Карбоангидраза высших растений: структурно-функциональная организация, регуляция и возможная физиологическая роль

Гулиев, Новруз Магамед оглы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Карбоангидраза высших растений: структурно-функциональная организация, регуляция и возможная физиологическая роль
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Карбоангидраза высших растений: структурно-функциональная организация, регуляция и возможная физиологическая роль"

П Н

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ГРУЗИЯ

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи

ГУЛИЕВ НОВРУЗ Л\ А Г А М Е Д оглы

УДК 577. 152. 11

КАРБОАНГИДРАЗА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ: СТРУКТУРНО—ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, РЕГУЛЯЦИЯ И ВОЗМОЖНАЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ

РОЛЬ

03.00.04 — биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Тбилиси — 1992

Работа выполнена в лаборатории биохимии фотосинтеза отдела молекулярно-генетических основ продукционных процессов Института ботаники АН Азербайджанской Республики.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. Е. Семененко доктор биологических наук, профессор Г. Ш. Ткемаладзе доктор биологических наук X. М. Касумов

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха Российской Академии Наук

Защита состоится « » ¿¿М^иъ^ 1992 г. в У/^час. на

заседании Специализированного Совета Д. 007.04.01 в Институте биохимии растений АН РГ по адресу: 380059, Тбилиси, аллея Давида Агмашенебели, 10-й км.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии растений АН РГ.

Диссертация разослана « ^ » « »1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат биологических наук М. В. БЕНДИАНИШВИЛИ

ОЕДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАЮ ТЫ .

Актуальность проблем». Карбоангидраза (карбонат-гидро-лиа-за, К5 <( .2.1.1), катализирующая обратимую реакцию С02 ♦ HgO НСО" + Н+, впервые была обнаружена в лабораирии Рафтона ( Ucldrua et al. , 1932 ¡ í'.eldrun , Roughton , 1932) в эритроцитах животных. 3 дальнейшей было установлено, что фермент эритроцитов состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 30 ООО Да, содержит иного кислотных и основных остатков и иало цистеииа, имеет в своей составе один атом цинка ( Со-leaan , 1971).

Карбоангидраза (КА) животного происхождения очень хорошо изучена. Установлена первичная структура эри1роцитарной KA(Hi-cole et al. , 1974; üartine et al. , 1974 { Tashian ct al. , 1984). Получены монокристаллы и изучена третичная структура этого фермента ( Liljas et al. , 1972; Kannaa et al. , 1977). KA животного происхождения сильно катализирует обратицую реакцию-гидратации С02 и является самый активным ферментом среди всех известных з литературе. Физиологическое значение животной КА определяется участием ее в актах дыхания, пяцбварениж, регуляции постоянства активной реахции .внутренней среды организма и водно-солевого обмена (Шпак, I9tíü).

Первоначально имелись некоторые сомнения по поводу существования КА в растениях ( Eoughton, I934f Burr, 1936 i Uommaerts, 1940). Однако использование усовершенственноа методики ( Brad-field , 1547 | V/aygood , Clendennig , 1950 j Pocicer , Ng , 1973) устранили эти сомнения и сообщение Нвйша ( Heish, 193У) о том, чю КА встречается у растений подтвердилось. В дальнейпем КА была обнаружена практически во всех исследованных растениях. 'Геи не менее растительная КА изучена значительно слабее, чем фермент животных.

К началу наших исследований имевшиеся немногочисленные литературные данные по растительной КА носили противоречивый характер и не внесли значительный вклад в рэпение вопроса о функционировании КА у растений. Поэтому необходимо было провести широкие систематические исследования этого фориента, катализирующего превращения основного субстрата фотосинтеза, главного процесса растительного организма.

Цель и задачи работы. Цель» данной работы явилось всестороннее изучение КА высших растопив. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи.

1. Получить гомогенный препарат КА из листьев двудольного растения нута и однодольного растения пшеницы.

2. Определить важнейшие физико-химические параметры КА.

3. Исследовать структурную организацис КА.

Исследовать функционально-значимые компоненты КА.

5. Исследовать природу связей, участвующих в поддержании нативной структуры КА.

6. Исследовать каталитические свойства КА.

■ 7. Исследовать регуляцию КА.

8. Получить информацию о возцожной физиологической роли КА высших растений.

Научная новизна исследования. Впервые проьедено коиглекс-ное исследование КА высакх растений. Выделен гомогенный препарат КА и проведена его кристаллкзациа. Изучены важнсйаиб физи-хо-химичесхие параметры КА я устаяовдено, что фермент листьев двудольного растения является октамером, а фериент листьев однодольного растение пшеницы - димером, состоящий из идентичных оубьединиц. Исследовано пространственное расположение мономеров КА листьев нута и показано, что в иоле куле фериента восеиь субъединкц расположены с точечной группой симметрии 122 (Д4) по вервинам двух квадратов, повернутых друг' относительно друга вокруг оси 4-го порядка. Изучена также вторичная структура этого/фермьнта. Исследованы типы, в возможные роли БЫ-группы фермента. Выявлены функционально-значимые компоненты п природа связей, участвующих в поддержании нативной структуры КА. Исследована регуляция и получена информация о возможной физиологической роли КА высших растений.

Прйктическел значимость .исследований. Методы и приемы, разработанные для изучения КА могут быть применены в подобных биохимических а физиологических исследованиях. Полученные а работе данные углубляют «аза знание о функционировании растительной КА, внося определенный тад а развитие фундаментальна . исследований в области 'эязвмодопЫ и фотосинтеза.

Апробация работы. Результаты исследований была доложены в обсуждались наг ЗШаенделед веком съезде (Баку, 1561)1 IV Всесоюзном симпозиуме, *$изико-химические основы ферментативного ка-

тализа и его регуляция" (Москва, 1982)$ I Биофизическом съезде (Москва, 1982)) Международном симпозиуме "Регуляция метаболизма первичных и вторичных продуктов фотосинтеза"«, (Москва, 1983) | Всесоюзной конференции "фотосингетическое ввделение кислорода" (Пущино, 1983)} УП и УИ Ботанической «езде (Ленинград, 1983} Алма-Ата, 1988); 16, 17, 19 конференции ФЕЮ (Москва, 1981} Берлин, 1986} Рим, 1989)} Всесоюзном совещании с участием иностранных ученых "Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в С3-расгенилх" (Таллинн, 1985)} Всесоюзной конференции молодых ученых "Современные проблемы биохимии а физико-химической биологии" (Москва, 1935)} Всесоюзном симпозиуме "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе" (Пущино, 1585)} 13-ом Международном биохимическом конгрессе (Амстердам, 1985)} Всесо-. юзном симпозиуме "Элементы газообмена лиота и целого растения" (Пущино, 1985)} У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986)} Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987)} Конференции молодых ученых, посвященной 70-летию ВЛКСМ (Баку, 1988)} II съезда Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990)} I республиканской биохимической конференции (Баку, 1990)} Международном совещании "Метаболизм углвг рода и азота" (Пущино, 1991)} И республиканской конференции "Микроэлементы в сельском хозяйстве и медицине" (Баку, 1991)} Международной конференции "Итоги и перспективы знзимологических исследований метаболизма углерода при фотосинтезе"(Душанбе, 1991)} семинарах Института ботаники АН Азербайджанской республики.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 печатных работ, из них I - монография в издательстве "Наука", Москва, 175 с.

ОСНОВНЫЕ МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовали листья двудольного растения нута ( С1свг аг1е-ыпии) и однодольного растения пшеницы ( ТгИ;1-сит аигид! Р. ). Растения выращивали в фнтотроне и на экспериментальной базе АзНИИ земледелия, располояеиной на Апсеронском полуострове.

■ Для выделения и очистки КА листья нута'гомогенизироради мо-ханичесг.нм дезинтегратором типа №¡-302 в течение 2 ы::н. б

- и -

0,ü25 ;.< Ua^irc^-Nal^K)^ буфере, pH 7,0, содержащем 0,CI Ы HaCi 0,005 М дитготрситол и 0,C.UI М 2ЛТА. Листья тшмицы гомогенизировали такжп механическим дезинтегратором б v f05> .'.! Трис-HCl буфере, pi! 8,<*5, содержащем 0,01 U HaCl , 0,01 U дитиотректол и 0,001 Si ЭЛГА. Гоиоген.и отжимали через двойной слой полотна и центрифугировали 10 иин при IÜC0 g , и затеи 30 млн при 5000 g для удалеьия неразрушенных клеток и их Фрагментов. Полученный таким способом ферментный экстракт подвергали'дальнейшей очистке.

Активность КА определяли электрометрическим методом по начальному изменении pH ( Rickli et al. , 196*0 с некоторыми напи-ми модификациями. Диск-электрофорез в 7,5$ полиакрилаиидпом геле (ПаАГ) приводили по иетоху Дэвпса и Орклайип (Davie, 1964 | Omstein, U-6't). Электрофорез в IO^-ном додецил сульфат . натрия ( ds-Na ) проводили по Веберу и Осборну («еоег, ОвЬогп , j959). Электрофороз продуктов протеолиза КА в L&f ПААГ с 0,Ii Eti-Na проводили в блоках, по модифицированному методу Томаса и Корн-берга ( ТЬопав , Kornberg , 1975). Изозлектрофокусярованне проводили на колонке LKB еюо-1 и на пластинке Multiplier , 1KB . Определение молекулярной массы КА проводили методом гель-фильтрации через сефадекс 0-2СС.

Аминокислотный состав КА проводили ни аминокислотном анализаторе blül ( leb) по методу Иура я'Шгеала I Иооге , stein , 1963)

N-концевую аминокислоту определяли дансильным методом С Heedlec/m, 1570). Значения фрикционного отиэвения и коэффициента диффузии рассчитывали то формулаи, представленным о книге Тэнфорда ( Taaiord, IS63). Коэффициент седиментации КА определяли методом ультрацечтрифугярованна в градиенте плотности сахарозы ( Uaxti-Q, Алев , IS6I) на улмраценгрифуге Вескшап Ь-5-€0 (СВА), роторе СК-65» Раяаус Зтокса определяли меюдоц гель-филирапви через'сефадеко G-2C0 ( Siegel, isonty, 1966). Содержаний цинка в препаратах КА определяли методом атомно-абсэрбци-оииоЯ спвктрофогомогрии (A.A. 80S, Янако, Япония и Carl Leise Jena , ГДР). Микрофотографии КА получены на олектрояном «вкро-скагш »iliria Eil-<»00 (гмиря , Нидерланды) при уводачеияа 50000 и ускорявшем напряжении ЙОет . Спектры кругового дихроизма (КД) измеряли на дихрогряфэ jasC0-40 . Для титрования вн-группы использовали 5,5-дииобнс (2-йитробензойиая кислота) (ДТЯБ)» реактива Зллм&на (Eilaan , 1959).

1отосинтегичоскиЯ метаболизм углерода, транспорт и распре-двленке ассимилятов изучали радиометрически« методом при естественной концентрации углекислого газа и киблорода (Заленский, 1955 { Вознесенский и др., 1965-, Уокроносов, 1966 ¡ Быков, Лииарь, 1978). Активность РБЬкарбоксилазы и ФЕП-кзрбоксилази определяли спектрофотометрическим истодом, а активность РБ$-оксигеназы амперометричесюш методой (Романова, 1981).

результату- кс с лед) в ah ия и их обсуждение

I. Локализация КА в клетке

Дня выяснения физиологической роли КА особый интерес представляет вопрос о "внутриклеточной локализации этого фермента у растений. Сам&ч высокая активность КА обнаружена в зеленых листьях высших растений. По нашим данный этиолированные листья íiy-та и пшеницы практически не содержат КА-активности. Следовательно, можно думать, что основная доля обцай активности КА должна быть во фракции хлоропластов. Однако некоторые исследователи во. обще не обнаружили ( Bradfield, I9V7) или обнаружили незначительную часть КА-активности в хлоропластах (Wood, 31Ъ1у , 1952; Poincolot, 1972). Это, как показали «паш исследования, овязано с теп, что при выделении хлоропластов-в водной среде, теряется значительная часть хлоропластной КА, которая переходит в растворимую фазу и попадает в другую фракцию. С .увеличением интакт-ности хлоропласгов доля активности фермента в хлоропластной Фракции увеличивается.

< В целом, полученные результаты и имеющиеся в литературе сведения указывают на то, что КА лиотьов высших растений локализована как в хлоропласте, так и в цитоплазме.

2. Очистка КА из листьев

При обычном механическом разрушении листьев нута и пиеницы .практически вся активность КА обнаруживается в растворимо а фазо. Активность фермента листьев нута требует для стабилизации своей активности дитиотрэйтол и НзС1 з стоутегяие этих реагентов на-б.-.ядасгсб резкое у&аяьвапне КА-активяости.'Она максимально ста-'-pi; рк 7,U. 2 Su/:очных зонах фориент бистро ииакгивируеI -

Для очистки KA листьев нута экстракт ферментов, полученный как описано в "Методы исследования", обрабатывали стрептомицин-сульфатом в конечной концентрации до IÍ-. Через 30 мин выпавший осадок удаляли центрифугированием при 5000g в течение 20 мин. К полученной надосадочной жидкости добавляли сульфат аммония до Э5£ от полного насыщения. Образовавшийся осадок, но обладавший активностью КА, отбрасывали, сульфат аммония добавляли до 55£ насыщения. Осадок поело центрифугирования 20 мин при 5000 в растворяли в минимальном объеме 0,025 И Na^PO^-Naí^FO,, буфере, рН 7,0, содержащем 0,1 M HaCi, 0,01 U дитиотрейтол, О,CCI U ЭДТА (буфер А) и диалиэовали сначала 2 ч против 100 объемов то-ío же раствора и затем I сут. против 400 объемов. Отдиализованный раствор центрифугировали 15 мин при 20000 g « надосадочнуг жидкость наносили на колонку (2,5 х 100 см) с ультрагелгм А2А-34, уравновешанную буфером А.

Обладавшие активностью КА фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией в атмосфере инертного газа чорвз мембрану "Рипор-А-б'»". Концентрированный раствор диализовали в течение I сут. против буфера А (рН.7,5). Отдиализованный раствор наносили на колонку (S х 300 мы) с ДЭАЭ-сефадексом А-50, уравневеданную тем же буфером. Колонку сначала промывали буфером уравновешивания, затем создавали линейный градиент NaCl (0,1-0,5 li). Фракции, сбладавпие активностью, объединяли, подвергали ультрафильтрации в атмосфере инертного газа через мембрану "Рипср-Ч-25". Концентрированный раствор диализовадк в течение I сут. против/буфера А (рН 7,5), содержащего 0,04 li NaCl. Отдиализовал-ный раствор накосили на колонку (4 х-300 мм) с дЭАЭ-целлслоэоП, уравновешапную упомянутым раствором. Элюирование белков Бели этим же- раствором, а затем в градиенте рН 7,5-6,0. Результаты показали, что градиент pii хаот очень хорезкя эффект при очистке фермента.' Таким путем мокно избавиться от тех балластных белков, которые Слизки в по суммарным зарядам и по молекулярным иасс si х карбоаягидразэ.

Обладание активностью фракции, полученные с кслпнкк целлвлозы, обьедвияла ü концентрировали ■улырз.-Зймьтравдей ь атмосфере инертного газа через мембрану "Рипор-4-25"- Как^енг^гро-ваннкй раствор даализовпли против буфера А. 0тдйгь-5;зо5п;шый раствор насщали сульфатом аммония до 70Í наска&ягя а хранили при -6° до использований. Sea операции па очмтке КА проводили

при 4o.

Следует отметить, что описанная методика очистки КА из листьов нуга по сравнению с другими опробованными методиками очистки имеет определеннее преимущества, так как при гель-фильтрации чсроз ультрагель A3A-31 значительная часть белков (как высокомолекулярных, так и ниэкоыолекулярных) отделяется от КА. Более того, отдаляется ог КА зеленая пигментированная фракция белков, что облегчает дальнейшую очистку. Однако эта методика такхе не лииена недостатков, связанных с тек, что обычно для препаративных целей при первой колоночной хроматографии приходится разделять больиио количества белков, что ограничивается возможностью голь-филырации. Поэтому при необходимости работать с больший объемом несколько изменили описанную выше мето-' дику. Для этой цели белки после осаждения сульфатом аммония растворяли в буфера А (рН 7,5) и диализоволи против этого ао .буфера. Отдиализованный раствор белков наносили на колонку с ДЭАЭ-сефшсехсои А-50. Затеи следовали стадии очистки: гель-фильтрация через ультрагель АСА-34 и ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлшозо. Условия хроматографирования на этих, колонках били такие со, как описало визе. Такая последовательность колоночных хроиатографий позволяет провести очистку карбоангидрази из большого количества исходного материала и получить гомогенный препарат фермента в достаточно больной количестве.

Следует отметить, что для получения гомогенного препарата в условиях наиих экспериментов каждый из использованных типов разделения на колонке бил необходим. Исключение одной из этих ^трох стадий приводило к получению негоиогенного препарата фермента. Однако при необходимости последовательность этих колоночных хромата графий могно было менять.

Гомогенность полученного препарата доказана методом аналитического диск-электрофореза в 7,5^-ном ПААГ и в присутствии DS-Na в ICW ПААГ. Гомогенность препарата проверена также определением и-концевой аминогруппы, изрэлектрофскусированием и электронной микроскопной.

Била проведена очистка КА также из листьев однодольного растения пшеницы. Активность фермента в гомогенате листьев этого растения около 5 усл. единиц на I мг белка, что намного ниже активности обнаруженной в rouon-'ü.vi - листьев двудольного растения nyia (около 250 )ол. единиц на I мг белка). КА из листьев

- в -

ппенкцы для стабилизации такке требует наличия в среде выделения' сульфгидрилвосстанавливаюздх реагентов - дитиотрейтола или меркаптоэтанола. Однако ионная сила не играет существенной роли для стабилизации активности КА листьев пзеницы, как для подобного фермента из листьев нута, £ериен1 из листьев псеницы максимально стабилен при рН 8,^5.

После подбора оптимальных параметров среды выделения КА листьев паеницы ферментный экстракт подвергали дальнейшей очистке. Сначала фракционировали белки сульфатом атония (48-76£ от полного насыщения). Осадок, полученный после осагдения, растворяли в 0,05 Ы Трис- нех-буфере, рН 8,45, содержащем 0,01 и НаСХ, 0,02 К меркаптоэтанола, 0,С01 11 ЭДТА (буфер Б) и диализовалк против этого же буфера. Диализованний раствор центрифугировали 15 мин при 20000 в ■ и вносили в колонку (2,5 х 60 см) с ДЭЛЗ-целлюлозоя, ураоновеааииуо буфером Б. Белки злЕ'фовалп сначала этим хе буфером « затеи в линейном градиенте ИаСХ (0,01-С,С2 М). Обладпепио активностью фракции объединяли и подачргадв уль-трофрдьтрацки в атмосфере инергного газа через мембрану "Рипор-4-25*. Концентрированный раствор снова дколизоваля против буфера Б, центрифугировали-15 мин при 2СС00 е и вносили в колонку (2,5 х ЮС см) с сефадскссм с-200. Элсирование белков вели буфером 5. Обладавшие КА-активностью Фракций концеитрпровали уль-трофп'льтрацпеП, центрифугировали 15 юш при 2СОСО е 'и внос?ля в колонку с ДЭЛЗ-ТаЯоиолои 650 М, урав.човеганпую буфером £. Колонку промывали сначала этим буфером, а затек в градиенте КаСХ (0,01-0,1 и). Полученные активные фракции объединяли, концентрировали ультрафильтра®!ей и диализовадм против буфера Б. Двали-зозакный раствор белка центрифугировали 10 шн при 20000 б* Надосадочную кидкость насыщали сульфатом аммония (60^ от полного насыщения). Сухим Трисом рН раствора доводили до 8,^5 и хранили при -б0..

3 результате проведенной очистки получили вксокоочиценный препарат КА листьев паеницы. Выделенная КА, з отлкчяе о г подобного фермеата яэ листьев лута является зермолазильныи фернентоя. Хранение ферментного препарата при комнатной температуре со временем приводит к потере ахманостк, и зг сутки она поляпстью ; исчезав?. '

Гокии образом, нами бадк разработок методы получения гсиэ-генного препарата КА яз диотьев куга я втсохоочищекно'го гоопа-

- s -

para КА из листьев пшеницы.

3. Кристаллизация КА листьев нута

Растительная КА не была получена в кристаллическом виде до наших исследований.

Для кристаллизации КА листьев нута настенный сульфатом аммония раствор гомогенного фермента (2 мг/мл), полученного как описано выше, центрифугировали 15 мин при 10000 е - Осадок поело центрифугирования растворяли в 0,02 Ц H а^нго^-.ЧаХ^Ро^ -буфера СрН 7,1), содержащих 0,1 !i NaCl, 0,01 II дитиотрейтола и 0,001 11 ЗДТА< Раствор фермента снова центрифугировали 15 мин при 10000 g для освобождения от нерастворимых мелких частиц. Надосадочную • жидкость немедленно использовали для кристаллизации КА. Конечная концентрация белка в полученном растворе 10 мг/мл. В ка- . честве осадителя использовали сульфат аммония.

Исследуемая КА, как было вменено нами, обладает высоким содержанием SH-группы, и их блокирование, в частносш окисление, приводит к инактивации фермента. Более того, было установлено, что блокирование SH-группы сопровождается также необратимым распадом молекул фермента до неактивных мономеров. Поэтому традиционные способы кристаллизации белков (Целик-Адамян, 1975{ Гарбер, 1978), где имеется доступ кислорода к белку, были неэффективными для кристаллизации КА листьев нута. Поокольку в этих способах капля раствора фермента окружена воздухом, фермент, по-видимому, быстро окисляется, в результате чего образуются разные по степени окисления формы, что мешает кристаллизации белка. Кроме того, часть фермента выпадает в осадок в неактивной форме.

Более успешной оказалась кристаллизация КА в герметично закрытых тонкостенных капиллярах. Кристаллизацию проводили в капиллярах с внутренним диаметром около I мм. Раствор сульфата аммония и белка вводили в капилляр за счет втягивания капиллярными силами с такой последовательностью, что раствор КА находился между равными объемами 3,0 а раствора сульфата аммония. Раствор соли л белка отделались друг от друга маленьким пузырьком воздуха. Концы капилляра герметично запаивали пицеинои и оставляли при комнатной температуре. Диффузия растворителя между раствором белка и солевым pa£ г во pu происходила через газо-

образное состояние. Появление микрокристаллов НА наблюдалось через несколько дней.

Полученные кристаллы хорошо светятся в поляризованной свете я имеют форму четких четырехгранных призы с максимальными размерами 0,02 х 0,02 х 0,10 ми (рис. I). Кристаллы фермента обладают такой хе удельной активностью, кок и первоначальный фермент в растворе, л сохраняет эту активность в комнатной температуре в течение года» что указывает прежде всего на гомогенность используемого для кристаллизации препарата КА, а также на хоровую сохранность этого фермента в кристаллическом состоянии.

Рис. I. Кристаллы КА листьев нута.

В дальнейпем г цель® получения больгах кргсталлов КА, годных для рентгеноструятурного анализа, иы проводили многочисленные эксперименты. Однако нам не удалось достичь получения крупных кристаллов (0,3-0,5 ш) этого фермента, что является пред- . истом будущих исследований.

Такик образои, в результате проведенных исследования впервые нами получена кристаллическая КА растительного проксхогде-ЛЙЯ.

4. Основные физико-химические параметры КА

В различных растительных объектах молекулярная масса КА колеблется в ыироких пределах - 42000-27000 Да. У высших растения существует два типа фермента*, один с более высокой молекулярной массой, найденный у двудольных растений и второй - с более низкой молекулярной массой, найденный у однодольных растений. По сообщению разных авторов, исследовавших КА, выделенную из одного и того se, а такае из различных объектов исследования, молекулярная масса этого фермента у двудольных растений такхе варьирует в пироких пределах - 145000-27000 Да (Алиез, Гулиев, 1950} Roed , Gruhaa, 1981). Такое отклонение значения молекулярной массы КА у двудольных растения связано, по-видимому, с различием методов определения и видовыми особенностями исследованных растений.

В т/0Г!Щ!ХСЯ работах, в основной, придерживались мнения о тон, что КА двудольных растений является гексамерои, состоящим из идентичных мономеров.

Надо исследование показало, что молекулярная масса КА дзу-' дольного растения нута составляет 206000 В двнатурпрушцкс условиях в присутствии Ijf-ного 2-шгркалтозганола и без него молекула фермента распадается на идентичные полипептидные цепи с молекулярной массой оноло 26000 Да.

При ульграценгрпфугироваиия з градиенте плотности сагароза фермент седимантирует в зоне, соотвегствуэцеА В,95 Б. При гель-фильтрации через сефадекс G-200 КА листьев-нута злюкруется с ^колонки симметричным пикой, соответствующим белку с радиусом Стокса 5,1 ни на основании данных ультрацентрифугирования и гель-фильтрации га формулам, приведенным в работе Сгдаела и Нонту С Siegel, lionfcy, 1966) определено фрикционное отноыение молекулы КА, которое составляет 1,31. Исходя из этих данных, рассчитал такте коэффициент диффузии молекулы этого фермента равный 4, 15.

Количественное определение цинка а молекуле КА листьев нута 'методом атомной абсорбционной спектрофотометр:!;; показало, что на кавдый мономер фермента с молекулярной массой около 25000 Да приходится один атогг цинка.

Такм» образсг полученные кач? дапь-о спздетельотауат о том, что КА. листьев .иу.-г.^нога растения гута явллогся октамерои,

состоящим из идентичных субъединиц, каждая из которых содержит один атом цинка.

Обращает на себя внимание гот факт, что молекулярная масса КА двудольных растений, расчитанная на один атом цинка, соответствует молекулярной массе мономерного животного фермента и каждый мономер подобно животному ферменту, содержит I г-экв связанного иона цинка. Такое структурное сходство предполагает эволюционную общность происхождения и животных я растительных КА.

Молекулярная масса КА листьев однодольного растения плени-цы составляет около 55000 Да. В присутствии диссонирующих агентов фермент распадается на мономеры с молекулярной массой около 27000 Да.

Прг гель-фильтрации через сефадекс о-200 КА листьев пшеницы элюируется с колонки симметричным пикой, соответствующим белку со стоксовским радиусом 3,2 нм. Коэффициент диффузии, молекулы КА листьев паеницы равен 6,14.

Таким образом КА листьев однодольного растения пшеницы является димером, состоящим из идентичных субъединиц.

5. Аминокислотный состав КА

Препарат КА листьев нута представляет собой кислый белок с изоэлектрической точкой (р1), равной 5,55, что хорозо согласуется с аминокислотным составом фермента (табл. I). Кзо-электрическал точка КА листьев пшеницы практически совпадает с р! фермента листьев нута. Совпадение рТ КА листьев нута и паеницы очевидно указывает на схожесть аминокислотных составов этих ферментов.

Как видно из табл. I, КА листьев нута состоит из 242 аминокислотных остатков а о^лйчаетоя высоким содержанием аспара-гиновоп и глутпаановой кислот, глицина, серина, валияа и лейцина и низким содержанием аргинина, гисткдина и триптофана. Обращает на себя внимание ют факт, что КА лготьов нута в стлп-*чие от подобного фермента животного происхождения характеризуется высоким содержанием цистекна., {»ермент животного происхождения обладает одним остатком цистеина. Однако КА аз тигровой акулы, подобно растительному ферменту также имеет исключлтель-но зысокое содержание цистеииа (оах1»г , 1972).

Таблица. I

Аминокислотный состав КА листе 2п нута

Аминокислота Число остатков на мономер Аминокислота Число остатков на мономер

Лиз 16 Тро 12

Гис Сер 21

Apr 4 Гли 28

Асх .20 Ала 18

Глх 24 Вал 20

Про 8 Ило 8

Тир 8 Лея 20

&зн 16 Цис 5

Три' " I Ног 3

Суша аминокислотных остатков - 2'i2

Минимальная молекулярная марса - 25792 Да

Извастно, что ароматические аминокислоты очень важны для •нативной информации молекулы ферментов. Интересно, однако, что растительные и бактериальные фермзнш, так же как исследуемая нами КА, особенно отличаются низким содержанием триптофана. В то же вромя некоторые растительные КА, например, фермент пет-руски и нута относительно богаты фенилаланнновши остатками. Этим свойством обладает такае фермент аз тигровой акулы.

Дансильный метод определения н-концевнх аминокислотных остатков в белках ( Нее<11етап, 1970) не позволил обнаружить в Молекуле КА и-концевую аминокислоту. На основании этого сделан вывод об отсутствии в КА листьев нуга свободной Н-конце- • вой аминогруппы; она, скорее всего, блокирована и в частности может быть ацллироваиа.

б. Четвертичная структура КА ^

Четвертичную структуру ЙА листьев нута исследовали о применением метода электронной микроскопии белковых макромолекул. На полученных микрофотографиях наблюдались.преимущественно округлые частицы размером около 10 нм (рис. 2). Иногда у этих частиц бцли видны восемь наругат рпатупов, которые, как прави-

Рис. 2. Электронно-микроскопические изображения и модель молекулы КЛ листьев нута, a - обэдп вид препарата КА, негативно контр^стированного ураниладетатом (увел. 2,5х105)'| б, в - подборка отдельных молекул Кк (увел. 3,0xI05)j б - фронтальная проекция (вдоль оси ч-то порядка)} в нижнем ряду ^приведены изображения, усредненные фотс.иетодом поворотом на угол 90° (увел. '1,8x1o6)$ А-2 - частицы с которыми была .проведена операция {мс-сугивроьания - j Í - результирующая картина наложения .10 частищ в - боковая проекция (перпендикулярная оси Л-го порядка)»? правой' части рисунка показа а модель 8 ориентация*, соответствутдих приводенкьм проекциям • частиц.'

ло, сближены попарно. Такие изображения пзжно охарактеризовать вращательной симметрией. Для определения порядка оси поворота (п) и усиления основных деталей структуры, ввязанных с симметрией вращения, изображения ряда частиц была усреднены фотографически, наложением с поворотом на угол 360°/а вокруг центральной точки. В результате этой операции отчетливые картины, хорошо соответствующие исходный азобразвниян удалось получить при а ■ 4. При других значениях а , в частности, а » 3, они становятся раэштши и. сходство с оригиналом утрачивается. На картинах наложения отчетливо видны 8 выступов, сближенных попарно. Эти изображения ыошго охарактеризовать плоской группой симметрии 4а . Встречаются также частицы высотой около 7 ни, у которых видны две параллельные белковые полосы, разделенные контрастерои (рис. 2в).

Сравнивая полученные изображения, можно сделать вывод, что первый тип изображения (рис. 2б) соответствует фронтальной проекции молекулы (вдоль оси 4-го порядка), а второй (рис. 2в) бо- . косой проекции (перпендикулярной оси 4-го порядка). Вид боковой проекции указывает, что молекула иыеет двухслойную структуру*

С использованием указанных проекций колекулы была предло- • жена ее модель. В ней восемь субъединиц расположены с точечной группой симметрии 422 (Д^).по вершинам двух квадратов, повернутых друг относительно друга вокруг оси 4-го порядка. Диаметр молекулы равен около 10 ни, высота около 7 ни. Модель молекулы КА в двух ориентацаях, соответствующих фронтальной (рис. 2б) и боковой проекциям (рис. 2в) показана справа от микрофотографий. Рассчитанный объем субъединиц в предложенной модели составляет около 30 ни3 и соответствует молекулярноа массе около 30000 Да, что согласуется с молекулярной массой субъединиц определенной о другими методами.

Таким образок, полученные данные, однозначно указывают на то, что КА двудольного, растения нута является октаыером, состоящим из идентичных субъединиц.

7. Вторичная структура КА

Вторичная структура растительной КА практически не была исследована. •

На рис. 3 представлен спектр КД КА листьев нута в области

lb И Ь-t

Рис. 3. Спектры КД КА листьев нута в 0,01 К Ка2НТ0^-НвЕ2К)4 буфере, рН 7,0, при 20°С. Спектр КД в области 250-310 ны измерен в I см кювете при концентрации белка 1,1 кг/мл.

помещения пептидно а связи (188-250 -ни) а ароматических аминокислотных остатков'(250-310 вм). Спектр КД пептидных связей исследуемого нами фермента отличается от КА акулы ( Uaynaxd, OoleraB , 1971) значительно меньшей амплитудой i ЛЛ^гг'1»30 я ~ 2,8, соответственно) в бдихо к КА В из быка (lleloj et al., 1980).

В табл. 2 представлено процентное содергание аминокислотных остатков в 8-и основных элементах вторичной структуры КА листьев нута я RA С чвло'ввка ( Kabech, Sander, IS83), рассчитанное на основании спектра КД я рентгеяострухтурного анализа, соответственно.

Результаты nasax расечетов свидетельствует о ои&чктбльеом сходстве в структурной организации этгагдвух КА. Несмстрй на низкое содержание «^-спиралей, и значительное количество анти' параллельной £ -структуры КА. образуют сибюшшй ппреллег.ьнкй <*/Ji ддаен Хпо клаосдфЕкад!» Рйчардссиа) (BiohexJscn, l?ei). Суда.по5 сшктру КД (отсутствие варокор. отрицательное полосы)

Таблица 2

Процентное содержание аминокислотных остатков в элементах вторичной структуру КА

Объект Элементы вторичной структуры Z

et 3Ю At А то S R

КА листьев нута 10 ч е- <п см 9 7 13 27 100

КА С человека (КлЪбсЬ , Sauader, I9&3) 7 5 19 8 II I 18 31 100

Л - -спираль, 3jq - Зэд-спираль, ßa- антипараллельная ß -структура, ßn - параллельная JS -структура, Т3 - изгибы типа . Т3, TQ - остальные типы ^J-изгибов, S-S - повороти, R - нерегулярная структура.

КА листьев нута в области 250-310 нм (при 280 ни), фермент не содержит s-s-связей. $орма спектра КД в этой области определяется ароматичеокими аминокислотами и Zn, Как' известно, КА С человека также не содержит В-а-свяэеИ ( Kabeoh, Sander , 1983).

Таким образом, несмотря на значительные различия молекулярных масс растительных и человеческих КА, наблюдается определенное сходство в их вторичных структурах, что, по-видимому, обусловливается близкими аминокислотными последовательностями этих ферментов.

8. Триптический гидролиз КА

Ограниченный протеолиз белков в нативных условиях широко применяется для исследования структурных и функциональных свойств ряда ферментов (Алахов и др., 1977 j Heed et al. , 1975 ; Files , Weber , 1976 5 Twardowskl et al. , 1976} Panasento et al., 1976). В частности, он используется в качестве парвого этапа изучения первичной структуры ферментов с целью расцепления их на крупные фрагменты^

Проведенное нами исследование показало, что характер три-птического гидролиза нативной КА листьев нута не зависит от времени инкубации этого препарата. Фермент'частично гидролизу-ется и на злектрофореграше обнаруживаема Ч основные и 3 незначительные полосы, интенсивность которых практически не меня-

вхся с увеличением времени инкубации с трипсином. Это свидетельствует о ток, что иолекула исследуемого фермента упакована очень хоыпактно н доступные трипсину связи количественно не меняется в ходе реакции. Однако обработка КАсЛГНБ приводит к значительному изменении интенсивности полос, соответствующих продуктам гидролиза, в зависимости от времени инкубации с трипсином. Это объясняется тех, что при модификации БН-групп с ДТНБ молекула фермента несколько раскручивается и доступность трипсина к определенный связям увеличивается.

Термическая обработка (5 мин, 85°С, рН 8,3 в присутствие 0,1 U HaHCOjí) нативной и модифицярованнойеДГНБ КА значительно меняет характер расцепления этого фермента о трипсином. Это особенно проявляется для модифицярованноплДПБ фермента (рис. Ч).

Рис. Электрофорез, в Ш-ноц ПААГ в присутствии DS-Яа , продуктов триптического гидролиза термически обработанной (1,2) и кодифицированной о ДТНБ, эател термически обработанной (3,4) КА. 1,3 - SO мяк. 2,4 -120 юн инкубации '. о трипсинои.

i 2 з ' /У'."' ч • * ♦ -

'Таюш образом, SH-группы играют существенную роль в под-дарвишв ниткой toiaassijoB структуры KA листьев вута.-

9. Оульфгкдрильнае груши КА ' .'-у.

Как уаа щгьъънута характеризуется высоким .

.содержанием фс^вава^и^рвЪвачалышё яоеяедованвя показали, • 4To i¡aE!iiTi:i¡? i!0¿;.íi;sai0p ан-группы белков n-ХМБ в прксутст-

вии 10 мЫ дитиогрейтола ингибирует активность этого-фермента. Неочищенная КА бистро инактивируатся при хранении и добавлении бн -соединений (дитиотрейтола, меркаптоэтанола) приводит к эффективной стабилизации ферментативной активности.

В связи с зтнц подробное исследование реакционной способности и функциональной роли ен-групп КА представляло больной интерес. Дяя этого ферментный препарат КА листьев нуга предварительно освобождали от дитиотрейтола о гожощью гель-филмрации на колонке с сефадексои а -25.

Титрование зд-групп КА ЛТНБ (рис. 5) показало, -что з моле-ауле фермента доступно действию реагента б^ ей-группы, по торна по спорости модификации можно разделить на два типа. Число наиболее реакционноспособных ш-групп твтруоша в течение 10 мин ' равно приблизительно 35 в расчета на молекулу фермента. Остальные ге ш-группы менее реакционно способные л иг модификация '. завериается в течение 50 минут. В присутствии £3 Н мочевины всэ 64 БН-группы модифицируются в течение.8 ману*. При этом общее количество доступных к реагенту ЕЗ-групп на меняется (рио. 5).

Рис. 5. Кинетика модификации БН -групп КА с ДГНБ (Ю~3 И> в отсутствии (I) и в присутствии (2) 8 II мочевины. Концентрация фермента 1,92 .ИГ6 И.

Проведенные нами исследования показали, что КА листьев нуга не имеет дисульфидных связей, а число, содержащихся в его мономере зн-групп, равно' 8. При модификации с ДГНБ 8 бн -групп в молекула или одной бн-группы, в каадом мономере фермента происходит полная инактивация КА. Это свидетельствует о том, что, по крайней пере, одна бн-группа каждого мономера входит в активный центр фермента и участвует в проявлении каталитичес-

49 60 00

ВроМЯ, ВЕН.

кой активности.

Модификация БН-групп с ДГНБ и п-ХИБ является рН-зависи-мым (рис. 6). Ингибирующий эффект рН вше и ниже нейтральной зоны усиливается. Это объясняется тем, что в щелочной зоне рН бН-группы белка находятся в виде меркаптидного иона и легко реагируют с кодифицирующий агентом. Увеличение ингибирувщего эффекта в кислой зоне обусловлено, очевидно, действием модифицирующего агента на вн-групгш, освобождающиеся при развертывания молекулы белка в условиях низких значений рН. Обработка препарата КА мочевиной, которая приводят к развертыванию молекулы, также обусловливает увеличение ингибируюцего эффекта модифицирующего яй-группы агента.

Рис. б. Инактивация КА под дейотвием п-ХИБ (2.Ю-6 М) при различных рН. Время «н-кубади* с п-ХМБ 5 мин. Концентрация фермента ело-7 И.

1.9 »Д

7.0

ЙД>

Приведенные данные в целом указывают на то, что исследуемая КА обладает как доступными, так и экранированными зн-груть П8ми, погруженными внутрь молекулы фермента.

Слодует отмыить, ч*о во всех экспериментах в течение 3 часов после инактивации фермента модифицирующим агентом добавленном 10 цй дитиотрейтола полностью воссгаипэлиэч-тск исходник активность КЛ. Однако на более поздних стодаях янаг.тплац:«« Д1> тиотрейтол т восстанавливал активность ферм««те. Сто сазане с тем, чхо, как показали наши исследования, мэди,^к>лил ^-груяп обусловливает развертывание и в далькейази расщепление молекула фермента на мономеры. Всс эти результаты в цело« показкваэт, что БН-груцпц учаогауг.т также а поддержании катяЕНой структуры

О наличии зл-групп у КА однодольных растений сведения но [ло. Проведенные начи исследования о КА тас'тьев паеницы пока-яо, что наличие высог.ого содержания £Н-групп в ьмдекуло ферта является обцял сгойстеом КА дзудольных и однодольных чтений. У этих ферментов БН-группы выполняет сходные функции.

Таким образом, £я-групгш играют существенную роль в под-фжании натизной сгрустни я проявлении каталитической ахтив-1сти растительной КА.' БН-группц могут, по-видимому, непос-)дственно участвовать в связывании субстрата. В го яо1 вреия, 1льзя исключить возможность инактивации КА при блокировании мьфгадрильных групп, вследствие стерическше затруднений, воэ-нсагщих привязывании модифицирующего реагента. Возможно, :о модификация Ба-групп индуцирует небольшие конформационные шенения в области активного центра фермента, которые препят-:вувт связывание субстрата. Потеря ¡информационной подвижноо-I белковой глобулы также может приводить к инактивации КА, :о имеет место, например, при модификации существенных бн->упп лактатдегидрогеназы ( Но1Ъгоок ¿1; «1. , 1975).

10. Роль ионов цинка в функциоьировании КА

Проведенные исследования показали, что, подобно животному (рменту, цинк в молекуле растительной КА также прочно связан апоферментои. При диссоциации фермента в каждой мономере ос-1ется по одному атому цинка. Однако при диализе против 3 мМ -фенантролина (агент хелатирувдий гп2+ ) уменьшается содержа-!е цинка в молекуле фермента. Удаление цинка с помощью о-фе-1нтролина сильно зависит от температур« среды. С увеличением ггаературы среды удаление цинка ускоряется. Обработка фермен-1 мочевиной также облегчает удаление цинка с о-фенаятролиноы. изкий рН среды способствует выходу цинка из молекулы фермен-а. •

Блокирование зн-групп и ^последующий диализ против Трис-ес1 буфера не приводит к существенному уменьшению содержания инка в молекуле фермента. Это может свидетельствовать о том, то ББ-группы скорее не участвуют в связывании цинка. Однако бработка ХЕШ» и последующий диализ против 3 м11 о-фэиантроли-а ч течение 1С0 мин приводит к полной потере цинка в молеку-

ле КА. Это связано с тек, что, как показывают полученные нами данные, модификация БН-групп приводит к развертыванию молекул! фермента, увеличивается доступность о-фенантролина и к участку связывания цинка, что обусловливает удаление цинка.

Интересно отметить, что обработка фермента 3 цЦ диэтилпи-рокарбонатом (ДЭПК), агентом, модифицируем имидазольные группы гистидина, приводит к существенной утрате цинка. Это наводи! па мысль о том, что, очевидно, гистидин являемся лигаядом Яп2* Отметим, что в молокуле КА шекопптоЕЦих цинк координирован тр< на гистидиновимп остатками ( Кашиш оъ &1. , 1577).

Проведенные исследования показали, что удаление цинка из молекулы сопровождается утратой его каталитвчвсюй активности. Инактивация КА под действием о-фенантролина, так се как и удаление* цинка, сильно зависит ох температуры а рН среди. Ускорение инактивошш КА о-фенантролпном с увеличением температуры среды объясняется, по-видимому, повьиенвем скорости диссрци&цл: я его реажцяонноспособности о о-фонантролином. При цолоч вон рй, равном 8,0, о-фюнслтролиа практически ке влияет на активность КА в течение 200 сш, тогда как при рН 6 за это время фермент полностью пноктивирузтся (рве. 7). Это, очевидно, объя

Рис.. 7; Зависимость икактивг цва КА под действием о-фена* тр'олпна (ЗЛО-3 II) от рН сре •ды инкубация. Время кнкубку 200 шш. Концентрация ферме! та г^.НГ6 II.

вяется-сехсюрым развергиванвеи молекулы белка в условиях нуз хих значей«й рН. йочевяна .(1,8. И), развертывала^ молекула бе, ка, также приводит к увеличению ингиб^рущэго.эдикта о-ренан' троляна ^йр. В).-.Этк. ррэ'уль^аты а целой.указывают на тс, что участож,связывания'циика лежит.в малодоступном.района молекул

Рис. 8. Кинетика инактивации КА под действием о-фенангролина (З.Ю"3 U) в отсутствии (I) и в присутствии (2) 1,8 (J цоче-вшш. Концентрация фермента 2.10"^ М. Среда инкубации - буфер А.

Вдоя, ним.

Необходимо отметить, что при удалении цинка о-фенантролк-[ КА листьев нута немедленно выпадает в осадок. Это явление, наш взгляд, связано с тем, что при удалении цинка в молекуле происходят определенные конфориационные изменения, приводя-I к раскручивании гидрофобных остатков, скрывающихся в глуби-нативной белковой глобулы. Попытка реактивации апоферыента цобавлением цинка не увенчалась успехом. Это свидетельствует :оы, что как ухе сказано выпе, удаление цинка из шлекулы шенга сопровождается необратгашии изменениями, которые не шеходят у легко реактивируемой КА животнпх.'Апофериент жи-:ной КА также; не Обладает ферментативной активность», но ак-¡ируется га2+.

В литературе вопрос о механизме взаииодействия комплексо-тзувщих соединений с цеталлоферцеятгли является дискуссион- . I (Козлов, 1985). В случае КА листьев нута, на основании пробных исследований полно сделать- вызод, что инактивация фер-иа о-фенантролинои в условиях напего зкеперииента протекает через образование тройного неактивного комплекса ЕМе-о-фэ-1тролин, а через диссоциацию на неактивный апофериент и ион галла.-

Исследование действия о-фенантролина на активность КА од-цолыюго растения пшеницы показало, что,• подобно ферменту :тьев нута, участок связывания цинка лежит также в малодо-упноы районе молекулы КА листьев' пшеницы, к тому яо он проч-

тительной КА.

но связан с апоферментом и участвует в проявлении каталитической' активности.

Таким образом, полученные нами данные указывает на то, что цинк играет незаменимую роль в функционировании растительной КА. При удалении цинка происходят необратимые ¡информационные изменения в молекуле, приводяцие к инактивации этого фермента. Цинк находится с глубине молекулы растительной КА и прочно связан с апоферментом. Гистидин участвует в связывании «инка с апофермен-том. БН-группы не являются лигандами цинка, однако их модификация обуславливает ускорение инактивации КА о-фенантролином.

. II. Функционально важные аыинокисяотныо остатки КД

Нами показано, что рЕ КА листьев нута и паоницы составляет, примерно, 7,0. Близкое зиачонис.рК имеет только и-имидвзоль-иоз кольце гистидика. Исходя из этого, мы сделали предположение о наличии гистидина в активной участке исследуемых КА. Более того, при фотоокислекип ферментов в присутствии иетиленового синего наблюдалась полная потеря активности этих КА.

Для подтверждения -этого предположения нами исследована кинетика инактивации КА листьев нута под действием ДЭПК. Этокси-кзрОонялированке ниидазольных групп фермента ДЭПК при 7,0 приводят; £ -раэвчваючейс^ во срсыонЕ паактивашш КА (рис. 9).

1 ъ .и . 'г.."»^' |

'""А «а, ..ю * шк..

Рис, 9. Кинетика инактивации КА под действием различных концентраций ДЭПК. I - контроль, 2 - 10"э Ц, 3 - 2.10"3 И 4 - З.Ю"3 М, 5 - 1.10*3-И, 6 - 5.10"3 Ц ДЗПК. Концентра-цця фермента 2,4.10*"^ 55.' Среда инкубашш - буфер А.

Следует отметить, что полученные нами данные исключают воэ-иожноеть реакции этого реагента с £В-группгми, а такие лизином и тирозином исследуемой нами КА.

Обращает на себя внимание тот факт, что обработка с ДЬПК приводит к наругению четвертичной структуры КА, она расцепляется на тетрамер, димер и мономер. Это объясняется тем, что к.:ди-фикация ДЭПК гистидинового остатка КА, приводит к разрушения внутримолекулярного координационного соединения гистидгн-цинк. Удаленпе цинка как ужо отмечено, сопровождаете*. необратимыми изменениями в молекуле КА.

Тазпш образом, совокупность полученных результатов показывает, что гястидин входит в активный участок растительной КА. Участвуя в связывании цинка, он играет существенную роль в функционировании этого фермента.

2,3-бутандион, модифицирующий аргшшновый остаток балка при рН 0,0-8,5 несколько увеличивал активность КА листьев аута (примерно па 'iO-45-i). Это.увеличение, по-впдгаоиу, могло объяснять некоторыми происходящими информационными изменениями молекулы КА в результате модификации аргининового остатка. Следует Отметить, что подобное активирующее влияние 2,3-бутандгона наблюдалось также для КА II животных (cbowiddea et al. , 1984). Это one ¡раз подтверждает, что функционально ватные аминокислотные остатки аналогичных ферментов различных видов, как правило, сохраняются в процессе эволюции, тогда как замещение одного остатка другим считается доказательством его несуцественности для функции фермента. Поэтому, еозкожно, что все КА животного и растительного происхождения, в том число исследуемый нами фермент, могут быть продутом дивергентной эволюции.

12. Стабильность нативной структуры КА

Стабильность белка, т.е. способность сохранять биологические Функции в данных условиях (рН, температура, состав никроок-руження), является объективно? физико-хнмяческой характеристика макромолекулы л обусловлена г.ак структурой белка, так и прп-родоз его яза7модействия с микроокругением. Поэтому изучение влияния различия факторов анеаней среды на активность -и четвертичную стрртуру может дать существенную информацию о нативной структуре, а такаге о.природе езязвг, участвующих в стабилизации.

этой структуры КА.

Проведенные исследования показали, что гомогенный препарат КА в бидистиллироваиной воде при комнатной температуре сохраняет свор активность в течение 10 часов баз потери. Затеи активность фермента постепенно уменьшается. В фосфатном го буфере при рН 7,0 фермент сохраняет свое активность без потери в течение 20 часов. Добавление 5.10"11 Н ЭДТА в среду увеличивает срок 100£ сохранности активности КА до 30 часов, 0,005 К дитиотрей-тол увеличивает это время до 40 часов. При полной сохранности нативности КА общее количество БН-групп не меняется.'Однако с уменьшением активности-фермента уыеньпается и количество £Н-групп, титруемых ДТНБ. При полной потере активности общоо количество зн-групп в молекуле уменьиается на 12. В то ко время добавление дитиотрейтола не восстанавливало активности КА. Это, по-видимому, указывает на то, что при хранении, наряду с окислением БН-групп, происходят также другие изменения в иолекуле фермента, приводящие к потере его. активности.

Для выяснений природы связей., участвующих в стабилизации нативной структуры, мы исследовали влияние различных диссоциирующих агектов на'четвертичную структуру и активность КА листьев нута. Для того, чтобы полностью исключить подобные воздействия на молекулу фермента, обработку фермента проводили только в присутствии данного реагента растворенного в воде. Фермент также был растворен в бидистиллированной воде. После инкубации фермента в различных условиях в течение часа, был проведен диализ против 0,05 ^ Трис-вС1 буфера, рН 7,0 для удаления агента, использованного для обработки фермента. Затем определяли активность КА и анализировали сохранность ее четвертичной структуры с помощью диск-электрофореза.

Проведенные исследования показали, что молекула КА в нативной состоянии имеет очень уникальную, в то же время лабильную трехмерную структуру, нарушение которой приводит к потере активности. Четвертичная структура КА сохраняется при воздействии агенюв, нарушающих ионные и водородные взаимодействия (иочези-на, ИаС1 , ИвС12 ). В то же время она полностью нарушается вплоть до выпадения фериыдта а осадок хаотропным агентои , ккслотшл!, гуалидинхлоридои. Это позволяет предположить, что основной нклед в стабилизацию четвертичной структуры КА вносят гидрофобные взаимодействия.

Нативная КА листьев нута имеет относительно низкую изоэлек-' грическую точку, около 5,5. Это свидетельствует о той, что количество свободных карбоксильных групп на поверхности молекулы фермент превилачт количество свободных аминогрупп. Эти карбоксильные группы, по-видимому, вносят значительный вклад в поддержание третичной структуры КА. Именно поэтому протонироваета этпх групп при низких рН ведет г. наругошш нативной структуры фермента. Состояние поверхностных аминогрупп г.п играет значительной роли в стабилизации четвертичной структуры КА, о чем свидетельствует ее устойчивость к высоким значениям рН.

Полученные нами данные в целом показывают, что связи, участвующие в поддержании четвертичной структуры, локализованы з областях контакта полипептидных цепей КА, где находится гидрофобное ядро молекулы КА,'относительно зазренное от внесних воздействия. Этим объясняется сохранение октамеров в присутствии Юй-На при комнатной теапоратуре. Однако при высоких температурах в присутствии 0,135 сз-Иа в течении 5 шш, фермент распадается на моноиеры.

Таким образом, приведенные данные показывают, что в стабилизации функционально активной нативноп структуры КА участвуют различные связи, имеющиеся в молекуле фермента, однако основной вклад п поддержание четвертичной структуры вносят гидрофобное взаимодействие.

13. Кинетика реакции гид?атайии С02, катализируемой КА"

Изучение кинетики реакции гидратации СО^ показало, что КА лвстьев нута, подобно гявотноа КА, сильно катализирует огу реакцию. Линейность щ>ивой зависисости скорости реакции от концентрации субс~рата в координатах'Лайяуивера-Еерка свидетельствует, о том, что фермент субстратное взаимодействие осуществляется по механизму Иихаэлиса-Иэнтзя. ,

Для определения числа молекул субстрата, связаннцх с одной колекулой фзриента, использовали кривую Хилла. Наклон кривой Хилла для КА лвенеэ нута ра!тн 0,376. Это указывает на то, что КА листьев нута связывается с СОд в относеяии 1:1. Используя простейвуй модель, катализируемая-ф^риектои реакция гидратации СОо может с:«ь изображена следующим, образом! .

КТ к2

Н^О + соо + Е -1- Е - СО? —Е + н + нсо:

Получена Сольная информация при изучении зависимости кинетических параметров (Кд , ккат) от рН и концентрации буферных компонентов. Значения и к определены в области pli 6,2 до 8,8. Полученные резулыатц представлены в табл. 3.

В исследованных нами областях с увеличением рН к (» Kg) - число превращений фермент-субстратного комплекса за единицу времени увеличивается..

Таблица 3

Зависимость кинетических параметров реакции гидратации OOg, катализируемой КА листьев нута от рН и состава буфера * 2,4.10~J U

1 ' Буфер ' .РН • «а . "И' мг^.мин"1 î^.ïo-5^-1

Фосфатный« ' '6,2 25,00 28,57 0,99

<0,025 М) 6,4 , 14,20 25,00 0,87

6,6 10,00 25,00 0,87

6,8 . 8,30 ' 33,30 1,10

7,0 6,25 50,00 1,70

7,4 4,54 100,00 3,50

7,6 4,17 125,00 4,30

7,8 3,85 142,86 4,95

Вероваловый 7,7 3,33 III,II 3,90

(0,025 И) 8,0 3,33 ' 125,00 4,30 '

8,2 3,33 645,18 22,40

8,5 3,33 250,00 8,70

. 8,8 3,33 222,22 7,70

Зависимость К^ от рН различна в двух участках. При рН ниже 7,5 к* увеличивается при уменьшении рН, а при рН выше 7,5 ка практически не зависит от рН среды. Однако, как показали наши, исследования, при постоянном рН Кв возрастает с увеличением концентрации фосфатного буфера. Следовательно можно предполагать,

что ца сродство фермента оказывают влияние скорее буферные ком*

поненты нетели просто степени протонирования среды. Другими словаки фосфат способствует тому, что фермент связывает СО2 менее эффективно. С увеличением значения рй зтот эффект снижается. При экстраполяции * нули концентрации буфера к^ при низких рН, очевидно, не отличается от к^ при высоких рН, т.е. к^ постоянна (1,5 мИ) в интервале рН 6,4-7,8, Такое se постоянство Кд при изменении рН обнаружено у бычьего ( Kernohan, IS>65) и человеческого (Reed, Qrahaa , 1581) ферментов. Величина ^ для СО2 в реакции гидратации составляла: 15,5 мМ для бычьего фермента я 4 мН для человеческой ICA 0. Таким образом, сродство к С02 у КА листьев нута выше, чем у эритроцитарных КА. Однако на сродство фермента сильно влияет I^PO^J, который ингибирует связывания OOg ферментом. Ингибирование сильно выражено тогда, когда группа, отвечащая за активность находится в кислой форме. С увеличением рН ингибирование уменьшается.

На основании этих фактов можно предположить, что фосфаты могут играть регуляторную роль для растительной КА, подобно tomj как 2,3-дафосфоглицерат для гемоглобина ( Benesah R. , Beneach H.е., I96S). Действительно, органические фосфаты в процессе кар-боксилированяя при фотосинтезе могут сами обеспечивать регуляцию сродства к COj растительной КА.

Что'касается ^ - число оборотов КА листьев нута, то оно имеет максимальное значение а том случае, если группа, отвечаю-яая за активность фермента, находится в основном состоянии. Если отвечающая за активность групга находится в кислой форме, то величина г-2 ниже. Другими словами, к2 увеличивается с повышением рН реакционной среды. Максимальное значение для Kg ^ листьев нута в условиях наяего эксперимента 2,24.10°.с"1. Зеличгна составляет I06.c_I для бычьего феэагнтэ и 1,4.10^.с"1 для человеческого фрраента ( Reed , GraMo , 1981).

Проведанное нами исследование кинетики реакции гидратации С02, хагализируоиоЯ КА однодольного растения пленнцы показало, что фериэнт-субстратное взагиодепствие также осуществляется по механизму Михаэлисо-Яентен. КА листьев пизнгци также овязывается с СО^ в отнозения 1:1. Однако, полученные данные свидетельствуют о том, что К^ Iv\ пшеницы для COj, в отличие от подобного ф®риеи-та двудольно го растения кута, увеличивается с увелкчевлен рН s рег.каионно;: срздг (табл. 4). Виоore с тем, Ras и у КА листьев нуга, при постоянной рН Кд и vna„ возрастает с увеличение« кон-

ценграции фосфатного буфера.

Таблица 4

Влияние рН и состава буфера на кинетические параметры реакции гидратации С02, катализируемой КА листьев пиеницы

Буфер рн нН V . ммоль. аах'

Фосфатный . 7,0 1,11 2,76

(0,025 Ю 7,4 1,25 6,29

* 7,7 1,42 10,53

8,0 • 1,70 11,76

ВеропаловыИ 8,5 4,54 • 40,00

(0,025 Н) ' 9,0. ' 8,30 55,00

I 9,5 •8,30 55,00

На основании вышеизложенных данных, можно сказать, что каталитические свойства КА листьев однодольного, растения пшеницы, •в определенной степени отличаются от подобного фермента листьев двудольного растения нута,'что, очевидно, объясняется структурными особенностями этих ферментов. Однако оба эти фермента в условиях проведения эксперимента не проявляет аллостеричности к СО2. Фермент-субстратное взаимодействие осуществляется по механизму Цихаэлвса-Лентеи. Одна молекула субстрата связывается с каждой молекулой или с каждый активный участком молекулы фермента при условии, что зги участки не взаимодействуют друг с другом.

Хотя сродство КА листьев нута выше, чем у эритроцитарного, ее число оборотов при высоких рН имеет значения близкие к к^ эрнтроцитарных.ферментов. В целом, полученные данные дают основание предположить, что, по-видимому, основной механизм катализа иьхог ¡шеть место как в растительном, так и в эритроцитарном ферментах, но природа реагирующих групп и отдельные детали механизма могут отличаться. Как было отмечено, аминокислотный состав исследуемого нами фермента и КА из эритроцитов различается, кроме того, молекулярная масса КА из листьев нута по сравнению с атвм ферментом г 8 раз больие, что указывает'на возможность существований у растительного фермента более сложного ие-

хаиизма действия.

14. Кинетика реакции дегидратации НСО", катализируемой КА

Каждый из компонентов реакции, катализируемой КА, крайне важен для функционирования хлоропласта. В частности, бикарбо-натный ион выполняет функция регулятора в различных участках этого организма. Поэтому представляется очень вахныц подробное изучение кинетики реакции дегидратации бикарбоната, катализи-рувиой КА растений.

Катализ дегидратации НСО" КА листьев нута, очевидно, происходит по механизму Нихаэлиса-Ментен, на что указывает линейность ¡рафика зависимости 1АЭНЗ от 1/ЙСО". В наиболее упрощенном виде катализируемая ферментом реакция дегидратации бикарбоната иохет Сыть представлена по схеме Михаэлиса-Нентен:

ЕН ♦ НСО" ЕН НСО~ -- Е ♦ С02 ♦ Н^

Однонаправленное изменение «2 и ка под Действием рН обнаружено нами при изучении кинетики реакции дегидратации НСО", катализируемой КА листьев пута (табл. 5).

Таблица 5

Зааисмгость кинетических параметров реакции дегидратации НСО", катализируемой КА листьев нута, от рН.реакционной среды «1,49.10~8 Н

Фосфатный буфер, рН мИ ... Уаех, таль. мг^.иан-1 к2.10"5,с^>

1 И ; 4

6,2 10,87 18,52 0,64

6,» 25,32 33,41 ■ 1,33

6,6 43, ПО 53,£3 2,04

6,3 63 66,67 2,31.

7,0 , ■ Й 50.СС 1*2, Ш 4,95

7,2 142,65 . 100 ,со 3,47

7,4 125,00 ■ 66,67 2,31

Продолжение таблицы 5

7,6 7,8

62,50 52,63

33,33 28,57

1,16 0,99

Очевидно, буферные компоненты одновременно влияет на к2 и Изучение кинетики реакции дегидратации НС0~, катализируемой КА листьев нута в фосфатном буфере при постоянном pH, показало, что как Е^ , так и к2 увеличивается с ростом концентрации буфера.

Эти результаты можно сравнить с данными, полученными при «учении кинетики реакции гидратации С02, катализируемой КА листьев нута. Как уже отмечено, одноосновной фосфат Н2Р0^ уменьшает кажущееся сродство фермента к С02, тогда как при высоких |)Н двухосновный фосфат НР0^~ и другие основные буферные компоненты увеличивает число оборотов к2 для Ц02.

Обнаруженное влиян'ие на растительную КА неорганического фосфата представляет собой особый интерес. Из ряда полученных результатов очевЯдно, что буферные компоненты вовлекаются в перенос протонов ( Bocker , Uikscb , 1978). Аналогичный эффект наблюдался у КА эритроцитов ( Christiansen , liagid., 1970 ; Silverman , Tu, 1975, 1976, 1977 j Pockor , BJorkquist , 1977 j Pocker, Tanaka , 1978). Простыми механизмами объяснить полученные результаты нельзя, к тому же нет уверенности в том, что растительный фермент действует аналогично эритроцитарному. Для эритроцитарного фермента была выдвинута схема реакции, объясняющая наблюдаемый буферный эффект (Pocker , Tanaka , 1978). В будущем предстоит выяснить, подходит ли эта схема для растительного фермента. Каким бы не был этот механизм, в нем нужно принимать во внимание то,.что в строме хлоропластов фосфат является очень важным компонентом. Влияние фосфата на растительную КА ыо-жет иметь большое физиологическое значение.

В последнее время обсуждаются возможные механизмы регулярного действия КА, основанные на влиянии продуктов гидратации 00?(Н+, ECO") на функциональные компоненты хлоропласта. Возкож-

15. КА и фотохимические реакции хлоропластов

ность такого действия КА в определенной степени доказывается четкой световой зависимостью КА-активности и ее корреляцией с ходом световых кривых фотосинтеза (Семененхо и др., 1979) и с активностью реакции Хилла изолированных хлоропластов.

Из данных, полученных нами, прослеживается четкая световая зависимость КА-активностм и величины скорости реакции Хилла, обусловленная различной интенсивностью света при выращивания растений. У растений, выращенных при низкой освещенности, оба исследуемых показателя оказались значительно меньае, чем у растений, выраженных при высокой освещенности.

Перестановка выращиваемых растений со слабого света на сильный также вызывает увеличение как активности КА, так и реакции Хилла. Эти результаты свидетельствуют о наличии коррелятивной связи между активностью КА хлоропластов и скоростью транспорта слехтронов, о которой судили по активности реакции Хялла.

В дальнейшем яаии было показано, что экзогенный НСО" существенно влияет на скорость фотохимических реакций хлоропластов, выделенных из листьев нута. Однако величина эффекта зависит от способа предварительной обработки хлоропластов.

Результаты, приведенные па рис. 10, свндетедьствуют о том, что если к лишенным Н*70~ хлоропласта» добавляла экзогенный НСО", то полная реактивация выделения кислорода ямела место только в темноте. Реакционную среду, содержащую хлоропласт, освещали в течение 2 мин, затем добавляли 10 иЯ н&нсо, (кривая 4). После 3 ush темноты хлоропласты вное» освещали. При этом наблюдалось трехкратное увеличение скорости выделения кислорода, тогда как при добавлении НСО" х аналогичному образцу к моменту включения света (кривая 3) наблюдалось неполное восстановление кисдород-вмделяющеЯ активности хлоропластов. Последующий темновой период (3 мин) способствовал полному восстановлению активности ^Если же хлоропласта освецаяись в течение 30 с перед добавлением HOOJ (крлввк 2) и таким'же светом впоследствии, то кислородвн- ■ дедяг-ад способность незначительно прегыаала хонтрольную (без добавления НСО", кр::зая I). Только после прекрацзиая освещения ка 3 кин вновь на^д-v.ась полная ккслородяи'деляздая активность.

Причгдеян.чо л^ч.чч.е оовладеюг с данвьня о действии ЗС0~.яа скорость переноса электронов от акцептора Q х накопителю зарядов 3 й от .•■ - к. ллпстг/икоау' ( Jurainio et al. , I976$Siggel et al., 1Ь77 ( Steriler , } i'omajs , Gcvindjce , I9SL).

2 3 6 7 t

Вкм.нкн.

Рис. 10. Теиновое восстановление' выделения кислорода лишенных Н20~ изолированных хлорспластов из листьев нута.

I - без НаНСО^; 2 - ИаНСО^ добавляли через 30 с поело включения света \ 3 - ИаНСО^ добавляли к моменту включения света; 4 г НаНСО^ добавляли после первого освещения, стрелка вверх - включение света, стрелка вниз выключение света'

Для исследования взаимодействий между НСО" и накопителем зарядов В были изучены условия, необходимые для возникновения НСО" -зависимости на свету. Показано, что у хлоропластов, изолированных из листьев нута, выдержанных в темноте в течение .3 мин в отсутствие феррицианида, зависимость скорости выделения кислорода от экзогенного НСО" была заметной. При освещении же хлоропластов светол высокой интенсивности в течение 3 мин в присутствии феррицианида также наблюдается значительная НСО" -зависимость, которая проявляется слабее, когда хлоропласты освещаются светом высокой интенсивности в течение 3 мин в отсутствие окислителя Хилла.-Исходя из этих данных, можно предположить, что Н00~ высвобождается кз комплекса реакционного центра фотосисте- • ш II только тогда, когда осуществляется переход из одного состояния в другое. На основе приведенных здесь результатов и литературных данных ( stealer, IS79) можно сделать вывод, что участок связывания НСО", вероятно, лежит в малодоступной области тклакоидной мембраны. Можно думать также, что именно поэтому необходимы высокие, выражаемые в ыиллимолях концентрации НСО" для восстановления скорости переноса электронов.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что зкзогек- ■ ный HCOg существенно уменьшает светоиндуцированнне изменения выхода флуоресценции. Помимо того, он оказывал стимулирупцее действие и на фотсфосфорилируюцую активность хлоропластов.

Тахзм образе м, изложенные здесь результаты указывают на возможность участия КА в регуляции активности системы фотосинтетического электронного транспорта хлоропласта, ''ожно предположить, что в непосредственном осуществлении "бнкарбонатного эффекта" на систему транспорта электронов хлоропласта участвует форма КА, которая обнаружена в частицах тилакоидов и фотосистемы II ( Vaillaova et al., 1^82, 198<ц Stealer, 1986).

16. КА и PDJ-карбоксилаза

Известно; что РБ^-карбоксилазд локализована в строме хлоропластов я именно здесь включается подавляющая часть двуокиси углерода, фиксируемой С3-растенкями на свету. В растворе СО2 подвергается обратимой реакции гидратации, благодаря чему она в клетке может существовать в различных молекулярных формах. Вопрос о том, в какой форме используется С02, долгие годы оставался дискуссионным. Купер С сотр. ( Cooper et al. ,' 1969) проводили опыты с РБ£-карбоксилазой и пришли к выгоду, что в этой реакции яспользуетсл именно С02, а не бикарбонат. Напротив, в реакции, катализируемой }ЭП-карбоксилаэой, используется бикарбонат, а не С02.

До 1971 г. считалось, что концентрация С02, необходимая РБф-карбоксилазе, чтобы обеспечить известные скорости фотосинтеза в хлоропластах и ткчяях, сликкои высока. Поэтому было постулировано, что возможная связь КА с карбоксилазой должна быть э^ фектпвной в обеспечении более приемлемого^ для С02.

Получсмше нами результаты, свидетельствуют о согласованной работе ¡'А и РБТ-карбоксилазы в различных условиях существования растений. Взаимоотноаение этих ферментов в клетке обсуждается в литературе (Пронина, Сеченеяко, Зярус» 19SS; ïbineelot,

19721 Bird, et al. , 1914)). Одной кз зозможних фуякцяа растительно й КА является учютие этого фермента в подготовке негидратиро-ванной молекулы ОС?-субстраТа Р£$-карбоксилазы з tree-rax. карбок-силлрозяянг. Для проверки этой возможности нами бюга азучеио влияние экг.огенной высокоактивной КА на активность РБ?-кароокси-

лазы in vitra Высокоочищенные препараты КА и РБФ-карбоксилазы получены из листьев паеницы, которые не обладали, соответственно, карбоксилазной и КА-активностью.

Проведенные опыты похазали, что экзогенная КА стимулирует активность РБФ-карбоксилазы. С увеличениеи активности КА в реакционной среде увеличивается и активность РБ^-харбоксилазы. Однако посла определенного соотношения ахтивносгей этих ферментов, активность РБФ-карбоксилазы выходит на плато и дальнейяее увеличение активности КА в реакционной среде не увеличивает карбоксилазной активности при заданной концентрации НСС~.

На ряс. II представлена зависимость активности РБф-карбок-силазы от концентрации НСО" в отсутствии и присутствии КА в реакционной среде. Зависимость активности РБ$-карбоксилазы от концентрации ионов НС0~ в отсутствие Кл имеет некоторую s-образность, которая снижает« в присутствии КА. Коэффициенты кооперативное«! РБФ-карбоксилазы, рассчитанные по разностному методу Курганова (Курганов, 1975) составляли 1,28 и 1,18, соответственно в присутствии'« отсутствии КА» Обнаруженный эффект увеличения коэффициента кооперативное!« в присутствии КА объясняется увеличениём в реакционной среде концентрации негидратированного '^-субстрата РБф-карбохсилазы. - являющегося также аллостервчес-ким эффектором этого фермента ( Uiziorko , 1978).

50 75 100 125 .150

• [НСОЗ . хХ

Рис. II. Зависимость активности РБФ-карбоксила-зы от концентрации Н00~ в отсутствии (I) и в присутствии (2) КА в реакционной среде. Активность КА 232,5 ад. на I мл реакционной, среды.'

Таким образомt приведенные данные еще раз подтверждают об-

суждаеную в литературе роль растительной КА о той, что она, ускорял реакции дегидратации НСО" увеличивает концентрации СОд в местах карбоксилироЕания и тем самым способствует эффективной работе ^Б^карбоксилазц в клетке.

17. КА и продукционный процесс растений

КА в связи с продукционный процессом растений до наших исследований практически не была исследована. Проведенные нами исследования показывают, что у высокоурожайных сортов пшетшы интенсивного типа активность КА и РБ-5-карбоксилаэн с начала формирования флаговых листьев монотонно увеличивается, достигает своего максимума в фазе холопения и затем уменьшается до конца иегетадки (рис. 12). В отличие от этого, у высокоурожайной ппе-ницн экстенсивного типа активность этих двух ферментов несколько раньие достигает своего ааксиаума, затем падает.

{ г

$ и

I.'

5. *

г ^

и Я

« г

¿3

1* ■г?

а и

аи

л и

Рис. 12. Изменения активности КА (А) и РБ^-кзрбохсилазы (Б) в онтогенезе флагового листа генотипов пиеници. 1,2- низкорослые, высокоурожайные (Гарап1ЛЧЫг-2, Аэа-матлп), 3, 4--высокорослые, низкоурожайные (Севиндх, Сары бугда) сорта ппенгцы.

7 и !Я !> 11 37 41

АК! яки гкщи/иий »«ЛЛ39С* л/ста

Обрацаот на себя внимание тог факт, что и ходе развития флаговых листьев, активности КЛ и РБ^-карбоксклазы у исследованных высокоурожайных генотипов ппеницц изменяются параллельно, что может свидетельствовать о согласованной работе этих ферментов. У высокоурожайных генотипов ниеницы высокая активность КА и РБ1>-кар0окс1:лозы играет существенную роль ь поддержании ассимиляции СО2 на высоком уровне. Сопоставление результатов по исследованию ассимиляции С02 к активности КА и РБъ-карбоксилазы йоказывает, что судестиует тесная корреляция между интенсивностью ассимиляции С02 и активностью изученных ферментов. При этом высокоурожайные' генотипы шел и Солее высокие значения этих показателей; е отличие от низкоурожайных генотипов.

Следует отметить, что активность КА во всех элементах колоса у высокоурожайного генотипа также значительно превышала таковые у низкоурожайного генотипа. Однако тесно« корреляции между активностью РБ1—карбоксилазц и 11А, как это наблюдалось во флаговом листе этих же генотипов пшеницы, не во всех элементах .обнаруживали. Тем не менее сопоставление этих данных с данной, полученными при измерении активности этих ферментов в онтогенезе флаТоЕого листа этих хо генотипов пзеницы показывает, что резкое увеличение активности ферментов в элементах колоса, особенно в чешуе обоих генотипов пшеницы во времени совпадает со снижением активности во флаговом листе. Это показывает, что в фазе налива зерна, элементы колоса, особенно чешуи, активно участвуют в процессе ассимиляции 002.

Как показали полученные результаты, нарушение донорно-акцепторных отношений у различных генотипов пшеницы, удалением части колоса или нижних листьев, приводит к изменению как активности ферментов, так и скорости поступления метка в продукты фотосинтеза а их утилизации.

Спустя I день после удаления нихикх листьев у низкоурожайного генотипа Севикдк ваблвдалось значительное снижение активности КА, РЕ^-харбохсмазы п 43П-харбоксилазы флагового листа по сравнению с контрольным расгениеи. Б посяедукцко дне после удаленм.е., £л~палость этих, ферментов состоаннэ увеличивалась к дахс презосходила йктвшостг. ферментов, наблюдаемых у контрольных растенаЕ.

V высокоурожайного генотипа активность важеуказанных ферментов в перзые дни пасхе удакеься нкхкех листьев увеличивалась,

хотя в последующей активность ферментов умечьиаллсь я существенно не отличалась от контроля. Следует отметить, что активность КА и РБ^карбоксилазы в первые дни после удаления увеличивалась значительно, по сравнению с активностью РБ;-оксигенаэы и ФЛ1-карбокг.илазы.

Наблюдаемое нами изменение скорости включения ^''с в сахарозу и в глицин+серин после удаления нижних листьев, как у высокоурожайных, так и у низкоурожайных генотипов, носит противоположный характер.

Полученные результаты показали, что удаление части колоса у низкоурожайного генотипа Севиндж, приводит к снижению активности всех изученных ферментов. Тогда как у высокоурожайного генотипа это приводит к уменьшению активности только РБ5-карбокси-лаэы а 5ЭЛ-карбоксилазы. При этом активность КА и РБФ-оксигена-зы у опытных растений но уменьпалась, а, наоборот, несколько увеличивалась.

Для высокоурожайного генотипа при удалении части колоса характерно заметное снижение включения С в сахарозу и незначительное усиление включения метки в глицин+серин. Включение

в продукты гликолатного пути при искусственном изменении до-норно-акцепторных откопенкй согласуется с изменением активности фермента РК}-оксигенаэы.

У контрольных растений обоих генотипов взеницы соотношение актизкосте й РБ^карбоксилазн/?Б>-оксигенаэн остается, практически, неизменным Ари более продолжительном времени измерения. Значительное изменение соотношения активностей Р&5-карбоксила-за/РБ^-оксигеназы происходило только при нарушении донорно-ак-цепторных отношений удалением части полоса или листьев. Однако, обнаруженный характер изменения соотношения РБМсарбоксилазы/ /?1»5-окскге мзы у опатнкх растений но сохраняется во времЗ'-мсс-перкаента и наблюдается тенденция пряблихения его к значению, наблпдаомоуу у коя:роль:пгх растений. Следовательно, какдий генотип, по-г.;:д:5Моау, характеризуется определенным значением соот-когенпя РгЗ-карСокоплазы/Рг-^оксигенезм и изменение этого соотношение прк р':зл!!'шч:< ьсздойстеуях носят рремеяиыл характер.

Пр;!оод?н.":;п д--л¡':.ч свидетельствуют о том, что исследуемые

¿сруечта участвуют в адаптационных процессах, происходят* з

растениях ^'И раз/н'п-.'х условиях су:'|чйтвов1пит. У низкоурожайного зк?<.г.оуротл,*:".>го генотипа процесс ада'!тчцил к яозм»' уело-

виям существования имеет как общие, так и отличительные черты, обусловленные их генотипическими особенностями.

Таким образом, полученные нами результаты, свидетельствуют о том, что высокая активность исследуемых нами ферментов, в частности КА, наряду с другими факторами, способствует формиро-. ванию высокого урожая зерна у интенсивных генотипов пшеницы.

основные вшюда

1. По разработанной методике получен гомогенный препарат карбоангидразы (КА) листьев нута и высокоочищенный препарат КА листьев пшеницы. Впервые получена кристаллическая КА растительного происхождения. Кристаллы Ш листьев нута имеют форму четких четырехгранных призм.

2. Определен аминокислотный состав КА листьев нута. Фермент представляет собой кислый белок с иаоэлектрмческой точкой, равг ной 5,55. Он седиментирует в зоне соответствующий В,95' в , характеризуется стоковским радиусом 5,1 ни, фрикционным отношением 1,31 и коэффициентом диффузии 4,19. КА листьев пшеницы также является кислым белком с изоэлектрической точкой 5,5, характеризуется стоксовским радиусом 3,2 нм и коэффициентом диффузии 6,14.

3. Установлено, что КА листьев нута является октамером с молекулярной массой яколо 208000 Да, состоящим из идентичных субъединиц, каждая из которых содержит I атом цинка. КА листьев ншиницы является димером с молекулярной массой около 55000 Да, состоящим также из.идентичных субъедиииц.

4. Предложена молекулярная модель четвертичной структуры КА листьев нута. Согласно этой модели в молекуле КА восемь субъедиииц расположены с точечной группой симметрии 422 (Д^) по вер-иинам двух квадратов, повернутых друг относительно друга вокруг оси 4-го порядка. •

5. Методом кругового дихроизма исследована вторичная структура КА листьев нута. Определены процентные содержания аминокислотных- остатков в 8-и основных.элементах вторичной структуры. Обнаружено значительное сходство в структурной организации исследуемого фермента и КА С человека.

6. Установлено, что.наличие большого количества БН-групп

в молекуле является,общим свойством для исследованных растительна! 1Ц. и за-группы, играют существенную роль в каталитическом

акте, а такте а поддержании структурной целостности ^тих фермой--гов. КА листьсз нута облает 64 БН-группами. Около 35 зн-группа доступны и легко реагируют с т;толоезм'^и реагентами, остальные экранированы. В молекуле этого фермента отсутствует дясульфидные СВЛ3 1. Выявлено, что по крайней мере одна зн-группа каждого мономера зходкт в активный центр фермента.

7. Выяснено, что участок связывания цинка лежит в малодоступном районе молекулы исследуемых КА и прочно связан с апофер-ыентом. Гистидкя участвует в связывании цинка с апоферментон. Наличие цинка в молекуле КА необходимо для проявления каталитической активное!".!. При удалении цинка происходят необратимые информационные изменения, приводящие к инактивации этого фермента.

В. Проведенные исследования показывают, что в стабилизации функционально активной нативной структур» КА листьев нута участвуют различнке связи, мгег:цкеся в молекуле фермента, однако основной вклад в поддержание четвертичной структуры вносит гидрофобное вэзииодеПетрйс.

5. Полученные долине свидетельствуют о том, что кат&тиги-чоские свойства КА однодольного растения пзеницц в определенной степени отличается от подобного фермента двудольного растения нута, очевидно, обуслозлнв.оЕгнеся структурны?.'!: особенностями этих ферментов. Однако оба эти фермента в условиях проведения эксперимента не проявляют здлостерачность к СО.,, <;~риент-суб-стратное взаимодействие осуществляется по механизму Махаэлиса-Уентен. Одна молекула СО^ ездзавается с каждой молекулой или с каждым активным участком молекулы фермента при условии, что эти участки не взаимодействуют друг с другой.

10. Полученные результаты ухаэнвают на возможность участия КА в регуляции активности системы фотосинтотачесгого электронного транспорта хлоропласта.

11. Показано, что а различных условиях существования расте-яя1 зктив!<ость КА и РК~карбсксилазх изменяется параллельно,

что может сгидетельстсовать о согласованной работе ззпх феэмея-тоз. КА способствует эффекта-мои ргбо»,е.?1>5-карбскейла5н путем уя?лйчС1п:г концентрации 30% в местах кьрбокеяллроязявя.

12. .Выявлено, что фергеяш КА, РБУ:'1), а таксе 5Ш-харбокси-

гт в ^■шт.да'знягх процессах растения. " лизмуро-зигяото х ? .созгоупояайгого п/ютила процесс «дг.птгцял к неям

условиям существования имеет как общие, ток и отличительные черты, обусловленные их генотипическими особенностями

13. Получены результаты, свидетельствующие о том, что высокая активность КА, РБ5К0 и фШ-карбоксилазн наряду с другими факторами способствует формированию высокого урожая зерна у интенсивных генотипов пденицл.

14. В целом, проведанные исследования показывают, что диссоциация молекулы фермента ка неактивные мономеры, блокирование его SH-группы, в частности окисление, фосфаты, а также интенсивность света при выращивании растений могут играть важную роль в регуляции растительной КА в клетке.

СПИСОК РАЮТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алиев Д.А., Гулиев Н.М., Аэиэов И.В. О взаимосвязи карбоан-гидразной и фотохимических реакций хлоропласгов листьев ну! та //Докл. АН АзССР._ - 1981. г- Т.37, » I. - С.63-66-.

2. Алиев Д.А., Гулиев H.H., Казибекова Э.Г., Азизов И.В., Наме-дов Т.Г. Карбоангидраза листьев нута и сопряжение ее активности k фотохимическими реакциями в хлоропластах //Тез.докл. ХП Менделеевск. съезда по общ. и прикладн. химии. - П., 1981. - К 2. -'C.III'.

3. Алиев Д.А., Гулиев H.H., Мамедов Т.Г., Халилов Х.Д. Некоторые физико-химические свойства карбоангидразы листьев нута //Тез. докл. I Биофиз. съезда. - М., 1982. - T.I. - С.132.

4. Алиев Д.А., Гулиев H.U., Маиедов Т.Г. Выделение и свойства карбоангидразц листьев нута //Докл. АН АэССР. - 1983. -

Т.39, К 5. - С.54-58.

5. Алиев Д.А., Гулиев Н.И., Казибекова Э.Г., Ыамедов Т.Г., Азизов И.В. Карбоангидраза листьев нута //Тез. докл. Кежду-¡¡sp. сиыпоэ. "Регуляция метаболизма первичных и вторичных продуктов фотосинтеза". -Пущино, 1983. - С. 15-16.

6. Гулиев H.H., Азизов И.В., Мамедов Т.Г. Карбоангидразная реакция и кислородвыделяющая активность хлоропласгов высших растений //Тез. докл. Всесоюзн. .конф. "фотосинтетическое выделение кислорода". - Пущино, 1983. - С.9.

7. Гулиев Н.К., Намедов Т.Г. Влияние факторов внешней среды на харбоакгидразную и фотосинтетическую активность хлороплас-тов листьев нута //Тез. докл. УП Ьотаничес. съезда. - Ленин-

- Hl -

град, 1983. - 0.338.

8. Алиев Д.А., Гулиев K.M., Аэипов И.В. Влияние иона биг.арбо-натд на активность фотохимичоских реакций изолированных хлорооластов из листьев нута //Хокл. АН АзССР, 1584. - Т. <Ю, № 8. - 0.73-78.

S. Алиев i.A., Гуливв Н.К., Мамедов Т.Г. Субъединичный состав и своСотва харбоангидрпэн листьев нута //Тез. докл. 16-ой конференц. ЯГО. - М., 1984. - 0.254.

10. Алиев i.A., Гулиев H.a., Каэябекова З.Г., Азизов Й.В., Кур-банов К.Б. Карбоамгидразная реажцкя я функциональная актчв-ностъ глсроплпстов знсяих растений //Материалы Bcscoioo. совея. с участием иностранных ученых "Кинетика фотосинтет. иотабслисыа углерода в Сурастениях". - Таллинн! Валгус, 1935. - Т.2. - С.50-55.

11. Guliov Я.К., Honedov T.G., Aliov J.A. Carbonic anhydraae fron Cicer aristinun Леауез» Pfcyoical-cbecilcal and cataly-tlcal properties //Abstr. 13til Intern. Congr. Biochemistry. Intem. Cocgreoccntrua Rai Aiisterdan the Netherlands, 19S5-150-151.

12. Гулиев H.a., Узисдоа Т.Г., Алаев Д.А. Субьедяяачная структура клрбопагядразы лг»стьез ну7а //Ъял. АН СССР. - 1985. T.28Ö. - С.1^66-1468,

13. Гулиев H.a., Пдаятов Р.Б., Алиев i.A. Кзрбоакгидраза и карбоксклирулзие ферменты у генотипов пиеницы //Тез. докл. BCOCOD3. скмпоз. "Связь метаболизма углерода ? азота при фотосинТ'323". - Пузкно, 1985. - С.94-95.

14. Гул лез H.U., Керимоз С.Х., Хгангироз A.A., Идаятоп Р.Б., Алиев i.A. Актиенсси ферментов фотосинтеза и интенсивность ассимиляции СОд у генотипов меницы //Тез. докл. Всесопэ. синпсз. "Элементы газообмена листа и целого растения и их-рзменечкя ü онтогенеза". - Лузине, 1585. - С.15-16.

15. Алиел Д.А., мупрун В.Л., Гулиев H.H., Мамедов Т.Г. О чет- -вертячкой структуре к^Ссанггдрпзг; дяетьеэ двудольного растения OiBcr arieSinira /ДЪкл. АН СССР. - ISS5. - 'Т.285. -С. 1473-1^75.

Го. Ахиез .А., Гу;,,'сп K.M., '{.ихедоа 7.Г. ':5П;:та-хи;лгческ:!Э и Кйт.гтггчевхге свойства яарбоангялразы лгетьев нута //Тез. Л;г.':. У Зсрсевэ, Г/Ггхим. съезда. - Наук?., 1S85. - Т.2.

- t*t -

17. Alifcv J.A., Guliev If .M., Tsupruu Y.L. The quatemary structure ai carbonic aiihjdrase frota Cicer arietluua leavea //Abstr- 1?th FbBS Ueeting. Weot Berlin, 1уЬ6. - P.277.

18. Щщедоь 1.Г., Гулиев ii.U., Алиев l.A. Кинетика реакции гидратации COjji катализируемой карСоангидразой листьев нута // Известия.АН АзССР. серия биол. наук. '- 1986. - fc 6. -

• С.3-10.

IS. Алиев Д.А., Гулиев Н.М., Мамедов Г.Г., Цупруи B.JI. Физико-химические свойства и четвертичная структура карбоангидра-зн листьев аута //Биохимия. - 1986. - Т.51, KII.- С.1785-1794.

20. Гулиев H.11., Каиедов Т.Г., Юсифов Э.Ф., Еайрамов li.a., Алиев Д.А. Кристаллизация карбоангидразы листьев Cicer arietl-пша //Известия Ail As'JC,'?, серия оиол. наук. - 1987. - ft 4.

- 0.3-6.

21. Керимов G.X., Гулиев НЛ., Кдаятов Р.Б., Джангиров А.А. Фотосинтетический метаболизм углерода у различных генотипов пвенкци //Труды Бсесоюз. межуниверситетской конференции "Биохимия клетки", посвященной 70 летнв Великого Октября. -Тбилиси, 1987. - С.210-21I.

22. Алиев Д.А., Керимов С.Х., Гулиев Н.М., Дхаягиров А.А., Ида-ятов Р.Б. Ассимиляция С02 и метаболизм углерода у различных генотипов пыеницк различного экологического происхождения //'Тез. докл. УШ делегате, съезда Всесоюз. ботанического общества. В сб. "Актуальные вопроси ботаники в CC3PÏ - Алма-Ата, 1988. - С.462-463.

23. Байрамов K.U., Гулиев Н.М. Кристаллическая карооангидраза растительного происхождения //В сб. Труды конференции молодых ученых, посвяценной 70-летию ЗЛКСМ. - Баку, 1988. - С.5.

24. Идаятоь Р.Б., Гулиев Н.Ы.,Выделение и некоторые физико-хи-иичеекка параметра карбоангидразы лкстьев пшеницы //В сб. Труды конференции молодых ученых, посвященной 70-летию ВШСМ

- Баку, 1988. - С.8.

25. Керимов С.Х., Кдаятов Р.Б.,-Гулиев H.U. Метаболизм углерода при нарушениях донорно-ахцепторных отношений у различных генотипов пшеницы //В сб. Труды конференции молодых ученых, посвященной 70-летию ВЛКСЫ. - Баку, 1988. - C.I0.

26. Алаев Д.А., Гулиов H.U., Керимов С.Х., йдаатов PiE. Ферменты первичного акцептирования СО о в онтогенезе флагового

листа генотипов ппеницы //Известия АН АэЯСР, сер. биол. наук. - 1968. - » П. - С .12-20.

27. Алиев Л.А., Керимов С.Х., Гулиев H.H., Идаятов Р.Б. Об активности фериентов первичной ассимиляции CCg в элементах колгса разлитых генотипов пяоници //Известия Ali АзССР, серия биол. наук. - 1989. - * 2. - С.3-9.

28. Guliev U.U., Manedov T.G., Bajraoov Sh.U., Allev J.A.. Struc-trural-functional organization of carbonic anhjtlxaee from Cicer arietinun leaves //Abatr. 19th FKBO вувр. Italy, Rome, 1989. TH-116.

29. Алиев Л.А., Гулиев H.'J., Идаятов P.Б. Выделение и некоторые свойства карбоангидрази из листьев пиеницн //Известия АН АзССР, серия биол. наук. - I9S9. - » 5. - С.15-29.

30. Гулиев H.H., Байрамов 13.П., Халыг-заде U.H., Идаятов Р.Б., Маыедов Т.Г., Алиев Д.А. Молекулярная.организация а функциональная активность карбоангидрази высеих растений //В сб. Тез. докл. П съезда Всесовз. общества физиалогов растений. -аинск, 1990. - С.27.

31. Алиев Д.А*, Гуляев Н.Ц. Карбоангидраэа растений //Иг Наука,

• 1990. - 175 с.

32. Гу/.иез H.H., ГаПргшов ¡З.Н., Халыг-заде 'J.H.,'"даятов Р.Б., Алиев Л.А. Структура, свойства и возможная физиологическая роль карбоангидрази вуспшх растений //В сб. I респуб. био-химич. конференции. - Баку, 1990. - С.52-53.

33. БаЯранов U.U., Гулиев !1.!Ь Роль цинка в функционирования карбоангидрази листьев нута //3 сб. И респуб. конферея. "Упкроэлеиенш в сельском хозяйстве и медицине". - Баку, 1991. - 3.92.

34. Алиев Д.А., Керлков С.Х., Гулиев H.Ü., Ахмедов A.A. Особенности игтаболиэма углерода 'у генотипов пшеница, контрастных по фотосинтетическим признакам //¿иэнологая растения, 1992. - * 3 (о печати).

35. Гулиев H.H., Байрлыгов И.Л., Алиев Д.А. ?уякцкональная организация .тарбоаяглдряэм высших растений //Физиология расто-HfiJ!, 1992. - Ä 3 (в печати).

Информация о работе

Гулиев, Новруз Магамед оглы
доктора биологических наук
Тбилиси, 1992
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы