Роль белок-липидных взаимодействий в регуляции каналоформерной активности сирингомицина Е

Бессонов, Андрей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль белок-липидных взаимодействий в регуляции каналоформерной активности сирингомицина Е
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль белок-липидных взаимодействий в регуляции каналоформерной активности сирингомицина Е"

На правах рукописи

Бессонов Андрей Николаевич

РОЛЬ БЕЛОК-ЛИПИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В РЕГУЛЯЦИИ КАНАЛОФОРМЕРНОЙ АКТИВНОСТИ СИРИНГОМИЦИНА Е

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители-. доктор химических наук, профессор

Валерий Вениаминович Малев Санкт-Петербургский государственный университет, Химический факультет; Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук Людмила Владимировна Щагина,

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Юрий Алексеевич Негуляев Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Юрий Николаевич Антоненко

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет

Защита состоится 30 июня 2006 года в 14 ч на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан " " мая 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

.Х-

Е.В. Каминская

/ЧШ 1

Актуальность исследования

Антимикробные пептиды природного и синтетического происхождения являются предметом многочисленных исследований, направленных на установление молекулярных механизмов их биологической активности [1]. Модель взаимодействия пептида с клеткой-мишенью предполагает, что липиды внешнего монослоя цитоплазматической мембраны участвуют в образовании трансмембранных пор при встраивании пептида в мембрану. Активность многих пептидов зависит от заряда липидных молекул, их спонтанной кривизны, а также от наличия стеринов в составе мембраны, что определяет селективность их действия [2, 3]. Типичным представителем антимикробных пептидов является группа фитотоксинов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae pv. syringae - сирингомицин E (СМЕ), сирингопептин 22А (СП22А), сирингостатин А (ССА) и сиринготоксин Б (СТБ). Цитотоксичность вышеуказанных липодеисипетидов определяется их способностью образовывать ионные поры в плазматической мембране клеток-мишеней [4-6].

Использование бислойных липидных мембран (БЛМ) дает возможность

моделировать плазматическую мембрану и изучать взаимодействия белков и

пептидов с мембраной, а также ответить на вопрос о факторах, влияющих на

биологическую активность экзогенных каналоформеров. Введение фитотоксина с

одной (цис-) стороны бислойной липидной мембраны приводит к образованию

ионных каналов [7-9]. Каналы, образуемые фитотоксинами, характеризуются

потенциал-зависимостью их открывания/закрывания, преимущественно анионной

селективностью, зависимостью проводимости от липидного состава БЛМ и

трансмембранной разности потенциалов [8, 10]. Свойства каналов зависят от

стеринового состава мембран, так в холестерин-содержащих бислоях скорость

формирования каналов, образованных сирингомицином Е (СМЕ-каналов), гораздо

ниже, чем в мембранах, содержащих эргостерин [11]. Сравнение коэффициентов

проницаемости модифицированных СМЕ эритроцитарных мембран и БЛМ для

катионов при одинаковых молекулярных соотношениях токсин/липид показало, что

ионная проницаемость эритроцитарных мембран существенно выше, чем БЛМ.

Можно предположить, что, помимо липидного состава мембран, активность

сирингомицина Е определяется внутриклеточными структурами, например,

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЖЮГСКА С.-Петербург

_ОЭ 200

элементами цитоскелета, взаимодействующего с мембраной. Известно, что функционирование многих ионных каналов клетки зависит от белков цитоскелета. Предварительные исследования показали, что мембранная активность сирингомицина Е зависит от присутствия глобулярного актина с противоположной введению токсина стороны БЛМ.

В данной работе исследовано влияние белков цитоскелета на мембранную активность сирингомицина Е (СМЕ) и его аналогов. Данные, свидетельствующие о связи между динамическими перестройками цитоскелета и активностью ионных каналов в мембране, позволяют говорить о непосредственном участии белков цитоскелета в процессах ионного транспорта [12, 13]. Тем не менее, мало известно о возможности влияния внутриклеточных белков на функционирование экзогенных соединений, что определяет актуальность данного исследования. Цель и задачи исследования

Цель данной работы - установление механизма влияния белков цитоскелета на каналоформерную активность сирингомицина Е и его аналогов в бислойных липидных мембранах. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1) исследовать изменение проводимости БЛМ, модифицированных сирингомицином Е и его аналогами, при введении в околомембранный раствор различных форм актина, других белков цитоскелета, а также синтетических полимеров, моделирующих различные участки белковых молекул;

2) провести сравнительный анализ характеристик ионных каналов, образуемых токсином в отсутствие и в присутствии вышеуказанных белков и полимеров;

3) изучить кинетику тока при различной последовательности введения СМЕ и соединений, увеличивающих каналоформерную акгивность токсина, а также зависимость трансмембранного тока от концентрации актина и полимеров.

4) разработать теоретический подход, описывающий механизм сорбции актина и синтетических полимеров на мембране.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Введение глобулярного или фибриллярного актина к модифицированной сирингомицином Е бислойной липидной мембране со стороны, противоположной введению токсина, существенно увеличивает число функционирующих СМЕ-каналов. Одностороннее введение СМЕ и актина не вызывает шког о эффекта.

2. Увеличение каналоформерной активности СМЕ обусловлено кооперативной сорбцией актина, сопровождающейся образованием его агрегатов на мембране. Неспособный к агрегации расщепленный трипсином актин оказывает незначительное, по сравнению с G-актином, влияние на каналоформерную активности СМЕ.

3. Механизм регуляции актином мембранной активности токсинов, продуцируемых Pseudomonas syringae pv. syringae, включает необратимую сорбцию актина на поверхности мембраны, образование зародышей агрегатов и дальнейший рост размеров (а не числа) агрегатов до достижения равновесных значений. При этом происходит изменение мембраны, что приводит к росту числа функционирующих СМЕ-каналов в результате увеличения концентрации предшественников каналов и (или) константы скорости их открывания.

Научная новизна

Впервые показано, чго каналоформерная активность липодепсипептидов СМЕ, СП22А, ССА и СТБ в модельных липидных мембранах регулируется актином, но не альфа-актинином или винкулином - белками, также входящими в состав цитоскелета. Сорбция актина на бислойной липидной мембране имеет кооперативный характер и сопровождается образованием агрегатов сорбирующегося вещества, главным образом, за счет гидрофобных белок-липидных взаимодействий. Предложен механизм влияния актина на каналоформерную активность фитотоксинов, согласно которому агрегаты актина изменяют структуру мембраны, что приводит к увеличению числа предшественников фитотоксиновых каналов и (или) константы скорости их открывания. Данные, полученные в ходе работы, показывают, что биологическое действие липодепсипетидов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae pv. syringae, может репетироваться внутриклеточными компонентами клеток-мишеней.

Теоретическое и практическое значение

глобулярного и фибриллярного актина с мембраной Показано, что амфифильные синтетические полимеры - полианион Кенига и полилизинтриптофан, могут быть использованы для тестирования вклада заряженных и гидрофобных групп белковых молекул при их взаимодействии с мембраной. Результаты, полученные в ходе исследования, показали, что актин формирует на мембране агрегаты, и способность к агрмации является необходимым условием влияния на активность СМЕ. Апробация работы

Основные положения работы были представлены на конференциях Биофизического общее 1ва США (Балтимор 2004; Лонг Бич 2005; Солт Лейк Сиш 2006), Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 2004), Конференции молодых ученых "Биоло1 ия-наука 21 века" (Пущино, 2004), 3-м Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004) Материалы работы докладывались на научных семинарах Института цитоло! ии РАН и Национального института здоровья (Бетезда, США).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Финансовая поддержка работы

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП "Материаловедение и диагностика в передовых технологиях", при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 06-04-48860, 04-04-49622), программы "Молекулярная и клеточная биология" РАН и программы поддержки ведущих научных школ (фанты НШ-2178.2003.4, НШ-9396.2006.4) Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка литературы, содержащего 4CQ наименований. Диссертационная работа изложена на 103 страницах и иллюстрирована 30 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы

Липодепсипептиды, фитотоксины СМЕ, СП22А, ССА и СТБ, продуцируемые Pseudomonas syringae pv. syringae, были предоставлены д-ром Д Такемото (Университет штата Юта, Логан, США) [14].

В работе использовали следующие реактивы- NaCl, MOPS, Tris, пентан, сквален, альбумин, лизоцим, миоглобин, поли-Ь-лизин (М ~ 30 кДа) (ПЛ), поли-L-глутаминовую кислоту (М ~ 27 кДа) (ПГ), сополимер лизина и триптофана в соотношении 4-1 (полилизинтриптофан, М~ 38 кДа) (ПЛТ) и трипсин фирмы "Sigma" (США); диолеоилфосфатидилсерин (ФС), диолеоилфосфатидилтганоламин (ФЭ) и дифитаноилфосфатидилхолин (ФХ) фирмы "Avanti Polar Lipids" (США). Полианион Кенига (сополимер сгирола, малеиновой и метакриловой кислот в соотношении 3:2:1, М ~ 10 кДа) (ПК) был предоставлен д-ром Н.С. Мелик-Пубаровым (Московский государственный университет) Винкулин и альфа-актинин были любезно предоставлены д-ром В Н. Бабаковым (Институт цитологии PAI [). G-актин выделяли из скелетных мышц кролика [15] F-актин получали путем полимеризации G-актина: увеличением концентраций солей и АТФ (KCl до 50 мМ, MgCl2 до 1 мМ, АТФ до 1 мМ) в растворе G-актина (2 мг/мл) и выдерживанием в течение 1 ч при температуре 25°С.

Для характеристики препаратов актина использовали параметр А [16] В работе использовали препараты G-актина с величиной А не ниже 2 54 и F-актина с А не ниже 2.7, что отвечает содержанию в препарате более 97 % соответствующей формы актина. Концентрацию актина определяли спектрофотометрически (коэффициент экстинкции /?28о= 1 09 мл/(мг см) Протеолитическое расщепление глобулярного актина проводили введением в раствор трипсина в соотношении актин/трипсин = 4:1 (по массе) и инкубированием полученной смеси при комнатной температуре в течение 1 ч Расщепление актина трипсином приводило к образованию двух фрагментов с молекулярными весами около 33 и 9 кДа, что согласуется с литературными данными [17]. Анализ степени расщепления проводили методом электрофореза с использованием 12% ПАА геля.

Формирование БЛМ и измерение их электрических характеристик

Формирование БЛМ проводили по методу Монтала и Мюллера [18]. Мембраны образовывали из ФХ (незаряженные мембраны), либо эквимолярной смеси ФС и ФЭ (ФС/ФЭ, отрицательно заряженные мембраны). Эксперименты проводили при одинаковом ионном составе разделяемых мембраной водных растворов электролита (0.1 или 1 М NaCl) Кислотность растворов (pH 6) поддерживали буферной смесью 5

мМ MOPS/NaOH. Фитотоксины вводили в раствор цис-отделения камеры в виде водного раствора (1 мг/мл, pH 3) после образования мембраны.

Измерение тока, протекающего через БЛМ, осуществляли в методике фиксации потенциала. Положительным считали потенциал, вызывающий поток катионов из цис- в транс-отделение камеры. Регистрацию токов через мембрану проводили с помощью операционного усилителя с дискретным диапазоном сопротивлений обратной связи (oí 107 до 10ю Ом). Сигнал с выхода усилителя записывали на жесткий диск персонального компьютера, используя плату АЦП (Adalab PCL 718 (Бельгия)), разрядность 12 бит, частота дискретизации 0 2-5 кГц Обработку записей трансмембранных токов осуществляли с использованием программного пакета Clampfit 9 0 ("Axon Instruments", США). При обработке записей трансмембранных токов, протекающих через СМЕ-каналы, для заданного трансмембранного потенциала (У) строили гистограмму распределения проводимостей (G) одиночных малых каналов (G = I/V, где I - ток, протекающий через одиночный канал), которую аппроксимировали функцией Гаусса. Величины / находили из изменений амплитуды тока при открывании (или закрывании) канала Величину воротного заряда каналов (0 рассчитывали из величин стационарных значений числа открытых каналов при

различных V по формуле: У - . _ ~ ~, где Nch(oo) - число функционирующих

а (Уг / til)

СМЕ-каналов при достижении равновесия (t —► оо) при заданном V, F - постоянная Фарадея, R - универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная температура [10]. Для анализа полученных результатов использовали программу Origin 7 0 ("OriginLab", США).

Исследуемые белки и синтетические полимеры вносили в растворы цис- или транс-отделений экспериментальной камеры после формирования бислоев. В использованных концентрациях вышеуказанные вещества не изменяли проводимость БЛМ в отсутствие СМЕ В кинетических экспериментах (измерении трансмембранного тока во времени при заданном трансмембранном потенциале) величина V равнялась ±50 мВ. Все эксперименты проводили при комнатной температуре.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Эффект различных форм актина на проводимость БЛМ

Глобулярный (в) или фибриллярный (Р) актин вводили в околомембранный раствор после формирования мембраны и ее модификации СМЕ с цис-стороны до уровня регистрации нескольких одиночных каналов при V = 50 мВ Добавка вышеуказанных форм актина с ^ыс-стороны (г^ис-добавка) не влияла на трансмембранный ток (рис 1, кривая 1). В то же время введение О- или Р-актина с транс-стороны мембраны (транс-добавка) приводило к увеличению трансмембранного тока с последующим достижением стационарного значения -"эффект актина" (рис. 1, кривые 2, 3) [19, 20].

Рис. 1. Зависимость 1(0/7(0) от времени для модифицированных СМЕ ФС/ФЭ-мембран после введения актина.

1(0/1(0) - отношение тока в момент времени I к стационарному значению тока до добавки актина. Кривая 1 -цис-добавка б- или Р-актина. Кривые 2, 3 - транс-добавка С- или Р-актина, соответственно Концентрация С-или Р-актина - 4 мкг/мл. Момент введения актина указан стрелкой. V = 50 мВ Состав водного раствора 0 1 ~25о МЫаС1,рН 6

l(t)/l(0)

4000-

3500-

3000-

2500-

2000-

1500-

1000-

500- |

0- t

0 50 100 150 200

t, мин

Транс-добавка G- или F-актина увеличивала проводимость мембран, модифицированных другими липодепсипептидами - сирингопептином 22А, сирингостатином А или сиринготоксином Б, что позволяет говорить об общем механизме действия актина на эту группу токсинов. Далее детально исследовали эффект различных форм актина на трансмембранный ток, индуцируемый сирингомицином Е - наиболее типичным представителем данной группы липодепсипептидов. Поскольку в отсутствие токсина введение актина в используемых концентрациях не вызывало изменения проводимости БЛМ, то наблюдаемое влияние транс-добавки актина следует связывать только с токсин-зависимой проводимостью мембран.

Представленные ниже результаты измерений проводимости одиночных каналов, их эффективного воротного заряда и потенциал-зависимости проводимости

мембран до и после действия акшна показали, что "эффект актина" (рис. 1) обусловлен увеличением числа функционирующих СМЕ-каналов Дискретные флуктуации тока, отражающие процессы открывания (закрывания) одиночных каналов, в отсуклвие и в присутствии в- или Р-актина представлены на рис. 2. Введение актина не приводит к изменению проводимости одиночных каналов, которые равны 2.9±0 4 пСм до и 3.1±0.4 или 2.8±0 3 пСм после транс-добавки в- или Р-актина, соответственно.

Рис. 2. Записи флуктуации трансмембранного тока через СМЕ-модифицированные ФС/ФЭ-мембраны до и после введения /•"- или С-актина (А, Б, В, соответственно) в транс-отделение камеры.

У= -50 мВ Состав водного раствора 0 1 М ЫаС1, рН 6 Пунктирной линией показан уровень нулевого тока

Величина Q, измеренная после введения

С- или Р-актина с транс-стороны СМЕ

модифицированной ФС/ФЭ-мембраны (0.1

М ЫаС1), равна 1 15±0.10 и 1.04±0.14, соответственно, и совпадает со значением,

полученным в отсутствие актина (1.08±0.07) [20, 21]. Для мембран,

модифицированных СМЕ, знак Q совпадает со знаком потенциала, вызывающего

увеличение трансмембранного тока [22]. Если актин индуцирует СМЕ-зависимый

ток, следует ожидать совпадения потенциал-зависимости проводимости мембран в

отсутствие и в присутствии актина. Действительно, как видно на рис. 3, для

отрицательно заряженных (ФС/ФЭ) мембран (0 1 М №С1), модифицированных

сирингомицином Е и содержащих О-актин с транс-стороны, характерна такая же

потенциал-зависимость проводимости (рис. 3 А), как и для СМЕ-модифицированных

мембран в отсутствие актина (рис. 3 Б) [19, 20]. В случае незаряженных (ФХ)

мембран или при 1 М концентрации №С1 в омывающем заряженную (ФС/Ф1)

мембрану растворе рос г числа открытых СМЕ-каналов происходит при

отрицательном трансмембранном потенциале, а уменьшение - при положительном

(рис. 3 В). Аналогичный вид потенциал-зависимости мембран наблюдался в этих

системах и при транс-добавке актина после СМЕ (рис 3 Г). Сохранение свойств

СМЕ-каналов при введении актина в систему свидетельствует, скорее всего, об

А В

0 2 пА |_

5 сек

отсутствие непосредственных взаимодействий белка с каналом Время достижения стационарного значения 1(0/1(0) ("плато") 01|Л) при транс-введении актина и приложении К соответствующего знака (рис 1, кривые 2, 3) зависит от формы актина и существенно больше 1Ш1 в отсутствие актина [21, 23].

Рис. 3. Кинетика тока через модифицированные СМЕ ФС/ФЭ-мембраны, в

отсутствие (Б, Г) и в присутствии С-актина с транс-стороны (А, В). Концентрации СМЕ -07 (А), 7 (Б), 0 4 (В) и 37 (Г) мкг/мл; концентрация О-актина - 4 мк?/мл Состав водного раствора 0 1 М ШС1, рН 6 (А, Б) и 1 М ЫаС1, рН 6 (В, Г)

Вышесказанное позволяет

предполагать, что медленное

увеличение 1(!)/1(0),

наблюдаемое при транс-введении актина - следствие относительно медленной

сорбции белка на мембране, и сорбция является лимитирующей стадией процесса

увеличения числа СМЕ-каналов.

Роль электростатических и гидрофобных взаимодействий

Сорбция актина может быть результатом электростатических и/или

гидрофобных взаимодействий между белком и мембраной, т.е. взаимодействий

между заряженными группами сорбирующихся молекул и "головами" липидов и

(или) гидрофобными группами молекул белка и жирнокислотной областью мембраны

[24, 25]. Рост проводимости СМЕ-модифицированной мембраны при трапс-лобжкс

актина к незаряженной (ФХ) или заряженной (ФС/ФЭ) мембране, омываемой 1 М

ЫаС! (см. рис. 3 В), говорит об участии гидрофобных белок-липидных

взаимодействий в "эффекте актина", поскольку в этих системах электростатические

взаимодействия существенно снижены. Однако такие эксперименты не позволяют

исследовать роль электростатических взаимодействий в заряженных мембранах при

низкой ионной силе омывающего раствора Применение сишетических полимеров,

моделирующих различные участки молекулы актина, позволяет детально изучить

взаимодействия, лежащие в основе наблюдаемого "эффекта актина". Для этого

использовали поликатион полилизин (ГШ), полианион полиглутаминовую кислоту (ПГ) и амфифильные заряженные соединения- полианион Кенига (ПК) и поликатион, сополимер лизина и триптофана (ПЛТ).

Введение поликатиона, ПЛ, в раствор, окружающий отрицательно заряженные (ФС/ФЭ) мембраны, должно приводить к нейтрализации заряда мембраны из-за электростатического притяжения между ПЛ и ФС Известно, что переход от отрицательно заряженных к незаряженным мембранам сопровождается уменьшением каналоформерной активности СМЕ [26].

Рис. 4. Влияние ПЛ на кинетику тока через мембрану, модифицированную СМЕ.

Момент введения ПЛ в транс-отделение камеры указан стрелкой Мембрана сформирована из ФС/ФЭ Концентрация СМЕ 3.7 мкг/мл; ПЛ - 1 мкг/мл V= 50 мВ Состав водного раствора 0 1 М NaCl, рН 6.

Ответе! венным за это1 эффект, видимо,

является транс-монослой мембраны,

поскольку экранирование его заряда высокой

концентрацией NaCl вызывает уменьшение

числа СМЕ-каналов, в то время как экранирование заряда г/нс-монослоя не

сказывается на каналоформерной активности токсина [22] Аналогичный эффект

наблюдается и при введении ПЛ' транс-добавка приводит к уменьшению

трансмембранного тока (рис 4), а г/ис-добавка ПЛ не изменяет проводимость СМЕ-

модифицированной мембраны [19]. Из приведенных на рис. 5 результатов измерений

Рис. 5. G-V зависимость одиночных каналов для ФС/ФЭ-мембран в присутствии полилизина в трансотделении камеры (кривая 1).

Проводимости СМЕ-каналов в мембранах из ФС/ФЭ (кривая 2) и в мембранах из ФХ (кривая 3) приведены согласно [10] Концентрация ПЛ - I мкг/мл Состав водного раствора 0 1 М NaCl, рН б.

G-V зависимости одиночных каналов до и

после транс- добавки ПЛ видно, что

проводимость в присутствии ПЛ (рис. 5,

/, ПА

G, пСм

кривая 1) больше таковой в его отсутствие (С7г,м.) (кривая 2) и приближается к проводимости СМЕ-канала в незаряженных мембранах (кривая 3). Эти данные позволяют считать каналы, наблюдаемые в присутствии полилизина, СМЕ-каналами, а изменение их проводимосш связывать с нейтрализацией транс-монослоя БЛМ. Отсутствие роста каналоформерной активности СМЕ при транс-введении ПЛ говорит о том, что "эффект актина" не может быть обусловлен электростатическим взаимодействием молекул актина с мембранообразующими липидами. Влияние амфифильных соединений (ПЛТ и полианиона Кенига), содержащих в своем составе гидрофобные группы, на проводимость СМЕ-модифицированных ФС/ФЭ-мембран (О 1 М №С1) оказалось качественно совпадающим с "эффектом актина" (рис. 6) [19, 27] Относительно ПГ известно, что этот полимер не взаимодействует с отрицательно заряженными и незаряженными мембранами [28] Поэтому наблюдаемый "эффект актина" при транс-добавке ПЛТ или ПК следует относить к наличию в составе этих полимеров гидрофобных групп, которые могут участвовать в их сорбции на

Рис. 6. Кинетика тока, протекающего через мембраны, модифицированные СМЕ, в присутствии ПЛТ с цис- (кривая 1) или трансстороны (кривая 2).

Момент введения полимера указан стрелкой Концентрация ПЛТ - 0 7 мкг/мл Мембраны сформированы из ФС/ФЭ V = 50 мВ. Состав водного раствора 0.1 М ЫаС1, рН 6.

Поскольку, как и в случае актина, введение

"I ' То ' ¡о ¡о 40 ' ¡о ПК или ПЛТ в отсутствие СМЕ не вызывало I, мин

изменения проводимости БЛМ, то влияние транс-добавки этих полимеров также следует связывать только с изменением СМЕ-зависимой проводимости БЛМ. Чтобы установить, происходит ли это изменение за счет увеличения числа СМЕ-каналов или образования иных путей транспорта ионов в результате непосредственных взаимодействий полимера и СМЕ, было проведено сравнение одиночных каналов в системах до и после введения ПК или ПЛТ. На рис. 7 А показано увеличение проводимости одиночных каналов при транс-добавке ПЛТ к ФС/ФЭ-мембране (кривая 1) по сравнению с проводимостью СМЕ-каналов в отсутствие этого полимера (кривая 2), аналогичное увеличению Ссик при трансдобавке ПЛ к отрицательно заряженным БЛМ (рис. 5). Поэтому приведенные на рис.

мембране.

7 А (кривая 1) одиночные каналы можно также считать СМР-каналами, и рос! их проводимости - результатом нейтрализации отрицательного заряда транс-монослоя поликатионом ПЛТ Однако при сорбции ПЛТ трансмембранный ток увеличивается примерно в 100 раз (рис. 6), а проводимость одиночных СМЕ-каналов (при 50 мВ) лишь в 1 5 раза Следовательно, эффект ПЛТ на СМЕ-модифицированные мембраны является результатом не столько увеличения проводимости СМЕ-каналов, сколько увеличения числа функционирующих СМЕ-каналов.

Введение ПК с транс-стороны ФС/ФЭ-мембран (0.1 М ЫаС1) приводит к

уменьшению проводимости одиночных каналов, которая становится равной

проводимости СМЕ-каналов в мембранах, сформированных только из заряженного

липида, ФС (рис. 7 Б, кривая 1) Такой результат возможен в случае, если одиночные

каналы, наблюдаемые при транс-добавке ПК, являются СМЕ-каналами и изменение

их проводимости обусловлено

Рис. 7. Зависимость проводимости одиночных каналов (в) от трансмембранной разности потенциалов (V) для ФС/ФЭ-мембран:

А. в присутствии ПЛТ в растворе трансотделения камеры (кривая 1) и в отсутствие полииона (кривая 2); Б. в присутствии ПК в растворе трансотделения камеры (кривая 1, (1)) и в отсутствие полииона (кривая 2) Кривая 2 (А, Б) приведена согласно [10]. Проводимость СМЕ-каналов в ФС-мембранах (кривая 1, (о)) приведена согласно [22]. Концентрация ПЛТ или ПК-1 мкг/мл Состав водного раствора 0.1 М ЫаС1, рН 6

увеличением отрицательного заряда транс-монослоя БЛМ [29]. Увеличение отрицательного заряда на мембране может происходить только в случае сорбции на ней ПК за счет I идрофобных взаимодействий, I .е. превалирования последних над электростатическим

в, пСм

6, пСм

V, мВ

отталкиванием Следовательно, влияние ПК на проводимость мембран заключается в увеличении числа СМЕ-каналов

Результаты исследования транс-добавок ПЛ, ПГ, ПЛТ и ПК показывают, что "эффект актина" наблюдается только в случае ПЛТ и ПК, т е полимеров, имеющих в своем составе гидрофобные группы Это позволяег считать, что рост числа СМЕ-каналов связан с сорбцией актина на мембране, обусловленной гидрофобными белок-липидными взаимодействиями [21]. В то же время, исследование эффекта трансдобавки других белков цитоскелета, а-актинина и винкулина, для которых предполагается взаимодействие с мембраной in vivo и in vitro через гидрофобные белок-липидные взаимодействия, не выявило увеличения каналоформерной активности СМЕ Также не наблюдалось увеличения числа СМЕ-каналов при введении с цис- или транс-сгорошл модифицированной СМЕ мембраны миоглобина, альбумина и лизоцима, способных сорбироваться на мембране в том числе при помощи гидрофобных взаимодействий. Таким образом, имеющиеся экспериментальные данные говорят о том, что наличие гидрофобных взаимодействий при сорбции молекул актина на мембране является необходимым, но не достаточным условием феномена увеличения каналоформерной активности СМЕ [21].

Кооперативная адсорбция на БЛМ соединений, увеличивающих каналоформерную активность СМЕ

Анализ зависимости стационарного числа СМЕ-каналов от концентрации актина, ПЛТ или ПК в транс-отделении камеры (Са) позволил исследовать характер сорбции на мембране молекул, вызывающих рост каналоформерной активности СМЕ. Сигмоидальная зависимость Nch(co)/Nchmax(oo) oí Са (рис 8), предполагает кооперативный характер сорбции вышеуказанных соединений. Здесь /Vc/,(<x) - число функционирующих СМЕ-каналов при достижении равновесия (t—юо) для данной Са, NLrxM - максимальная величина Nch(со) при Са—>оо. Проверить обоснованность этого предположения можно, используя изотерму Фрумкина: 1п[0/(1-0)]=1п[ад]-2я0 (1)

где 0 - степень заполнения транс-мтюспоя сорбирующимися частицами, Kd -коэффициент распределения частиц между мембраной и водной фазой, а -аттракционная постоянная в единицах RT. Значение а>О говорит об 01талкивании

Ы^НЦ

Рис. 8. Зависимость Nс™ахот концентрации С-актина (А) и ПЛТ (Б) в транс-отделении камеры.

Л^/со) - число функционирующих СМЕ-каналов при достижении равновесия 0—юз), для данной Ст МС1,тах(со) - максимальная величина N^(0°) (при С„ —> со) Мембраны сформированы из ФС/ФЭ V ~ 50 мВ Состав водного раствора О 1 МЫаС1,рН 6

частиц друг от друга, я<0 - о притяжении. Предполагая число функционирующих СМЕ-каналов пропорциональным количеству сорбировавшихся молекул акгина, ПЛТ или ПК, 0 можно принять равным ■/Ч-/,(оо)/Лгс/,"ю\оо). Зависимость {1п[0/(1-0)] - 1пСа} от 0 позволяет определить а. Полученные величины а < -2 в случае в-актина, а также а- -2 для ПЛТ и ПК показывают высокое сродство между сорбирующимися частицами [21, 27] Такой характер зависимости может быть результатом образования сорбирующимися молекулами на поверхности мембраны новой фазы - агрегатов. Таким образом, "эффект актина" обусловлен кооперативной сорбцией актина на мембране и образованием агрегатов за счет белок-белковых и белок-липидных взаимодействий.

С , мкг/мл

что)

20 40 60 80 100 120 140

МИН

Рис. 9. Зависимость 1(0/1(0) от времени для ФС/ФЭ-мембран, модифицированных СМЕ, при введении расщепленного (кривая А) и нашивного С-актина (кривая Б).

Первая (по времени) стрелка указывают момент введения нативного (Б) или расщепленного (А) актина, вторая - трансдобавку трипсина после достижения стационарного значения тока

Концентрация нативного и расщепленного актина - 4 мкг/мл, трипсина - 1 мкг/мл V = 50 мВ Состав водного раствора 0 1 MNaCl, рН 6

Последнее должно вызывать изменение упаковки лигшдов в мембране и приводить к увеличению числа функционирующих СМЕ-каналов.

Для О-актина показано, что липидный монослой является эффективным полимеризующим агентом [30] В то же время, известно, что частично расщепленный трипсином О-актин теряет способность к полимеризации [31]. Если считать образование новой фазы, агрегатов, при сорбции актина на мембране неким аналогом его полимеризации, то представляло интерес сравнить влияние на каналоформерную активность СМЕ нативного и расщепленного трипсином О-актина. На рис 9 приведены кинетические кривые изменения трансмембранного тока после 1 введения расщепленного (кривая Л) и нативного О-актина (кривая Б) с транс-

стороны СМЕ-модифицированной ФС/ФЭ-мембраны. При добавке нативного О-актина наблюдается примерно 1700-кратное увеличение СМЕ-индуцированного трансмембранного тока, а добавка расщепленного О-актина приводит лишь к 10-кратному росту гока. Существенное увеличение СМЕ-индуцированного тока в присутствии нативного О-актина, по сравнению с расщепленным, можно считать подтверждением гипотезы о необходимости агрегации адсорбированных на транс-монослое мембраны молекул для увеличения каналоформерной активности СМЕ. Введение трипсина в транс-отделение камеры после завершения сорбции актина и достижения стационарного значения трансмембранного тока вызывало уменьшение тока примерно на 30% (рис. 9, кривая Б). Этот факт свидетельствует о необратимом характере сорбции актина на липидной мембране, поскольку в противоположном случае наблюдался бы спад СМЕ-индуцированного тока до величины такового в случае расщепленного актина, а также о существенной недоступности сорбировавшихся молекул актина для расщепления трипсином.

Кинетические параметры СМЕ-канала после сорбции соединений, ( увеличивающих каналоформерную активность СМЕ

Как упоминалось ранее, при транс-добавке к отрицательно заряженным СМЕ-модифицированным мембранам глобулярного или фибриллярного актина ^ существенно больше такового в отсутствие актина (9±3 мин, рис. 11 А) и равно 130±40 мин или 200±20 мин, соответственно. Аналогичные изменения наблюдаются и при транс-добавке ПЛТ или ПК, с той лишь разницей, что достижение плато происходит за 30-40 мин (рис. 6). Значительное увеличение числа функционирующих СМЕ-каналов при транс-добавке актина (рис. 1) наблюдается через некоторый промежуток времени, т.н. "латентный период", т (рис. 10). Разумно полагать, что

латентный период отражает время, необходимое для процессов сорбции молекул

актина на монослое и формирования ими зародышей агрегатов. На рис. 10

представлена зависимость трансмембранпого тока от времени при трех

последовательных т/?я«с-добавках глобулярного актина, но латентный период

наблюдается только после первой добавки актина. О продолжении процесса сорбции

актина в результате второй и последующих добавок актина свидетельствует

последующий рост трансмембранного тока. Поскольку латентный период при

последующих добавках актина отсутствует, можно считать, что дальнейший рост

числа функционирующих СМЕ-каналов происходит в результате увеличения размера

образовавшихся на мембране агрегатов, более быстрого по сравнению с процессом

Рис. 10. Кинетика тока, протекающего через мембрану, модифицированную СМЕ, при трех последовательных трансдобавках G-актина. Концентрации G-актина после 1-й, 2-й и 3-й добавки равны 2, 4 и б мкг/мл Величина латентного периода г определялась как время от момента добавки актина (указанного стрелками) до начала линейного роста актин-индуцированного тока (пересечение пунктирных и штриховых линий) V = 0 - 60 100 150 200 50 мВ Состав водного раствора 0.1 М t, МИН NaCl, рНб.

образования зародышей агрегатов. Следует отметить, что при транс-добавках ПК или ПШ латентный период практически отсутствует (рис. 6). Это говорит о том, что в случае полимеров образование зародышей агрегатов происходит за время, сравнимое с временем, необходимым для их сорбции Счшая сорбцию и последующую агрегацию актина лимитирующей стадией процесса роста числа СМЕ-каналов, можно предполагать, что введение СМЕ к БЛМ после завершения формирования агрегатов актина приведет к более быстрому достижению стационарного значения трансмембранного тока. Дейавшельно, при введении СМЕ через 150 мин после транс-добавки G-актина, или через 210 мин после F-актина (т.е. через период времени, необходимый для сорбции этих веществ) величина t,,,, равнялась таковой в отсутствие актина (рис. 11 Б, В). Этот факт позволяет говорить о том, что наблюдаемая на рис. 11 Б, В кинетика трансмембранног о тока обусловлена только открыванием СМЕ-каналов.

Ранее было установлено, что образование СМЕ-каналов из непроводящего состояния (предшественника) в первом приближении описывается уравнением

dNJt)/dt = kNpr-pNJt)

(2)

где к и р константы скорости открывания и закрывания СМЕ-канала, соответственно, 0 - число функционирующих СМЕ-каналов в момент времени г, Л'?„. - число предшественников СМЕ-каналов на г/ис-монослое мембраны [23] Решение уравнения (2) с учетом начального условия А^/,(0) = 0 приводит к экспоненциальному закону изменения числа каналов во времени:

= (3)

Уравнение 3 позволяет провести сравнение кинетических параметров СМЕ-каналов в отсутствие в- или Р-актина и в условиях равновесия по адсорбции этих веществ.

мин

I, мин

ад/лг н

мин

Рис. 11. Зависимость нормированного числа СМЕ-каналов (^(О/^^гг,)) от времени в отсутствие (А) и в равновесии по адсорбции С- (Б) или Р-актина (В) с трансстороны ФС/ФЭ-мембраны.

со) - отношение числа каналов в момент времени I к числу каналов при стационарном значении проводимости Вставки на рисунках А, Б и В - результат обработки кривых по ур (3) Концентрации СМЕ 5 мкг/мл (А) и 0 8 мкг/мл (Б, В), в- (Б) и Р-актина (В) 4 мкг/мл У= 50 мВ Состав водного раствора 0 1 М ЫаС1, рН 6

Величины р, рассчитанные из кривых, приведенных на вставках рис. 11 для СМЕ-модифицированных мембран как в присутствии с транс-стороны в- или Р-актина, так и в отсутствии этих веществ

оказались совпадающими в пределах погрешности измерений (р = 0.30±0.04 мин-1) [21]. Аналогичные значения р наблюдались и в системах, эквилибрированных с ПК или ПЛТ (р = 0.27±0.03 мин-1) [27]. Кроме константы р, уравнение (2) содержит два параметра, которые мо1у1 меняться при транс-добавке актина или полимеров' !\'рг и к. В общем случае в уравнении (2) Ырг можно замени гь на "эффективную концентрацию предшественника" \к(Са)!к\ А'рг(Са), где Са показывает возможное влияние

концентрации актина и полиионов, С„, на величины Ирг и к. В результате такой замены решение уравнения (2) не изменяет своей качественной формы. Это обстоятельство позволяет формально трактовать наблюдаемый "эффект актина" как увеличение "сродства" мембраны к предшественнику при транс-добавке актина, ПК или ПЛТ без дальнейшей детализации механизма влияния этих веществ; за счет ли увеличения концентрации №рг или константы к, либо совместного влияния на оба этих параметра [21]

Проведен анализ данных по кинетике увеличения проводимости мембран в наименее сложных для описания условиях отсутствия латентного периода (т е. после образования на мембране агрегатов актина) - условиях, отвечающих второй и последующим добавкам актина с транс-стороны мембраны (см. рис 10). Аналогичная обработка кинетических данных выполнена для ПК или ПЛТ, при введении даже первой добавки которых латентный период практически отсутствует (см рис 6) Полученные результаты показали, что при транс-добавке актина рост проводимости мембран обусловлен увеличением размеров агрегатов в резульгаге непосредственной сорбции в них молекул актина, находящихся в растворе, а при транс-цобавке ПК или ПЛТ - за счет включения в агрегат молекул полимера, сорбировавшихся на мембране [21]. Эти выводы, полученные из проведенного анализа кинежческих результатов, подтверждают правильность и общность механизма действия актина, ПЛТ и ПК на каналоформерную активное 1ь СМЕ, предложенного первоначально на основании данных по их равновесной адсорбции.

Таким образом, согласно предложенному механизму молекулы актина необратимо сорбируются на БЛМ за счет гидрофобных взаимодействий и образуют агрегаты на ее поверхности. После образования зародышей а1регатов дальнейшая сорбция актина приводит к увеличению размеров агрегатов (а не их числа) до достижения ими равновесных значений. Образование на транс-монослое агрегатов

приводит к изменениям мембраны, которые сопровождаются увеличением эффективной концентрации предшественника на цис-стороне мембраны, и, соответственно, ростом числа функционирующих СМЕ-каналов

ВЫВОДЫ

1. Проводимость БЛМ, модифицированных с цис-стороны фитотоксинами сирингомицином Е, сирингостатином А, сирингопептином 22А или сиринготоксином Б, существенно увеличивается при введении F- или G-актина с транс-стороны мембраны и не изменяется при введении актина с г/мс-стороны.

2. Актин-индуцированное увеличение проводимости СМЕ-модифицированных мембран обусловлено только ростом числа функционирующих СМЕ-каналов.

3. Благодаря гидрофобным белок-липидным взаимодействиям актин кооперативно сорбируется на БЛМ с образованием агрегатов, что говорит о возможности непосредственного взаимодействия глобулярного и фибриллярного актина с мембраной. Сорбция актина на мембране имеет необратимый характер

4 Согласно предложенной теоретической модели, после образования зародышей агрегатов дальнейшая сорбция актина приводит к увеличению размеров агрегатов, а не их числа. Образование на транс-монослое агрегатов приводит к росту эффективной концентрации предшественника каналов на мембране, что увеличивает число функционирующих СМЕ-каналов.

5. Полученные результаты позволяют полагать, что кортикальный актин клеток-мишеней может участвовать в биологической активности липодепсипептидов, продуцируемых Pseudomonas syringae.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zasloff М 2002 Nature. 415: 389-395. 2. Matsuzaki К. 1999. Biochim et biophys. acta. 1462: 1-10 3 Sobko A.A. et al. 2006. J. Bio!. Chem. 281- 14408- 14416. 4 Zhang L„ Takemoto JY 1987. Phytopathology. 77 297-303 5 Hutchison M.L. et al 1995 Mol. Plant-Microbe Interact 8:610-620.6 Carpancto A et al 2002. J Membr Biol 188-237-48. 7. Feigin A.M. et al. 1996. J. Membr. Biol. 149: 41-47. 8. Щагина Л.В и др. 1998. Биол. мембраны. 15: 433-446. 9. Гурьнев Ф.А. и др. 2002. Цитология. 44 296304. 10. Malev V.V. et al. 2002. Biophys. J. 82: 1985-1994. 11. Feigin A.M. et al. 1997.

Biochim. et biophys acta 1324' 102-110 12 Negulyaev et al. 2000. J. Biol. Chem. 275' 40933-40937 13 Staruschenko A V. et al. 2005. Biochim. et biophys acta. 1669: 53-60. 14. Sorensen KN et al 1996. Antimicrob. Agents Chemother. 40: 2710 2713 15. Pardee JD„ Spudich J.A 1982 Methods Enzymol. 85' 164-181. 16. Туроверов К К. и др 1998 Цитология 40- 806-817 17. Mornet D , Ue К. 1984 Proc. Natl. Acad. Sci USA. 81: 3680-3684. 18 Montal M„ Mueller P. 1972. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65: 3561-3566. 19. Гурьнев Ф.А., Бессонов A.H и др. 2003. Биол. мембраны 20: 425-432. 20. Бессонов АН. и др. 2004. Цитология. 46: 628-633. 21. Bessonov A.N. et al. 2006 Eur. Biophys. J. 35: 382-392 22 Schagina L.V. et al. 2003. Bioelectrochemistry 60:21-27.23. МалевВ.В. и др 2000 Биол мембраны. 17:653-665.24 St-Onge D., Gicquaud С. 1990. Biochem. Biophys. Res Commun 167-40-47 25 Bouchard M. et al 1998. Biochemistry. 37: 3149-3155. 26 Гурьнев ФА и др. 2002. Биол. мембраны 19- 244-250. 27 Бессонов АН и др. 2006. Биол. мембраны. 23- 248-257 28. Chang С.A., Chan S.I. 1974. Biochemistry. 13: 4381-4385. 29. Гурьнев Ф.А., Бессонов A.H. и др. 2004. Биол. мембраны 21- 247-254 30. Renault A. et al. 1999 Biophys. J 76- 1580-1590. 31. Jacobson G.R., Rosenbusch J P 1976. Proc. Natl. Acad Sci. USA. 73: 2742-2746.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. ФА. Гурьнев, А.Н. Бессонов, И.М. Кузнецова, В.В. Малев, В.П. Першина, Г.П. Пинаев, Д Такемото, А.В Тихомирова, К.К Туроверов, Л.В Щагина. 2003. Влияние актина и полиионов на каналоформерную активность сирингомицина Е в бислойных линидных мембранах Биологические мембраны. 20: 425-432.

2. Ф.А. Гурьнев, А.Н. Бессонов, Д. Такемото, Л.В. Щагина, В.В. Малев. 2004. Проводимость ионных каналов, индуцируемых сирингомицином F,, в асимметричных по поверхностному заряду бислойных липидных мембранах. Биологические мембраны. 21: 247-254.

3. А.Н. Бессонов, Ф.А. Гурьнев, И.М Кузнецова, Дж. Такемото, К.К. Туроверов, В В. Малев, Л.В. Щагина. 2004. Взаимодействие фибриллярного актина с липидным бислоем вызывает увеличение каналоформерной активности сирингомицина Е. Цитология. 46: 628-633

4. A.N. Bessonov, L.V. Schagina, J Y Takemoto, P.A. Gurnev, I M Kuznetsova, K.K. Turoverov, V.V. Malev. 2006a. Actin and amphiphilic polymers influence on channel formation by syringomycin E in lipid bilayers. European Biophysics Journal 35: 382-392.

5. А.Н. Бессонов, JI В. Щагина, К К. Туроверов, И М Кузнецова, Д. Такемото, В В. Малев. 2006. Влияние кооперативной адсорбции макромолекул на каналоформеную активность сирингомицина Е в бислойных липидных мембранах. Биологические мембраны 23: 248-257.

6. A.N. Bessonov, Ph A. Gurnev, V.V. Malev, J.Y. Takemoto, L.V. Schagina. 2004. Konig's polyanion modulates syringomycin E - induced conductance of lipid bilayers. Abstracts of the 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, Baltimore, February 1418. Biophys. J. 86:206a.

7. А.Н. Бессонов Роль фибриллярного актина в каналоформерной активности фитотоксина сирингомицина Е 2004 Тезисы 8-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых Пущино, 17-21 мая 2004 г 77.

8. L V Schagina, A.N. Bessonov, Ph.A Gurnev, I.M Kuznetsova, V V. Malev, J Y. Takemoto, K.K Turoverov 2004. G- and F-actin affects channel-forming activity of syringomycin E in model lipid membranes. Abstracts of international symposium "Biological motility", Puschino, May23 - June 1. 62-63

9. JI.B. Щагина, А.Н. Бессонов, Ф.А. Гурьнев, И.М. Кузнецова, К К Туроверов, В В. Малев 2004. Влияние актина на каналоформерную активность фитотоксинов, продуцируемых Pseudomonas syringae. 3-й съезд биофизиков России Воронеж. 24-29 июля . 1: 306-307

10. A.N. Bessonov, VN. Babakov, 1 М. Kuznetsova, K.K. Turoverov, V.V. Malev, J.Y. Takemoto, L.V. Schagina 2005 Structural specificity of G-actin adsorption on model lipid membranes Abstracts of the 49Ul Annual Meeting of the Biophysical Society, Long Beach, February 12-16. Biophys. J. 88: 425a.

11. A.N. Bessonov, L.V Schagina, P.A Gurnev, J.Y. Takemoto, IM Kuznetsova, К К. Turoverov, V.V. Malev 2006b. Cooperative adsorption of actin and synthetic polymers on syringomycin E modified planar lipid bilayers. Abstracts of the 50th Annual Meeting of the Biophysical Society, Salt Lake City, February 18-22. Biophys. J. 90: 62a.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 23.05.2006. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 570Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14 Тел./факс: 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бессонов, Андрей Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна.

Теоретическое и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизм действия антимикробных пептидов. Образование трансмембранных пор.

1.2. Биологическая активность фитотоксинов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae.

1.3. Образование трансмембранных пор сирингомицином Е.

• 1.4. Связь каналоформерной активности сирингомицина Е с его биологической активностью.

1.5 Взаимодействие цитоскелета с цитоплазматической мембраной. Регуляция связывания актина.

1.5.1. Взаимодействие актина с мембраной через актин-связывающие ^ белки.

1.5.2. Непосредственное взаимодействие актина с липидным бислоем.

1.6. Влияние цитоскелета на ионный транспорт.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы.

2.2. Методы исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Эффект G- и F-актина на проводимость токсинмодифицированных БЛМ.

3.2. Роль электростатических и гидрофобных взаимодействий в "эффекте актина".

3.3. Влияние заряженных полимеров на проводимость СМЕ-канала при

Ф цис- и транс-добавке.

3.4. Кооперативная адсорбция на БЛМ соединений, увеличивающих каналоформерную активность СМЕ.

3.5. Анализ процесса увеличения размеров агрегатов, образованных актином, ПЛТ или ПК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль белок-липидных взаимодействий в регуляции каналоформерной активности сирингомицина Е"

Актуальность исследования

Антимикробные пептиды природного и синтетического происхождения являются предметом многочисленных исследований, направленных на установление молекулярных механизмов их биологической активности (Zasloff, 2002). Модель взаимодействия пептида с клеткой-мишенью предполагает, что липиды внешнего монослоя цитоплазматической мембраны участвуют в образовании трансмембранных пор при встраивании пептида в мембрану. Активность многих пептидов зависит от заряда липидных молекул, их спонтанной кривизны, а также от наличия стеринов в составе мембраны, что определяет селективность их действия (Matsuzaki, 1999; Sobko et al., 2006). Типичным представителем антимикробных пептидов является группа фитотоксинов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae pv. syringae - сирингомицин E (СМЕ), сирингопептин 22А, сирингостатин А и сиринготоксин Б. Цитотоксичность вышеуказанных липодепсипетидов определяется их способностью образовывать ионные поры в плазматической мембране клеток-мишеней (Zhang and Takemoto, 1986; Hutchison et al., 1995; Carpaneto et al., 2002; Гурьнев и др., 2002а).

Использование бислойных липидных мембран (БЛМ) дает возможность моделировать плазматическую мембрану и изучать взаимодействия белков и пептидов с мембраной, а также ответить на вопрос о факторах, влияющих на биологическую активность экзогенных каналоформеров. Введение фитотоксина с одной (цис-) стороны бислойной липидной мембраны приводит к образованию ионных каналов (Feigin et al., 1996; Щагина и др., 1998). Каналы, образуемые фитотоксинами, характеризуются потенциал-зависимостью их открывания/закрывания, преимущественно анионной селективностью, зависимостью проводимости от липидного состава БЛМ и трансмембранной разности потенциалов (Щагина и др., 1998; Malev et al., 2002). Свойства каналов зависят от стеринового состава мембран, так в холестерин-содержащих бислоях скорость формирования каналов, образованных сирингомицином Е (СМЕ-каналов), гораздо ниже, чем в мембранах, содержащих эргостерин (Feigin е1 а1., 1997). Сравнение коэффициентов проницаемости модифицированных СМЕ эритроцитарных мембран и БЛМ для катионов при одинаковых молекулярных соотношениях токсин/липид показало, что ионная проницаемость эритроцитарных мембран существенно выше, чем БЛМ. Можно предположить, что, помимо липидного состава мембран, активность сирингомицина Е определяется внутриклеточными структурами, например, элементами цитоскелета, взаимодействующего с мембраной. Известно, что функционирование многих ионных каналов клетки зависит от белков цитоскелета. Предварительные исследования показали, что мембранная активность сирингомицина Е зависит от присутствия глобулярного актина с противоположной введению токсина стороны БЛМ (вишеу е1 а1., 2003).

В данной работе изучено влияние белков цитоскелета на мембранную активность сирингомицина Е (СМЕ) и его аналогов. Данные, свидетельствующие о связи между динамическими перестройками цитоскелета и активностью ионных каналов в мембране, позволяют говорить о непосредственном участии белков цитоскелета в процессах ионного транспорта (Ие£и1уаеу е1 а1., 2000; 81агшс11епко е! а1., 2005). Тем не менее, мало известно о возможности влияния внутриклеточных белков на функционирование экзогенных соединений, что определяет актуальность данного исследования.

Цель и задачи исследования

1) исследовать изменение проводимости БЛМ, модифицированных сирингомицином Е и его аналогами, при введении в околомембранный раствор в- или Б-актина, других белков цитоскелета, а также синтетических полимеров, моделирующих различные участки белковых молекул;

3) изучить кинетику тока при различной последовательности введения СМЕ и соединений, увеличивающих каналоформерную активность токсина, а также зависимость трансмембранного тока от концентрации актина и полимеров.

Научная новизна

Впервые показано, что каналоформерная активность липодепсипептидов СМЕ, СП22А, ССА и СТБ в модельных липидных мембранах регулируется актином, но не альфа-актинином или винкулином - белками, также входящими в состав цитоскелета. Сорбция актина на бислойной липидной мембране имеет кооперативный характер и сопровождается образованием агрегатов сорбирующегося вещества, главным образом, за счет гидрофобных белок-липидных взаимодействий. Предложен механизм влияния актина на каналоформерную активность фитотоксинов, согласно которому агрегаты актина изменяют структуру мембраны, что приводит к увеличению числа предшественников фитотоксиновых каналов и (или) константы скорости их открывания. Данные, полученные в ходе работы, показывают, что биологическое действие липодепсипетидов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae pv. syringae, может регулироваться внутриклеточными компонентами клеток-мишеней.

Теоретическое и практическое значение

Полученные данные о влиянии актина на каналоформерную активность фитотоксинов в модельных мембранах развивают представления о роли кортикального актина в регуляции активности ионных каналов и образовании экзогенными соединениями липидных пор в клеточных мембранах. Несомненную ценность представляют сведения о возможности непосредственного взаимодействия глобулярного и фибриллярного актина с мембраной. Показано, что амфифильные синтетические полимеры - полианион Кенига и полилизинтриптофан, могут быть использованы для тестирования вклада заряженных и гидрофобных групп белковых молекул при их взаимодействии с мембраной. Результаты, полученные в ходе исследования, показали, что актин формирует на мембране агрегаты, и способность к агрегации является необходимым условием влияния на активность СМЕ.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Бессонов, Андрей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Проводимость Б JIM, модифицированных с цис-стороны фитотоксинами сирингомицином Е, сирингостатином А, сирингопептином 22А или сиринготоксином Б, существенно увеличивается при введении F-или G-актина с /яраяс-стороны мембраны и не изменяется при введении актина с z/ис-стороны.

4. Согласно предложенной теоретической модели, после образования зародышей агрегатов дальнейшая сорбция актина приводит к увеличению размеров агрегатов, а не их числа. Образование на транс-монослое агрегатов приводит к росту эффективной концентрации предшественника каналов на мембране, что увеличивает число функционирующих СМЕ-каналов.

3.6. Заключение.

Таким образом, проведенные исследования показали, что каналоформерная активность СМЕ, токсина, продуцируемого бактериями Pseudomonas syringae pv. syringae может регулироваться внутриклеточными компонентами, в частности белками цитоскелета, G- и F-актином, но не альфа-актинином или винкулином. Об этом говорит зависимость числа функционирующих СМЕ-каналов от концентрации актина, введенного только с транс-стороны мембраны, модифицированной СМЕ с цис-стороны ("эффект актина"). Транс-добавки G- или F-актина увеличивают проводимость мембран, модифицированных другими липодепсипептидами - сирингопептином 22А, сирингостатином А или сиринготоксином Б, факт, указывающий на общность механизма действия актина на эту группу токсинов.

Анализ кинетических параметров СМЕ-каналов в отсутствие в- или Б-актина и в условиях равновесия по адсорбции актина на мембране показал, что рост числа функционирующих СМЕ-каналов в присутствии актина происходит в результате увеличения концентрации предшественников СМЕ-каналов и (или) константы скорости их открывания. Использование синтетических полимеров, моделирующих различные участки молекулы актина, позволило сделать вывод о превалирующей роли гидрофобных белок-липидных взаимодействий в сорбции актина на мембране. Отсутствие влияния на каналоформерную активность СМЕ других белков, сорбция которых на мембране также обусловлена гидрофобными взаимодействиями, заставило считать наличие гидрофобных взаимодействий в сорбции актина необходимым, но не достаточным условием феномена увеличения каналоформерной активности токсина. Обнаруженный сигмоидальный вид зависимости числа функционирующих СМЕ-каналов от концентрации актина позволил связать увеличение каналоформерной активности СМЕ с образованием агрегатов на поверхности мембраны, а теоретический анализ наблюдаемых изменений позволил предложить гипотезу увеличения каналоформерной активности токсина. "Эффект актина" обусловлен изменением структуры мембраны, вызванным кооперативной сорбцией на ней актина за счет гидрофобных взаимодействий и образованием новой фазы - агрегатов в результате дополнительных белок-белковых взаимодействий, т.е. обязательным условием "эффекта актина" является способность сорбирующихся молекул к агрегации (полимеризации) на поверхности мембраны. Подтверждением этой гипотезы явился тот факт, что неспособный к агрегации расщепленный трипсином актин, оказывает незначительный, по сравнению с в-актином, эффект на каналоформерную активность СМЕ. Кинетический анализ роста числа СМЕ-каналов от концентрации сорбирующихся на мембране соединений позволил сделать заключение о природе роста размеров агрегатов - структур, наличие которых было обнаружено в результате обработки данных по равновесной адсорбции. Рост размера агрегата, образованного молекулами актина, происходит за счет их непосредственной адсорбции из раствора.

Следует специально отметить установленную в работе возможность непосредственного взаимодействия в- и Б- актина с мембраной и превалирующую роль гидрофобных взаимодействий в этом процессе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бессонов, Андрей Николаевич, Санкт-Петербург

1. Бессонов А.Н., Гурьнев Ф.А., Кузнецова И.М., Такемото Дж., Туроверов К.К., Малев В.В., Щагина Л.В. 2004. Взаимодействие фибриллярного актина с липидным бислоем вызывает увеличение каналоформерной активности сирингомицина Е. Цитология. 46:628633.

2. Бессонов А.Н., Щагина Л.В., Туроверов К.К., Кузнецова И.М., Такемото Д., Малев В.В. 2006. Влияние кооперативной адсорбции макромолекул на каналоформеную активность сирингомицина Е в бислойных липидных мембранах. Биол. мембраны. 23:248-257.

3. Гурьнев Ф.А., Каулин Ю.А., Тихомирова A.B., Вангспа Р., Такемото Д., Малев В.В., Щагина Л.В. 2002а. Активность токсинов,продуцируемых Pseudomonas syringae pv. syringae, в модельных иклеточных мембранах. Цитология. 44:296-304.

4. Гурьнев Ф.А., Каулин Ю.А., Такемото Д., Щагина Л.В., Малев В.В. 2002b. Роль заряда и дипольного момента мембранных липидов в воротных свойствах ионных каналов, индуцируемых сирингомицином Е. Биол. мембраны. 19:244-250.

5. Гурьнев Ф.А., Бессонов А.Н., Такемото Д., Щагина Л.В., Малев В.В. 2004. Проводимость ионных каналов, индуцируемых сирингомицином Е, в асимметричных по поверхностному заряду бислойных липидных мембранах. Биол. мембраны. 21:325-332.

6. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. 1981. Динамическая структуралипидного бислоя. Изд-во Наука. Москва.

7. Малев В.В., Матвеева А.И. 1981. Кинетика растекания капель на свободных жидких пленках. ДАН СССР. 261:685-689.

8. Малев В.В., Матвеева А.И. 1983. Кинетика образования бислойной липидной мембраны. Биофизика. 28:50-55.

9. Малев В.В., Каулин Ю.А., Безруков С.М., Гурьнев Ф.А., Такемото Д., Щагина JI.B. 2000. Кинетика открывания закрывания каналов, образованных сирингомицином Е в липидных бислоях. Биол. мембраны. 17:653-665.

10. Малев В.В., Каулин Ю.А., Гурьнев Ф.А., Безруков С.М., Такемото Д., Щагина JI.B. 2001. Эффекты пространственного распределения заряда в проводимости одиночных каналов, образованных сирингомицином Е в липидных бислоях. Биол. мембраны. 18: 145153.

11. Мальцева Е.А., Антоненко Ю.Н., Мелик-Нубаров Н.С., Ягужинский JI.C. 2002. Влияние синтетических амфифильных полианионов на транспорт ионов через плоскую бислойную липидную мембрану. Биол. мембраны. 19: 347-350.

12. Русанов А.И. 1967. Фазовое равновесие и поверхностные явления. Изд-во Химия. Ленинград.

13. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофеюк A.C., Кузнецова И.М. 1998. Комплекс аппаратных и программных средств для изучения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 40:806-817.

14. Фрумкин А.Н., Дамаскин Б.П. 1967. Адсорбция органических соединений на электродах. В книге "Современные основы электрохимии". Изд-во Мир. Москва.

15. Щагина Л.В., Каулин Ю.А., Фейгин A.M., Такемото Д., Бранд Д., Малев В.В. 1998. Зависимость свойств ионных каналов, образованных антибиотиком сирингомицином Е в липидныхбислоях, от концентрации электролита в водной фазе. Биол. мембраны. 15:433-446.

16. Axelrod D., Wang M.D. 1994. Reduction-of-dimensionality kinetics at reaction-limited cell surface receptors. Biophys. J. 66:588-600.

17. Babiychuk E.B., Draeger A. 2000. Annexins in cell membrane dynamics. Ca(2+)-regulated association of lipid microdomains. J. Cell Biol. 150:1113-11124.

18. Backman P.A., DeVay J.E. 1971. Studies on the mode of action and biogenesis of the phytotoxin syrigomycin. Physiol. Plant Pathol. 1:215234.

19. Bakolitsa C., de Pereda J.M., Bagshaw C.R., Critchley D.R., Liddington R.C. 1999. Crystal structure of the vinculin tail suggests a pathway for activation. Cell. 99:603-613.

20. Bakolitsa C., Cohen D.M., Bankston L.A., Bobkov A.A., Cadwell G.W., Jennings L., Critchley D.R., Craig S.W,. Liddington R.C. 2004. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430:583586.

21. Barzic M.R., Guittet E. 1996. Structure and activity of persicomycins, toxins produced by a Pseudomonas syringae pv. persicae/Prunus persica isolate. Eur. J. Biochem. 239:702-709.

22. Basanez G., Sharpe J.C., Galanis J., Brandt T.B., Hardwick J.M., Zimmerberg J. 2002. Bax-type apoptotic proteins porate pure lipidbilayers through a mechanism sensitive to intrinsic monolayer curvature. J. Biol. Chem. 277:49360^9365.

23. Bechinger B., Zasloff M., Opella S.J. 1993. Structure and orientation of the antibiotic peptide magainin in membranes by solid-state nuclearmagnetic resonance spectroscopy. Protein Sei. 2:2077-2084.

24. Bender C.L., Young S.A., Mitchell R.E. 1991. Conservation of Plasmid DNA Sequences in Coronatine-Producing Pathovars of Pseudomonas syringae. Appl. Environ. Microbiol. 57:993-999.

25. Bender C.L., Alarcon-Chaidez F., Gross D.C. 1999. Pseudomonas syringae Phytotoxins: mode of action, regulation, and biosynthesis by peptide and polyketide synthetases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63:266292.

26. Berdiev B.K., Prat A.G., Cantiello H.F., Ausiello D.A., Fuller C.M., Jovov B., Benos D.J., Ismailov I.I. 1996. Regulation of epithelial sodium channels by short actin filaments. J. Biol. Chem. 271:17704-17710.

27. BessalIe R., Kapitkovsky A., Gorea A., Shalit I., Fridkin M. 1990. All-D-magainin: chirality, antimicrobial activity and proteolytic resistance. FEBSLett. 274:151-155.

28. Bessonov A.N., Schagina L.V., Takemoto J.Y., Gurnev P.A., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Malev V.V. 2006. Actin and amphiphilic polymers influence on channel formation by syringomycin E in lipid bilayers. Eur. Biophys. J. 35: 382-392.

29. Bezrukov S.M. 2000. Functional consequences of lipid packing stress. Curr. Opin. In Colloid and Interface Sei. 5:237-243.

30. Bidwai A.P., Takemoto J.Y. 1987. Bacterial Phytotoxin, syringomycin, induces a protein kinase-mediated phosphorylation of red beet plasma membrane polypeptides. Proc Natl Acad Sei USA. 84:6755-6759.

31. Bidwai A.P., Zhang L., Bachmann R.C., Takemoto J.Y. 1987. Mechanism of Action of Pseudomonas syringae Phytotoxin, syringomycin: stimulation of red beet plasma membrane ATPase activity. Plant Physiol. 83:39-43.

32. Blasko K., Schagina L.V., Agner G., Kaulin Y.A., Takemoto J.Y. 1998. Membrane sterol composition modulates the pore forming activity of syringomycin E in human red blood cells. Biochim. Biophys. Acta. 1373:163-169.

33. Bouchard M., Pare C., Dutasta J.P., Chauvet J.P., Gicquaud C., Auger M. 1998. Interaction between G-actin and various types of liposomes: A 19F, 31P, and 2H nuclear magnetic resonance study. Biochemistry. 37:31493155.

34. Bretscher A., Edwards K., Fehon R.G. 2002. ERM proteins and merlin: integrators at the cell cortex. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3:586-599.

35. Buber E., Stindl A., Acan N.L., Kocagoz T., Zocher R. 2002. Antimycobacterial activity of lipodepsipeptides produced by Pseudomonas syringae pv syringae B359. Nat. Prod. Lett. 16:419-423.

36. Camoni L., Di Giorgio D., Marra M., Aducci P., Ballio A. 1995. Pseudomonas syringae pv. syringae phytotoxins reversibly inhibit the plasma membrane H+-ATPase and disrupt unilamellar liposomes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 214: 118-124.

37. Cantiello H.F., Stow J.L., Prat A.G., Ausiello D.A. 1991. Actin filaments regulate epithelial Na+ channel activity. Am. J. Physiol. 261:882-888.

38. Cantiello H.F., Prat A.G., Bonventre J.V., Cunningham C.C., Hartwig J.H., Ausiello D.A. 1993. Actin-binding protein contributes to cell volume regulatory ion channel activation in melanoma cells. J. Biol. Chem. 268:4596-4599.

39. Cantiello H.F. 2001. Role of actin filament organization in CFTR activation. Pflugers Arch. 443:75-80.

40. Carpaneto A., Dalla Serra M., Menestrina G, Fogliano V., Gambale F. 2002. The phytotoxic lipodepsipeptide syringopeptin 25A from Pseudomonas syringae pv syringae forms ion channels in sugar beet vacuoles. J. Membr. Biol. 188:237-248.

41. Chang C.A., Chan S.I. 1974. Nuclear magnetic resonance studies of the interactions of sonicated lecithin bilayers with poly(L-glutamic acid). Biochemistry. 13:4381^385.

42. Cortese J.D., Schwab B. 3rd, Frieden C„ Elson E.L. 1989. Actin polymerization induces a shape change in actin-containing vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:5773-5777.

43. Cram E.J., Schwarzbauer J.E. 2004. The talin wags the dog: new insights into integrin activation. Trends Cell Biol. 14:55-57.

44. Critchley D.R. 2000. Focal adhesions the cytoskeletal connection. Curr. Opin. Cell Biol. 12:133-139.

45. DeMali K.A. 2004. Vinculin a dynamic regulator of cell adhesion. Trends Biochem. Sci. 29:565-567.

46. Denker S.P., Barber D.L. 2002. Ion transport proteins anchor and regulate the cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 14:214-220.

47. Duclohier H. 2006. Bilayer lipid composition modulates the activity of dermaseptins, polycationic antimicrobial peptides. Eur. Biophys. J. 35:401—409.

48. Ehrenstein G., Lecar H. 1974. Electrically gated ionic channels in lipid bilayers.1. Q. Rev. Biophys. 10:1-34.

49. Feigin A.M., Takemoto J.Y., Wangspa R., Teeter J.H., Brand J.G. 1996. Properties of voltage-gated ion channels formed by syringomycin E in planar lipid bilayers. J Membr Biol. 149:41-47.

50. Feigin A.M., Schagina L.V., Takemoto J.Y., Teeter J.H., Brand J.G. 1997.The effect of sterols on the sensitivity of membranes to the channelforming antifungal antibiotic, syringomycin E. Biochim. et biophys. acta. 1324: 102-110.

51. Fievet B.T., Gautreau A., Roy C., Del Maestro L., Mangeat P., Louvard D., Arpin M. 2004. Phosphoinositide binding and phosphorylation act sequentially in the activation mechanism of ezrin. J. Cell Biol. 164:653659.

52. Finkelstein A., Holz R. 1973. Aqueous pores created in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. Membranes. 2:377-408.

53. Fox R.O., Richards F.M. 1982. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-A resolution. Nature. 300:325-330.

54. Fukami K., Endo T., Imamura M., Takenawa T. 1994. alpha-actinin and vinculin are PIP2-binding proteins involved in signaling by tyrosine kinase. J. Biol. Chem. 269:1518-1522.

55. Galli A., DeFelice L.J. 1994. Inactivation of L-type Ca channels in embryonic chick ventricle cells: dependence on the cytoskeletal agents colchicine and taxol. Biophys. J. 67:2296-2304.

56. Gazit E., Boman A., Boman H.G., Shai Y. 1995. Interaction of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI with phospholipid vesicles. Biochemistry. 34:11479-11488.

57. Gerke V., Moss S.E. 2002. Annexins: from structure to function. Physiol. Rev. 82:331-371.

58. Ghosh J.K., Shaool D., Guillaud P., Ciceron L., Mazier D., Kustanovich I., Shai Y., Mor A. 1997. Selective cytotoxicity of dermaseptin S3 toward intraerythrocytic Plasmodium falciparum and the underlying molecular basis. J. Biol. Chem. 272:31609-31616.

59. Gicquaud C. 1993. Actin conformation is drastically altered by direct interaction with membrane lipids: a differential scanning calorimetry study. Biochemistry. 32:11873-11877.

60. Gicquaud C., Wong P. 1994. Mechanism of interaction between actin and membrane lipids: a pressure-tuning infrared spectroscopy study. Biochem. J. 303:769-774.

61. Gicquaud C. 1995. Does actin bind to membrane lipids under conditions compatible with those existing in vivo? Biochem. Biophys. Res. Commun. 208: 1154-1158.

62. Glogauer M., Arora P., Yao G., Sokholov I., Ferrier J., McCulloch C.A.1997. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J. Cell Sci. 110:11-21.

63. Goldmann W.H., Teodoridis J.M., Sharma C.P., Alonso J.L., Isenberg G.1999. Fragments from alpha-actinin insert into reconstituted lipid bilayers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 225-229.

64. Gopalan S., He S.Y. 1996. Bacterial genes involved in the elicitation of hypersensitive response and pathogenesis. Plant Dis. 80:604-609.

65. Greenwood J.A., Theibert A.B., Prestwich G.D., Murphy-Ullrich J.E.2000. Restructuring of focal adhesion plaques by PI 3-kinase. Regulation by Ptdlns (3,4,5)-p(3) binding to alpha-actinin. J. Cell Biol. 150:627-642.

66. Grilley M.M., Stock S.D., Dickson R.C., Lester R.L., Takemoto J.Y.1998. Syringomycin action gene SYR2 is essential for sphingolipid 4hydroxylation in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 273:11062— 11068.

67. Grigoriev P.A., Tarahovsky Y.S., Pavlik L.L., Udaltsov S.N., Moshkov D.A. 2000. Study of F-actin interaction with planar and liposomal bilayer phospholipid membranes. IUBMB Life. 50:227-233.

68. Gross DC. 1991. Molecular and genetic analysis of toxin production by pathovars of Pseudomonas syringae. Annu. Rev. Phytopathol. 29:247278.

69. Guenzi E„ Galli G., Grgurina I., Gross D.C., Grandi G. 1998. Characterization of the syringomycin synthetase gene cluster. A link between prokaryotic and eukaryotic peptide synthetases. J. Biol. Chem. 273: 32857-32863.

70. Hamada K., Shimizu T., Matsui T., Tsukita S., Hakoshima ,T. 2000. Structural basis of the membrane-targeting and unmasking mechanisms of the radixin FERM domain. EMBO J. 19:4449^462.

71. Han X., Li G., Li G., Lin K. Interactions between smooth muscle alpha-actinin and lipid bilayers. Biochemistry. 1997. 36: 10364-10371.

72. Haussler U„ Rivet-Bastide M., Fahlke C., Muller D., Zachar E., Rudel R. 1994. Role of the cytoskeleton in the regulation of CI- channels in human embryonic skeletal muscle cells. Pflugers Arch. 428:323-330.

73. Hille B. 2001. Ion channels of excitable membranes. Sunderland Massachusetts. Sinauer Associates Inc.

74. Hoeflich K.P., Tsukita S., Hicks L., Kay C.M., Tsukita S., Ikura M. 2003. Insights into a single rod-like helix in activated radixin required for membrane-cytoskeletal cross-linking. Biochemistry. 42:11634-11641.

75. Honda M., Takiguchi K., Ishikawa S., Hotani H. 1999. Morphogenesis of liposomes encapsulating actin depends on the type of actin-crosslinking. J. Mol. Biol. 287:293-300.

76. Hutchison M.L., Gross D.C. 1997. Lipopeptide phytotoxins produced by Pseudomonas syringae pv. syringae: comparison of the biosurfactant and ion channel-forming activities of syringopeptin and syringomycin. Mol. Plant-Microbe Interact. 10: 347-354.

77. Jacobson G.R., Rosenbusch J.P. 1976. ATP binding to a protease-resistant core of actin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73:2742-2746.

78. Janmey P.A. 1995. Protein regulation by phosphatidylinositol lipids. Chem. Biol. 2:61-65. *

79. Janmey P.A. 1998. The cytoskeleton and cell signaling: component localization and mechanical coupling. Physiol. Rev. 78:763-781.

80. Johnson R.P., Niggli V., Durrer P., Craig S.W. 1998. A conserved motif in the tail domain of vinculin mediates association with and insertion into acidic phospholipid bilayers. Biochemistry. 37:10211-10222.

81. Kaulin Y.A., Schagina L.V., Bezrukov S.M., Malev V.V., Feigin A.M., Takemoto J.Y., Teeter J.H., Brand J.G. 1998. Cluster organization of ion channels formed by the antibiotic syringomycin E in bilayer lipid membranes. Biophys. J. 74:2918-2925.

82. Kaulin Y.A., Takemoto J.Y., Schagina L.V., Ostroumova O.S., Wangspa R., Teeter J.H., Brand J.G. 2005. Sphingolipids influence the sensitivity of lipid bilayers to fungicide, syringomycin E. J. Bioenerg. Biomembr. 37:339-348.

83. König T., Stipani I., Horvath I., Palmieri F. 1982. Inhibition of mitochondrial substrate anion translocators by a synthetic amphipathic polyanion. J. Bioenerg. Biomembr. 14:297-305.

84. Laliberte A., Gicquaud C. 1988. Polymerization of actin by positively charged liposomes. J. Cell Biol. 106:1221-1227.

85. Lambert S., Davis J.Q., Bennett V. 1997. Morphogenesis of the node of Ranvier: co-clusters of ankyrin and ankyrin-binding integral proteins define early developmental intermediates. J. Neurosci. 17:7025-7036.

86. Latal A., Degovics G„ Epand R.F., Epand R.M., Lohner K. 1997. Structural aspects of the interaction of peptidyl-glycylleucine-carboxyamide, a highly potent antimicrobial peptide from frog skin, with lipids. Eur. J. Biochem. 248:938-946.

87. Lavermicocca P., Iacobellis N.S., Simmaco M., Graniti A. 1997. Biological properties and spectrum of activity of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol. Mol. Plant Pathol. 50:129-140.

88. Le Bihan T., Pelletier D., Tancrede P., Heppell B„ Chauvet J.P., Gicquaud C.R. 2005. Effect of the polar headgroup of phospholipids on their interaction with actin. J. Colloid Interface Sei. 288:88-96.

89. Levitan I., Almonte C., Mollard P., Garber S.S. 1995. Modulation of a volume-regulated chloride current by F-actin. J. Membr. Biol. 1995 147:283-294.

90. Li S., Palmer A.F. 2004. Effect of actin concentration on the structure of actin-containing liposomes. Langmuir. 20:4629-4639.

91. Limozin L., Barmann M., Sackmann E. 2003. On the organization of self-assembled actin networks in giant vesicles. Eur. Phys. J. E. Soft Matter. 10:319-330.

92. Malev V.V., Schagina L.V., Gurnev P.A., Takemoto J.Y., Nestorovich E.M., Bezrukov S.M. 2002. Syringomycin E channel: a lipidic pore stabilized by lipopeptide? Biophys. J. 82:1985-1994.

93. Mangeat P., Roy C., Martin M. 1999. ERM proteins in cell adhesion and membrane dynamics. Trends Cell Biol. 9:187-192.

94. Martel V., Racaud-Sultan C., Dupe S., Marie C., Paulhe F„ Galmiche A., Block M.R., Albiges-Rizo C. 2001. Conformation, localization, and integrin binding of talin depend on its interaction with phosphoinositides. J. Biol. Chem. 276:21217-21227.

95. Matsuzaki K., Yoneyama S., Fujii N, Miyajima K., Yamada K., Kirino Y., Anzai K. 1997. Membrane permeabilization mechanisms of a cyclic antimicrobial peptide, tachyplesin I, and its linear analog. Biochemistry. 36:9799-9806.

96. Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. Biochim. et biophys. acta. 1999. 1462:1-10.

97. Merrifield E.L., Mitchell S.A., Ubach J., Boman H.G., Andreu D., Merrifield R.B. 1995. D-enantiomers of 15-residue cecropin A-melittin hybrids. Int. J. Pept. Protein. Res. 46:214-220.

98. Mitchell R.E. 1991. Implications of toxins in the ecology and evolution of plant pathogenic microorganisms: bacteria. Experientia. 47:791-803.

99. Mittal, S.M., Davis K.R. 1995. Role of the phytotoxin coronatine in the infection of Arabidopsis thaliana by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol. Plant-Microbe Interact. 8:165-171.

100. Miyata H., Hotani H. 1992. Morphological changes in liposomes caused by polymerization of encapsulated actin and spontaneous formation of actin bundles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:11547-11551.

101. Montall M., Mueller P. 1972. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69:3561-3566.

102. Mornet D., Ue K. Proteolysis and structure of skeletal muscle actin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. 81: 3680-3684.

103. Negulyaev Y.A., Vedernikova E.A., Maximov A.V. 1996. Disruption of actin filaments increases the activity of sodium-conducting channels in human myeloid leukemia cells. Mol. Biol. Cell. 7:1857-1864.

104. Negulyaev Y.A., Khaitlina S.Y., Hinssen H., Shumilina E.V., Vedernikova E.A. 2000. Sodium channel activity in leukemia cells is directly controlled by actin polymerization. J Biol Chem. 275:4093340937.

105. Niggli V., Dimitrov D.P., Brunner J., Burger M.M. 1986. Interaction of the cytoskeletal component vinculin with bilayer structures analyzed with a photoactivatable phospholipid. J. Biol. Chem. 261:69126918.

106. Niggli V., Sommer L., Brunner J., Burger M.M. 1990. Interaction in situ of the cytoskeletal protein vinculin with bilayers studied by introducing a photoactivatable fatty acid into living chicken embryo fibroblasts. Eur. J. Biochem. 187:111-117.

107. Niggli V. 2001. Structural properties of lipid-binding sites in cytoskeletal proteins. Trends Biochem. Sci. 26:604-611.

108. Oike M., Schwarz G., Sehrer J., Jost M., Gerke V., Weber K., Droogmans G., Nilius B. 1994. Cytoskeletal modulation of the response to mechanical stimulation in human vascular endothelial cells. Pflugers Arch. 428:569-576.

109. Oren Z., Hong J., Shai Y. 1997. A repertoire of novel antibacterial diastereomeric peptides with selective cytolytic activity. J. Biol. Chem. 272:14643-14649.

110. Palmer A.F., Wingert P., Nickels J. 2003. Atomic force microscopy and light scattering of small unilamellar actin-containing liposomes. Biophys J. 85:1233-1247.

111. Pardee J.D., Spudich J.A. 1982.Purification of muscle actin. Methods Enzymol. 85:164-181.

112. Patil S.S., Hayward A.C., Emmons R. 1974. An ultraviolet-induced nontoxigenic mutant of Pseudomonas phaseolicola of altered pathogenicity. Phytopatology. 69:493-496.

113. Piepenhagen P.A., Nelson W.J. 1998. Biogenesis of polarized epithelial cells during kidney development in situ: roles of E-cadherin-mediated cell-cell adhesion and membrane cytoskeleton organization. Mol.Biol. Cell. 9:3161-3177.

114. Pouny Y., Rapaport D. Mor A., Nicolas P., Shai Y. 1992. Interaction of antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogues with phospholipid membranes. Biochemistry. 31:12416-12423.

115. Prat A.G., Bertorello A.M., Ausiello D.A., Cantiello H.F. 1993. Activation of epithelial Na+ channels by protein kinase A requires actin filaments. Am. J. Physiol. 265:224-233.

116. Rana F.R., Macias E.A., Sultany C.M., Modzrakowski M.C., Blazyk J. 1991. Interactions between magainin 2 and Salmonella typhimurium outer membranes: effect of lipopolysaccharide structure. Biochemistry. 30:5858-5866.

117. Reidl H.H., Takemoto J.Y. 1987. Mechanism of action of bacterial phytotoxin, syringomycin. Simultaneous measurement of early responses in yeast and maize. Biochim. Biophys. Acta. 898:59-69.

118. Renault A., Lenne P.F., Zakri C., Aradian A., Venien-Bryan C., Amblard F. Surface-induced polymerization of actin. 1999. Biophys. J. 76:1580-1590.

119. Rescher U., Ruhe D., Ludwig C., Zobiack N., Gerke V. 2004. Annexin 2 is a phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding protein recruited to actin assembly sites at cellular membranes. J Cell Sci. 117:3473-3480.

120. Rioux L., Gicquaud C. 1985. Actin paracrystalline sheets formed at the surface of positively charged liposomes. J. Ultrastruct. Res. 93:42-49.

121. Scaloni A., Bachmann R.C., Takemoto J.Y., Barra D., Simmaco M., Ballio A. 1994. Stereochemical structure of syrigomycin, aphytotoxic metabolite of Pseudomonas syringae pv. syringae. Nat. Prod. Lett. 4:159— 164.

122. Schagina L.V., Gurnev Ph.A., Takemoto J.Y., Malev V.V. 2003. Effective gating charge of ion channels induced by toxin syringomycin E in lipid bilayers. Bioelectrochemistry. 60:21-27.

123. Schwiebert E.M., Mills J.W., Stanton B.A. 1994. Actin-based cytoskeleton regulates a chloride channel and cell volume in a renal cortical collecting duct cell line.J. Biol. Chem. 269:7081-7089.

124. Sechi AS, Wehland J. 2000. The actin cytoskeleton and plasma membrane connection: PtdIns(4,5)P(2) influences cytoskeletal protein activity at the plasma membrane. J. Cell Sci. 113:3685-3695.

125. Seelig A., Blatter X.L., Frentzel A., Isenberg G. 2000. Phospholipid binding of synthetic talin peptides provides evidence for an intrinsic membrane anchor of talin. J. Biol. Chem. 275:17954-17961.

126. Selsted M.E., Harwig S.S., Ganz T., Schilling J.W., Lehrer R.I. 1985. Primary structure of three human neutrophil defensins. J. Clin. Invest. 76:1436-1439.

127. Selsted M.E., Novotny M.J., Morris W.L., Tang Y.O., Smith W., Cullor J.C. 1992. Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils. J. Biol. Chem. 267:4292^295.

128. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. 1999. Biochim. et biophys. acta. 1462:55-70.

129. Sheterline P., Clayton J., Sparrow J.C. 1999. Actin. 4th edition. University press. Oxford.

130. Simons K., Ikonen E. 1997. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387:569-572.

131. Smith W.J., Nassar N., Bretscher A., Cerione R.A., Karplus P.A. 2003. Structure of the active N-terminal domain of Ezrin. Conformational and mobility changes identify keystone interactions. J. Biol. Chem. 278:4949-4956.

132. Sobko A.A., Kotova E.A., Antonenko Y.N., Zakharov S.D., Cramer W.A. 2004. Effect of lipids with different spontaneous curvature on the channel activity of colicin El: evidence in favor of a toroidal pore. FEBS Lett. 576:205-210.

133. Sobko A.A., Kotova E.A., Antonenko Y.N., Zakharov S.D., Cramer W.A. 2006. Lipid dependence of the channel properties of a colicin el-lipid toroidal pore. J. Biol. Chem. 281:14408-14416.

134. Sorensen K.N., Kim K.-H., Takemoto J.Y. 1996. In vitro antifungal and fungicidal activities and erythrocyte toxicities of cyclic lipodepsinonapeptides produced by Pseudomonas syringae pv. syringae. Antimicrob. Agents Chemother. 40: 2710-2713.

135. Srinivasan Y., Lewallen M., Angelides K.J. 1992. Mapping the binding site on ankyrin for the voltage-dependent sodium channel from brain. J. Biol. Chem. 267:7483-7489.

136. Staruschenko A., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2005. Actin cytoskeleton disassembly affects conductive properties of stretch-activated cation channels in leukaemia cells. Biochim. et biophys. acta. 1669: 53-60.

137. St-Onge D., Gicquaud C. 1989. Evidence of direct interaction between actin and membrane lipids. Biochem. Cell Biol. 67:297-300.

138. St-Onge D., Gicquaud C. 1990. Research on the mechanism of interaction between actin and membrane lipids. Biochem. Biophys. Res. Commun. 167:40^7.

139. Takemoto J.Y. 1992. Bacterial phytotoxin syringomycin E and its interaction with host membranes. In D.P.S. Verma (ed.), Molecular signals in plant microbe communications, CRC Press, Inc.

140. Unwin N. 1993. Nicotinic acetylcholine receptor at 9 A resolution. J. Mol. Biol. 229:1101-1124.

141. Vogt T.C., Bechinger B. 1999. The interactions of histidine-containing amphipathic helical peptide antibiotics with lipid bilayers. The effects of charges and pH. J. Biol. Chem. 274:29115-29121.

142. Wade D., Boman A., Wahlin B., Drain C.M., Andreu D., Boman H.G., Merrifield R.B. 1990. All-D amino acid-containing channel-forming antibiotic peptides. Proc. Natl. Acad. Sc. USA. 87:4761-4765.

143. Wong H., Bowie J.H., Carver J.A. 1997. The solution structure and activity of caerin 1.1, an antimicrobial peptide from the Australian green tree frog, Litoria splendida. Eur. J. Biochem. 247:545-557.

144. Yang L., Weiss T.M., Lehrer R.I., Huang H.W. 2000. Crystallization of antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin. Biophys. J. 79:2002-2009.

145. Yi S.J., Liu S.C., Derick L.H., Murray J., Barker J.E., Cho M.R., Palek J., Golan D.E. 1997. Red cell membranes of ankyrin-deficient nb/nb mice lack band 3 tetramers but contain normal membrane skeletons. 36:9596-9604.

146. Zasloff M. 1987. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:54495453.

Информация о работе

Бессонов, Андрей Николаевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Роль белок-липидных взаимодействий в регуляции каналоформерной активности сирингомицина Е - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы