Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Каналоформерные белки транспорта двухвалентных ионов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Каналоформерные белки транспорта двухвалентных ионов"

Р Г Б ффЕЫИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОНШШ

2 7 ФЕ8 г:

л

На правах рукописи УЖ 577.23.352.6.3558.03:577.37

БЕСПАДЛО ЛАДЕЯДА ВАШШЮЗНА

!ШШ05СШЕР1Ш Шй

транспорта двшлхгнткых конов

03.00.02 - Сиофиэика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 1994

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУэ

Научный руководитель: кандидат биологических наук

а. М. МАХЫ.УДОВА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В. И. ЖАКОВ,

кандидат биологических наук П. Г. МЕРЗЛЯК

Ведущая организация: Кафедра биофизики ТагГУ

Защита диссертации состоится "¿O'c>¿£,uuu 1995 года б_часов

на заседании Специализированного совета Д 015.01.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу; 700095,Ташкент ул.Ниязова 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Физиологии и бмофизики АН РУэ Автореферат разослан "ÍQ. "ЛН-б'ф/ 199i^r.

Ученый секретарь

Специализированного г\ //■"■■ .

Совета, д.б.н.,профессор . э.С.Махмудов

t «

Актуальность проблемы. К концу 70-х годов стало накапливаться достаточно экспериментальных данных, дающих возможность рассматривать транспорт Са2+ череа митохондриальную мембрану как "цикл" входа и выхода* регулирующий меточный го-меостаз. Исследования индуцирования ионами Са2+ "ортодоксальной" и "агрегированной" форм матрикса привели к предположению о соответствии их "переходным" состояниям проницаемости, колебательному режиму функционирования митохондрий, наблюдаемому in vitro. В соответствии с этим одиночные "всплески" в кинетике аккумуляции Са2+ и Sr2+, являющиеся начальной фазой затухающих колебаний можно рассматривать как "мини' циклы". Колеба-тёльный характер функционирования митохондрий может обеспечиваться гидрофильной порой, пронизывающей внутреннюю мембрану, регулируемой со стороны матрикса ионами Са2+, а также редокс-состоянием пиридиндинуклеотидов '(Hunter,Haworth»1979). Возможность обеспечения как колебательного режима транспорта Са2+, так и "переходных" состояний проницаемости открыванием и закрыванием гидрофильной поры была недавно продемонстрирована на митохондриях асцитной опухоли Эрлиха (Evtodlénko ét al., 1994). Однако, если колебательный режим .'аккумуляции двухвалентных катионов митохондриями нормальной ткани лучше всего проявляется при транспорте Sr2+, "переходные" состояния проницаемости этих органелл индуцируются только Са2+, но не Sr2+. Ионы стронция даже блокируют эту проницаемость, по-видимому* закрывая гидрофильный канал (Saris,Bernardl,1983).

Представление о том, что транспорт ионов в митохондрии, также как и в клетку, осуществляется с помощью каналов или мембранных пор, стало весьма прочным. Этому способствовала возможность применения техники регистрации флуктуации токов проводимости как на нативной мембране, так и на модельных системах, реконструированных мембранными компонентами. В частности, были зарегистрированы АТР-чувствительные одиночные каналы калиевой проводимости на мембранах митопластов (Inone et al.,1994)/ Индуцированные флуктуации токов проводимости наблюдались при встраивании в бислойные липидные мембраны (БЛМ) компонентов, выделенных из внесших (Scheln et al.,1976) и внутренних мембран митохондрий (Проиевич и др.,1983,Махмудова и др., 1983).

• - 2 - ■ . , Известные в настоящее вреыя ммтохондркадъные каналоформе-ры-гликопротеины, отличающиеся по составу.молекулярной массе, чувствительности к ингибиторам транспорта, ионной селективности. . '

Целью настоящей работы являлось: 1. Выделение митохондриадьного гликопептида. содержащего нукде-отидную составляющую, исследование его свойств. . -.2.Выделение Из бурой водоросли Cystoselra barbata мембранной компоненты, участвующей в процессеизбирательной аккумуляции ионов стронция, и исследование ее свойств.

Основные задачи исследования быди следующие:

1. Очистка белков, определение их молекулярных масс.

2. Исследование физико- химических, каналоформерных и флуоресцентных характеристик мйтохондриального гликопептида.

3. Исследование физико-химических и каналоформерных свойств мембранного белка водоросли. . .

Научная новизна работы. Из внутренних мембран митохондрий печени крыс выделен нивкомолекулярный каналоформер (м.м.3000 Да) индивидуальный гллхопепгид, содержащий 2-3 молекулы NADP.

Из водорастворимой; мембранной фракции, бурой водоросли Cystoselra barbata выделен нивкомолекулярный канадоформер. обладающий высокой Sr^VCa2* селективностью (м.м.БООО-10000 Да, Sr2VCa2* избирательность- 7)

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 3 конференции биохимиков Ср.Азии и Казахстана (Душанбе,1981), I Всесоюзном биофизическом сгеаде (Москва,1982), Ш Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Таокент,1983), VI конференции по спектроскопии полимеров (Харьков,1988), IV съезде физиологов Узбекистана (Ташкент, 1988).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и Б тезисов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и- методов, изложения полученных результатов и юс обсуждение, выводов и списка цитируемой литератур (200 ссылок). Работа изложена на 1С? страницах, включая 3 таблицы и 21 рисунок.

t Материалы и методы исследования.

Выделение митохондриадьного каналоформера

■ - 3 .. ' - ' '

Митохондрии из печени крыс-самцов линии "В'истар" выделяли по общепринятым схемам. "Тени" митохондрий получали по методу (Lehnlr¡¿er, 1971). Осадек"теней" митохондрий обрабатывали ацетоном и высушивали под вакуумом. Полученный порошок суспендировали в бидистиллированной воде, в присутствии.О.61 мг/мл дити-отреитола и 0,001 мл/мл спиртового раствора ионола (100мг/л). Суспензию после центрифугирования пропускали через колонку с сефадексои 3-100. Второй пик.сблад&ювдй мембранной активностью хроматографировали на колонке с сефадексом G-10 (70x2см). При элшровании 5 мМ трис-HCI буфером (или 5 Ш ацетатным буфером) рН 7,5 мембранный компонент разделялся на 4 фракции. Мембранной активностью обладала 3 фракция.

Выделение белкового каналоформера водоросли.

Свежие водоросли растирали в агатовой ступке в 100 мл холодной среды выделения, содержащей 0,3 М сахарозу, 0,01 М трис-HCI буфер рН 7,5 и осаждали 90Z холодным ацетоном. Высушенный досуха осадок экстрагировали бидистиллированной водой в присутствии 0,61 мг/мл дитиотреитола и 0,001 мл/мл спиртового раствора (100 мг/мл) ионола, при постоянном перемешивании в течение 12 часов. Супернатант. пссле центрифугирования пропускали через колонку с сефадексом G-25.(Элюирующий раствор содержал 150 мМ трис-HCI рН 7,5) а затем - через колонку с сефадексом G-15 (50x2 см).

Фосфолипиды, используемые для получения БЛМ, выделяли из белого вещества мозга быка по методу Фолча и . др. (Folch at al, 1957). БЛМ получали по методу Миллера с соайт. (Mueller et ai.,1562,1963) наслаиванием фосфолипидоз на отверстие диаметром 1 мм в тефлоновой ячейке, погруженной- в стеклянный стакан. Оба сосуда наполняли 25 мМ трис-HCI буфером-рН 7,2. Электрическое сопротивление БЛМ измеряли при помощи хлорсеребряных _ электродов с агаровыми мостиками, заполненными 3 М HCI. Падение напряжения на БЛМ регистрировали электрометром 0П-105.

Для регистрации индуцированных- скачков тока проводимости использовалась техника изучения одиночных, каналов в режиме фиксаций напряжения с помощью электрометрического усилителя V 1-7, ток измеряли-с помощью регистратора КСП-4И. Диаметр отверстия в тефлоновой .ячейке - 0,3 мм.

Диск-электрофорез проводили: в 7Z полиакриламодном геле, который окрашивлй в 0,252 растворе Cumassi brilliant blu 6-250

Углеводы определяли по методу (Dubols et.al. ,1956). Отсутствие фосфолипидов было установлено методом тонкослойной хроматографии^ Молекулярная масса была определена по методу Вебера и Осборна (Weber,0sborn,1969). Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lov»ry et.al., 1951). Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Uvicord Karl Zeiss Jena (ГДР).

Спектрофлуориметрические исследования проводились на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi 203, выведенном на самописец КСП-4. Спектры флуоресценции и спектры возбуждения флуоресценции измеряли на флуоресцентном спектрофотометре модели "Hitachi" 203 и спектрофлуориметре, сконструированном по традиционной блок-схеме с наблюдением под углом 90° к направлению пучка возбуждающего света (возбуждающий монохроматор СРМ-2, Cari Zeiss Лепа.ГДР, аналитический монохроматор ЫДР-2 "Ломо", усилитель 0Р-201/2 "Radelkls" ВНР, самописец КСП-4) с применением ртутной лампы среднего давления мощностью 150 вт.

Спектры флуоресценции исправляли на спектральную чувствительность регистрирующей системы флуориметров. Спектры возбуждения гликопептида такой обработке не подвергали, а сравнивали со спектрами' в ээбуадения водных растворов NAD,NADH,NADP,NADPH . . Восстано!дение нуклеотида в составе гликопептида проводили с помощью ферментной.системы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6РД) - глюкозо-6-фосфат (Г6Р). Нативный препарат инкубировали 6 минут при 25 С с 10 мМ трис-HCI, 4 мЫ Г6Р и 5 мкг Г6РД по - методу (Morelll et al.,1972), á также подвергали действию этой ферментной системы после экстрагирования окисленных форм в кислой среде (0,5 N НСЮ4) по методу, описанному (Методы биохимических исследований под ред. Прохоровой,1982).

Обработка гликопептида ферментной системой алкогольдегид-рогеназа-этанол (АДГ), а также лактатдегидрогеназа-пируват (ЛДГ) проводились по методу ЕК}денфрезд.1965).

Аминокислотный состав п лкогептида определяли на аминокислотном анализаторе "Бекман', состав был подтвержден на препаратах, полученных в процессе трех различных выделений.

Влияние стронциевого каналоформера на секрецию медиатора было исследовано на изолированных нервно-мышечных препаратах портнакной мышцы . лягушки Rana temporaria при температуре 22°-24°С. Спонтанно возникающие миниатюрные потенциалы конце-

вой пластинки (ШКП) и мембранный потенциал покоя (ШГО) мыше--чных волокон регистрировали по методике (Мирходжаев,Калику-лов и др..1988). Перед контрольной регистрацией препараты выдерживали не менее 30 минут в растворе Рингера следующего состава (в мМ): NaCI-111.0; KCI-2,5; СаС|2-2,0; NaH2P04"0,8; Na2P04-2,0 рН 7,2-7,4. Все изменения состава раствора производили за счет NaCI.

Результаты экспериментов и их обсуждение. В начале 7СЬх годов в нашей лаборатории из внутренних мембран митохондрий печени крыс был выделен компонент, обладающий способностью связывать, кальций с высоким и низким .срддс-твом (КОВ). Связывание блокировалось La3* и гексаминокобальтом (Tashmukhamedov et al.,1972). Отличительными особенностями КОФ от известных в то время Са2+-связывающих митохондриальных факторов были низкая молекулярная масса (U5000 Да) й содержание NADP и флавинов (Гуссаковский и др.,1975).

В данной работе из КОФ был выделен индивидуально чистый гликспептид, о чем свидетельствовало выявление одной N-конце-вой аминокислоты - аланина. Аминокислотный состав:.asp (l),thr

(1).ser (2-3),gly *{2),pro (l).srlu (6),ala (4),phe (l).hls

(2) , lys (1). Молекулярная масса -3000 Да.

Соответствие нуклеотидной составляющей, содержащейся в гликопептиде, никотинамидадениндинуклеотидам доказывалось следующем: 1. Совпадением спектров поглощения гликопептида (Хмакс -263 нм) и NAD(P). (рис.1)

2. Совпадением спектров флуоресценции, возбуждаемой при 365 нм, гликопептида (X макс™ 440-450 нм) и NAD(Р) (рис.2).

3. Совпадением спектров возбуждения флуоресценции гликопептида и NAD(P) (в пределах ошибок эксперимента) (рис.3).

4. Ферментативные реакции, приводящие к изменению соотношения NADP/NADPH позволяют наблюдать сдвиг спектра флуоресценции гликопептида в Солее коротковолновую область (соответствующий окислению NADPH)-, (рис.2), а также увеличение интенсивности флу оресценции (соответствующее восстановлению NADP) (рис.4) Ферментативные реакции, специфичные для NADP/NADPH более эффективны, чем для NAD/NADH.

По спектроскопическим данным на одну молекулу гликопептида приходится 2-3 молекулы NADP.

А«

0,6

42

Рис.1 Спектры поглощения: 1-КА0,2-«А0Р. Э-глико-пептвд.

<и

ш

ш

на

¡40

I 01*. ед.

Рис.2 Спектры флуоресценции, (Хгоэб.2б5 нм). 1-НА0Р,2-глико-пептид+ферм. сист.,3-КАЭ,

4-гл!копептид,

5-НАЛРН,6-НАСН

№0 ш

Как следует из данных, представленных в табл.1, влияниэ

Табл.1 Изменение интенсивности флуоресценции каналоформе-ра, NAD,MADH,NADP,NADPH в 2 от нормы в зависимости

от влияния катионов

каткскн конц. каналоформер. NAD NADH NADP NADPH

Ca1 La' RR:

2+ Я*

3+

SQ.'J.i 4,511

20mM 42t6

2Л0-5»! 3 t2

1-10-5M "53,0

"5 10,4

"6 "20,0

"2,1 +22,8 +19,Б "5,5 *20,0 '2,7

10 +4 10,0 +47,4 +55,9 +11,9

гТ

«о ta

ÍCO «О

та.

с

Рис.3 Спектры возбуждения флуоресценции: 1-гликопе птид,2-NAD, 3-NÁDH,4-NADP,5-NADPH

мо

"Тис.4 Интенсивность флуоресценции глцкопеп-тида при использовании его в качестве кофермевта в реакции Г6РДГ+ ГбР (а) и АДГ+этанол (б).

- , • ' •• . - в -ионов кальция и калия на собственную флуоресценцию гликопептл-да,. возбуждаемую при 365 им, совпадает с влиянием этих катионов на флуоресценцию водного раствора NADPH. Если кальций значительно увеличивает как собственную флуоресценцию гликопепти-да. так и NADPH,калий вызывает незначительные изменения интенсивности флуоресценции в обоих случаях. Действие ионов лантана и рутениевого красного (РК) на собственную флуоресценцию, гли-копептида различно.и не соответствует эффектам на водных растворах NADPH. Лантан не влияет на флуоресценцию гликопептида. РК вызывает ее тушение. Зависимость уменьшения флуоресценции гликопептида от концентрации красителя описывается экспонен-той, что соответствует статическому механизму тушения (Eftink,Selvldge,lS82). Константа тушения - .ГКАг1. Это свидетельствует о комплекеооОразовании гликопептида с РК.

Исследуемый гликопептид в концентрации 4-5 мкг/мл способен увеличивать Са2+-проводимость БЛМ на порядок, при этом десятикратный градиент ионов кальция вызывает появление потенциала в 16 мВ. Наблюдаемое увеличение проводимости обусловлено образованием каналов с амплитудой 2 рА (рис.5а). Калиевая проводимость, индуцируемая гликопетидом, значительно выше (£-3 порядка). Амшн туда одиночных канзиюв, регистрируемых в калиевой среде, 20 рА (рис.56). В этом случае наблюдаются четкие 5 уровней, пропорциональные по величине. При двукратном градиенте ионов калия на мембране появляется потенциал в 10 мв, что соответствует числу переноса t«- 0,8.

Если калиевая проводимость наблюдается регулярно, то вероятность индуцирования кальциевой проводимости Находится в сильной зависимости от редокс состояния NADP составляющей. Препараты. содержанию более окисленные нуклеотиды, легче индуцируют кальциевую проводимость. В присутствии ферментной системы, увеличивающей отношение NADP/NADFH, кальциевая проводимость, растет (рис.б): Эти результаты согласуются с данными о влиянии Са2+ и отсутствии влияния на нуклеотидную флуоресценцию г ли копетида. Редокс состояние нунлеггидов дов имеет функциональное значение только для ка ¡ьциечсй проводимости. Это подтверждается и данными о действии ионов-блокаторов, лантана и РК на индуцируемое проводящее состояние .- ВШ. Ладтан блокирует как калиевую, так и кальциевую проводимости, в то время, как РК не

«5

-1) -а -<о

ю зо ы «I I,}

Ч»

-Ч

-г.»

Рис.5 Флуктуашии тока проводшюсти БДЫ.индуцированиыэ митс хондриальньм гликопептвдом вприсутствии 10 мЫ Са2*(а) и 100 мЫ КС1 (б) при фиксированно напряжении 100 ыВ на мембране. Среда:5 трис-НС1, рН 7,5. (в) Вольт-амперная характеристика каналов проводимости в присутствии 100 ыУ КС1. Концентрация белка с обеих сторон БЛМ 5г/мл.

влияет на калиевую и увеличивает кальциевую проводимость. Увеличение кальциевой проводимости РК было продемонстрировано и на нативных мембранах (Mas1.nl, 198?). Скорость выхода кальция из митохондрий увеличивалась Под влиянием зтого поливалентного соединения. Известно, что производные рутения могут использоваться в качестве редокс-центров на биологических и модельных системах (Ваш, 1987). Возможно, между РК и нуклеотидной составляющей- гликопептида, образующими по флуоресцентным данным прочный комплекс, имеет место тмищш ш ьтш'пчими взаимодействие, индуцирующее свободные радикалы. Последние, в свою оч< -редь, взаимодействуют с митохондриальными и модельными мембранами, увеличивая их проницаемость. Это согласуется с представлением о том, что именно образование свободных радикалов является "общим знаменателем" всех механизмов, лежащих в основе выхода кальция из митохондрий.

Исследуемый нами гликопептид-каналоформер напоминает гипотетическую пору, .осуществляющую "переходные" состояния про-

•в'*

о

N

хВ сЬ

10 Л

•8

-9

10 £

№

Рис.6 Влияние РК и Ферментной системы на индуцирование кана-лоформером проводимости в среде,содержащей 10 мМ Са2+,10 МЫ трис-НС1.рН 7,5. О-ферментная система:

Глутаматдегидрогена ' эа-й-кетоглутарат-Ш4С1,РК-рутениевый красный,б-канал сфо-рмер

68 ЯОИ

• ~ 11 -

ницаемости, обеспечивающую "ортодоксальное" и "агрегированное" состояния матрикоа, регулируемую с внутренней стороны концентрацией ионов кальция. Ярко выраженная нелинейная- вольт-амперная характеристика одиночного канала, наблюдаемая в присутствии гликопептида с обеих сторон БЛМ (рис.бв) 'объясняется,возможно, несимметричностью встраиваемых каналов.

• Однако, в отличие от митохондриальной поры, индуцируемая на ВЛМ проводимость не блокируется ионами стронция.

Еще один низкомолекулярный каналоформер белковой природы был выделен нами из бурой водоросли СузЬозе1га ЬагЬаЬа.

Среди множества морских организмов есть виды, проявляющие высокую Бг2специфичность.• В частности, планктонные простейшие акантарии строят свой скелет из ЗгБ04, все клеточные метаболические процессы регулируются 'здесь стронцием, а не кальцием. Бурая водоросль Суз1о5е1га ЬагЬа1а аккумулирует Эг2+из морской воды с избирательностью Бг2+/Са2+-4,но является более доступной для исследований по сравнению с акантарией, обитающей в Средиземном море.

Нами было обнаружено, что мембранная. водорастворимая Фракция бурой водоросли Суз1озе1га ЬагЬаЬа способна индуцировать Бг2+проводимос'ть БЛМ с высокой избирательностью. При десятикратном градиенте ионов Зг2+ и Са2+на мембране- индуцируется потенциал 27±2 мв и 22±2 мв соответственно. С помощью измерения биионных потенциалов был установлен следующий ряд селективности: 5г2*:Са2+:Ме2*:Ва2+- 1:0,14:0,17:0,21. Зг2+/Са2+ избирательность -7.

Исследование зависимости индуцируемой проводимости от рН показало, что число переноса через .БЛМ и проводимость макси- -мальны при значении рН-7,0 (рис.7), что свидетельствует об участии в этом процессе белковых карбоксильных групп.Зависимость роста проводимости от концентрации белка принимает квадратичный характер (рис.8), предполагая наличие в растворимой мембранной фракции каналоформера.

В последующих экспериментах из данной мембранной фракции был выделен низкомолекулярный компонент, соответствующий при электрофорезе в присутствии БОБ белковой полосе в 10000 Да (иногда 5000 Да).При добавлении этого белка с обеих сторон БЛМ в стронциевой среде регистрируются одиночные каналы проводимости. Амплитуды скачков тока составляют 4,5; 9,0 и 13,5 рА,.

8" К А|

2L g«>

о

до.

Р.,

" V %

ÍI»

> « » » » * » «>'|

I 4 1 té > I • X Р1

Рис.7 Действие рН на число переноса (ордината) (А) и на проводимость ВЛМ (В). модифицированную фактором водоросли.-Среда:5 Ш ацетатный буфер,1Ь»/мл белка и 10 мЫ БгОЮз)*.

«о

ч.

о

Рис.8 Зависимость проводимости БЛМ от концентрации белкового фактора водоросли.

401

' JL1Ü -

JU' i V-,

Рис.Q Свойства каналов,наблюдаемых в присутствии Sr(K03)s.1,11,III,IV-кокцентрация Sr(N0a)2 соответственно 2,10,20,30 мМ. Концентрация белка с обеих сторон ЕЛМ 1 Or/мл,напряжение на мембране 100 нВ,среда: 10 мМ ацетатный буфер рН 7,4

г

фи концентрациях стронция 2-10; 20 и 30 мМ соответственно и .{отемгиале на мембране 100 МВ, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия проникающих катионов между собой при исследуемых концентрациях электролига, (рис.9). Волы-амперные зависимости одиночных каналов, регистрируемые в присутствии белка с обеих сторон Б.И, имеют нелинейный характер. По-види-мсму, при отрицательных значениях потенциала ток определяется входом ионов в канал, в положительной области потенциалов Зольаее влияние приобретает перенос ионов через энергетический Зарьер в середине канала.

Функциональная роль изученных нами стронций-проводящих каналов, по-видимому, заключается в обеспечении избирательной 1ккумуляшш стронция из морской воды на фоне внешней высокой ;0!щентрэш!и ионов кальция. Вероятно, такая дискриминация ¡вухвзлентных ионов обуславливается не только специфическими :тронций-связывающими компонентами клеток, но и непосредственней системой транспорта ионов з мембранах, включающих в себя гидрофобный белковый канал.

Реконструирование стронциевого каналоформера з биологи-(«ские мембраны, а именно в нервно-мышечные'синапсы лягушки -¡оказало следующее. В Физиологическом растворе, содержащем ио->{ы стронция вместо кальция, исследуемый каналоформер вызывает цискретное увеличение спонтанного выброса медиатора (рис.10), чффект зависит от концентрации каналоформера. При увеличении :онцен?рации" каналоформера (1-10~6-1'10~5) увеличивается длительность "пачек" и частота МПКП в "пачках" (2-5/сек и 0-20/сек соответственно).' Интервал ме^кдУ "пачками" и латент-

, I ?1 1 - I ' : ' •

Рис.ю Действие стронци-.j ,i|),¡ ' Y ' евого каналоформера

на спонтанную активность нервио-мышечно ijlM . Ii Г- . Hi|, . : го синапса лягушки в

среде,содержащей 2,Б . MM Sr2+.1-контроль, , i. ", Ii i1j 2-через БО мин.З-че-

'—' рез 70 мин,4-через

2 О С " '

' 120 мин после добав-

ления пептида в количестве 10~®М.

.. .. • :■■ ; - 14 - .

ный период уменьшаются. В обычном физиологическом растворе, содержащем ионы кальция, эффект каналоформера также наблюдается , однако ов менее выражен, частота МПКП в "пачках" на порядок ниже. Наблюдаемые эффекты обусловливаются высокой Sr2+/Ca2+ избирательностью данного каналоформера. Этот низкомолекулярный белок, являющийся составной частью .строн-, ций-транспортирующэй системы бурой водоросли Cystoselra barbata, воспроизводит . действие низкомолекулярных белковых токсинов на пресинаптические мембраны.

. ВЫВОДЫ

1. Из внутренних мембран митохондрий печени крыс выделен индивидуальный гликопептид с м.м.3000 Да. Установлен его аминокислотный состав/Показано, что на 1 молекулу гликопептида приходится 2-3 молекулы NADP.

2. Митохондриальный гликопептид индуцирует на ВЛМ кальциевые и калиевые каналы с амплитудами 2 рА и 20 рА соответственно. Как кальциевая, так и калиевая проводимости блокируются лантаном. РК, образующий комплекс с NADP составляющей гликопептида, увеличивает кальциевую проводимость и не влияет на калиевую. Показано, что.индуцирование кальциевой проводимости зависит от редокс состоян'ю NADP. .

3. Несимметрич юсть вольт-амперных характеристик одиночных каналов при добавлении белка с обеих сторон БШ, возможно, обменяется несимметричностью встраиваемых каналов .

4. Иа мембранной водорастворимой фракции «урой водоросли Cystoselra barbata выделен низкомолекулярный каналоформер (5000-10000 71а) белковой природы.

ВТ. Установлено, что этот белок индуцирует проводимость БЛМ для двухвалентных катионов со следующим рядом селективнос-TH:Sr2+:Caz:*feÄ+:Ba*Vl:0,i4:0,i7:0.21. Sr2+/Ca2+, избирательность равна 7.

ff. Одиночньг каналы проводимости, индуцируемые данным канало-формером, имеют амплитуды 4, ¡; 9,0; 13,5 рА при концентрациях стронция 2-10; 20; 30 мМ соответственно при потенциале на мембране 100 мв.

tS. При встраивании данного белю <вого каналоформера в биологические мембраны - нервно-мьшечные синапсы лягушки, наблюдаются МПКП, частота которых в стронциевой среде почти на порядок выше, чем в кальциевой. Низкомолекулярный белковый каналоформер

< - ia -

из Оурой водоросли обладает пресинаптическим действием.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Махмудова Э.М., Беепалько Н.В.,Казаков И., Ташмухамедов Б.А. Митохондриальный низкомолекулярный компонент, индуцирующий катионную проводимость бислойных фосфодипидных мембран, 3 конференция биохимиков Ср.Азии и Казахстана,Душанбе,1981, т.2, с. 168. ; •■• '•'■

2. Махмудова Э.М., Беепалько Н.В.,: Казаков И., Ташмухамедов Б.А.. Лазоренко P.E.Поликарпов P.P. I Всесоюз.биоф.сьезд, Москва, 1982,с.200. Реконструкция на НЛМ Sr2"1"-транспортирующей системы бурой водоросли цибтоэиры. '

3. Махмудова Э.М., Беепалько Н.В., Казаков И., Ким Т.А., Лазоренко Г.Е., Поликарпов Г.Г. Белковый канаиоформер иа бурой водоросли Cestoseira barbata. III Сов.-Швейц.еймп."Биологические мембраны. Структура и Функции", Ташкент,1983,с. 165.

4. Махмудова Э.М., Беепалько Н.В,, Казаков И., Красильников О.В., Терновский В.И., Ташмухамедов Б.А.' Ниэксмолекулярный белок- каналоформер мембраны митохондрий. Биофизика,1983,т.28,N1, с.140-142.

5. Taahmukhamedov B.A., Makhmudova Е.М., Bespalko N.V.,Kazakov Л., Pollkarpov G.G., Lazarenko G.I. Strontium transport system of brown alga Cystoselra baibata: reconstitution on bllayer lipid membranes. Gen.Physiol.BJophys. ,1983,2,KT/'-llO.

6. Махмудова Э.М., Беепалько И.В., • Казаков И., Ташмухамедов Б.А., Лазоренко P.E., Поликарпов P.P. Стронцийпроводящие каналы мембран бурой водоросли Cystoselra barbata. Биологические науки,1985.N4.81-84.'

7. Беепалько Н.В., Махмудова Э.М., Гуссаковский Е.Е. Исследование митохондриального Оаг+-каналоформера методами спектроскопии и собственной флуоресценции. VI конференция по спектроскопии полимеров.Харьков,1988,44.

8. Беепалько Н.:В., Махмудова Э.М.. Казаков И., Гуссаковский Е.Е. Реконструкция на SJIM системы выхода Ca2"*" из митохондрий. VI съезд физиологов Узб., Таикент,1988,с.1Б9.

9. Беепалько Н.В., Гуссаковский Е.Е., Махмудова Э.М.. Ташмухамедов Б. А. Исследование состава Ca2*"-каналоформера. из внутренних мембран митохондрий печени.Узб.биолог.журнал,1991,N3,6-10. Ю.Каликулов Д., Беепалько Н.В.,. Махмудова Э.М. Индукция пеп-

» t

• -16- .

тидным канапоформером спонтанного выделения медиатора. Узб.биолог. журнал,1991,N5.с.6-8.

П.Бесналъко Н.В,, Махмудова Э.М. Возможные пути рециклизации Са'г+ в митохондриях печени крыс. У зб. биолог, журнал. 1992,N3-4,С.3-7.

Ккки валентли ионлар транспортининг Канал 1(осил »фиувчи оцсиллари - Иккита паст молекуляр канал цосил килувчилар ажратилди ва икки 1^атламли ыембранада реконструкция (ришнди:

1. Каламуш жигари цитохондрилсининг ички мембранасидан Са2+, К* уткааувчанликни индукциядовчи NADPra эга Оусган ало^ида г'ликспептид <м.о.\ЗОСО Да).

2. К,унгир сув £ти т Cystoselra borbata дан щори Sr£+/Ca2'f танловчанлик билан икки валентли ионлар буйича утказувчан-ликни индукцияловчи оцскл тайиатига эга булган. мембрана компонент (м.о. 5000-10000 Да).

The channel-former proteins for transport

of the Ыvalence lenes Two low tnoleoular channel-fonaer protein were Isolated and reconstituted on BLM;

1. Individual NADP-containing •fclycopeptlde from, the inner mitochondrial membrane of rat's liver (т.т.-ЗООО Da), wlch lnduuces Ca^.K* conductivity. £. Protein membrane component from alga Cystoselra barbata (т.т.БООО-10000 Da) wlch Induces the conductivity by 2-va-lency lories with high discrimination or Sr£* and Ca2".