Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КАРБОКСИДОБАКТЕРИИ (БАКТЕРИИ, ОКИСЛЯЮЩИЕ ОКИСЬ УГЛЕРОДА)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КАРБОКСИДОБАКТЕРИИ (БАКТЕРИИ, ОКИСЛЯЮЩИЕ ОКИСЬ УГЛЕРОДА)"

-2Н9Ы

АКЛДЕЖЯ НАУК СССР ИЮТИТУТ ШКРОЕИОЛЮПШ

На правах ружопаов

Н01ЕШИК0ВЛ Ляда И и иол пеана

КАРЮЮ ИДОСАКТКЖИ (Бахтерма, окисляыцие окись углерода)

ОЬдойаоаогая - Ui.OU.U?) (Диосартациа напиоана на i усаком жэыхе)

Автореферат диссертации на оо искание учило! степени кандидат« оиологачиски* наук

WooiíitM - 1 'УМ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

КОЖЕВНИКОВА Алла Николаевна

КАРВОНС ВДОНАКТЕРНИ (Бактерии, окисляющие окись углерода)

(Микроб коло гая - 03.00.07) (Диссвртащл написана на русском языке)

Автореферат диссертации яа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1974

1 Г/:бл!Ю7(;иг

Радона выполнена в Института микробиологии АН СССР Научныя руководитель: доктор биологических наук

»■ г.А.ашрзиа

Официальные оппоненты: доктор биологических наук ,

профессор В ,НЛСОЦШТЬШ кандидат биологичвоких вауя Н.Н.МБДЗЗДВВД ( Лялякова) Диосертацияяаправлвча да $фициальвнй отаыв в Инотитут биохимии и физиологи^ микроорганивмов АН СССР

Автореферат разослав -/3 '^е^саЗ^ 1974 г.

Защита днсоертацш оовтовтоя -/5"» 1ЭТ5 р.

в (2, час-5С?ыин. на ааовданвд Ученого совете Института микробиологии АН СССР. Чооква В-312, Профсоюзная, 7 норп.2.

С диооертациеВ и окно ознакомиться в библиотека Института микробиологииАН СССР.

Ученый секретарь ИВДИ АН СССР от.вауч.оотр., каад.биол.н.

/ Л.К.Осницкая/

ВВЕДЕНИЕ

Способность микроорганизмов использовать вредные соединения во многой определяет пути удаления этих веществ из окружающей среды. Из токсичесшх веществ, находящихся в атмосфере в рассеянном состояния, окись углерода имеет наиболее важное значение. Ее концентрация в чистом воздухе составляет 0,10 - 0,15 х 10"^ по объему, но в урбанизированных районах достигает более 50 х КГ6, что'приближается к опасным пределам.

До последнего времени считалось, что СО образуется преимущественно в результате техногенных процессов, связанных с неполным сгоранием углеродистых теплив, и продукция этого газа оценивалась »-0,27 х Ю9 тонн, в год хдее, 1970).

Однако, в 1972 г. на основании изотопных определений было установлено, что годовал продукция окиси углерода на Земле по крайней мере в 20 раз больше и составляет около 6 х 10^ тонн ( «ъ «1., 1972). Среднее время пребывания СО в

нижних слоях атмосферы било оценено в 10 - 30 суток, что ее согласуется с имевшимися ранее представления ¡и о высокой стабильности этого соединения. Предполагается, что наиболее вааныад источниками СО является разложение порфкриновьа соединений и фотохидаческое окисление метана. Пути удаления СО оставались неясными, хотя в числе возможных находятся фотоокисление в верхних слоях атмосферы, связывание с порфири-новыми соединениями и окисление микрофлорой почвы.

Из микробиологический литературы известно довольно большое число работ, описывающих микроорганизмы, окисляющие СО и способные существовать за счет этого соединения в качестве единственного источника энергии. Однако, критический анализ этих сообщений, проведенный Кистнером (К1вЪаег, 1953), привел к заключению, что большинство из этих работ невоспроизводимо. Культуры, окисляющие окись углерода, к началу нашей работы были утрачены, в том .числе и культура Кистнера.

Таким образом, выделение и исследование бактерий, окисляющих СО, представляет определенное'значение для поникания судьбы окиси углерода в природе. В связи с этим задачей нашей работы было детальное изучение физиологии 3

выделенной ранее в лаборатории бактерии Sellberia carbo-sydohydrogena 7r 1062 ( Санжиева, Заварзин, 1Э71) и обнаружение! выделение к описание других СО-окислнющих вдкро-органиэмов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

S рай сне были использована карбоксидойактераи Seilte- ' ria carboiydohydrogena Z -1062 и выделенные вами штампы 2 -II7I, Z-II07, 2-1607, z-1155, 2-1I56, 2-1651. Для сравнения использовали водородные бактерии Яуdr-ogenomonaв (Alkallgsnes) eutropha 2-1, Hydrogeaomoua в pantotropha Ъ-11, z-14, a. facilis 2-15ИЗ коллекции отдела физиологии хеио-автотрофиих микроорганизмов Института микробиологии АН СССР, Alceligeneo paradoxus АТОС I77I6 , Pseudomonas pallerwiil ATCCI7724, Paeudomonaa facllis ATCC 17695, полученные от доктора Станиера (тогда Беркли), pseudcmo~ aas flava И Carbozyäomonas oligocarbophilus , полученные иэ коллекции Технического университета в Дельфте (Нидерланды) .

Минеральная среда содержала (г/л): ira^HPc^'lZHgO -4,5! - 0»?5t ДН^СЬ - 1,5t «®S0V7 J^O - 0,2; CaCI^-O.oei

аммиачное лимоннокислое железо -0,013; 1,5 мл раствора микровлементов Хоглавда. В случае необходимости добавляли цаНСО^ - 0,5 г/л, простерилиэованну» в ампулах. При исследовании органотрофного роста в минеральную среду добавль»-! 0,3% органического вещества. Витамины'вносили в водном растворе.

Газовые смеси готовили в стеклянных газометрах путем смещения чистых газов. Окись углерода получали, приливая очищенную муравьиную кислоту в нагретую до 110° концентрированную серную кислота, и очищали газ, пропуская его через 20% раствор едкого натра. Состав газовой смеси контролировали на газовом хроматографе XJI-4 или XT-8 с молекулярным ситом, в качестве газа-носителя использовали аргон. Стандартная газовая смесь содержала 75% Н2, 20$ 02 и % СОр или 80$ со и 2Q5 Q?.

А

Для культивирования использовали заполненные газовой смесью нужного состава колбы Эрланиейвра емкостью £50 и 500 мл с притер тыки кранаш и впаянными в боковую стелку пробирками для измерения.оптической плотности суспензии, а также колбы Бунзена, в резиновую пробку которых была вставлена пробирка» При культивировании на чашках Петри и в пробирках использовали вакуумзксикаторы. Массовое культивирование осуществляли в двухлитровых колбах , соединенных о газометраш, с перемешиванием среды на магнитной мешалке с поющьв магнита (ЗсЫевеХ « а1., 1961 ), а также в фершнтере В±о4вс емкость« 3 и 10 литров, в которой осуществлялась циркуляция газа с помощью помпы.

Частому .культур регулярно проверяли высеваш на чайка с агариз о ванными экстрактивными средами и шкроскопир ова-нием. Запасные культуры хранили на картофельном и мясопеп-тонном агаре при С. ■

Иорфологш клеток изучали в электронных микроскопах Jem~7 и Т«в1а. препараты контрастировали напылением хромом или окрашивали их Ф8К при рН 7,4.

Сйтическую плотность измеряли на ФЭК-56Ц при 360 и 590 ни в квветах Ъ и 5 мм и в стеклянных отростках колО.

Вес сухой биомассы определяли доведением да постоянного веса определенного.объема.отмытой биомассы в пробирках при 105° шш на меибранвых фильтрах при 85° С.

Белок определяли по Лоури (ю»г1 «ъ ад.., 1951 ) цо^ле трехчасового гидролига клеток в I н яаОН при 57° С. з бесклеточного экстракта белок осаждали 5% трихлоруксус-

ой кислотой.

Нуклеиновые кислоты определяли после гидролиза в 0*5 II #С104 по разности экстинвдй при 270 и 290 ян (Спирин, 1958).

Сахара определяли дадафйцировакным антроновым методом (Зайцева, Афанасьева, 1957). .

Циюхрош определяли качественно в интактных клетках по дифференциальным спектрам на'спектрофотометрах СФ-ГО и Спекорд.

Асстиляцию углерода живыми клаткама определяли изо-

юпным методом при фиксация ^СО, ^СО^ или Н^СО^". Опыты ставили в герметично закрывающихся сосудиках или в плаващеВ над ртутър хамере ( Домав, 1955)* Клетки фиксировали 5-кратньш оЗъеиом ккпяцего этанола в радиоактивность определяли ва латунных дисках после подкисленкя б II НС1.

Ранние продукт {иксацик исследовали с понотв двумерной восходядей хроматографии ва бумаге с последующей радиоавтографией {Романова и др.* 1970).

Константы урожая определяли иаотопньш и весовым метами. Б первом случае культуры выращивали я присутствии СО в сосудиках Варбурга и определяли радиоактивность клеток, которые собирали на мембранных фильтрах, внеклеточных продуктов я образовавшейся углекислоты, которую связывали едким натром. Во втором случае определяли вес сухой бкомаосм и образовавиейся углекислоты, которую фиксировали щелочью л«0Н) и переводили в бариевую

СОЛ».

БесююгочяыЯ «кстрвкт получали рвзруяекнем клеток ва прессе типа Нив«»-рг#в» при -55° или обработкой ультразвуком лря ¿0 *ц я 500 вт оря 2° С. Клетки суспендировали в 5-кратаом об гаме 0,2 У тряо-йС1 буфера рН 7,4 с 0,01 щдох^ и 0,01 Н восстановленного гдутатиона или дитиотреитола.

Активность рибулоэодифосфаткарбохснлазы определяли ло Романовой (Романова и др., 1969). I ил ферментной смеси содержал 10 мХ11 хлористого нагни я; 10 икИ глутатиона; 50 мк!1 жаН14С03 в 0,5 К трис-НС1 буфере рН 7,4;1 ик11 рибуяозо-1,5-дифосфата; беоклеточный экстракт ( 5- 10 иг белка). Предик-кубация в течение 20 мин беа рибулоэо-1,5-дифосфата.

Суммарную активное» фосфорибоязомераэы, фосфорябулоки-назы и рибулозодифосфаткарбокснлаэн шределяли в снеся, I ил которой содержал ю мк>1 глутатиона; ю «кМ хлористого магния 5 мкК АТф; 5 мхИ рибоао-5-фосфата; 50 шШ лаН1^С03 в 0,5 Н трис-НСО^- буфере рН 7,4; бесклеточный экстракт ( 5 мг белка).

ВЫДЕЛЕНИЕ СО-ОРСЛШЩ БАКТЕРИЙ

Для потения накопительных культур было- взято 20 образцов почв, яла я воды в пределах Иосхвы. Пробы (по X г) поиедали в 0,5 л колбы о 50 ил минеральной среды без источника углерода и заполняли газовой смесью' 80$ СО и 20% 02* Использовали стационарные культуры и качающиеся. На двадцатые сутки культивирования в 10 случаях было отмечено падение давления внутри колб на 80 - 210 мм. ртутного столба, что свидетельствовало о потреблении газа. Для пересева отобрали те колбы, где давление падало'больше всего и наблюдалась пленка на поверхности или цуть. Последующие пересевы производили через 25 30 суток, Урожай накопительных культур составлял 0,75 - 1,0 мг/мли в них присутствовало по 5- 6 бактериальны! форы. Газохроматографический анализ показал исчерпание кислорода, уменьшение содержания СО и образование углекислоты. Таким образом, было установлено, что в почвах города присутствует микрофлора, способная окислять СО. '

Выделение чистых культур СО-окисляюцих бактерий оказалось.трудной задачей из-за медленного и слабого роста культур. Частично очищенные культуры, содержащие 3-4 формы, и образующие до 1,7 г/л сухой биомассы, были получены с помощью метода больших разведений о предварительным растиранием пленок в стерильной стеклянной ступке. Из этих культур рассевом колоний на агаризованных средах'в атмосфере СО и О^ и на картофельном агаре после ряда неудачных попыток удалось получить чистые культуры карбокоидобактеркй 2-1171, 2-П07 и 2-1607, но наиболее характерные.организмы, образовывавшие пленки очистить не удавалось. Предположив, что в смешанной культуре микроорганизмы образуют необходимые друг другу факторы роста, что подтверждалось наблюдением за расположением колоний ва чашках, мы произвели посев парных сочетаний колоний на минеральную среду. Урожай, сравнимый с исходным, был получен только в бинарной культуре штаммов

т

2-1155 (иди 2-1651) и 2-1156, Второй компонент б бинарной культуре оказалось возможный заменить смесью витаминов группы 8. Исключая из смеск витаминов по одному, мы установили, что штаммы а-П55 и ъ-1651 являются тиамкнзависимыми, а штамм 2-1156 нуждается в добавлении витамина В^. При перекрестном посеве пташаг-Х155, растущего на минеральной среде в атмосфере СО и 02 с добавлением тиамина, на ультрафильтрат кулмуральной среды втамиа 2-1156,'выраженного в этих условиях с В^, и наоборот, мы наблюдали удовлетворительный рост обоих птамиов, Это свидетельствует о том, что взаимодействие этих организмов является промкооперацией, основанное ла взаимном снабжении витаминами. Штамм &-П55 нуждается в 20 мкг тиамина для накопления I г сухой биомассы, а ятамм " 2-1156 требует 4-5 и кг витамина В1г в автотрофных условиях роста.Рост этих штаммов на минеральной' среде с добавками витаминов был достаточно активным, чтобы признать эти организмы главными продуцентами биомассы в смешанной бактериальной лопулкцаи, использующей окись углерода. Из-за трудностей выделения и медленного роста организмов при выделении чистых культур внимание было уделено получению отличающихся друг от друга форм, а не накоплению различных штаммов одного вида.

микробиологическая характеристика и установление '

састашичйжого положения бшерий, окисляющих со

Выделенные вами организмы были грамотрицательными подвижными палочками, не образующими спор,, размножающимися делением. Они различались формой и размерами клеток, числом » местом прикрепления жгутиков, пигментацией; Условия культивирования не сказывались заметным образом на морфологии научаемых микроорганизмов.

Большинство СО-окисляющях бактерий,за весьма примечательным исключением штамма г-П?1, хорошо растет в атмосфере Н2, 02 и С02. Поскольку было высказано предположение, что СО-окисляющие бактерии принадлежат к водородным ( К1вЬ-пег, 1953,195*)» нами были испытаны имеющиеся в нашем раса

поряжении различные виды водородаах бактерий ( си. вше). Ни одна из испытанных культур не росла в атмосфере 80$С0 и г(% 0г пли ЗОр СО и 70£ воздуха. Более того, рост их под водородом подавлялся даже неболъаой (менее 10$) лрииесьо СО. Три штамма СагЬохуйакюпае оИвосагЬорЫДиа также ве росли за счет СО ни на жидкой, ни па агаризованной минеральное среде. В атмосфере бытового газа только карбоксидобахтерия а-1156 обнаружила слабый рост, в атмосфере о пропаном ни о див штамп СО-окнсляюшис бактерий ве рос.

Все карбоксидобактеркн растут также органотрофно на ряде органических субстратов в качестве единственных источников углерода и энергии. Ширминзависимые втаимы на средах с органическими субстратами мрглн расти только лри добавлении витаминов* По способности использовать органические соединения культуры значительно различались. Органические кислоты и ниэиомолевдлярные спирты использовали все штаммы, ни один штамп не использовал формиата. Это также является отличием от водородных бактерий, использующих формиат органоавт отрофно (Намсараев и др., 1971), но ве исподьзуювдх метанол* Штампа а-П71, а-И07 и а-1607 использовали углеводы и многие аминокислоты, в то время как другие птанмы,использовали лишь отдельные аиинокислотыц. Общая .«евдешзия-была ясно "выражена: чём лучше рост в атмосфере СО, тек меньше число используемых органических соединений. На один из выделенных организмов ве гидролизовал крахмал, клетчатку, желатину, ви один из них не развивался анаэробно.

Выделенные нами организш различаются морфологическими и физиологическими признаками и не могут быть отнесены к одному роду. Поскольку способность окислять СО явно представляет специфическую функцию организма, мы сочли возможным выделить их в самостоятельные виды, отнеся к тем родам, о видами которых они сходны по признака« органотрофного роста. Для физиологической группы бактерий) способных расти аа счет СО как единственного источника энергии и углерода мы предлагаем тривиальное название карбоксидобакгерии. Объединить их с водородными нельзя, так как есть вид карбохси-

»

добактерий, не способный к окисления водорода, а известные водородные бактерии не только не использует СО, но сильно подавляются примесью ее в водороде, в то время когда рост карбоксидобактерий никогда не подавляется окисью углерода полностью. Ниже приводятся краткие диагнозы выделенных нала карбоксидобактерий» а такие Ssliberia carboxydohydro-gena 2-1062.

Pseudomonas carbozydoflava. КарбоксидобаKTерии

2-1107 и а-1607. Видовое название отражает сходство этих организмов с Hydrogeoomonaa flava и способность использовать СО. Граиотрицательные палочки с закругленными концами 0,6 - 0,8 х ¡1,5 - 3,0 мк. Подвижны благодаря наличию одного субтерииналького жгутика. Образуют слизь. Колонии на картофельном и мясо-пептонном агаре до 3 им лопастные, желтые, затеи оранжевые. Колонии.в атмосфере СО или Н2 мелкие, желтоватые. Органотрофы и литоавтотрофы, окислительные аэробы. Желатину, крахмал, целлюлозу не гидролизу»!. Нитрат восстанавливают в нитрит. В качестве единственного источника углерода и энергии используют органические кислоты, спирты и аминокислоты, Хорошо растут в атмосфере Н2, О* и С02 с образованием желтых слизистых хлопьев. Штаммы а-1107 и э-1607 слегка различаются по виду хлопьев* В атмосфере СО и Og рост , такой же, как в атмосфере Hg, но значительно более медленный, Организмы сильно напоминают Еуйгоееповоюлв flava , но не B^drogeuomoiias pantotropha или Alcallgenee paxadcrrue . Однако типовой штамм q. flava (Дельфт) не использовал ни Н2, ни СО в условиях, подходящих для Peeudomortaa carboxydoflava.

Pseudomonas (tazotropiia. Карбоксидобактерияz -II56. Видовое название отражая способность организма использовай газы. 1*раиотрицательные палочки со слегка заостренными концами, 0,7 х 1,10 мк. Подвижны благодаря наличии единственного полярного жгутика. Образуют слизь. Колонии мелкие, бесцветные. На мясо-пептонном агаре рост скудный. Зависит от витамина В12. Органотроф и лятоавтотроф, аэроб. Органотрофко использует только органические кислоты и первичные спирты. Углеводы и аминокислоты (за немногими исключениями) не окисляет. Хорошо растет

ю

метялотрофно. Литотрофно хорошо растет в атмосфере с СО и Hj с образованием толстой бесцветной пленки в статической культуре и быстро оседашцих хлопьев при росте с перемешиванием. Внеше напоминает н, facills, но различия с ним, как и с метанол-используюцими псевдомокадами, более существенны.

Cañameñas compraos oris. Карбоксидобактерии 3-П55 и 2-1651. £ра«отрицательные слэгка изогнутые палочки с заостренными концами. Размеры варьируют: 0,8 - 1,2 х 2,0 - 5,0 ык. Движение осуществляется посредством одного или нескольких полярных жгутиков. Часто наблюдаются инволюционные гигантские банановидные клетки. Образуют слизь. Органотрофы и лятотрофы. Аэробы. Колонии на картофельном агаре бесцветные, матовые с диффузным ореолом из клеток, мигрирующих по поверхности. Нуждаются в тиамине. Желатину, крахмал, целлюлозу не гидролизуют. Цитраты не восстанавливают. Углеводы ие ферментируют и не окисляют. Органические кислоты, немногие аминокислоты, первичные спирты могут служить единственным источником углерода и энергии. Литотрофно используют Н^ и СО. Рост в виде толстой пленки или хлопьев. Добавление тиамина в среду не требуется при росте с карбоксидобакте-рией г-1156, что послужило посылкой для видового названия, означающего "сотрапезник".

Achremobacter- carboxyüus. Карбоксидобактеркя 2-1171. Грамотрицательные короткие палочки с закругленными концами 0,8 х 2,0 мк. Молодые клетки овальные, почти круглые. Подвижны, перитрихи. Органотроф. Аэроб. Колонии на картофельном и мясо-пептонном агаре до Зим в диаметре, выпуклые, круглые, кремово-белые, вязкие. Желатину, крахмал, целлюлозу не гидролизует. Углевода не ферментирует, нитраты не восстанавливает, Использует ряд органических соединений ний; углеводы, органические кислоты, аминокислоты, спирты. Рост диффузный. Нет роста в атмосфере с ЯЯвный, so скудный рост с СО в качестве единственного источника уилерода и энергии.

it

N

Sellberia carboaydobydroEeaa (Сакхиева, Заварзин, I97IJ. Карбокси добактерия 2-1062. Гра м отри цат е льные мелкие палочки 0,3 х 1>0 - ¿,0 ик. Образуют розетки благодаря полярно выделяемой слизи. Дочерние клетки подвижны благодаря наличие единственного субтерминального жгутика. Органотроф и литоевтотроф. Дзроб, окислитель. Колонии нелвие, круглые, бесцветные, затем коричневатые. Желатину, крахмал, целлюлозу не гядролиаует. нитраты восстанавливает до нитритов. Рост на жидкой среде в виде мелких хлопьев. В качестве единственного источника энергии и углерода использует органические кислоты. Сахара, аминокислоты, спирты не использует. Хороший рост в атмосфере с водородом и с СО.

РОСТ КАРБОКСВДОБАКТЕРйЯ В АВГОТРОФНЫХ УСЛОВИЯ!

Поскольку окись углерода является заведомо токсичным веществом, необходимо было выяснить влияние еа на рост кар-боксидобактерий как в качестве единственного субстрата, так и в смеси с водородом.

Чувствительность карбоксидобактерий к СО оказалась различной у испытанных штаммов. Для культур с пленочным ростом определяли урожай биомассы, а для штаммов с диффу а ним ростом была также определена скорость роста. Опыты ставили при достоянной концентрации 02, равной 2С$, и варьировали концентрации СО, разбавляя ее азотом. Культивирование гели в течение 39 суток <ркс. I), Для штаммов а-1107 и г-1607 максимальный урожай наблюдался при концентрации СО 2QS, при 40% урожай уменьшался в полтора раза, а при 8Q5 СО - в три раза. Урожая штамма а-1155 в условиях эксперимента почти не зависел от концентрации СО. Урожай втамма г-1156 увеличивался с увеличением концентрации окиси углерода и достигал максимума при 8056 СО в газовой смеем. Урожай бинарной культуры штаммов Z-II55 и Z-II56 приблизительно раваялся сумме урожаев чистых культур. Примечательно, что в данном случае не наблюдается конкуренции за общий субстрат, по-видимому это связано с взаимным обеспечением витаминами, добавления которых при совместном культивировании этих штаммов ве требуется. Рост

I 1 '

2о

во

ло % со

Ряс. I. Клияние концентрации окиси углерода на урожай карбоксцдобактерий при ^льтявкроваши их в газовой смеси СО, азота а кислорода ( 20% ) в течение 30 суток.

1 - ДсЬгоаоЬосФег сагЬохусШе 2-1171

2 - РаеиЛодюпаа сагЪохуао П ауа 2-110?

3 - Сошалопае сапргаавог1в

Л — 5е11Ъвг1а сагЬохуйоЪуйговепа 2-1062 5 - РввшЮдолав б&гойгорЬа 3-1156 С - бинарная культура штаммов 2-1155 л 2-1156.

ктаима а-1171 при давних условиях роста оказался весьма скудным, так как организм требует лучше» аэрации. Благодаря диффузному росту этого штамма оказалось возможным определить для него скорость роста ( рис. 2). Она максимальна при концентрации СО и уменьшается до 0,8 от максимума при концентрации СО 80%.

С водородом в качестве энергетического субстрата рост карбоксидовактерий происходит значительно быстрее, чек с окисью углерода. Прибавление СО к смеси водорода, -кислорода и углекислоты ингибировало рост карбоксидобак-терий, уменьшая скорость роста в ликейаой части кривой роста и выход биомассы. Чувствительность различных штаммов к СО и в этих опятах варьирует (табл. I),Таким оврагом, водород является предпочтительным субстратом для карбоксидовактерий, за исключением ктамма 2-П71, не использувиего водород.

Рис. 2. Влияние концентрации СО в газовой смеся на скорость роста АсЪгодоЪасЪвг сагЪозуйия 2-1171.

I — I

¿о «о

% -СО

И

Влияние добавления СО в газовую смесь Н2. 02 (20$) и СО^ (10?6) на урожай карбоксидобактерий после 14 суток культивирования

% Вес сухой биомассы ( иг/мл )

СО а-1107 2 ,-1607 2 -1062 2 1-1155 2 ;-И5б &-1|55 г-1X56 Ъ-1111

70 0 1,38 1,16 0,54 1,40 1,10 1,42 0,01

60 10 1,10 1,00 0,52 0,60 1.04 1,16 0,04

50 20 0,30 0,25 0,50 0,45 1,00 0,70 0,05

35 35 . 0,10 0,10 0,^0 0,30 0,72 0,52 0,06

го 50 0,05 ■ 0,05 0,14 0,20 0,50 0,32 0,09

0,7 70 " 0,02 0,03 0,06 0,12 0,11 0,10 0,08

Когда в газовой снеси присутствовали два газообразных субстрата, СО и Н2, штаммы с диффузный ростом давали типичную картину дмауксии. По-видимому, первая ступень соответствует исчерпанию водорода. В опыте с искусственным акцептором электронов, кеотетраэолнем, клетки, выравненные в атмосфере водорода, оказались неспособными в течение опыта (2 часа) окислять Со, а в свою очередь клетки, выращенные под СО, окисляли Ц^ медленнее, чем окись углерода. Эти данные нашли подтверждение в опытах по ассимиляции меченой углекислоты и указывают на вероятность существования двух разных ферментов или ферментных систем для окисления СО я водорода.

Рост карбохсидобактврий при использовании окиси'углеро-да характеризуется малой скоростью и небольшим^ выЛдом биомассы. Однако', окись углерода для карбоксидобактерий может быть единственным источником углерода и энергии, и, следовательно; она'ассимилируется* Иы произвели определение констант урожая наших штаммов по углероду изотопным и весовым методами ( табл. 2 ).

Включение углерода в клетки карбоксидобактерий, вив- ■ клеточные продукты и углекислоту ( %% общего количества углерода' утилизированной СО)

изотопное определение весовое определение

ШяАин ___

штамм клетки внеклеточные продукты со2 клетки со2

2-1062 3,02 0,58 96,4 4,40 95,60

а-иот 3,55 0,44 96,2 4,15 95,85

Z-I607 3,32 0,70 96,0 4,10 . 95,90

2-1X56 2,41 2,00 95,6 4,70 95,30

Z-II55 2,80 0,90 96, 3 4,30 95,70

Z-II7I 3,30 0,30 96,4 4,00 96,00

среднее 3,8 96,2 4,3 95,7

Оба метода дали близкие результаты* Приблизительно 4% СО включается в клеточный углерод , а окисляется до С02» Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности превращения СО в углекислоту карбоксидобактериями. По-видимому при окислении СО в бактериях функционирую? не все участки фосфорилирования, так как энергетическая эффективность процесса иенее:8% и близка к таковой У «(тарификаторов.

Устойчивость карбоксидобактерий к высоким концентрациям окиси углерода заставляет нредооложить у них либо наличие особой» нечувствительной к СО, цепи переноса электронов, либо существование специальных механизмов работы цнто-хромов алектронпереаосящвр4 цепи. Цитохроиы определяли по диффервЯЦкальным спектрам ( восстановленные дитионитом против окисленных феррицианидом ). Наличие отчетливых пиков, соответствующих по положению цитохромаи ^ л с, а также не-больяой пик в области нахождения цитохроиа а обиаруиива-

лйсь у всех втаммов карб о кси добактерий кеэависяио от субстрата роста. Таким образом, если и есть разница в составе ци-тохромев у карбоксидобактерий, то она скорее количественная, чем качественная, и при окислении СО в клетках присутствует полная цитохронная цель. Действие цепи переноса электронов в митохондриях при отравлении СО описано количественно ( Chance: *t al*, 1970 ).

Для пути поступления углерода в клетки карбоксидобактерий существует две возможности. Окись углерода имеет такой ее уровень восстановленное™ как муравьиная кислота, следовательно, она может быть ассимилирована метилотрофно. Другой возможностью является автотрофная ассимиляция после окисления СО в СО^. Неспособность карбоксидобактерий расти на формиате,как единственном источнике углерода и энергии, и хороший рост в атмосфере Н-,,. 02 и СО^ указывают на большую вероятность автотрофного пути. РазличнУе штаммы карбоксидобактерий включали мечекий углерод в кислотоустойчивые продукты клеток к из ^СО, и из H^COj-. Однако,кинетика накопления метки клетками была различной ( рис. 3 ). Клетки, которые инкубировали в атмосфере немеченой окиси углерода с E^COj", начинали ассимилировать углекислоту немедленно и с постоянной скоростью, причем присутствие СО как энергетического субстрата было необходимо. Меченый углерод из

включался в кислотоустойчивые продукты клеток карбоксидобактерий после некоторого лаг-периода и с промежуточным образованием кислотокеустойчивого продукта ( или продуктов). Добавление немеченой углекислоты заметно уменьшало включение метки из ^СО. То же самое наблюдалось при поглощении едким натром 14С02, образующейся из меченой СО. Эти данные указывают на то, что СО, по-видимому, ассимилируется после окисления до СО^

В экстрактах клеток карбоксидобактармй 2-1062 и £-1156, выращенных в атмосфере СО и 02, обнаружена рибулозодкфосфат-карбоксклиза, ключевой фермент цикла Кальвина. В карбохси-добактериях, выращенных под водородом,также обнаружена ак-

1Т

тивность этого фермента. Ассимиляция углекислоты более детально неучена У авИЪег1а сагЬохуйоЪучЬеовеиа 3-1062.

Рис. 3. Кинетика включения в кислотоустойчивые продукты клеток Рееийощопаз вагой-орЬя 2-1156. Варианты опыта:

1 - "со

2 - + НС03"

3 - 14С0 + *аСН

4 - н^соз" + со

5 - Н^СО^ + воздух

• автол рофеш РОСТ биалвеви САВВОШКЯтЖОЩША z-1062

при окислении со и нг

В целях более детального сравнения карбоксидобавтерий с истинными водородными бактериями мы исследовали физиологи» роста к автотрофную ассимиляцию углекислоты Seiiberia с&гЬо-

zjdoh^drogena Z-I062.

. При стандартных условиях культивирования, применявшихся ранее для водородных бактерий, рост штампа 2-1062 в атмосфере 80$ СО и имел характер, типичный для организмов с газовым питанием, однако происходил значительно медленнее, чем рост водородных бактерий под водородом ( рис. 4). Срок культивирования достигал 15 суток, удельная скорость роста в экспоненциальной фазе была обычно равна 0,02 час"*, минимальное время удвоения равнялось часам, скорость роста в линейной фазе составляла 5-10 мг сухой биомассы/лнтр/час, а выход биомассы как правило не достигал 2 г/литр.

Рис. 4. Кривые роста и состав биомассы пт. 2-1062 при росте в атмосфере 80% СО и 20Í 02. I - вес сухой биомассы, мг/мл; 2— оптическая плотность при 360 ни;

3 - белок, мг/мх;

4 - нуклеиновые кислоты, мг/мл;

5 - полисахариды, мг/мл.

я а- • г 9 *t

ie

При poete в атмосфере H^, 02 и CO¿ организм ведет себя как типичная водородная бактерия и развивается приблизительно в 5 - 6 раз 6ucTpeet чем в атмосфере с (¡0, срок культивирования обычно не превышал 5 суток, удельная скорость роста до<;тига-ла 0,06 час-1, абсолютная скорость роста равнялась 45 уг/литр/ час, а урожай достигал 3,5 г/литр, что сравнило с урожаем сат мой активной группы водородных бактерий Bydrogenomonae eutrojpba. Сос-тав клеточной биомассы втамма 4-1062 был сходным при рос-» те и с Си и с Н^. Содержание белка в клетках на всем протяжении культивирования оставалось более или менее постоянным и составляло 35 - % сухой биомассу. Нуклеиновые кислоты и полисахариды составляли по 10 - 12 % . Запасное вещество имеет липидную природу, однако в большое количествах в клетках не накапливается.

Фиксация углекислоты культурами, развивающимися с водородом или СО, различается по фазе, яр которую приходится максимальная удельная активность. В культуре, окисляющей водород,, максимум удельной активности карбокеялирования приходятся на конец экспоненциальной - начало линейной фазы роста, причем определяемые скорости ассимиляция углекислоты обеспечивают прирост углерода в культуре на 80 - 90 % на всех фазах развития ( рво. 5). В клетках, растущих под СО, кербоксидирующая

активность увеличивается в ходе роста, культуры^ и ^иедяцу^ее._____—------

развития в ^ ^5,раа_пр8вш1отт^1таросгь^в1ышчения углерода,_

^вычисленную "ilü "Up3p¡££ty биомассы (рис. 6 ). Это указывает на то, что не первые ступени анаболизма ограничивают рос^ культуры в атмосфере СО.

Наличие адаптации клеток штамма 2-1062 к СО и Нг как субстратам проверяли измерением начальной скорости ассимиляции С02 ( табл. 3J. Лучшая ассимиляции углекислоты наблюдалась в атмосфере, соответствующей составу газовой смеси в культиваторе. Эти данные не соответствуют результатам Кистнера (Klet-ner, 1954 J, который не наблюдал адптации к Н2 у Hydrogeno-пош| carbtntydovorene , выращенной под СО.

so

4 5 ж/0 № п Ж i * f

м- а

ti п ,

Фа го !t

*» 9

qos л- - t

qpt rt- ?

c¡oí а. t*- в

ю- г ■ f

цок » t,t- *■

qos 6 <* 3

цог * ц» г

apt г- о.*-Ч/ t **

vocór

jv '4o Ло во МО tía tfO

Ríe. 5, Ассимиляция H^^COg*" клетками S. carboxydoiiydroge-na z -1062, растуцими в атмосфере C^ и СС^,в культуре разного возраста

I - оптическая плотность при 360 им; 2 - й&яок, мг/мл;

3 - скорость ассимиляции углекислота едангщей объеЪга культуры, мкМ ассимилированной Н^^СО^/шн/ил суспензии?

4 - удельная скорость ассимиляции углекислота, икМ ассимилированной Н^Соу/мипАг белка.

Ряс. 6. Ассшиляцпя Н14С03" клетнада е, слгьохуйоЬуйгоев&а 2-1062, растущяш в атмосфере СО и в культуре разного возраста

I - оптическая плотность при 360 нм; 2 - содержание белка, глг/гяя суспензия; 3 - скорость ассимиляции углекислоты единицей объема культур!, мкМ ассимилированной Н14С0 суспензии; 4 - удельная скорость ассимиляции углекислоты, мкМ ассимилированной П^^СО^-/ мин/мг белка.

32

Влияние энергетического субстрата на интенсивность фиксации углекислоты живыми клетками штамма 2-Ю62, ( и км ассимилированной КнС03~/м*к/мг белка)

Газовая смесь в Газовая смесь в опытном сосудике

культиваторе -..—-------

СО + 02 н2 f °2 Воздух

Н2 + 0£ + С£>2 0,0612 0,8470 0,0455

CO t 02 0,2780 0,0684 0,0216

Для установления пути включения углекислоты карбоксндо-бактеркяма был исследован состав ранних продуктов ассимиляции **С0г клетками панна 2-1062* вы раненными с водородом я с СО ( табл. 4 а, б Независимо от энергетического субстрата первыми продуктами оказались фосфорные афиры Сахаров л глицериновое кислоты, что свидетельствует о преимущественном усвовияи углекислоты в восстановительном пентозофосфатном цикле Кальвина* Раннее появление метим в аспарагиновой я гдугаминовой кислотах указывают на карбокснлировашю фосфоеиолпируваха.

Активность рибудоэодяфосфаткароохсялаэы быка одинаковой по порядку величины в экстрактах клеток, выращенных в атмосфере с СО и с Н2, составляя соответственно 0,087 и 0,12 мхм ассимилированной Н^СОу/мав/мг белка. Такая же удельная активность этого фермента наблюдается и у истинных водородных бактерий.

Таким образом, на основании состава ранних продуктов фиксации 1 С02, наличия ферментативной активности и списанных выше физиологических опытов, можно считать, что шташ z-1062 ассимилирует углерод, аототрофныы путец при росте как за счет окисления водорода, так я за счет окисления окиси углерода.

Процентное содержание меченых по углероду соединение при кратковременном хемосинтеза клеток штамма ъ -1062 ( % от общей ассимилированной радиоактивности; а> в атмосфере В,, О, и ^СО-,

Радиоактивные Экспозиция 0 *4С0ч ( сек. )

вещества

3 15 30 45 60

фосфорные э$иры Сахаров 44,08 54,86 53,22 60,30 61,ВЗ

«ГК 44,17 39,59 39,89 29,30 7,96

Аспарагиновая кислота следы 0.7? 2,56 2,11 3,71

Глутаииновая кислота следы 0,34 0,49 0,76 11,21

Остальные вещества 7,76 2,32 2,28 4,21 7,35

Точка нанесения 2,09 1,67 ;3,27 8,02

б) в атмосфере СО, о2 и 14со2 ,

Фосфорные эфира. Сахаров 52,15 . 65,66. 79.91 54,42 63,39

ФГК 33,89г 15,97 12,66 13,12 2,76

Аспарагииоваи кислота нет 2,22 2,46 3,84 5,81

Глутаииновая кислота нет 2,01 1,67 3,87 7,62

Остальные вещества 6,00 9,25 ; 1,88 6,59 >,57

Точка нанесения - 7,97 4,90 5,41 10,41 14,85

обсуждении результатов

- Окись углерода является яродуктом естественных процессов и, как было показано в геохимических работах, годовая продукция ее на Земле превышает продукцию метана ( stevena al., 1972). Основным путем удаления СО из нижних слоев атмосферы по-видимому является поглощение ее почвой, обусловленное деятельностью почвенной микрофлоры ( laman et al., 1972). Нала работа, проведенная одновременно с этими геохимическими исследованиями, выявила существование группы бактерий, окисляющих СО и использующих энергию окисления для своей жизнедеятельности. В последнее время появился ряд предварительных сообщений и упоминаний зарубежных исследователей, в которых указывается на выделение организмов о аналогичной функцией, однако подробные данные «uta отсутствуют.

На основании нашей работы для СО-окисляющях бактерий можно считать характерным ряд особенностей, позволяющих выделить их в самостоятельную физиологическую группу, которую мы назвали карбоксидобактерий. К этой группе относятся организмы разнообразного таксономического положения, способные существовать за счет окисления СО в качестве единственного источника энергии и углерода, осуществляя суммарную реакцию:

гь со + и о2 + н2о = 23 со2 + (сн2са

Все эти организмы способна использовать помимо СО и другие соединения. Большщство использует водород, низшие спирты, органические кислоты. Способность использовать углеводы и аминокислоты наблюдается у ограниченного числа штаммов. Гидролитической активностью ни один из выделенных штаммов не обладал. Окись углерода является токсическим субстратом для большинства карбоксидобактерий и для каждого вида существует своя пороговая концентрация.СО, при превышении которой становится заметным торможение роста. СО яе является предпочтительным субстратом для карбоксидобактерий. В окислении ее, по-видимому, участвует самостоятельный фермент или ферментная система, во всяком случае, наши штаммы, выращенные на СО, не были одновременно адаптированы к использовании водорода. У всех кар-

ав

боксидобактерий обнаружена достаточно развитая цитохроиная цепь. Конструктивный обмен карбоксидобактерий характеризует-ан способностью к автогрофноку усвоению углекислоты« образующейся при окислении СО, что было показано наш ^экологически ци опытаии с усвоением ^СО и **С02, составом ранних продуктов ассимиляции углекислоты и наличием соответствующих ферментов* Ассимиляция углерода у исследованного нами штамма 8е11Ъ»г1* сагЪохуаоЬ;<1го£епа осуществлялась через восстановительный пеятозофосфатный цикл Кальвина. Некоторые карбок-сидобактерии являются уникальншш в тон плане, что могут переходить от автотрофного к органотрофному и метилотрофно- . му типам пихания.

Карбоксидобактерии довольно широко распространены в почвах и особенно в поверхностном слое ила, однако численность их трудно оценить.из-за медленного роста и склонности образовывать агрегаты из клеток. Тем не менее, ухе на основании широкого распространения этих организмов и их болыиого шдорого разнообразия можно заключить, что эта специфическая группа микроорганизмов удовлетворяет требованиям, необходимым для агента, ответственного за быстрое удаление окиси углерода в природе.

Б и В О Д Ы

I* Установлено существование бактериальной микрофлоры, окисляющей окись углерода в качестве источника энергии в соответствии с уравнением

24 СО + II 02 + Н20 « 23 С02 + [СН2Ш

2. Выделены в чистую культуру и описаны следующие шды карбоксидобактерии: РееиОотоаав сагъоху<1о«.аул п. ер., рвви-

<1отоав8 еазоЪгорЬа п. ер., Сошиаонае сотргеобог1в п. ер., ДсЬгопоЬ&сЪег сагЪоху<1ив п. ер., диагнозы которых приводятся.

3. Дана сравнительная характеристика автотрофного ^оста карбоксидобактерий при использовании газовых субстратов. Установлено, что для этих организмов, за исключением

зе

Acbrooobacter oarboaydue Z-1I?I, предпочтительны« субстратом является водород. Рост за счет окисления окиси углерода осуществляется значительно медленнее, причем среди представителей группы карбоксидобактерий наблюдается различная чувствительность к СО.

4. На примере Selibtrla carbo:rydoby drogaría установлено, что включение углерода углекислоты в клетки карббхсидобак-терий происходит по автотрофному пути как при окислении.водорода, так и при окислении СО.

СПИСОК

работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Савельева Н.д., Кожевникова А.Н., 1972. Автотрофный рост

Sel iberia carbojtydohydrogena при окис- ^ лении водорода и окиси углерода* Микробиология, 4J, 6, 813-817.

2. Кожевникова Д.Н., Савельева Н.Д., 1972. Автотрофная асси-

шляция углекислоты у бактерии, окисляющей окись углерода. Микробиология, 41, б, 939-946.

3. Кожевникова А.Н,, Заварзии Г.А., 1973. Симбиотическое

окисление окиси углерода бактериями. Микробиология, 4g, I, 158-159.

4. Кожевникова А.Н., Савельева Н.Д.,1974. Основные характе-

ристики окисления окиси углерода СО-окис-ляющей бактеркей ßeliberta «arboxydobydro-gena Z-Í062. Микробиологическая промышленность, I f109í. 6-9.

5. Кожевникова А.Н., Заварзик Г.А., 1974. К таксономии СО-

окисляпщих грамотрицательных бактерий. Известия АН СССР, серия биологическая) ¿,436-440. .

6. Кожевникова А.Н., 1974. отношение СО-окислязощих бактерий

к окиси углерода. Известия АН СССР, серия биологическая, 6 , 877-883.

Пело.» «4.37 /Х1-7ЧГ. Формат 60*84 |/1вд.п. Овын 1.75я.л. Заказ 17ЭЙ1 - - Зама 1ТЗЙ1

Фабрш КМП Гл41»го упраяяакмя вчислцтмиы^ р*Йот

- , ЦСУ СССР