различных зонах клетки видны частицы гликогена, иногда встре-[аются липидные включения, микротрубочки и мультивозикулярныо 'ельца. В зона аппарата Гольджи можно видеть типичные центриоли, ¡бллзи от которых иногда заметны поперечно-исчерченные пучки гонких филаментов с периодом исчерчснности 50-70 нм, напоминаю-цив корешки ресничек. Нередко встречались и реснички. Специализированные контакты между клетками представлены редкими примитив-шмя вставочными дисками к десмосомамл.

Ультраструктура мпоцотов САУ в митозе. У 16- и 18-суточкых эмбрионов М1ия число делящихся митозом мюцитов в САУ в 2-4 раза пике, чем в келудочке и предсердии и составляет 0.8 и 0.65а (ЕгокЫпа, ЯитуаггЬяеу, 1988). Столь низкие значения миготических индексов весьма затруднили исследование ультрэструктуры митоза в этих клетках. На ультратонких срезах нагл удалось обнаружить в различных фазах митоза 49 мкоцитов. из центральных зон САУ в окружения тгаинних узловых киоцитов в интерфазе. Чаще встречались профазы (22) и телофазы (£5), что объясняется, по-видимому, их Зольией продолжительностью. После инъекций %-Т через I ч хромо-зомы не имеют метки, л то время как через 24 ч все митозы били меченые.

Кяоциты в' профаз а различили благодаря присутствию, хорошо очерченных хромосом. Изменения ядерной оболочки, ядрышек, ценгриолой и микротрубочек типичны для любой другой клетки в пролазе. Ультраструктура цигоплазматическях органвлл, особенно мио-ьибрилл', ь.ала изменяется по сравнению с инторфазой; видам А- и . 2-диски. Постоянно присутствуют элементы саркоплазматической сети. В ранней й средней профазе, как и з интерфазе, хорошо выражен аппарат Гольдни. В п р о м.е г а ф а з-а вблизи от хромосом видны фрагменты ядерной оболочки а мккротрубочки веретена, прикрепленные к кпнетохорам, а также митохондрии, элементы гранулярной ондоплаэматнческой сети и остатки аппарата Гольдки. Ультра^ структура фрагментов ядерной оболочка в прометафазе аналогична описанной для других клеток (Зацепина и др., 1976деИ5я^о11сап, 1979). Наиболее четкое изменение миофибрилл - прогрессивная

потеря контрастного материала 2-дисков, которые выявляются лишь-в. виде редких пятен слабоконтрастного нитевидно-сетчатого материала в местах исчезающих 2-дисков на границе саркомеров. Послед ниа в основном еще собр.аны в редкие миофибриллы, миофиламенты которых сохраняют приблизительно параллельную ориентацию. На периферии клеток вид,та немногочисленные, одиночные и объединенные в пучки, миофиламенты.

В серийных срезах миоцитов САУ в метафазе и/или ■ ран н. ей анафазе, трудна отличимых на срезах, материал ^дисков не удалось обнаружить ни в одной из 8 исследованных клаток. Немногочисленные миофибриллы и саркомерн распадаются на одиночные или объединенные в пучки миофиламенты, которые смещаются в, основном под плазматическую мембрану или в отростки клетки. Актиновыа филаменты становятся трудно различимыми. Структура мио-фибриллярного аппарата сходна с наблюдаемой при митозе малодиффе-ренцированных. рабочих миоцитов желудочка (Румянцев, 1982). Светлая зона цитоплазмы с хромосомами и митогическим веретеном окружена редкими митохондриями и многочисленными пузырьками, являющимися- производными.' ядерной оболочки, цистерн аппарата Гольдки в саркоплазматической сети, а также каналов гранулярной эндоплаз-ыатической сети, утративших частично или полностью'рибосомы. Цистерны последней на периферии клеток обычно остаются неизмененными. По всей цитопла&ма разбросаны свободные рибосомы и скопления частиц гликогена. Дентриоли, миготическое веретено и кинетохоры с прикрепленными к ним хромосомными • микрогрубочками имеют типичную ультраструктуру,

В поад'ней анаф.аае. на будущих дочерних ядрах ' начинается реконструкция ядерной оболочки, фрагменты которой появляются сначала на латеральных поверхностях хромосомных комплексов в виде отдельных плоских цистерн, контактирующих с хроматином. Интерзона между хромосомными комплексами содержит микро- ■ . трубочки веретена, рибосомы и полисомы, частицы гликогена и отдельные митохондрии. На периферии клеток видны отдельные мйофи-- ламенты и -пучки миофилале.нтов без ?,-дисков.

Телофаза-ран.ний период . Реконструкция ядерной оболочки, начавшаяся в'анафаге, протекает очень быстро'

почти завершается в ранней телофазе, за исключением центро-.ерншс зон, где микротрубочки веретена подходят к кинегохорам. лртинн восстановления ядерной оболочки сходны с описанными в итературе (Зацепина и др., I97G; Zeiigs, Wollman, 1979). ядом с кшгдыгл из дочерних хромосомных комплексов постепенно останавливается аппарат Гольдка!. В интерзоне, кроме многочис-:енных пузырьков и единичных митохондрий, появляются осмкофиль-eq предшественники mid-bodies . Борозда цитокинеза намечает-я иногда ук? в ранней телофазе, придавая клетке гантелеподобную 1орглу. Завершение цитокинеза приводит к образованию дочерних . шоцитов. Обнаружены клетки с бороздой цитокинеза, завершившегося в плоскости среза, ухе на стадии средней гелофазы, в дочерних драх которых начинается деконденсация хроматина. Несмотря на лабоа развитие сократительного аппарата в типичных миоцитах САУ стречаются поздние телофазы со сближенными дочерними ядрами без риэнаков цитокинеза и единичные дауядерные клетки.

Пучки мисфиламентов остаются разбросанными вплоть до поздней елофазы,. ког;,а отдельные пятна контрастного z-подобного материа-:а появляются среди миофиламентов. В ранних постмитотических летках, самой характерной чертой которых является присутствие ояодых дочерних ядер, можно видеть примитивные миофибриллы с ятнами контрастного 2-материала. В отличие 'от дисков z на всех тадиях митоза сохраняется контрастный материал десмосом и при-итив1шх вставочных дисков а. ориентированными в направлении 'asoiae adhérentes миофиламентами как на концевых, так и на бо-овнх поверхностях клеток. Сохранение соединительных комплексов вжду делящимися и интерфазгшми клеткали подчеркивается всеми . вторами, исследовавпшмл глитоз рабочих кардиомиоцитов (Румянцев, 982;ftmasek, 1968;Нау, Low, 1972). '

Синтез ДНК и митоз. в немшечных клетках САУ. Синтезирующие ,НК и делящиеся фибробласты, эндотелиальные клетки и перициты., -вгко отличимы от пролиферирующих миоцитов САУ благодаря их топо-:огии и ультраструктуре (отсутствии мкофиламентов, хорошо развя-ой гранулярной эндоплазматической сети и др.). Дифференциация . аких клеток в. миоциты САУ не "наблюдалась независ шло от интерва-:а времени мезду инъекцией %-Т и фиксацией (I, 24 или 48 ч).

Представленные данные на примере миоцитов САУ доказывают, что в НС, как и в РМ, репликация и миофибриллогенез протекают в одних и тех же клетках. В САУ сердца 16-18-суточных эмбрионов мши всс типы ылоцитов способны к синтезу ДНК и митозу.

Сходство ульграструктуры миоцитов САУ в фазе синтеза ДНК и в других перлодах интерфазы, так же как и отсутствие фракции ыорфологически различимых миобластов, позволяет заключить, что в кардиомиогенеае САУ растет таким же образом, что и РМ желудочка и предсердия, т.е. за счет пролиферации самих дрфферешдирую-щихся мышечных, клеток скорее, чем за счет каких-либо внешних источников - миобластов и/или миоцитов из РМ, приобретающих свойства клеток ПС ( Field, 1951; Muir, 1954).

Тот же вывод может быть сделан и на основании исследования ультраструктуры мптотически делящихся клеток САУ, т.к. в профазу митоза вступают миоциты с ультраструктурой сходной с ультраструктурой соседюсх интерразных клеток узла. Однако между профазой и телофазой миофибриллы находятся в дезинтегрированном состоянии в результате резорбции 2-дисков. В основном поведение миофибриллярного аппарата в делящихся митозом клетках 11С (рис.1) аналогично наблюдаемому при делении малодифференцироцая-ных миоцитов Р1Л эмбрионов крысы и курицы (Румянцев, 1982).

Таким образом, характер взаимосвязи процессов ддфференциа-' ции и пролиферации в миоцитах ПС и РМ сходен. Однако индексы, включающих Н-Т ядер миоцитов IIC, в частности САУ, на исследованных стадиях значительно ниже,, чем миоцитов РМ. Необходимо было провести анализ кинетики пролиферации миоцитов разных от. делов ПС в течение кардиогенеза, что возможно было сделать только методами светоопгической авторадиографии.

1.2. Авторадиографический анализ кинечики пролиферации миоцитов ПС развивающегося сердца грызунов

Синтез ДНК и митозы. Наиболее деташгое исследование пролиферации миоцитов IIC и Р.>1 было выполнено на миокарде мши, начиная с 15-х суток эмбриогенеза, т.к..с утой 'стадии различные от-• делы TIC довольно легко идентифицируются и содержат достаточное . '• число клеток для количественной оценки пролифератюшой активности

гга.1. Схема изменений ультраструктуры миоцитов синоатриальвого узла эмбрионов мыли в митотичгсном цикле

& го

■Su

■f

Рис. 2. Ицдексы первично меченных, мышечных ядер после однократных инъекций 3Н-Т (в %, во оси ординат) в разных отделах РМ (А) и ЕС (В)'на разных стадиях развития мши (в сутках, но оси'абс- ' вдос). Стрелка -момент рождения. I - кедудочек . (компактный мио-' кард), 2 - предсердие, 3 - грабанули, 4 - САУ,, 5 - АВУ, б ---пучок Еиса. Каждая точка - среднее.значение о 35%-ным довари- ■ тельным интервалом.

Значения индексов

аао©—

з 5.7 в ./) 13 а первично меченных birth Time of ontogenesis CdJ . яд0р посла одно- • кратных инъекций значительно отличаются для миоцитов РМ желудочка и предсердия только .иа, 15-е сутки эмбриогенеза. На остальных стадиях пре- й пост катального развития кривые индексов для втих отделен практически совпадают, приближаясь к нулю на 15-е сутки после рождения (рис.2,-А). В.РМ самые низкие .значения индексов меченых.ядер имеют миоциты оксифильньх.субэндокарддалъных трабекуд эмбрионального миокарда желудочков.

Различия по индексам меченых ядер между ПС и РМ наиболее четко выражены на эмбриональных стадиях развития.'На 15-е и 18-е

-м,

зутки эмбриогенеза индексы первично меченных ядер в САУ (в 2-4 раза) и в АВУ (в 4-6 раа) ниже (Р<0.001), чем в быстро растущей компактном миокарде желудочка и в миокарде предсердия (рис.2,В). Сак же как и в РМ индексы меченых ядер в АВУ и САУ постепенно уменьшаются и приближаются к нулю к началу 3-ьей недели после рождения. У 15-суточных эмбрионов индекс меченых ядер в САУ в 2 раза выше, чем в АВУ (Р<0.01), однако в дальнейшем в САУ индексы снижаются быстрее, чей в АВУ, и с 3-ьих по 11-е сутки после рождения индексы меченых ядер в САУ в 3-4 раза ниже, чем .в АВУ (0.001<Р< 0.01). ПГ легко различим на постнатальпых стадиях: о 3-ьих по 7-е сутки нривая индексов, меченых ядер для ПГ занимает 1ромежуточяое положение между кривыми для САУ и АВУ,а затем ариблянаетоя к кривой для АВУ (рис.2, В). ' .

100

3jü

E1S

Рио.З. Индексы меченых мышечных ядер после 3-4-кратных инъекций %-Т (в %, по оси ординат) в разных отделах РМ и ПС сердца 15(Е15)- я 18(Е18)-суточных эмбрионов и 7(Р7)-суточных мышей. По оси абсцисс -время посла первой, инъекции "%-Т (ч), стрелки -

r--f 3 время инъекции.

' 2 * I - желудочек (компактный миокард), ; 2 - предсердие, г 3 - САУ, 4. - АВУ. 5 Остальные обозна-t " t is чения те же, что и

Г/те after first 3H-TdR injection Ch] на рис. 2.

Значения индексов- меченые ядер и скорость их увеличения после многократных инъекций аН-Т, как и после однократных, на пренаталышх стадиях значительно ниже для миоцитов САУ и АБУ, чем для миоцитов желудочка и предсердия'(рис. 3). У 7-суточных мышей индексы меченых ядер в ПС и РМ имеют близкие значения и не возрастают ни в одном из. отделов посла трехкратных инъекций по сравнению, с двукратными. У II- и 13-суточных мышей трехкратные инъекции ^Н-Т с интервалом в 12 ч по сравнению с однократными не приводят к какому-либо значительному увеличению индексов. После ЭО-краишх инъекций в период от 15-х до 30-х суток после рожде- . ния в САУ, АВУ, желудочке и предсердии метится от 0.71 до 0.86$ ядер, в ПГ - 1.69 ± О.ядер. После 10-кратных инъекций ^Н-Т ' взрослым шшам индекс; меченых ядер колеблется в отделах РМ и ПС от 0.09 до 0,64$. ЕО.-кратныа инъекции по сравнению с Ю-кратнши на дают существенного прироста числа меченых ядер,

. Митотический индекс во всех отделах миокарда варьирует гораздо больше, чем. соответствующие! индексы первично'меченных ядер. Тем не .менее, ыа большинстве, стадий вдтотическая активность в .-САУ, АВУ и ПГ значительно шдаэ, чем в РМ (рис. 6 из: ЕгоШ-па, Вшпуаглзег, 1988). В целом форма кривых митогической активности напоминает кривые первично меченных ядер для отделов РМ и ПС.

Данные настоящей работы по включения %-Т в ядра кардношю-цитоа кролика и морской свинки показывают, что и у этих животных на исследованных стадиях развития пролиферация миоцитов в ПС бо-• лее вялая, чем в РМ (рис.4). Наши довольно неполные данные предполагают, что у кролика и морской свинки, как и у мыши, динамика пролиферации в САУ и АВУ различна: на более ранних стадиях индекс меченых ядер в САУ вше, чем в АВУ, на более поздних - наоборот.

Следует отметить, что.динамика изменения индексов меченных • ^Н-Т ядер кардиомиоцитов у разных видов грызуноз отракает степень зрелости еивотнкх к моменту рождения. Так,'у морских свинок ( пев1:-двд.ъсегз ), рождающихся активными и оставляющих гнездо после рождения,' индексы меченых ядер во всех тинах кардиомиоцитов . снижаются почти до нуля к моменту рождения. Напротив, у милей, кроликов (настоящая работа) и крно (Румянцев, 1978), рождающихся незрелыми и сидящих в гнезде после рождения ( пебЪ-зхЬЬьго ),

индексы меченых ядер во всех отделах сердца в перинатальный период еще относительно высокие и снижаются до нуля только в течение 2-3-х, недель после рождения. Интересно, что у крысы и морской свинки существует корреляция между выходом клеток из митоти-ческого цикла и сроком завершения дифференциации кардиомиоцитов по данным электронномлкроскопической морфометрии ( Нд-гакою, ао-ЬоЪ, 1980) И ЦИТОХИМИИ ( ТоЪЬ.БсЫеЫег, 1967). п>ььи I

Guinea pig I I

А В С О 1S

А в С О - 21

А 3 С D 26

A BCD 35

А В С О 53

А в с о 2

А ВС D •dull 1 Л )

Рис.4. Индексы'меченных 3Н-Т тшшечпых ядер (в %, по вертикали) э левом желудочке (А), левом предсердии (В), САУ (С), АВУ и ПГ (В) на эмбриональных стадиях развития кролика (I) и на эмбриональных и постнатаяьных стадиях развития морской свинки (II) (в сутках,по горизонтали). Светлые точки - индексы после однократных инъекций, черные точки - индексы после трехкратных инъекций с интервалами 12 ч. Остальные обозначения те ке, что и на рис.2.

Как известно, индекс меченых ядер может отраяать как долю пролиферирущих клеток, так- и 'среднюю продолжительность фазы синтеза ДНК и всего митотического цикла. Для выяснения причин

наблюдаемого различия в индексе меченных Н-Т ядер следовало определить параметры митотического цикла.

Продолжительность митотического цикла и его Фаз. Для оценки параметров клеточного цикла кроме метода меченых митозов применяли метод, двойной метки с использованием ^С- и 3Н-тимидина и метод, "разведения" метки. •

Определение продолжительности периодов митотического цикла методом меченых митозов затруднено не. только из-за редкости митозов, но и из-за малого чиола клеток в каждом иа небольших по размеру отделов ПС развивающегося сердца мыши. Нагл удалось получить достаточное числа митозов для построе ния кривых меченых митозов для САУ 15- и 18~суточнкх.эмбрионов '. (митотические индексы 0.80+ 0.1852 и 0.61 + 0.11% соответственно и душ АВУ и ПГ (суммарно) 15-суточных эмбрионов и 7-суточных ыышей (митотическиё индексы 0.47 + 0.115& и 0.76 + 0,17/2 соответственно).

. Кривые меченых.митозов для миоцитов желудочка и отделов ПС. на каждой из исследованных, стадий в целом имеют сходную форму (рис.5). Вместе с тем у 15-суточных эмбрионов вторая волна меченых митозов достигает в желудочке 60$, в то время как в САУ и -АВУ она не превышает 30%, что является результатом постепенного . удлинения фазы (или выхода клеток из цикла фазе со )' в мио-цитах ПС. У 7-суточных, мышей подъем кривой для АВУ-ПГ более _ плавный, чем для желудочка, и первая волна меченых митозов доходит только до {Ю^-ного уровня в отличие' от 100%-тго для желудочка. .Это указывает на значительную гетерогенность популяции •• миоцитов ПС по' продолжительности фазы и постоянное вхождение в митоа немеченых клеток, которые в момент инъекции ®Н-Т находились в фазе о2 • Данные о длительности периодов клеточного цикла, полученные по кривым меченых -митозов, (рлс.5, а также ЕгокШпа, КитуапЪвеу, 1388), представлены в таблице. I. Минимальная длительность фазы .определяемая по времени появления первых меченых митозов, на зсех исследованных стадиях .развития мши в. отделах ПС на 1-2 ч больше, чем в иелудочке и предсердии. Однако средняя длительность Фаз . а0 и 1/2 митоза (о2 +1/21.1), определяемая по 50$-ному уровню восходящей, кривой, в мипцигах РМ к Г1С

различается только у 7-суточных мышей. Длительность фазы 8 на эмбриональных стадиях в миоцитах РМ. и ПС примерно одинакова. ( 7-суточных мышей' сильная индивидуальная вариабельность доли леченых митозов в период от 15 до 23 ч после введения Н-Т (рис,5) не позволяет с достаточной точностью определить значение Тд : для миоцитов РМ и АВУ-ОТ эта величина, по-видимому, одного I того же порядка (12-14 и 11-13 ч, соответственно), Длительность всего меточного цикла - по кривым меченых митозов мож-зо приблизительно определить только для миоцитов желудочка и тредсердия эмбрионов мыгаи.

Рис.5. Кртые меченых митозов для миоцитов желудочка (А) и фоводящей системы (В) сердца мыши. 1,2,3 - желудочек 15- и 18-¡уточных эмбрионов и 7-суточных мышей соответственно; 4 и 5 -!АУ И ЛВУ 15-суточных эмбрионов; 6 - САУ 18-суточных эмбрионов;

АВУ и ПГ 7-суточянх мншей. Каждая точка - индивидуальное качение или среднее значение с Э5$-ным доверительным интервалом.

Таблица I. Продолжительность клеточного цикла и его фаз в миоцитаж.разных отделов сердца в онтогенезе мыши по данным авторадиографии

Ста- Отдел сердца Длительность клеточного Длительность фазы В, дия. цикла к его фаз, опреде- определенная, мето-

онто- ленная методом меченых дом двойной метки,

гене- митозов, ч ч

au. ?2 min G2+1/2 м - S весь цикл II .

315 Желудочек I 3.0 9.5 13.0 9.8+0.8 10.2+0.а

Предсердие X 3.0 9.5 13.0 8.7+0.6 9.6+0.8

САУ 2 3.0 9.5 - 7.3+0.3 7.6+0.7

АВУ 2 3.0 • 9.5 - 9,8+3.4. 7.2+1.0

318 Желудочек • I 3.5 13.0 ~1В.0 - — '

Предсердие 2 ' ' 3.5 I3.Q -18,0 - -

. САУ 2 3.5 ХЗ.О -16.0 - -

П7 ЗКелудочак I 5.0 ' 12-14 10.5+1.7 12.0+0.6

Предсердие 3 5.0 12-14 - 9.2+0.4 10.0+1.I

САУ - - - - 9.4+1.9 ' .9.2+1.7

АВУ и ПГ • . 3 8.0 . 11-13 . 8.5+1.0 9.3+1.2

*Э15, ЭХ8, 117 - мыши на 15-е и Xö-e сутки эмбриогенеза и на 7-е сутки после рождения соответственно.^^Х - длительность фазы S вычислена по формуле для популяций, находящихся в'стационарном состоянии ( Korr et ai.,1973) и II - по формуле для экспоненциально <• растущих популяций (Knolle, 1984).

Определение длительности фазы 8 методом д в о. й н о й • м. е т к и менее трудоемко, чем методом меченых митозов, а возможность использования метода не зависит от наличия митозов,'И поэтому .метод особенно ценен для популяций слабо пролиферирувщих клеток. Значения т3 »полученные по формула,!, предложенным для. клеточных популяций, находящихся в стационарном и экспоненциальном состояниях, в большинстве случаен дли каждой зоны, оказались блиа-Kir/J! (Таблица I). Для миокарда желудочка и предсердия 15-суточных

эмбрионов значения ,полученные методом двойной метки и по кривым меченых митозов, очень близкие, в остальных случаях -'значения та .определенные методом двойной метки на 1-3 ч меньше,.чем вычисленные по методу меченых митозов (таблица). Согласно обоим примененным методам длительность 8 -фазы в процессе кардиогенеза во всех отделах сердца проявляет тенденцию к увеличению, которая сильнее вырат.ена при использовании метода меченых митозов. ■

... .... . . . ..... '. Рис,6. Эксперимент

с "разведением" метки 3Н-Т. А -число зерен серебра через 48 ч после инъекции 3Н-Т над ядрами миоцитов желудочка (а), предсердия (ь), СЛУ (с) и АВУ-ДГ (а.) сердца 15-су-точных эмбрионов (Г.) и 7-суточных мышей (2). Данные . вира:;шш в % от числа зерен на ядро через 1 ч после инъекции

О'Л

/ ш го зо чо а

I ю го зо ю

(пунктирная линия на уровне 100$). Столбики- - средние значения. Вертикальные линии 95^-ныа доверительные интервалы. По вертикали - среднее число зерен на' ядро (%). В т- число зерен серебра метки 3Н-Т над ядрами миоцитов аелудочка (а),, предсердия ( ъ), САУ (с), АВУ-ЛГ ( а) сердца 7-суточных мышеи через I ч и'40 ч после инъекции По гори-

зонтали - число зерен на ядро, по вертикали -г количество ядер

В.эксперимента с "р а а в е д е и и е м" метки у 15-суточньс: эмбрионов средняя интенсивность метки над ядрами миоцитов РМ и ПС чераз 48 ч после инъекции "%-Т в 2 раза меньше, чем через I ч, т.е. клетки всех отделов за 47 ч в среднем успевают разделиться I раз. Напротив, у 7-суточшгх мылей среднее число зерен на ядро "разводится" в течение.48 ч только на 20$ и 10/1 в ГМ и ПС соответственно'(рис.6 А). Это сопровождается увеличением доли слабо.меченых, ядер в РМ и ПС (рис.6 В), Данный, полученные этим методом, позволяют сделать, вывод,.что длительность, клеточного цикла для миоцитов ЕЛ и ПС 1га каждой из двух исследованных. стадий примерно одинакова и значительно' увеличивается в период от 15-х суток эмбриогенеза до 7-х суток после рождения.

Данные светомикроскопичесркой авторадиограГяи показывают, что в кардиогенезе миоцпты всех отделов ПС синтезируют ДНК и делятся, митозом. .Однако-на. большинстве пре--и поогнатальных стадий кардио-генеза мыши в ПС по сравнению с РМ наблюдаются более низкие индексы меченных. 3Н-Т ядер. Это типично не только для миоцитов. САУ,_но и'АВУ и П1. Каждый отдел ПС характеризуется своей динамикойпро-лиферативной активности. Различия по индексам меченых ядер для миоцитов САУ и РМ келудочка по данным светошкроскопической и электронномикроскопической авгорадиограшш оказались одного и того не порядка. Зто указывает на отсутствие.значительных ошибок при идентификации миоцитов ПС на светомикроскопических автографах. . , . _

В настоящей работе впервые сделана, попытка "оценить* длительность фаз митотйческого цикла"для шоцйтов" разных отделов ПС. На зеновании. данных, полученных разными. методами, можно сделать вывод ) том, что в целом параметры клеточного'цикла для миоцитов келу-дачка, ..предсердия, САУ и АВУ сердца мышей на исследованных стади-IX онтогенеза сходны я сходным образом изменяются в"процессе раз-|ития, а различия в индексах меченых,ядер в ПС и РМ объясняются в юновпом различиями- в дода■пролиферирующих клеток, за счет которой ■лавным образом и регулируется объем всей популяции клеток ПС, сос-'авляющей у.взрослых позвоночных небольшую.часть всех миоцитов ердца.Слабой пролй^еративной активностью-объясняется тот факт, то в литературе редко отмечались митозы в ПС.

Согласно данным световой микроскопии пр крайней мере веко- , торые миоцигы ПС у мышей (настоящая работа) и крыс (Румянцев, 1978) остаются митотически активными в течение двух недель после рождения. Можно ожидать, что в постнатальном кардиогенезе большинство митозов в миоцитах ПС становятся ацитокинетическиии подобно митозш в миоцитах Р!Л (Румянцев, 1982). Если ото так, то накопление двухъ- и четырехъядерных клеток в ПС с возрастом, особенно в клетках Пуркинье ( Field, I95I;r-!uir, 195-1) может объясняться отсутствием цитотошш в конце митоза ( Hintasch», 195-1). 1.3. Авторадиографический анализ синтеза РНК и белка в миоцитах

IIC в кардиогенезе ыиши

Включение ^Н-уридшга. Через I ч после инъекции %-уридана метка концентрируется в основном над ядрами. Индекс меченых ядер миоцитов в желудочке и предсердии колеблется от 93 до 100$, в САУ - от 87 до 93$, в АВУ - от 53 до 64$ на эмбриональных и от 70 до 100$ па посткатальных'стадиях. Интенсивность метки ядер миоцитов в САУ на большинстве стадий варьирует от 45 до 75$, в АВУ на всех стадиях - от 31 до 62$ от соответствующих значений для Р.М желудочка (рис.7,А). Интенсивность метки ядер в предсердии на большинстве стадий нижа, чем в желудочке,но это менее выражено, чем для IIC.

Концентрация метки над ядрами (число зерен на условную еди-

• ницу площади) в АВУ составляет 40-53$ и 63-84$ от метки в желудочке на пренаталышх и постнаталытнх стадиях соответственно (0,00х<р<0.01 Erokhina, Rumyaniaev, 1988).

Включение ^Н-лейцина. В целом различия по включению аН-лейцина между РМ желудочку и отделами ПС выражены не так сильно, как :по включению 3Н-уридина. Тем не менее,на эмбриональных и ранних ' шстнагалБНых стадиях развития концентрация метки над клетками САУ на 8-25$,а над клетками АВУ на 21-32$ ниже,чем над РМ желудочка (рис.7,В).На остальных изученных стадиях (кроме САУ 16-су-точннх мышей) значения концентрации метки над, клетками ПС близки к соответствующим значениям для PL1 желудочка или превышают знача--кия для желудочка. Клетки предсердия и желудочка по интенсивности включения почти на всех стадиях достоверно не отличаются (рис.7,В). Картина вкиэчония Зц-лаЛпина в гялжл ИТ в основной мгалогичиа

• лаблвдкемой для АЗУ. Концат-рлцнг !мгки над клетками тр<Л:куляр-

иого миокарда желудрчков 15- и 18-суточных см' ниже,чем лад 1слзткани компактного миокарда ке

1978).

J 100

.и

I ° ^

Cl £ 100

•5; ti

^ so

<u <1

1 о

c; .c

100

r'H

H + + +

rfi

+ Ш

нГг»

rh rh rh

+++ rh

rfi

160

>-"4

-3;

л; v.

С: * ' 0

О V» юд

<3 so

^ 0

с;

.с:

брионов на 20-45% лудочков (Ерохина,

i+l

100

rk-f

ill

+ flrii'

■k

3 8 16 adult

.15 18 | 3 8 IS adult_____15_ 13

birth 'rime of ontogenesis Ed] birth

.Рис.7. Включение 3Н-урцдина (А) и 3Н-лейцина (В) в миоциты САУ (а), АВУ (ъ)и предсердия (с) на разных стадиях онтогенеза мы-'пш (в сутках, по горизонталям). .По вертикалям: А, - число зерен серебра метки 3Б-уридина на ядро (в Я, В - число зерен серебра метки К-дейцина на единицу площади ткани (в %). Данные выражены в процентах от значений для миоцнтов желудочка (пунктирная линия на уровне 100%). Столбики - средние значения. Вертикальные линии - 95$-нне доверительные интервалы.

Таким образом по интенсивности синтеза белка миоцитц РМ и IIQ не отличаются так значительно как модно было бы ожидать на основании данных электронной микроскопии (chailice, 1271; Tramim-Jensen, 1376), показывающих, что в кардиогенозе клетки . ПС не накапливают таких больших количеств миофибриллярпих белков как миоцигы РМ. Более низкое включение %-уридина и 3Н-лейцина на ряде стадий, развития в клетки ПС по сравнению с РМ может объясняться как более, слабил синтезом сократительных белков в них, так и их слабой пролиферацией.

II. СПОСОБНОСТЬ К РЕАКГИВШМУ СИНТЕЗУ ДНК МИОЦИГОВ ПРОВОДЯЩЕЙ СИСТЕМЫ (ПС) СЕРДЦА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ МШКАРДА

II.I. Синтез. ДНК в миоцитах ПС при экспериментальной патологии

сердца грызунов Синтез ДИК при инфаркте миокарда у двух- и трехнедельных крысят и взрослых крис. В сердце крый как в контроле, так и при инфаркте, статистически значимые различия по индексам меченных ядер между АВУ и проксимальными отделами ПГ отсутствовали. Это позволило суммировать данные по.этим отделам и рассматривать данные для всего AB отдела ПС (АВУ и ПГ).

Инфаркт миокарда индуцировали у двух-, и трехнедельных крысят, и у взрослых крыс (опыты I, II и III" соответственно,' рис.8). У 'контрольных крысят, после. 30-кратных инъекций 3Н-Т в период, от 16-х до 30-х суток после рождения в исследованных отделах миокарда средние индексы меченых ядер относительно'высокие (рис,8,1). В период между опытами I и III.количество кумулятивно меченых iyieToK в левом желудочке уменьшается от 6.2 до.0.2$, в левом предсердии - от 17.5 до 2.2^, в САУ - от 3.6 до 0*1%, в AB отделе ПС - ор 7.8 до 0.6/J. У крае всех трех возрастов наибольшее число меченых ядер накапливается в левом предсердии, наименьшее тв САУ (рис.8, I-III).

При плфаркте миокарда левого желудочка в зонах этого желудочка, удалошпк. от некрозов, средний шдекс мечен;« ядер ыио-цитоз иредшясот урогеиь в контроле (п 3 раза, Р<0.05) только в экешершлонтах на тхюхиоделышх крысятах (рас.в, II А), в. основном за счет под'/.е^п. индекса кеченнх ядер до 4. 1-10,0& у полойшш

' i ii iii • ix i .

Рис.8. Индексы печеных ядер (в %, по вертикали) миоцитов разных отделов сердца крыс и мышей при экспериментальной патологии после ЭО-кратных инъекций По горизонтали : А' - левый желудочек, Б - левое предсердие, .В - САУ, Г - АВ отдал ПС (АВУ и пучок Гиса). 1,11,111 - экспериментальный инфаркт мио-„ ¡карда у двухнедельных,трехнедельных и взрослых крыо, соответственно; 1У,У - инъекции изопротеренола взрослым-1фыоам и мышам,' ^.соответственно. Столбики - средние значения индексов; вертикаль-,ные отрезки - 85^-ные доверительные интервалы средних аначений. ^Заштрихованные части столбиков и точки - значения индексов в ...контроле. Разница кеяду контролем и опытом достоверна при ^;Р< 0.05 (*),;приР<0*01 (к*) или при Р<0.001 б»**).

оперированных животных, в го время как у остальных животных значения индексов оставались на уровне контроля (0.4-2.0$). Наиболее высониа индзкоы меченых ядер при инфаркте'миокарда левого желудочка, индуцированном как.у молодых, так и у взрослых крыс, характерны для миоцигов левого-предсердия, причем наиболее значительно индекс мечешсс ядер возрастает в предсердии взрослых крыа (рис.8, ср.IE ii II.Б с ШБ).

При-¡экспериментальном инфаркте миокарда левого желудочка некрозы в. отделах ПС встречались очень редко. Обилие меченых ядер в миоцитах' предсердия резко контрастирует о почти полным отсутствием меченых, ядер в миоцитах САУ, топографически тесно связанного с предсердием. У крыс всех трех возрастите групп инфаркт миокарда не влиял на индекс меченых ядер в САУ (рис.8,I-III).

В AB отделе ПС индексы меченых мышечных ядер при инфаркте миокарда у крыс всех трех возрастов-выше, чем в САУ, но значительно ниже, чем в левом предсердии (рис.8, I-III). При инфаркта миокарда у двух- и трехнедельных крысят среднее число, вступающих в синтез ДНК миоцитов в АВУ-ПГ. относительно, высокое и приближается'а 9 и Wo, соответственно, но-усиления включения 3Н-Т по сравнению с контролем па обнаружено (рис.8, 1,11). Возрастание среднего.индекса меченых ядер по.сравнению с контролем наблюдается только в АВУ-ПГ взрослых крыс (Р<0.01, рис.8, III); в этом отделе значения индексов меченых ядер оказались выше, чем в суб-ёпшеардиальном слое левого желудочка (Р<0,001, рис.8,III).

Индексы меченых ядер немышечных клеток соединительной ткани, в отделах ПС как- у контрольных крыс, гак и у крыс с инфарктом миокарда в 10-30 раз превышают значения индексов для мышечных клеток. • "

Синтез ДНК после инъекций изопротсренола взрослы?.! красам и шиш, Изопротерепол,. синтетический катехоламип, селективно действующий на ^-рецепторы, является кардиотоксичнш препаратом и ■ индуцирует как гипертрофию сердца, так и множественные некрозы, напоминающие некротические повреждения при шемии и инфаркте (см.: Pfitzer et al.,1972; Adler, ¿Vmdritter,i960; fkijer et al., ,1988).. • ;

Как и при экспериментальном инфаркте миокарда, при воздей- • ствии г.зопротеренола в сердца взрослых крыс и мышей средние ин-

■3 Г'

дексц меченных Н-Т ядер наиболее высоки в'миоцитах предсердия (рис.8,1У,У), при этом сильно выражена вариабельность индивид дуальных значений индексов (у крнс - от 2 до.1Е$, у мышей - от 6 до 25%). Следует оплатить, что на данной модели у взрослых крыс и мшей средние индексы меченых ядер в предсердии, так же как и в АВУ-ЛГ,значительно ния;е, чем.при инфаркта миокарда у взрослк крыс (рис.8, ср. III и У).

При инъекциях.изопротеренола в САУ и АВУ-ПГ сердца, крыс и мшей, а таксе в миокарде левого желудочка, 'удаленном от очагов некроза, какой-либо активации синтеза ¡ДНК в мио.цитох обнаружить не удалось (рис.8, 1У, У), j

Таким образом, при экспериментальной патологии шюкарда у крыс и. мшей в ПС наиболее высокие абсолютные значения кумулятивных индексов меченных %-Т ядер во всех опытах имеют млоциты AB отдела ПС (АВУ и проксимальной части ПГ). Однако четкая активация 'вступления этих клеток в синтез ДНК (повышение в 6 раз) наблюдается только при.инфаркте миокарда у взрослых крыс, для которых в норме.характерно' низкое значение Пролиферативного пула. Совершенно неожиданным оказалось, нто у двух- и трехнедельных крыс, у которых в норме в шпотическом цикле находится еще относительно много миоцигов (2-8^),.активадия синтеза ДНК в миоцитах AB отде-■ лаПС при инфаркте на обнаружена. Следует отметить, что кумулятивные индексы меченых ядер в глзоцятах АВУ-ПГ при инфаркте миокарда'у трехнедельных и взрослых крыс (настоящая работа), так же как и при эксперт,:ентальиой гипертрофии миокарда у-взрослых крыо • (Румянцев, IS82), ¡¡злеют близкие значения (2.0-3.7?'). Хотя абсо- ' лютные значения индексов ядер, Ъключащлх'%-Т, в миоцитах АВУ-ПГ сравнительно невксохше, но при инфаркте миокарда у взрослых крыс ~ они в 15 раз. выше, чем в миоцитах САУ и в миоцитах левого желу- •' дочка, удаленных'от не.кротическкх зон.

Несмотря на то, что при экспериментальном инфаркте миокарда левого желудочка у взрослых крыс некрозы в САУ и АВУ при свето-микроскошгческом исследовании обнаруживаются редко, часть миоци-тов узлов испытывает различной степени дегенеративные изменения

• (/qllhkii, и др., 1987). Судя по данным настоящей работы, при инфаркте миокарда мпоццты АВУ-ПГ п гораздо большей степени, чем мцоциты СЛУ, способны к обновлеюш поврежденных клеток.

■Результаты настоящей работы о наиболеа интенсивной дистантной активации синтеза ДНК в пиоццтах предсердия в ответ на индукцию некрозов в левом желудочке у крыс и при воздействии изо-протеренола у крыс ц' ыыыей подтверждают сделанный ранее вывод о высоком пролкфератшшом потенциале миоцнтов предсердия грызунов при патологии миокарда (Румянцев, 1982; Румянцев и др., ISG7).

II.2. Плондность ядер миоцитов ПС при гиперфункции сео.дца

человека

Гиперфункция сердца вследствие ревматических пороков клапанов, гипертензил и других заболеваний приводит к гипертрофии миокарда (см.: Регг.шз, 1984). По данным настоящей работы при весе сер.вда от 450 до 760. г в Р1Л желудочков и предсердий преобладают полиплоидные (4с и более) ядра'(рис,9), при этом общее количество полиплоидных: ядер и доля ядер разной степени плоидности в отдельных.аутопсиях значительно варьирует. Количество полиплоидных. ядер в левом целудочка колеблется от 65 до Q&fj, в правом желудочка - от 32 до 82/в, в левом предсердии - от 69 до 88/J, в правом предсердии - от 5£ до 91$. Большую долю составляют высоко' шюидныа (8с и выше) ядра: в левом желудочке - 33vO+5.?i®, в правом желудочке - 15.4+6.3^, в левом■предсердии - 39.8+6.-$, в правом предсердии - 43.7+8.2^ ядер. В носледовашш. вариантах, патологии шюкарда ореднт количества как полиплоидных, так и высоко-пловдных ядер в 2 раза вша (Р<0.05) в "левом желудочке, чем в :правом, испытывающем меньшие'гемодЕнамические нагрузки (рио.9J. Различия между лавш и правым предсердием вира-лены меньше.

В сердцах нормачъного веса (менее 300 г), полученных от двй, не страдавших заболеваниями сердца, количество полиплоидны* ядер, как и в пшзртрофиропащцее сердцах, колеблется в широких •пределах (в :.:елудочкп;; -- от 45 до С2%, в предсердиях - от 49 до 7<$). Самые зиачитедыш различия меэду нормальными и гипертрофи-ропгдншш cspimntfit ммоюуон по г/. :1осптелы:ол дола высокоплшшшх ■ ядер. В иодхталыт сердцах /ада а сода^иашт АЫ< 8с и более

. составляют в левых и правых, отделах желудочков и предсердий от 3 до 17$, ядра с-содержанием ДНК более 8с не. превышают 2% (данные настоящей работы, см, также: Мартынова и др., 1983).

■■ Рис.9. Содержание ДНК в ядрах ыиоцитов разных отделов гипертрофированного сердца человека. По горизонтали - классы шюидности ядер; А - левый желудочек, Б - правый желудочек, В -левое предоердие, Г - правое предсердие, Д - САУ, Е - АВУ, Ж.-■ пучок Гиса. По вертикали - доля ядер' данной шюидности (в %). Остальные обозначения те же, что и на рис.8.

Уровень шюидности ядер ыиоцитов ПС оказался разным в раз- . 'личных, ее отделах (рис.9). В.-резком контрасте о миоцитами желудочка и предсердия в миоцитах. СИ и АВУ как из нормальных, так л гипертрофированных, сердец, преобладав! диплоидные ядра, доля которых не зависит от степени гипертрофии сердца и в САУ колеб-_ лютея от 83 до 92%, в АВУ - от 77 до Доля высокошюидных •

ядер нз превышает 4$. Шгоциты АВУ иа сердца 4.5-6.5 - месячных детей содержат 94-33$ диплоидных ядер.

......... .... ........ Рис.10. Корреляция

между содержанием ДНК (числом диплоидных. геномов, по 9 г осям ординат) и числом телец полового хроматина (по осям абсцисс) в ядрах АВУ (а, срезы, 2 гипертрофированных сердца), предсердий (б, давленные препараты, 3 гипертрофированных сердца, см.: Мартынова и др., 1933) и яелудрчков (с, давленные препараты, I нормальное и 5 гипертрофированных сердец) сердца человека (см. подробнее: Йигпуагазет: а Г а1., 1990). Каждая точка -- среднее значение о 95^-ным доверительным интервалом. Цифры около точек - . число ядер.

НигаЪаг оГ вех с|1гота11п Ьо<11ев

lia мпощиах АВУ из гипертрофированных сердец женщин был проведен параллельный анализ в ядрах содержания ДНК и числа телец полового хроматина (конденсированных Х-хроыосом, телец Барра). Последние на препаратах, окрашенных по Фельгену,. в большинстве ядер лег га отличимы от гетерохроматиновых гранул по более интенсивной окраске и характерной локализации (см. : Зыбша, Тихомирова, 1965), Как правило, ядра с одшш тельцем полового хроматина содержат около 2с ДНК (1_геном), ядра с двумя тельцами - 4с ДчНК (2 генома) и т.д., т.е. число телец полового хрома- . тина в ядрах коррелирует с содержанием в них ДНК (рис.10). Аналогичные данные были, получены ранее для миоцктов предсердия (Мартынова и др., 1983) и желудочка (Антиланоза и др., 1387). Коэффициенты корреляции во всех случаях приближается к единице, варьируя от 0.80¿0.03 до 0.26h¡0.02 (рис. 10).

В сердце человека основной тш'мдоцигов ПГ и его дисталь-' ных субэндокардиальных разветвлений представлен клетками Пурки-иье ( Jamas, sherf, 1971; james et al., 1974). На препаратах, окрашенных по Фельгену, эти клв'тки отличаются от рабочих мноци-тов желудочка и ыежжелудочковой перегородки более крупными раз' мерами. .На срезах, окрашенных гематоксилином-эозином или азуром II-эозином, они тлеют более светлую окраску цитоплазмы. Плоид-ность клеток Пуркипье изучена еще недостаточно. В гипертрофированных сердцах (вес сердца от 480 до 780 г ) ядра миоцитов прокоп- • малыюй части ПГ на уровне бифуркации его но;хек в противоположность ядрам миоцитов узлов клеит очень высокий уровень плоиддо-сти: полиплоидные ядра составляют 97-39$, из îihx на долю ядер с содержанием ДНК 8с и более приходится 45-51$ (рис. 9). Высокая доля полиплоидных ядер (82$) обнаружена также в клетках ПГ из гипертрофированного.сердца 4.5-месячного ребенка.

Плоидность ядер клеток Пуркипье из дисталышх субэндокар-диалышх разветвлений ПГ и клеток из прилежащих зон межжелудочковой перегородки в-норме (вес сердца менее 300 г) находится на одном уровне (2с - 63-64$, 8с и ьыше - 2-3$). В исследованных гипертрофированных сердцах (вес сердца 480 и 500 г) все ядра в субэндокарднатькък клетках Пуркипье являются полиплоидными, а ядра с содержанием ДЖ 8с и более составляют 58 и 88$, в то время

как уровень плоидности ядер в миоцитах межжалудочковой перегороди повышен лишь незначительно (2с - 32$, 8с и более -

Итак, при гиперфункции сердца человека в исслодованлцх вариантах патологии способность к реактивному синтезу ДИК (полналоидазацни) проявляется в различной степени в разных типах икоцитов ПС| В резком котрасте с ядрами рабочих миоци-2ов желудочка и предсердия ядра относительно малочисленных миоцитов САУ и АЕУ, млеющих слабо развитый сократительный аппарат, для которых функция сокращения является побочной, при гиперфункции сердца не вовлекаются в интенсивную полиплоидизацию. В противоположность миоцнтам узлов в клетках Пуркинье из ПГ и. его дистальных отделов в исследованных гипертрофированных сердцах наблюдается очень высокий уровень плоидности ядер, при этом диплаиднне ядра почти полностью исчезают. Однако это на ддет асновашгй рассматривать клеики Пуркинье как своего рода источник для обновления поврежденных рабочих миоцитов желудочка при патологии сердца (см.: Field, 1951; Hudgson, Field, 1973).

Клетки Пуркинье отличаются как от рабочих миоцитов аелу-дочка, с которп,п1 они контактирует, так и от гшоцитов других отделов ПС.по морфологически:.!, цитохимическим, ишуноцитохими-ческш, физиологическим и другим характеристикам ( Eliaa et al., 1982; Forsgren et al., 1983; Vlragh efc ai., 1987; Toshlnori et al., 1988). Пока очень мало известно о изменениях шгацнтов разтк отделов ПС, и в частности ее вентрикудярных частей, при гиперфункции сердца. Имеются данние авгорадиографии об акт ив а-ции включения лейцина в миоциты АВ отдела ПС при гипертрофии сердца у крыс (Vitali-Mazza et al.', ' 1976). Увеличение числа геномов в. клетках Пуркинье сердца'«словака при гиперфункции шв1 способствовать интенсификации всех функций, выполняемых отшли'клетками,'.

Корреляцию мз~.ду содержанием ДНК в ядрах и числом телец полового хроматина в них, показанную для миоцитов АВУ, так ке как и для г/лоцптов Pi.1 ( Rumyantsev et al., 1990), молено pac-матризать как косвенное указание на репликация всего генома.

К»рд1.сгевеэ,11Ышв,КИМ,^ '

предсердие

15 сутки

Энслерамеятальная г.зтоясггя , взрослые крысы и мна2,КЙИ, %

йн ф а ^инъ^ к ц в з

миокарда изоиротереяола

ГГре^сердае 59.0 САУ 0.2

деямочех О.г АВУ-ПГ 3.0

5.4

о.:

0.6 0.9

Гипергрофш* илохарда' человека, доля полиплоидных ядер,^

100'

Предсердие САУ 5еидочек

АВ7

Болокаа Еуркинье

Рис II. Показатели пролиферативной активности миоцитоз рааных отделов рабочего миокарда и проводящей системы в развивающемся и патологически^ ' измененном сердце. САУ - синоатриальный узел, АВУ - атриовентрикуляряки узел ИТ - пучок Гиса, КШ - кумулятивный индекс меченых ядер после многократных инъекций Зн-тимвдана с интервалами времени, меньшими длительности фазы синтеза ДНК, стрелки на графиках - рождение зивотшд.

заключение

Данные настоящей работы свидетельствуют о том, что клеточные механизмы пролиферации кардиомиоцитов РМ и ПС идентичны. В ПС, как и в РМ, в митотический цикл входят.клетки, содержащие киофлбриллы, структура которых претерпевает циклические изменения в каждом цикле деления. Клетки РМ и НС различаются в основном по интенсивности пролиферации. В кардиогенезе мыши в атриаль-ком (САУ) и атриоваптрикулярноы (АВУ и 11Г) отделах ПС доля проли-ферирующих клеток значительно ниже, чем в РМ предсердия и желудочка, что особенно резко выражено на пренатальных стадиях развития (рис. Ш. Однако параметры митотических циклов клеток РМ и ПС сходны.

При экспериментальной патология миокарда взрослых крыс а мышей в атриальном отделе сердца под. действием такого стимула как некрозы миокарда в САУ доля синтезирующих ДНК клеток достоверно не увеличивается, в то время как в предсердии ыиоциты интенсивно вступают в митотический цикл. Напротив, в атриовентрикуляр-ном и вептрикулярном отделах сердца ыиоциты АВУ и ПГ обладают бо'лыпей-способностью возобновлять синтеа ДНК, чем миоциты желудочка, удаленные от некротических зон.

В отличие от грызунов, у которых рабочие миоциты предсердия и желудочка четко различаются по способности к реактивному синтезу. ДНК при патологии миокарда, при гиперфункции сердца человека миоциты как предсердия, так и желудочка вовлекаются в интенсивную полидлоидизацша ядер, которая может захватывать и вентрику-лярные отделы ПС - ПЦ и его субэпдокардиальные разветвления, образованные клетками Пуркинье.' В противоположность клеткам Пур- ' ¡шньо в.миоцитах узлов ПС (САУ и АВУ) полиплоидные ядра,.хотя и присутствуют, но доля их незначительна и представлена преимущественно тетраплоидными ядрами.

Таким образом, способность мибцитов возобновлять.синтез ЩК при повреждении миокарда варьирует в разных типах не только рабочих миоцитов, но и клеток ПС и зависит как от типа патологии, *ак и систематического положения млекопитающих.

ВЫВОДЫ

±. Характер взаимосвязи процессов пролиферации и дифференциации в кардломлоцитах рабочего миокарда (РЫ) и проводящей системы (ПС) идентичен. Как показал анализ ультраструктуры включай-

о а

щих °Н-тимидан ( Н-1) и делящихся клеток атриального отдела ПС .(синоатриапыгого узла, САУ), миоциты ПС, содержащие сократительный аппарат, способны к синтезу ДНК и митозу. Морфологически Недифференцированные клетки типа миобластов не обнаружены.

2. Типичные миоциты САУ (клетки-водители ритма) 16-18-су-точныг. эмбрионов мыши, преобладающие в центре узла, резко отличаются от рабочих ыиоцитов предсердия относительной бедностью органеллами, особенно ыиофиламентами, 'слабым развитием миофибри-ллярного аппарата и почти полным отсутствием гранул, сходных со специфическими предоердними. По данным электронноыикроскопичес-кой авторадао'графии ивдекс меченных 3Н-Т ядер в таких миоцитах

в 3-4 раза нже, чем в рабочих миоцитах предсердия и желудочка. Кроме типичных, узловых клеток на периферии САУ присутствуют "переходные" клетки, занимающие по морфологическим признакам промежуточное положение между типичными узловыми и рабочими мио-цитами предсердия.

3. Ультраструктура миофибрилл и других цитоплазматических органелл в интерфазных меченых (в фазе Б ) и немеченых (в фазах

-ио2 ) миоцитах САУ через I ч после инъекции 3И-Т, так же как и в миоцитах. в профазе митоза, сходна и типична для большинства узловых клеток на исследованных стадиях развития мыпш. Этот факт, а также отсутствие морфологически различимых миобластов,■ позволяет заключить, что СЛУ растет подобно рабочему миокарду желудочков и предсердий, т.е. за счет.пролиферации самих дифференцирующихся мышечных клеток, вступающих в митогичеокий цикл беа заметных изменений ультраструктуры миофибрилл. В САУ эмбрионов мыши пролиферируют все типы мышечных клеток. '

4. Миоциты САУ делятся типичным митозом, ео время которого, начиная с проагегафазы, немногочисленные плохо развитые миофибри-ллы распадаются на пучки миофиламентов и отдельные миофилаыентн в результате резорбции г-дисков. Восстановление структуры миофибрилл начинается только в поздней телофазе - е.,-фазе, когда •

среди пучков млофнламентов появляются пятна, z-подобного материала. В отличие от z-дисков на всех стадиях митоза сохраняется осмиофильпий материал десмосом и fasciae adharantes вставочных диской. Циклические изменения миофибриллярного аппарата, как и других органелл, во время митоза клеток САУ эмбрионов мши сходни с описаншгми для делящихся малэдМференцировалши рабочих кардио-миоцитоп крысы. Борозда цитокинеза намечается в ранней телофазе, но цитокинез завершается не во всех клетках, что приводит к образованию единичных' двуядерних миоцитов..

5. Данные свзтомикроскопической авторадиоррафии показывают, что в процессе кард.чогензза пролифериру&г миоциты всех отделов IIG. На большинстве пре- и постнатаяьннх стадий развития мши и на исследованных стадиях эмбриогенеза кролика и морской свинки индексы тченных "Н-Т и делящихся митозом клеток во всех отделах ПС шеге, чем в PL!. У или! наиболее резкие различия меэду ПС и Pfi по индексам меченых ядер'наблюдается на прекатальных стадиях развития.

6. Динамика пролиферагнвной активности в разных отделах НС различна: у мыши на эмбриональных стадиях развития индексы меченых ядер в САУ вша, чем в атриовентрикуляриом "узле (АВУ), на посгнатальных - наоборот. В САУ, АВУ и пучке Гиса (ИГ), как и в РМ желудочка и предсердия, индексы первично меченных %-Т-ядер

и делящихся митозом клеток приближаются к нулевому уровню к началу 3-ьей недели после рождения мышей. У морских свинок, рождающихся в отличие от мышей более зрелыми, индексы меченых ядер близки к нулю уже к доценту роздения. У кроликов, как и у мышей, выход большинства клеток из. митотического цикла происходит только посла роздения животных. •

7. Анализ длительности митотического цикла и'его фаз, проведенный разными методами, показал, что параметры митотического цикла для миоцитов САУ, АВУ, желудочка и предсердия сходны. В процессе кардиогенеза длительность всех фаз митотического цикла увеличивается. Различия мехду 1IC и РМ по индексам меченных %-Т ядер объясняются главным образа геньшей фракцией пролк.форируищйх клеток в отделах ПС,

8. Интенсивность синтеза РНК и бежа в миоцитах разных отделов Ш на большинстве исследованных стадий кардиогенеза мыши ниже, чем в рабочих миоцитах, что может, быть следствием как слабого синтеза сократительных белков в миоцитах ПС, так и их более низкой пролпферагивной активности.

9. В исследованных вариантах экспериментальной патологии сердца грызунов и клинической патологии сердца человека способность к-реактивному синтезу ДНК (полишюидизации) выражена в разн личноц степени в миоцигах разных отделов ПС.

10. При инфаркте миокарда у двухнедельных, трехнедельных и взрослых крыс, как и в норма, самыми высокими индексами меченых ядер после 30-кратных инъекций 3Н-Т характеризуются миоциты предсердия, самыми низкими - миоциты САУ. Степень активации включения ^Н-Т при инфаркте миокарда, как и после инъекций изопротёре-нола,сильнее всего вьракена в -миоцитах предсердия, что находится в соответствии с открытым ранее явлением высокого дролифератив-ного потенциала миоцитов предсердия.

11. В отделах ПС индекс кумулятивно меченных ядер миоцитов достоверно увеличивается только в атриовентрикулярном отделе ПС (АВУ и ПГ) при инфаркте миокарда у взрослых крыс. После инъекций изопротеренола взрослым крысам и мышам активация синтеза ДНК в миоцитах САУ, АВУ и ПГ но обнаружена.

12. При гипертрофии сердца человека, вызванной гиперфункцией ■ вследствие врожденных и приобретенных пороков сердца, гипертен-зии и других заболеваний, полишюидазация ядер достигает наивысшей степени в миоцитах желудочков и предсердий и в клетках Пур-, кинье иа ПГ и его субэндокардиапьных периферических разветвлений, 'Напротив, в миоцитах САУ и АВУ преобладают диплоидные ядра, а полиплоидные ядра представлены преимущественно теграплоидными.

13. Корреляция ыевду содержанием ДНК в ядрах и числом телец полового хроматина в них, показанная для миоцитов АВУ, как и об- • нарушенная ранее для миоцитов желудочка и предсердия, может рассматриваться как косвенное указание на то, что в кардиомиоцитах. человека имеет место истинная полишюидизация ядер.

ОСЮВШЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕ1ЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

. " I. Ерохина И.Л. Пролиферация и синтез ДНК на ранних стадиях развития миокарда // Цитология. 1968а. Т.10, И 2. С. 162-172.

2. Ерохша И.Л. Динамика пролиферации клеточных элементов • дифференцирующегося миокарда мши // Цитология. 19686. Т.Ю.Й II. С. 1391-1409.

3. Румянцев П.П., Ерохина И.Л., Миракли В.О. Гистогенез и регенерация миокарда в свете данных авторадаографического анализа // Применение радиоактивных изотопов в кардиологии. Ереван: 1969. С.163-164.

4. Ерохина И.Л., Румянцев П.П. Синтез ДНК в развивающемся миокарде крыо, мышей и морских свинок // Проблемы биологии развития. М.: 1970. С. 52-53.

5. Ерохина И.Л., Румянцев П.П. Авторадиографическое изучение синтеза ДНК и РНК в клетках проводящей системы развивающегося сердца грызунов // Функциональная морфология, генетика и биохимия клетки. Л.: 1974. С. 45-48.

6. Румянцев П.П., Ерохина И.Л. Синтез ДНК и деление мышечных клеток проводящей системы развивающегося сердца // Мат. УШ Всесоюзн. съезда анат., гистол., эыбриол., Ташкент : 1974.

. С. 320-321.

7. Ерохина И.Л. Включение Н-тимидина в клетки проводящей системы сердца (синоатриальный л атриовентрикулярный узлы, пучок Гиса) в процессе кардиогенеза мыши.//Онтогенез. 1977. Т. 8, Ш 5. С. 451-459.

8. Ерохина И.Л.' Включение %-лейцина в клетки проводящей системы развивающегося сердца мыши по данным авторадиографии // Кровообращение. 1978. Т. II, й I; С. 3-7. ' ■ ' '.

9. Ерохина И.Л; Ультраструктура клеток синоатриалыюго уала проводящей системы сердца эмбрионов мши//В кн.: Проблемы сравнительной электрокардиологии, Сыктывкар : 1979. С. 33. .

10.' Ерохша И.Л., Румянцев П.П. Ультраструктура синтезирующих ДНК клеток сшоатрйального узла сердца эмбрионов мыши по данным 'электронпомякроскопической авторадиографии // Цитология. 1979. ' Т. 21, Л 10. С. 1131-1138. ' .

11. Бушмар'ина Ы.С., Ерохина И.Л., Комарова Н.И., Комаров С.А., Маркозадшили Ю., Ннлова В.К., Румянцев П.П., Сеина Н.В.Метод алектрогатмпЕросЕошпеской авторадиографик при изучении синтеза

. ДНК в миогенезе разных типов мышц // Мат. XI Всесоюзн. конфер. по электронной микроскопии, Таллин: 1Э79. Т. II, Биология. С.201.

12. Erokhins I.L., Rumyantsev P.P. Ultrastructure and proliferation of sinoatrial node ovocytes from nouno embryo hearts // J. №1. Cell. Cardiol. 1980. Vol. 12, suppl. A. P. 38.

13. Румянцев П.П., Ерохина И.Л. Морфологические аспекты дл-фференцировкп и пролиферации в гистогенезе скелетных, сердечной

и гладких мышц позвоночных // Проблемы миогеноза. Л.: Наука,1981. С. 22-50.

14. Ерохина И.Л., Румянцев П.П. Ультраструктура делящихся ' митозом клеток синоатриального узла сердца эмбрионов мыш // Мат. II Всесоюзн. совещание эмбриологов. 1Л.: Наука, 1981. С. 58.

15. Ерохина И.Л., Румянцев П.П. Ультраструктура миоцптов синоатриального узла сердца эмбрионов мыпш в митозе // Цитология. 1983. Т. 25, Jfe 4. С.371-379.

16. Erokhina I.L., Runyantsev P.P. Autoradiographic study of the DNA, RH& and protein synthesis in cardiac conduction system • of the developing mice // J. Kol. Cell. Cardiol. 1983. Vol. 15, suppl. 1. P. 37.

17. Runyantsev P.P., Coro К.И., Erokhina I.L., Polenova O.A.. Tri-iodothyxonine- and б-hydroxydopamine-induced stimulation of UNA synthesis in postnatal cardiogenesis // -J. tfol. Cell. Cardiol. 1983. Vol. 15, suppl. 1. P. 38.

18. Erokhina I.L., Rurayantsev P.P. infrastructure of DNA-aynthesizing and mitotically dividing nyocytes in sinoatrial node of mouse embryonal heart // J. fpl. Cell; Cardiol. 1986. „Vol. .18, К 12. P. 1219-1231.

19- Ruiayant.sev P.P., Antipanova Е.И., Eorisov А.В., Erokhina I.L., Martynova M.G., Nilova V.K. Hew data on. in vivo and in vitro replication of cardionyocy^es from atria, ventricles and conductive system of the human and animal hearts in terms of age // III Symp. 3ov. section of the International Society of Heart Research Vifetabolism, structure and function of cardiac

cell", Baku : 1986. P. 134.

20. Erokhina I.L. Cell cyclq parameters of slowly proliferating iayocytea from the conductive syatea of nouse heart // III Synp; Sov. eention of the International Society of Heart Research "Metabolism, structure and. function of cardiac cell", Baku : 1936. P.'135-

21. Antipanova E.M.,"Erokhina I.L., Bunyantsev P.P. Compara-i tive investigation of rayooyte nuclei' replication in different conparteents of hucan heart // III Syap. Sov. section of the International Society of Heart Research "Metabolism, structure and function of cardiac cell ", Baku : 1986. P. 161.

22. Румянцев П.П., Антяпанова E.M., Ерохина И.Л., Коро Антнч P.M., Мартынова Ы.Г., Нилова В.К. Парадоксы реплинативного ново- ,. дения кардиошоцитов человека в сопоставлении с друг юли млекопитающими // Маг. республиканской конф. "Макромолекулы и функционирование клетки", Ереван' :' 1986« С,50-51.

23. Румянцев П.П., Антппанова Е.М., Борисов А.Б., Ерохина И.Л., Мартынова М.Е.,, Ншюва В.К. Биология миоцитов предсердия и проводящей системы сердца - особенности дифференцировки,"реактивности и-роста вне оргшйзма // Мат. X Всесоизн. съезда анат.'.гнс-тол., змбриол., Винница : 1988. С. 293-294.

24. Ерохина И.Л. Алалнэ продолжительности периодов клеточного цикла медленно пролиферирувдшс мнощтов системы проведения в развивающемся сердце мыпш »//' Цитология. 1987. Т.29, $ 4.

С. 439-447.

25. Антшханова Е.М., Ерохина И.Л., Румянцев П.П. Содержание ;ДНК и. телец полового хроматина в ядрах миоцитов разнихотделпв

сердца человека // Цитология. 1987. Т. 29, Ь 7. С. 782-787,

26.. Erokhina I.L., Huiayantaev P.P. Proliferation and biosyn-thetic activities of myocytes fron conductive system and working myocardium of ths developing mouse heart. Light nicrosco-•pic autoradiographic study // Acta hiatochen. 1988. Vol. 84.

P. 51-66. ' .

27. Erokhina I.L., Borisov Д.В., Bushraarina M.3., Buayaat^QV P.P. ^H-thynidine and ?H-uridine incorporation in myocytes' of hunan hasLCt : a study of auricular biopsies //J. llol. Call.

•Cardiol. 1939. Vol.21, зирр1. II. P. 56.

28. BoriaovA.B., Erokhina I.L., Bushmarlna M.S., Rumyantscv P.P. DHA synthesis in prenatal and. postnatal • human cardiac muscle tissue in vitro // J.Mol.Cell.Cardiol. 1989. Vol. 21, suppl. IV. P. 26.' . -

29. Erokhina I.b., Jluisyantsev P.P. On the capacity of the conductive system myocytes of human heart for reactive DNA synthesis // J. Jfcl. Cell. Cardiol. 19S9r Vol. 21, suppl. IV. P. 26.

30. Ruoyantsev P.P., Erokhina I.b., Antipanova E.M., Marty-nova M.G. DMA. and sex chromatin content in nuclei of conductive system and working myocytes of normal and hypertrophied human heart // Acta histochem. 1990. Suppl. £9. P. 225-237- '

51. Erokhina I.b., Rumyantsev P.P. Proliferation of conduction system oocytes in car<|iogenesis and regeneration // Ihe development and regenerative potential of cardiac muscle. Chur, Switzerland : Harwood Acad. Publ., 1991. P. 93-11532. Ерохина И.Л., Селиванова Г.В., Власова Т.Д., Комарова Н.И., Емельянова 0.И.,, Алешкин Н.Г., Сорока В.В. Изменения ультраструктуры, содержания ДНК и белка в миоцитах предсердия человека при гиперфункции' сердца, вызванной пороками митрального клапана // Цитология. 1991, Т. 33, М 7. С. 39-51.

33. Ерохина И.Д., &1ельянова О.И., Сеива Н.В. Синтез ДНК в миоцитах проводящей система сердца при инфаркте миокарда, индуцированном у молодых крыс // Архив патологии. 1992. Т. 54, ШЗ. С.

34. Erokhina I.L., Selivanova Q.V., Vlasova T.D., Komarova N.I., EmeljJanova 0.1., Soroka V.V. Ultrastructure and biosynthe-

• tic activity of polyploid atrial lipocytes in patients with mitral valve disease //Acta histochem. 1992. Suppl. 42. P; 293-299.

35. Ерохина И.Л. Способность к реактивному синтеэу ДНК

' миоцитоа проводящей системы сердца при экспериментальной я клинической патологии иногда // Цитология. 1992.Т. 34, * С. 39-48.

Информация о работе

Ерохина, Инэса Лазаревна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1992
ВАК 03.00.25

Автореферат

Кардиомиоциты системы генерации и проведения импульсов: особенности пролиферации в процессе развития и при патологии сердца - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы