Многоуровневая проводимость ионных каналов, образованных циклическими липодепсипептидами Preudomonas Syringae в липидных бислоях

Остроумова, Ольга Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Многоуровневая проводимость ионных каналов, образованных циклическими липодепсипептидами Preudomonas Syringae в липидных бислоях
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Многоуровневая проводимость ионных каналов, образованных циклическими липодепсипептидами Preudomonas Syringae в липидных бислоях"

На правах рукописи

Остроумова Ольга Сергеевна

¡МНОГОУРОВНЕВАЯ ПРОВОДИМОСТЬ ИОННЫХ КАНАЛОВ, ОБРАЗОВАННЫХ ЦИКЛИЧЕСКИМИ ЛИПОДЕПСИПЕПТИДАМИ PSEUDOMONAS SYRINGAE В ЛИПИДНЫХ БИСЛОЯХ

03.00 25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биолог ическнх наук

Санкт-Петербург 2007

2 4 \Ш 2007

003060030

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители

доктор биологических наук

Людмила Владимировна Щагина,

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат физико-математических наук Сергей Михайлович Безруков, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, США

Елена Валентиновна Казначеева,

Институт цитологии РАН, Санкт-Пегербург

кандидат биологических наук Елена Аврамовна Котова, Институт физико-химической биологии им АН Белозерского,МГУ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Ведущая организация•

Санкт-Петербург скии институт ядерной физики им Б II Константинова РАН

Защита состоится 30 мая 2007 года в 15ч на заседании Диссерыпионною совета Д 002 230 01 при Инсштуте цитологии РАН по адресу 194064, Camu-Петербург, Тихорецкий пр , д 4 http //www cytspb rssi ru

'ч на заседании

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института циюлогии РАН Реферат разослан апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного кандидат биологических наук

Е В Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Актуальность изучения многоуровневой проводимости ионных каналов, образованных циклическими ииподепсипепищами бактерий Pseudomonas syrmgae pv syringae в липидпых бислоях, имеет несколько аспектов

Прежде всего, следует отметить широкий спектр медико-биотогнчсской актвности этих соединении Циклические липодепсипептиды способны предотвращать грибковые заболевания растений, поэтому штаммы Pseudomonas syringae syrmgae могут быть использованы в сельском хозяйстве для создания систем биологическою контроля сохранности урожая [1,2] Следует отметить, что тнподепсинанопептид сирингомицип Е (СМЕ) ингибирует и рос г клинически важных возбудителей грибковых заболеваний человека [3,4] Показано, что образование пор в мембранах клеюк-мишеней является общим механизмом токсического действия всех бактериальных липопетидов [5-9] Поэтому изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе каналообразугощей активности СМЕ и родственных соединений, необходимо в интересах применения липопешидов в биотехнологии, практической фармакологии, медицине и сельском хозяйстве Особый интерес для понимания механизмов функционирования токсиновых каналов представляет природа их многоуровневой проводимости Установление факторов, способных влиять на свойства подсосюяний проводимости каналов, открывает широкие перспективы направленного изменения противо1рибковой активности липодепсипепгидов

С дру1 ой стороны, многоуровневая проводимость - широко распространенное явление, свойственное большому числу ионных каналов клеточных мембран Поэтому каналы, образуемые циклическими липодепсипептидами Pseudomonas syungae, могут выступать в качестве адекватной модели для иссчедовання механизмов функционирования ионных каналов клеточных мембран, что является одним из фундаментальных направлений клеточной биологии Изменение многоуровневой проводимости канатов в результате воздействия каких-либо эндогенных или экзогенных факторов может быть одним из регупяторных механизмов в клетке

Для получения надежных результатов, позволяющих выяснить принципы молекулярной организации и функционирования токсиновых каналов, необходимо широкое варьирование условий эксперимента, что в случае лабичьных клеточных мембран не представляется возможным Поэтому для решения лих вопросов представляется актуальным исследование модифицированных каналоформерами липидных бислоев

Цели н задачи исследования Цель данной работы - установление механизмов многоуровневой проводимости ионных каналов, образованных циклическими липодепсипептидами, сиришомицином Е (СМЕ) и сирингостатином А (ССА) Для достижения поставленной цели решались следующие экспериментальные задачи

1) изучить потенциал-зависимость кинетических парамефов и кооперативное!и функционирования СМЕ- и ССА-каналов,

2) выяснить влияние поверхностного заряда липидных бислоев, спошаннои кривизны липидных молекул, ионной силы околомембранных растворов и дипольною потенциала мембраны на синхронность открывания каналов в кластере,

3) установить i еометрию СМЕ-канала и определить радиусы его устьев,

4) исследовать влияние диполыюго П01енциала мембраны на каналообразующую активность СМЕ

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Многоуровневая проводимость каналов, образованных циклическими липодепсипетидами, обусловлена синхронным и одиночным функционированием элементарных пор Число элементарных каналов, кооперативно открывающихся в кластере, зависит от величины трансмембранного и дипольного потенциала Диполь-дипольные и заряд-дипольные взаимодействия ответственны за синхронизацию элементарных канатов в кластере

2 Элементарный СМЕ-канал представляет собой коническую пору, пептидное \стье которой в два раза меньше липидного и имеет радиус ~ 0 3 нм

3 Дипольныи потенциал мембраны влияет на каналообразующую способность СМЕ в липидных бислоях

Научная новизна. Впервые показано, что кооператншюсть функционирования эпемешарных каналов в кластере зависит от величины фаисмембранного и днпольного потенциала Синхронизация элементарных каналов в кластере определяется диполь-дипольными и заряд-дипольными взаимодействиями Предложена кинетическая схема функционирования циклических липодепсипептидов в мембране, которая вктючает два непроводящих состояния, предшествующих открыванию как элементарных каналов, так и кластеров Впервые показано, что водная пора СМЕ-канала имеет форму усеченного конуса Разработан теоретический подход, позволяющий оценить радиусы устьев конической поры Данные, полученные в ходе работы, показывают, что токсичность циклических липодепсипептидов для клеток-мишеней может регулироваться дипольным потенциалом их мембран

Теоретическое и практическое значение Несомненную важнос1ь для понимания механизмов многоуровневой проводимости каналов клеточных мембран иредс1авлягот полученные данные о роли диполь-дипольных и заряд-дипольных взаимодействий в кооперативное™ функционирования каналов, образованных циктичсскими липодепсипептидами в бислоиных липидных мембранах Предложен механизм функционирования циклических липодепсипептидов в мембране Полученные данные о влиянии диполыюго потенциала мембраны на каналообразугощую активность СМЕ важны с точки зрения регуляции его токсичности для грибковых клеток Разработанный теоретический поход для оценки радиусов водной поры СМЕ-канала может быть использован для определения размеров пор других конических каналов

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на 3-м Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), конференциях Биофизического общества США (Лонг Бич, 2005, Солт Леик Сити, 2006, Балтимор, 2007), Международной научно-практической конференции «МБТРОМЬД» (Санкт-Петербург, 2007) Материалы докладывались на научных семинарах Института цитологии РАН и Национальных институтов здравоохранения (Бегезда, США)

Объем и структура диссертации Диссертация сосюит и? введения, трех пив, выводов, приложения и списка литературы В первой главе дан обзор читерат)ры, посвященной много}ровневой проводимости ионных каналов и

капалообразующеи активности циклических лнподепсипептидов Во второй главе приводится описание использованных в работе материалов и методов исследования В третьей главе приведены результаты и их обсуждение Работа изложена на jjf?) страницах и иллюстрирована рисунками Список литературы содержит наименований

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы Липодепсипсптиды Pseudomonas syrmgae pv syiingae, сирингомицин L (СМЕ) и сирингосгатии А (ССА), а также экстракты сфинголипидов из мембран штаммов Saccharomyces cerevisiae W3Q3C (МАТа ade 2 his3 leu2 trpl игаЗ) и W txSYR2a (МАТа ade2 h¡s3 leu2 trpl игаЗ syr2 URA3) были любезно предоставтены д-ром Д Такемото (Utah State University, USA)

Использовали следующие реактивы NaCl, MOPS, нентан, этанол, хлороформ, сквален, гексадекан, эргостерол, флоретин, 6-кегохолестанол, полиэтиленгликоли (ПЭГ) ('Sigma', США), RH421 ('Molecular Probes", США), 1,2-дифитаноил-™-ишцеро-З-фосфохолнн (ДФФХ), 1,2-диолеоил-ли-глицеро-3-фосфохолин (ДОФХ), 1,2-диолсонл-.5п-глицеро-3-фосфоэ1аполамип (ДОФЭ) и 1,2-диолеоил-.ш-глицеро-3-фосфоеерин (ДОФС) ("Avanti Polar Lipids", США)

Формирование липидных бислоев и измерение их электрических характеристик. Формирование бислойных липидных мембран (БЛМ) проводили по методу Монтала и Мюллера [10] путем сведения конденсированных липидных монослоев на отверстии в тефлоновой пленке, разделяющей экспериментальную камеру на два (иис- и транс-) отделения Перед началом формирования мембраны отверстие в тефлоновой пленке обрабатывали скваленом или рас ¡вором гексадекана в пешане (1 10, v/v) Фосфолипидные мембраны формировали из ДФФХ, ДОФХ, ДОФЭ, или смеси ДОФС и ДОФЭ Для формирования бислоев, близких по липидному составу к плазматической мембране Saccharomyces cerevisiae, использовали эквимотярную смесь ДОФС/ДОФЭ/эргостерол и 20 М% сфинюлипидов мембран W303C или WASYR2a Эксперименты проводили при одинаковом ионном составе разделяемых мембраной водных растворов электролита (0 02 - IM NaCl), кислотность растворов (pH 6) поддерживали буферной смесью 5 мМ MOPS/NaOH

Iokchhm добавляли к водной фазе одного из отделений камеры (цис-отделения) из водною раствора 1 мг/мл (рН 3) до конечной концентрации в околомембранном растворе 1-5 мкМ

Дипольный потенциал мембраны изменяли двухсторонней добавкой флоретина (10-100 мкМ) или RH 421 (5-10 мкМ) в омывающие мембрану растворы, либо введением 6-кегохочестанола в мембраиообразующий раствор (33-67 М%) Вечичину днпочьного потенциала оценивали согласно [11-18]

Для нодачи трансмембранного потенциала (V) и отведения сигнала с БЛМ использовачи члорсеребряиые электроды (Ag/AgCI), соединенные с растворами камеры через мостики 1 5 % агарозы в растворе 2 М КС1 Положительным считали потенциал, вызывающий ногок кашонов из цис- в нуюне-отделение камеры Измерения тока через модифицированные липодепсипептидами мембраны осуществили с помощью усилителя, собранною на базе микросхемы К544УД1А а также Axopatch 200В (Axon Instruments) с использованием 8-полярного фильтра Бесселя (Model 9002, Frequency Devices) (частота фильтрации 1 кГц) Отфильтрованный сигнал записывали на компьютер с часюгой дискретизации 5 кГц Все эксперименты проводили при комнатной температуре (21 +2° С) Для установления геометрии канала и определения размеров его устьев использовали одностороннее введение ПЭГ различного молекулярного веса в омывающие мембрану растворы [19-22] ПЭГ различного молекулярного веса поочередно добавляли в раствор с одной стороны мембраны (15%w/w) Чтобы уравновесить осмотическое давление с разных сторон бислоя, с противоположной стороны вводили непроникающий в канал ПЭГ4600 (15 % w/w) Известно, что ПЭГ увеличивают активность ионов в растворе, поэтому проводимость капала в присутствии ПЭГ данною молекулярного веса нормировали на проводимость в присутствии пепроникающего ПЭГ, усредненную для ПЭГ1500, ПЭГ3400 и ПЭГ4600 Анализ экспериментальных данных Обработку записей трансмембрашнлх токов осуществляв с использованием программного пакета Clampfit 9 0 ("Axon Instruments", США) Анализ полученных данных проводили с помощью программы Origin 7 0 ("OngmLab", США)

Общее число событий (N), использовавшихся для построения гистограммы фчуктуацнй трансмембраиного гока при фиксированном значении трансмембранного

потенциала, было от 500 до 20000 По оси ординат откладывали приведенные частоты значений трансмембранного тока n/{Nh), те относительные частоты попадания флуктуации тока n/N в промежуток h Все пики аппроксимировали плотностью нормального распределения Пик с минимальным (по абсолютной величине) центральным значением тока (г) соответствует открыванию/закрыванию элементарных каналов Проводимость этих каналов (g) определяли как отношение i к поданной на мембрану разности потенциалов (V) Для представления зависимости числа синхронно функционирующих элементарных каналов от V использовали среднее нормированное значение, определяемое для СМЕ-каналов как

т = £ (к рк) / £ рк, где рк - площадь под кривой аппроксимирующей пик с кратностью

к**

к Величину к определяли как отношение тока, протекающею через канал-кластер, к току элементарного канала

При определении времени и вероятности нахождения каналов в открытом сосюяшш использовали только случаи функционирования одного элементарного капала, так называемые «пачки» Для построения временных гистограмм по оси ординат откладывали относительные частоты n/N Общее число измерений, используемых для построения гиегсирамм, было от 100 до 20000 Аппроксимацию проводили плотностью показательного распределения с параметром топ Для всех гистограмм при проверке пшотезы о законе распределения использовали критерий/2 (Р < 0 05) Вероятность пребывания малого канала в открытом состоянии в пачке

находити согласно формуле Р„„ = jj(t)dt /(i At), где Дt = Ь - f, -длительность пачки,

I(t) -значение тока в момент времени t Интеграл, входящий в формулу, находили с помощью Clampfit 9 0

Относительное число каналов-кластеров в общем пуле каналов, ответственных за трансмембранный юк, определяли как S = Nt /(Ж где Nc - число каналов-

кластеров, пе - число эпементарных каналов

Эффективный воротный заряд определяли как Q = d(ln Nih)/d(FV / R1) |23], где Nci, - эффективное число открытых элементарных каналов, те отношение

стиионарного трансмсмбранного тока к / при заданном V, Р - число Фарадея К -универсальная газовая постоянная, Т-абсолютная температура

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Геометрия элементарного СМЕ-канала Циклические липодепсипептиды. СМЕ и его аналоги, образуют в БЛМ потенциал-зависимые каналы многоуровневой, преимущественно анионной проводимости Многоуровневая проводимость -результат функционирования одиночных малых (элементарных) каналов и каналов-ктастеров - нескольких синхронно открывающихся/ закрывающихся элементарных каналов [24,25] Элементарный СМЕ-канал представляет собой асимметричную пептид-липидну го пору, цис-устье которой образовано каналоформером, а трансустье - молекулами мембранных липидов [23] Сказывается ли асимметрия распрсдеченпя молекул токсина и липида в канале на геометрии водной поры'7 Измерения проводимости элемешарных СМЕ-каналов при одностороннем введении ПЭГ позволили ответить па этот вопрос На рис 1 приведены записи флуктуаций трансмембранного тока, соответствующие открыванию/закрыванию СМЕ-каналов в присутствии проникающею ПЭГ200 и непроникающего ПЭГ4600 с разных сторон бислоя Видно, что уменьшение проводимости канала по сравнению с контролем (непропикающий ПЭГ4600 с обеих сторон мембраны) больше при транс-добавке проникающего ПЭГ200, чем при его г/мс-введении Эти результаты свидетельствуют о том, что СМЕ-пора имеет форму усеченного конуса, размер транс-устья которою больше, чем цис-устъя

ПЭГ 4600 цис ПЭГ 200 цис ПЭГ 4600 транс ПЭГ 4600 транс

ПЭГ 4600 цис ПЭГ 200 транс

кШЬ ■ - — LAia f&ffw iWf

ОпА

05с

10 пА

Рис 1. Влияние асимметричного введения ПЭГ200 и ПЭГ4600 на проводимость эчемешпарного СМЕ-канача Мембраны сформированы из жвимолярной смеси ДОФС иДОФЭ, омываются 1 MNaCl (рН 6) V = -200 мВ

Для опредечения радиусов устьев каната были проведены измерения проводимости элементарных СМЕ-каналов в присутствии полимеров различного молекулярного

веса (IV), введенных с гщс- или с транс- стороны мембраны, в то время как пепроникакнций ПЭГ4600 добавлен с противоположной стороны бислоя На рис 2 полученные результаты представлены в виде зависимости отношения проводимости элементарною СМЕ-канала в присутствии ПЭГ молекулярного веса (и') к средней проводимости канала в присутствии непроникающих ПЭГ 1500)) от м> при

V = -200 мВ

Рис 2. Зависимость отношения от молекулярного веса ПЭГ (уг) Гидродинамический радиус почимерных частиц (>) указан в соответствии с [26] (о) цис- и (я) транс- добавка ПЭГ молекулярного веса IV Непропикающий ПЭГ4600 с противопочожной стороны Штриховая пиния соответствует среднему отношению удечьных электропроводностей растворов в присутствии и в отсутствие ПЭГ V = -200 мВ

Видно, что цис-введение ПЭГ практически не сказывается на проводимости канала при VI/ > 300 Да, и только добавка ПЭГ200 приводит к достоверному уменьшению проводимости СМЕ-канала Из этого следует, что полимеры с > 300 Да при введении с цкс-стороны не попадают в канал В случае транс-добавки полимеров проводимость канала уменьшается при введении ПЭГ с 1000 > и' > 200 Да, т е ПЭГ с и > 1000 Да в канал не проникают Аппроксимация экспериментальных данных на основе разработанною теоретического подхода дает следующие величины для радиусов цис- и транс-устьеъ СМЕ-канала 0 25-0 35 им и 0 5-0 9 нм, соответственно I акнм образом можно заключи 1ь, что элементарный СМЕ-канал представляет собой коническую пору с меньшим устьем со стороны введения каналоформсра Образованная мембранными липидами транс- область канала имеет приблизитетыю в два раза бочьшии радиус ус!ья по сравнению с устьем пептидной части поры

Влияние зарядов каналоформера и липида на потенциал-зависнмость кооперативности функционирования элементарных каналов. Рис 3, пример записи флуктуации трансмембранного тока, протекающего через модифицированную СМЕ офицательно заряженную мембрану, демоисфнруег многоуровневую проводимость СМЕ-каналов

150 мВ

ОпА-

Ж-

1 пА

-150 мВ

25 с

Рис 3 Записи флуктуации СМЕ индуцированного трансмембранного тока Мембрана сформирована из эквимочярной смеси ДОФС и ДОФЭ омывается раствором О 1 МNaCl (рН б) Моменты подачи потенциалов на мембрану указаны стрелками Интервачы между пунктирными ч иниями

соответствуют току, протекающему через одиночный элементарный канач при фиксированном значении V Па рисунке видны одиночные

элементарные каналы и каналы-кластеры Последние имеют проводимость, кратную проводимости элементарных каналов На рис 4 представлены шеюграммы флуктуаций трансмембранного тока при V- ±50 мВ, являющиеся результатом обработки большого числа треков, аналогичных рис 3

Рис 4 Гистограммы флуктуаций СМЕ индуцированного трансмембранного тока (1) в мембранах, сформированных из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ, омываемых 0 I М ИаС1 (рН 6) (А) V = 50 мВ, (Б) V = -50 мВ Пики с к = 1 соответствуют открыванию—закрыванию элементарных каналов Пики с к ~ 2 отвечают случайному открыванию—закрыванию двух эчементарных каналов Пики с к > 3 - результат синхронного функционирования эчсментарны\ каначов

Приведенные на рис 3 и 4 данные показывают, что число синхронно функционирующих элементарных каналов в кластере зависит о г трансмембранного потенциала при V = +150 мВ кооперативно открываются 3 элементарных канала при У~ -150 мВ синхронно закрываются 7 элементарных каналов (рис 3), при V- 50 мВ в кластере могут кооперативно функционировать как 4, так и 5 элементарных каналов, при Г= -50 мВ - как 7, так и 8 (рис 4) Можно думать, что наблюдаемая потенциал-зависимость числа синхронно функционирующих элементарных каналов (далее

«синхронизация» или «кооператнвность») определяется зарядами н(или) диполями

олекул, входящих в состав кластера

Для анализа вклада зарядов каналоформера и липида в кооперативное™

функционирования каналов была исследована потенциал-зависимость синхронизации

открывания-закрывания элементарных СМЕ-каналов в заряженных и незаряженных

мембранах омываемых растворами различных концентраций NaCl Поскольку при

фиксированном значении трансмембранного потенциала мотут наблюдаться большие

каналы с разной близкой кратностью (рис 4), то для представления результатов

испочьзовали среднее нормированное значение числа синхронно функционирующих

элементарных каналов в кластере (т) Приведенные на рис 5 результаты показывают

1) в 1 М растворах NaCl, где заряды каналоформера существенно экранированы,

кривая m(V) симметрична относительно оси ординат, имеет колоколообразную

форму, и величина т падает с роиоч \V\, 2) в pacieopax малой концентрации соли

(0 1, 0 02 М), максимальные значения т (тетах) близки к таковому в 1 М растворах, но

максимумы зависимостей m(V), также имеющих колоколообразный характер,

сдвинуты приблизительно на 100 мВ в область отрицательных V, 3) кривые m(V) в

пределах погрешности измерении совпадают для отрицатечыю заряженных

(ДОФС/ДОФЭ) и незаряженных мембран, сформированных из липидов с различной

спонтанной кривизной (ДОФХ и ДОФЭ)

Рис 5 Потенциач-зависимость т дчя СМЕ-кластеров (А.) ДФФХ мембраны омываются 1М NaCl (рН б), (А) ДОФХ мембраны омываются 01 М NaCl (рН б), (0) ДОФЭ мембраны омываются 0 1 М NaCl (рН б), (о) мембраны сформированы га эквшютрной смеси ДОФС и ДОФЭ, омываются 0 1 М NaCl (рН б), (п) ДФФХ мембраны омываются 0 02 М NaCl (рНб)

Анапнз этих результатов позволяет заключить, что заряд липидных молекул и их спонтанная кривизна не втияюг на потенциал-зависимость синхронизации элементарных каналов в кластере, а заряд каналоформера ответствен за сдвш mmax в область отрицательных потенциалов

Проведенное сравнение кооперативности функционирования СМЕ- и ССА-каналов показывает, что для СМЕ шпич - 7, а для CCA mmax = 4 Разчичия шгаах могут

быть результатом разной химической структуры молекул этих токсинов Несмотря на различие ттп, ¡-'^зависимости для СМЕ- и ССА-каналов имею! сходный характер Если учесть, что молекулы СМЕ и ССА не различаются по величине заряда (-2е) го одинаковый сдвиг т1ШХ по оси F (—100 мВ), наблюдающийся для этих токсинов в разбавленных растворах, подтверждает вывод о роли заряда каналоформера в кооперативное™ функционирования элементарных каналов в кластерах

Влияние мембранного диполыюго потенциала на многоуровневую проводимость токенновых каналов. Для проверки предположения о роли диполь-дипольных и заряд-дипольных взаимодействий в синхронизации элементарных каналов в кластере были проведены исследования многоуровневой проводимости СМЕ-каналов в БЛМ, имеющих различный дипольный потенциал {<pj) В качестве модификаторов, уменьшающих дипольныи потенциал мембраны, использовали флоретин, а для увеличения (pd - 6-кетохолестанол или RH 421 На рис 6 представлены записи флуктуации трансмембранного тока, соответствующие открыванию-закрыванию элементарных каналов и кластеров при V = 160 мВ в ДОФС/ДОФЭ-мсмбранах, омываемых 1 М растворами NaCl (рН 6), в присутствии 20 мкМ флоретина (рис 6А), в отсутствие дипольных модификаторов (рис 6Б) и в присутствии 5 мкМ RH 421 (рис 6В)

ОпА

_I 5пА

0 02 с

ОпА

J 5пА

1 с

0пА —I 5 пА Зс

Рис. 6. Записи флуктуаций СМЕ индуг{ированного трансмембранного тока во времени в мембранах с различным дипольныи потенциачом ((р^ БЛМ сформированы из эквимочярной смеси ДОФС и ДОФЭ, омываются раствором 1 М NaCl (рН 6) V = ¡60 AtB (A) <pd = (120 ± 20) мВ (20 мкМ флоретина), (Б) <pd = (230 ± 20) мВ (отсутствие дипольных модификаторов), (В) <pd = (300 ± 40) мВ (5 мкМ RH 421) Интервалы между пунктирными линиями соответствуют току, протекающему через одиночный элементарный канал в заданныхусчоьиях

Как видно на рис 6, увеличение днпольного потенциала от 120 до 300 мВ приводит к уменьшению числа синхронно функционирующих элементарных каналов в кластере, а также к увеличению проводимости и времени жизни этементарных СМЕ-каналов

На рис 7 А представлена потенциал-зависимость среднего нормированного числа синхронно функционирующих СМЕ-каналов в кластере в мембранах, омываемых 1 М растворами №С1 и различающихся динольиым потенциалом, Видно, что увеличение (ра на ~ 200 мВ приводит к уменьшению т во всем изученном диапазоне V, при этом ттах падает с 9 до 6 Приведенные результаты подтверждают предположение о том, что синхронизация каналов в мембранах регулируется диполь-дипольными взаимодействиями

В случае разбавленных растворов, те в отсутствие экранирования заряда каналоформера высокой концентрацией №С1, кроме диполь-дипольных взаимодействии за кооперативность функционирования каналов в кластере также ответственны заряд-дипольные взаимодействия, приводящие к сдвигу т,„ах в область отрицагечьных V(рис 7Б)

Рис. 7. Потенциал-зависимость т для СМЕ-кластеров в мембранах с различным дипочъным потенциалом (ср^) (А) Мембраны сформированы из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ, омываются 1 М NaC! (рН б) (A) (pd = (120 ± 20) мВ (20 мкМ флоретина), (ш) tpj = (230 ± 20) мВ (отсутствие дипольных модификаторов), (•) <pj = (300 ± 40) мВ (5 mkMRH 421) (Б) Мембраны сформированы из ДОФС (33 М%) и ДОФЭ или 6-кетохопестанола соответственно, омываются 0 1 МNaCl (рН 6) (и) <pj - (230 ± 20) мВ (67 М% ДОФЭ, отсутствие дипольных модификаторов), (о) (Pd = (430 ± 20) мВ (67 М% 6-кетохочестаноча)

Механизм функционирования циклических липодепсипептидов в БЛМ

Результаты нашей работы позволили уточнить ранее предложенную [27]

кинетическую схему функционирования СМЕ-каиалов, а также качественно и количественно охарактеризовать включенные в нее состояния

Элементарный канал

Предшественник 1 —> Предшественник 2

(пептид-липидная мицелла) (непроводящий кластер)

Большой канал (т синхронно открытых элементарных каналов) Наличие двух непроводящих состояний, предшествующих открыванию как

элементарных каналов, так и каналов-кластеров, Предшественника 1 и

Предшественника 2, было установлено в результате изучения потенциал-зависимости

кинетических параметров одиночных каналов и относительного числа каналов-

кластеров в общем пуле каналов На рис 8А и 8Б приведены зависимости времени

жизни (т,„) и вероятности нахождения элементарного СМЕ-канала в открытом

состоянии в пачке (Р0„) от V, соответственно Как следует из рис 8А и 8Б, г„„ и Ра„ не

зависят от V СИсутствие зависимости вероятностей и времен нахождения этих

каналов в открытом и закрытом состояниях в пачке от трансмембранной разности

потенциалов говорит о том, чю величина энергетического барьера между

проводящим и непроводящим состояниями элементарного канала не зависит от К В

то же время потенциал-зависимость открывания-закрывания СМЕ-каналов

предполагает изменение энергетического барьера между открытым и закрытым

состояниями канала в ответ па изменение V Эти факты говорят о наличии, как

минимум, двух непроводящих состояний элементарного канала с потенциал-

зависимым переходом от Предшественника 1 к Предшественнику 2, в то время как

переход из Предшественника 2 в проводящее состояние от V не зависит Можно

думать, что Предтиественник 1 образуется в результате пептид- липидных

взаимодействий это «мицелла» с включенными в нее молекулами токсина и липнда,

формируется на г/г/с-повсрхносш мембраны при некоторой «критической»

концентрации СМЕ Под действием трансмембранного потенциала происходя!

конфирмационные перестройки в «мицелле», что приводит к образованию Предшественника 2

Рис. 8. Потенциач-зависилюсть среднего времени жизни элементарных СМЕ- (•) и ССА-(о) каналов (т0„) (А), вероятности пребывания элементарных СМЕ-каналов в открытом состоянии в пачке (Роп) (Б) и относительного числа СМЕ- (А) и ССА- (А) кластеров (S) (В) Мембраны сформированы из эквимочярной смеси ДОФС и ДОФЭ, омываются 01 М NaCI (рН 6) Проведена линейная аппроксимация экспериментачъных данных Результаты исследования потенциал-

зависимости относительного числа кластеров

(S) привели к выводу, что из Предшественника

2 открываются как элементарные каналы, так и

каналы-клас1еры На рис 8В видно, что

относительное число CMF-кластеров в общем

пуле каналов не зависит от V (S = 0 18 ± 0 03),

следовательно, количество наблюдаемых

каналов-кластеров при изменении V

увеличивается-уменьшается пропорционачьно числу peí истрируемых элементарных

каналов Этот факт и юворит о наличии общего предшественника для кластеров и

элементарных каналов Поскольку абсолютное число каналов в мембране (как

элементарных, так и каналов-кластеров) зависит от V, а относительное число каналов-

кластеров не является функцией трансмембранного потенциала, то следует думать,

что при изменении V изменяется концентрация Предшественника 2 В приведенной

схеме переход от Предшественника 1 к Предшественнику 2 изображен иным образом,

чем другие переходы Это сделано для того, чтобы отметить лимитирутощии характер

этого перехода время жизни Предшественника 2, определенное на основании

изучения динамики трансмембранно1 о тока через модифицированные СМЕ липидные

бислои [28], составляет «3 мин =200с, что существенно больше, чем время

пребывания одиночных каналов в открытом состоянии Для элементарных каналов

= (0 9 ± 0 1) с, а время жизни каналов-клас1еров Т0„ = (9 2 ± 1 1) с На основании

«¡(^-зависимостей (рис 5) можно представить, что Предшественник 2 -

А 1,5 т I 1* - Tan< с -o—o

Í ? 1 Х 0,5 . -в—о-

-■ Г ......... 1 1 ' Б I В 1,0 - Pon X i i

* " в 0,5 - í í ¥

В Ч I т I I s ' ' 1

1 X 1 oi - I I I I ■ A I ■

í 4 í .4 i é ж T....... 1

—)—.—+—*——■—i—.—i— -200 -100 0 100 200

V, мВ

непроводящий кластер, состоящий из нескольких элементарных каналов Поскольку изменение синхронизации в кластере происходит за время, меньшее или равное времени разрешения экспериментальной установки (1 мс) (рис 3), те за время много меньше гто можно считать, что при изменении V меняется число кооперативно функционирующих, а не число образующих кластер элементарных каналов Экстраполяция зависимости ттах(^) в область <ра —* 0 позволила оценить максимальное число элемен[арных каналов, входящих в состав Предшественника 2 В случае СМЕ оно равно 13 Поскольку при приложении трансмембранной разности потенциалов Предшественник 2 может функционировать как элементарный канал н(или) как канал-кластер, то можно полагать, что каждый из элементарных каналов имеет свой воротный механизм, а в кластере они объединены общим воротным механизмом Нами установлен сходный характер изменений времен жизни элементарных каналов и кластеров при увеличении как концентрации соли в омывающих мембрану растворах, так и дипольного потенциала мембраны Эти факты указывают на одинаковую природу воротных механизмов, ответственных за открывание-закрывание элементарных каналов и кластеров

Результаты, полученные для ССА-каналов, отвечают приведенному механизму Наблюдаются лишь количественные различия с приведенными выше величинами для СМЕ-каналов В случае элементарных ССА-каналов в БЛМ, сформированных из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ, при концентрации околомембранных растворов О 1 М №С1 (рН 6) г„„ = (0 09 ± 0 02) с, 5 = 0 70 ± 0 03 (рис 8А и 8В) Таким образом, можно считать, что предложенный механизм функционирования является общим для циклических линодепсинептидов

Каналообразующая активность СМЕ. Результаты наших исследований показали что дипольный потенциал мембраны (<ра) влияет не только на характеристики одиночных СМЕ-каналов, но и на каналообразующую активность токсина в БЛМ На рис 9А представлена кинетика трансмембранного тока до и после введения флоретина (20 мкМ) в омывающие заряженные мембраны растворы 0 1 М№С1 (рН 6) Видно, что уменьшение <рл от 230 до 120 мВ (за счет добавки флоретина) вызывает существенный рост трансмембранного тока нри 50 мВ Увеличение щ от 230 до 360 мВ (при введении 10 мкМ ЯН 421) приводит к

значительному уменьшению абсолютного значения стационарного трансмембранного тока при ± 50 мВ с одновременным изменением знака трансмембранного потенциала, открывающего СМЕ-каналы (рис 9Б)

Рис 9. Вчияние дипочъных модификаторов на кинетику трансмембранного тока Мембраны сформированы из эквимочярной смеси ДОФС и ДОФЭ, омываются О 1 MNaCl (рН 6) (cpd = (230 ± 20) мВ) (А) стрепкой указан момент добавки 20 мкМ флоретина (<pj = (120 ± 20) мВ), (Б) стречкой указан люмент введения 10 мкМ RM 421 (<pd = (360 ± 40) мВ)

Влияние çv [,а такие параметры СМЕ-каналов, как g, m и S, может приводить к изменению стационарного трансмембранного тока при введении дипольных модификаторов Увеличение щ сопровождается ростом g (рис б) и уменьшением m (рис 7) Величина S от cpd не зависит Расчет показывает, что модификация указанных характеристик СМЕ-каналов не может быть причиной наблюдаемого различия трансмембранных токов до и после введения дипольных модификаторов С другой стороны, абсолютное значение эффективного воротного заряда СМЕ-каналов ( j Q | ), коэффициент распределения каналоформера между водной и линидной фазами (К). который определяет число предшественников каналов в мембране (Npr), и химическая составляющая работы образования канала (UCh) влияют на эффективное число открытых элементарных каналов Nih = N,.r(K)exp(-Ulh)exp(QVF / RT) [17] Известно, что | Q\ зависит от (pd [17], поэюму чисто открытых каналов при фиксированном V будет зависеть от дипольного потенциала мембраны Анализ результатов изучения зависимости Nch or V до и после введения дипольных модификаторов позволил заключшь, что каналообразующая активность СМЕ в мембранах с различным дипочьным потенциалом обусловлена не только изменением | Q |, но и К и(или) Uch

Эксиеримен гы с дрожжевыми клетками, Басскаготусе-ч сегехтае,

показали, что токсическая активность СМЕ связана с наличием определенных

сфчнголипидов в плазматической мембране клегок-мшиеней [29,30] Поскольк}

токсичность обусловлена способностью липодепсипептида образовывать ионные

каналы в мембранах клеток-мишеней, были проведены исследования

каналообразующей активности СМЕ в БЛМ, в состав которых вводились

сфинголипиды мембран дикого (\V303C) и мутантного Д8УГ<2а) штаммов

дрожжевых к ¡еток Оказалось, что кластерная орт анизация СМЕ-каналов зависит от

вида сфинголипида, входящего в состав бислоя т прибтизительно в 1 2, а 5 в 2 раза

больше в БЛМ включающих сфинголипиды \V303C чем в бислоях с добавкой

сфинголишщов \\' \SYR2a Эти изменения т и 5 могут обеспечить приблизительно

дв\ кратное различие трансмембранных токов Тем не менее, из рис 10 следует, что,

независимо от V, эффективное число элементарных каналов в бислоях, содержащих

сфинголипиды дикого типа, в 40 раз выше, чем в мембранах с участием

сфинголипидов мутантных клеток Значения эффективного воротного заряда для

СМЕ-каналов в мембранах, включающих разные сфинголипиды, не различаются и

составляют 10 ± 0 1 Следовательно, каналообразующая активность СМЕ в

содержащих эти сфингочипиды БЛМ определяется, главным образом, К и(или) иск

Рис 10. Потенциал-зависимость эффективного числа эчел1ентарных каналов в мембранах,

содержащих различные сфинголипиды Мембраны сформированы из эквимолярной смеси ДОФС, ДОФЭ, эргостерола и содержат 20 М% сфингочипидов мембран клеток дикого типа 1¥303С (о) или мутантных клеток IV А8У1{2а (•) Концентрация СМЕ равна 0 93 мкг/мкл Околомембранный раствор — 0 1 М ЫаС1, (рН 6) На вставке показан пример экспериментального опредечения при различных значениях V в мембране, содержащей сфингочипиды М'ЗОЗС Известно, что дипольный потенциал мембраны зависш от ее сфинголипидного

состава [31] Сфинголипиды XV \SYR2a отличаются от \УЗОЗС отсутствием одной

полярной труппы (ОН) Это позволяет пола1ать, что обнаруженные различия

определяются дипольным потенциалом бислоев, содержащих указанные

сфинголипиды

Порученные результаты заставляют учитывать различие

дипольных потенциалов клеточных мембран при сравнении токсичности СМЕ и его

аналогов для ктеток-мишеней

ВЫВОДЫ

1 Многоуровневая проводимость ионных каналов, образованных сирингомицином Е и сирингостатином А в липидных бислоях, обусловлена кооперативным функционированием элементарных каналов Диполь-диполыше и заряд-дипольные взаимодействия определяют синхронизацию элементарных каналов в кластере

2 Элементарный СМЕ-канал представляет собой коническую пору с меньшим устьем со стороны введения каналоформера Радиусы устьев канала составляют О 25 - 0 35 нм и 0 5 — 0 9 нм

3 Полученные данные позволяют предложить принципиальную схему образования каналов, которая включает два непроводящих состояния, предшествующих огкрываншо как элементарных каналов, так и каналов-класгеров

4 Дииольный потенциал мембраны влияет на каналообразующую активность СМЕ за счет изменения эффективного воротного заряда каналов, а также коэффициента распределения токсина между липидной и водной фазами и(или) химической составляющей работы образования канала

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ostroumova O.S., Malev V V , Kaulm Yu A , Gurnev Ph A , Takemoto J Y , Schagina L V 2005 Voltage-dependent synchronization of gating of syringomycin E ion channels FEBS Letters 579 (25), 5675-5679

2 Kauhn Yu A Takemoto J Y , Schagina L V , Ostroumova О S R Wangspa, Teeter J H, Brand J G 2005 Sphingolipids influence the sensitivity of lipid bilayers to fungicide, syringomycin E J Bioeneig Biomembr 37 (5), 339-348

3 Остроумова О С , Гурьнев Ф А Такемото Д , Щагина Л В , Малев В В 2005 Кинетические характеристики одиночных ионных каналов и стационарная проводимость модифицированных фитотоксинами липидных бислоев Цитология 47(4) 338-343

4 Остроумова О.С , Малев В В , Щагина Л В , 2006 Кооперазивность функционирования ионных каналов, образованных фитотоксинами, сирингомнцином Е и сиришосгагином А Биологические мембраны 23 (5), 412419

5 Ostroumova О S , Gurnev Р А , Schagina L V , Bezrukov S М 2007 Asymmetry of byringom>cin E channel studied by polymer partitioning 1'EBS Letters 581 (5), 804808

6 Остроумова O.C., Гурьнев Ф A , Щагина JIВ 2004 Зависимость кластерной организации ионных каналов, образуемых фитотоксинами в модельных липидиых мембранах, от трансмембранного потенциала Тезисы докладов III Съезда биофизиков России, Воронеж, Июнь 24-29 1 271-272

7 Ostroumova О S , Gurnev Ph А , Takemoto J Y , Malev V V , Schagina L V 2005 Kinetic parameters of phytotoxin ion channels in planar lipid bilayers Abstracts of 49lh Annual Meeting of Biophysical Society, Long Beach, California, February 12-16 Biophys J 88 248a

8 Schagina L V , Ostroumova О S., Gurnev Ph A , Takemoto J Y , Malev V V 2005 Voltage-dependent synchronization of gating of phytotoxin ion channels in planar lipid bilayers Abstracts of 49th Annual Meeting of Biophysical Society, Long Beach, Cahlornia February 12-16 Biophys J 88 247a

9 Ostroumova О S , Malev V V , Gurnev Ph A , Kaulin Yu A , Takemoto J Y , Schagina L V 2006 Membrane dipole potential modulates synchronization of gating of syringomycin E channels Abstracts of 50lh Biophysical Society Annual Meeting, Salt Lake City, Utah, February 18-22 Biophys J 90 518a

10 Ostroumova OS, Schagina LV, Gurnev Ph A , Takemoto JY, Bezrukov SM 2007 Probing pore geometry of the syringomycin E channel with polyethylene glycols Abstracts of 51th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, Maryland, March 3-7 Biophys J 92 613a

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Janisiewicz W J ct al 1999 J Food Prot 62 1372-1375 2. Bull С et al 1998 Biol

Control 12 89-95 3 Sorensen К N etal 1996 Antimicrob Agents Chemother 40 27102713 4 De Lucca A J etal 1999 Antimicrob Agents Chemother 43 371-373 5 Maget-

Dana R, Ptak M 1990 Biochim et Biophys Acta 1023 34-40 6. Brodley С L etal

1991 Mol Plant-Microbe Interact 4 407-411 7 Sheppard T D etal 1991 Biochim el

Biophys Acta 1064 13-23 8 Hutchinson ML et al 1995 Mol Plant-Microbe Interact 8 610-620 9 Carpaneto A eta! 2002 J Membr Biol 188 237-248 10. Montal M, Mueller P 1972 Proc Natl Acad Sci USA 65 3561-3566 11. Pickar A D , Benz R 1978 J Membr Biol 44 353-376 12 riewellmg R F et al Biophys J 49 541-552 13. brankhn J С , Cafiso D S 1993 Biophys J 65 289-299 14 CsehR,BenzR 1998 Biophys J 74 1399-1408 15. Cseh R et al 2000 Eur Biophys J 29 172-183 16. Peterson U et al 2002 Chem Phys Lipids 117 19-27 17. Schagma L V et al 2003 Bioelectrochemistry 60 21-27 18. Starke-Pcterkovic ct al 2005 AJP-Regul Integr Comp Physiol 288 R663-R670 19 Krasilnikov О V et al 1998 J Membr Biol 161 83-92 20 Mer/lyak P G et al 1999 Biophys J 77 3023-3033 21. Yuldasheva LN et al 2001 Biochim Biophys Acta 1512 53-63 22. Carneiro С M et al 2003 Biochim Biophys Acta 1612 144-153 23. MalevVV et al 2002 Biophys J 82 1985-1994 24 Щагина Л В идр 1998 Биол мембраны 15 433-446 25 KauhnYA et al 1998 Biophys J 74 2918-2925 25 MalevVV et al 2002 Biophys J 82 1985-1994 26. Kuga S J 1981 Г Chromatogr 206 449-461 27. Малев BB идр 2000 Биол мембраны 17 653-665 28. Бессонов А Н и др 2006 Биол мембраны 23 248-257 29 Gnlley М М et al 1998 J Biol Chem 273 11062-11068 30 Stock SD et al 2000 Antimicrob Agents Chemother 44 1174-1180 31. Brockman H L el al 2004 Biophys J 87 1722-1731

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 24 04 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 1560Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Остроумова, Ольга Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность исследования.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна исследования.

Теоретическое и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Многоуровневая проводимость ионных каналов.

1.1.1. Флуктуации эффективного диаметра поры.

1.1.2. Кластеризация ионных каналов в специфических мембранных областях.

1.1.3. Кооперативное функционирование каналов в кластере.

1.2. Влияние спонтанной кривизны липидных молекул на активность ионных каналов.

1.3. Влияние дипольного потенциала мембраны на активность ионных каналов.

1.4. Характеристика объектов исследования.

1.4.1. Молекулярная структура липодепсипептидов.

1.4.2. Биологическая активность липодепсипептидов.

1.4.3. Каналообразующая активность циклических липодепсипептидов в липидных бислоях.

1.4.3.1. Подсостояния проводимости каналов, образованных циклическими липодепсипептидами. Кластерная организация СМЕ-каналов.

1.4.3.2. Вольт-амперные характеристики элементарных каналов.

1.4.3.3. Воротные свойства фитотоксиновых каналов.

1.4.3.4. Каналообразующая активность циклических липодепсипептидов в клеточных и модельных мембранах.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Формирование липидных бислоев и измерение их электрических характеристик.

2.2.2. Анализ экспериментальных данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Геометрия элементарного СМЕ-канала.

3.2. Потенциалзависимость синхронизации элементарных каналов в кластере.

3.2.1. Влияние заряда липидных молекул и каналоформера на кооперативность функционирования элементарных каналов.

3.2.2. Дипольная модель десинхронизации функционирования элементарных каналов в кластере.

3.3. Влияние дипольного потенциала мембраны на многоуровневую проводимость каналов.

3.3.1. Влияние дипольного потенциала мембраны на число кооперативно функционирующих элементарных каналов.

3.3.2. Влияние дипольного потенциала мембраны на проводимость элементарных каналов.

3.4. Механизм функционирования циклических липодепсипептидов в мембране.

3.4.1. Кинетические характеристики подсостояний проводимости.

3.4.2. Общий предшественник для элементарных каналов и каналов-кластеров.

3.4.3. Кинетическая схема функционирования каналов.

3.5. Каналообразующая активность липодепсипептидов в липидных бислоях.

3.5.1. Зависимость каналообразующей активности СМЕ от мембранного дипольного потенциала.

3.5.2. Зависимость каналообразующей активности СМЕ от сфинголипидного состава мембраны.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Многоуровневая проводимость ионных каналов, образованных циклическими липодепсипептидами Preudomonas Syringae в липидных бислоях"

Актуальность исследования

Актуальность изучения многоуровневой проводимости ионных каналов, образованных циклическими липодепсипептидами бактерий Pseudomonas syringae pv. syringae в липидных бислоях, имеет несколько аспектов.

Прежде всего, следует отметить широкий спектр медико-биологической активности этих соединений. Циклические липодепсипептиды способны предотвращать грибковые заболевания растений, поэтому штаммы Pseudomonas syringae syringae могут быть использованы в сельском хозяйстве для создания систем биологического контроля сохранности урожая [Janisiewicz et al., 1999; Bull et al., 1998]. Следует отметить, что липодепсинанопептид сирингомицин Е (СМЕ) ингибирует и рост клинически важных возбудителей грибковых заболеваний человека [Sorensen et al., 1996; De Lucca et al., 1999]. Показано, что образование пор в мембранах клеток-мишеней является общим механизмом токсического действия всех бактериальных липопептидов [Maget-Dana and Ptak, 1990; Brodey et al., 1991; Sheppard et al., 1991; Hutchinson et al., 1995; Carpaneto et al., 2002]. Поэтому изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе каналообразующей активности СМЕ и родственных соединений, необходимо в интересах применения липопептидов в биотехнологии, практической фармакологии, медицине и сельском хозяйстве. Особый интерес для понимания механизмов функционирования токсиновых каналов представляет природа их многоуровневой проводимости. Установление факторов, способных влиять на свойства подсостояний проводимости каналов, открывает широкие перспективы направленного изменения противогрибковой активности липодепсипептидов.

С другой стороны, многоуровневая проводимость - широко распространенное явление, свойственное большому числу ионных каналов клеточных мембран. Поэтому каналы, образуемые циклическими липодепсипептидами Pseudomonas syringae, могут выступать в качестве адекватной модели для исследования механизмов функционирования ионных каналов клеточных мембран, что является одним из фундаментальных направлений клеточной биологии. Изменение многоуровневой проводимости каналов в результате воздействия каких-либо эндогенных или экзогенных факторов может быть одним из регуляторных механизмов в клетке.

Для получения надежных результатов, позволяющих выяснить принципы молекулярной организации и функционирования токсиновых каналов, необходимо широкое варьирование условий эксперимента, что в случае лабильных клеточных мембран не представляется возможным. Поэтому для решения этих вопросов представляется актуальным исследование модифицированных каналоформерами липидных бислоев.

Цели и задачи исследования

Цель данной работы - установление механизмов многоуровневой проводимости ионных каналов, образованных циклическими липодепсипептидами, СМЕ и сирингостатином А (ССА). Для достижения поставленной цели решались следующие экспериментальные задачи:

1) изучить потенциал-зависимость кинетических параметров и кооперативности функционирования СМЕ- и ССА-каналов;

2) выяснить влияние поверхностного заряда липидных бислоев, спонтанной кривизны липидных молекул, ионной силы околомембранных растворов и дипольного потенциала мембраны на синхронность открывания каналов в кластере;

3) установить геометрию СМЕ-канала и определить радиусы его устьев;

4) исследовать влияние дипольного потенциала мембраны на каналообразующую активность СМЕ.

Научная новизна исследования

Впервые показано, что кооперативность функционирования элементарных каналов в кластере зависит от величины трансмембранного и дипольного потенциала. Синхронизация элементарных каналов в кластере определяется диполь-дипольными и заряд-дипольными взаимодействиями.

Предложена кинетическая схема функционирования циклических липодепсипептидов в мембране, которая включает два непроводящих состояния, предшествующих открыванию как элементарных каналов, так и кластеров. Впервые показано, что водная пора СМЕ-канала имеет форму усеченного конуса. Разработан теоретический подход, позволяющий оценить радиусы устьев конической поры. Данные, полученные в ходе работы, показывают, что токсичность циклических липодепсипептидов для клеток-мишеней может регулироваться дипольным потенциалом их мембран.

Теоретическое и практическое значение работы

Несомненную важность для понимания механизмов многоуровневой проводимости каналов клеточных мембран представляют полученные данные о роли диполь-дипольных и заряд-дипольных взаимодействий в кооперативности функционирования каналов, образованных циклическими липодепсипептидами в бислойных липидных мембранах. Предложен механизм функционирования циклических липодепсипептидов в мембране. Полученные данные о влиянии дипольного потенциала мембраны на каналообразующую активность СМЕ важны с точки зрения регуляции его токсичности для грибковых клеток. Разработанный теоретический поход для оценки радиусов водной поры СМЕ-канала может быть использован для определения размеров пор других конических каналов.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Остроумова, Ольга Сергеевна

122 ВЫВОДЫ

1. Многоуровневая проводимость ионных каналов, образованных сирингомицином Е и сирингостатином А в липидных бислоях, обусловлена кооперативным функционированием элементарных каналов. Диполь-дипольные и заряд-дипольные взаимодействия определяют синхронизацию элементарных каналов в кластере.

2. Элементарный СМЕ-канал представляет собой коническую пору с меньшим устьем со стороны введения каналоформера. Радиусы устьев канала составляют 0.25-0.35 нм и 0.5-0.9 нм.

3. Полученные данные позволяют предложить принципиальную схему образования каналов, которая включает два непроводящих состояния, предшествующих открыванию как элементарных каналов, так и каналов-кластеров.

4. Дипольный потенциал мембраны влияет на каналообразующую активность СМЕ за счет изменения эффективного воротного заряда каналов, а также коэффициента распределения токсина между липидной и водной фазами и(или) химической составляющей работы образования канала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Остроумова, Ольга Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Абидор И.Г., Аракелян В.Б., Пастушенко В.Ф., Тарасевич М.Р., Черномордик J1.B., Чизмаджев Ю.А. 1978. Электрический пробой бислойных липидных мембран. Доклады АН СССР. 240: 733-736.

2. Бессонов А.Н., Щагина J1.B., Туроверов К.К., Кузнецова И.М., Такемото Д., Малев В.В. 2006. Влияние кооперативной адсорбции макромолекул на каналоформеную активность сирингомицина Е в бислойных липидных мембранах. Биол. мембраны. 23: 248-257.

3. Гелетюк В.И., Казаченко В.Н. 1990.Кластерная организация ионных каналов. Москва: Наука. 224 с.

4. Гурьнев Ф.А., Каулин Ю.А., Тихомирова А.В., Вангспа Р., Такемото Д., Малев В.В., Щагина J1.B. 2002а. Активность токсинов, продуцируемых Pseudomonas syringae pv. syringae, в модельных и клеточных мембранах. Цитология. 44: 296-304.

5. Гурьнев Ф.А., Каулин Ю.А., Такемото Д., Щагина JI.B., Малев В.В. 20026. Роль заряда и дипольного момента мембранных липидов в воротных свойствах ионных каналов, индуцируемых сирингомицином Е. Биол. мембраны. 19: 244-250.

6. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. 1982. Липидный бислой биологических мембран. Москва: Наука. 224 с.

7. Котова Е.А., Рокицкая Т.П., Антоненко Ю.Н. 1999. Две фазы фотоинактивации грамицидина в бислойной липидной мембране в присутствии фотосенсибилизатора. Биол. Мембраны. 16: 336-343.

8. Малев В.В., Каулин Ю.А., Безруков С.М., Гурьнев Ф.А., Такемото Д., Щагина Л.В. 2000. Кинетика открывания закрывания каналов,образованных сирингомицином Е в липидных бислоях. Биол. мембраны. 17: 653-665.

9. Малев В.В., Каулин Ю.А., Гурьнев Ф.А., Безруков С.М., Такемото Д., Щагина JT.B. 2001. Эффекты пространственного распределения заряда в проводимости одиночных каналов, образованных сирингомицином Е в липидных бислоях. Биол. мембраны. 18: 145-153.

10. Терновский В.И. и Берестовский Г.Н. 1998. Эффективный диаметр и структурная организация реконструированных кальциевых каналов из харовой водоросли Nitellopsis. Биол. мембраны. 15: 66-73.

11. Цыбульская М.В., Антоненко Ю.Н., Тропша А.Э., Ягужинский JT.C. 1984. Иодсодержащие гормоны дипольные модификаторы фосфолипидных мембран. Биофизика. 29: 801-805.

12. Щагина JT.B., Каулин Ю.А., Фейгин A.M., Такемото Д., Бранд Д., Малев В.В. 1998. Зависимость свойств ионных каналов, образованных антибиотиком сирингомицином Е в липидных бислоях, от концентрации электролита в водной фазе. Биол. мембраны. 15: 433-446.

13. Agner G., Kaulin Y.A., Schagina L.V., Takemoto J.Y., Blasko К. Effect of temperature on the formation and inactivation of syringomycin E pores in human red blood cells and bimolecular lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1466: 79-86.

14. Ahern G.P., Junankar P.R., Dulhunty A.F. 1997. Subconductance states in single-channel activity of skeletal muscle ryanodine receptors after removal of FKBP12. Biophys. J. 72: 146-162.

15. Akanda N., Elinder F. 2006. Biophysical properties of the apoptosis-inducing plasma membrane voltage-dependent anion channel. Biophys. J. 90:4405-4417.

16. Alakoskela J.M., Soderlund Т., Holopainen J.M., Kinnunen P.K. 2004. Dipole potential and head-group spacing are determinants for the membrane partitioning of pregnanolone. Mol Pharmacol. 66: 161-168.

17. Allende D., Vidal A., Simon S.A., Mcintosh T.J. 2003. Bilayer interfacial properties modulate the binding of amphipathic peptides. Chem. Phys. Lipids. 122: 65-76.

18. Andersen O.S., Finkelstein A., Katz I., Cass A. 1976. Effect of phloretin on the permeability of thin lipid membranes. J. Gen. Physiol. 67: 749-771.

19. Apel E.D., Merlie J.P. 1995. The assembly of the postsynaptic apparatus. Curr. Opin. Neurobiol. 5: 62-67.

20. Asawakarn Т., Cladera J., O'Shea P. 2001. Effects of the membrane dipole potential on the interaction of saquinavir with phospholipid membranes and plasma membrane receptors of Caco-2 cells. J. Biol. Chem. 276: 38457-38463.

21. Anspe N., Pollard H.B., Rojas E. 1996. Zn interaction with Alzheimer amyloid beta protein calcium channels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 1710-1715.

22. Bala S., Kombrabail M.H., Prabhananda B.S. 2001. Effect of phloretin on ionophore mediated electroneutral transmembrane translocations of H(+), K(+) and Na(+) in phospholipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta. 1510: 258-269.

23. Balaram P., Krishna K., Sukumar M., Mellor I.R., Sansom M.S. 1992. The properties of ion channels formed by zervamicins. Eur. Biophys. J. 21: 117-128.

24. Ballio A., Bossa F., Collina A., Gallo M., Iacobellis N.S., Paci M., Pucci P., Scaloni A., Segre A., Simmaco M. 1990. Structure of syringotoxin, a bioactive metabolite of Pseudomonas syringae pv. syringae. FEBS Lett. 269: 377-380.

25. Basle A., Iyer R., Delcour A.H. 2004. Subconductance states in OmpF gating. Biochim. Biophys. Acta. 1664: 100-107.

26. Bender C.L., Alarcon-Chaidez F., Gross D.C. 1999. Pseudomonas syringae phytotoxins: mode of action, regulation, and biosynthesis by peptide and polyketide synthetases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 266-292.

27. Bessonov A.N., Schagina L.V., Takemoto J.Y., Gurnev P.A., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Malev V.V. 2006. Actin and amphiphilic polymers influence on channel formation by syringomycin E in lipid bilayers. Eur. Biophys. J. 35: 382392.

28. Bezprozvanny I.B., Benevolensky D.S., Naumov A.P. 1991. Potassium channels in aortic microsomes: conductance, selectivity, barium-induced blockage and subconductance states. Biochim. Biophys. Acta. 1064: 75-80.

29. Bezrukov S.M., Vodyanoy I. 1993. Probing alamethicin channels with water-soluble polymers. Effect on conductance of channel states. Biophys. J. 64: 16-25.

30. Bezrukov S.M., Vodyanoy I., Brutyan R.A., Kasianowicz J.J. 1996. Dynamics and free energy of polymers partitioning into a nanoscale pore. Macromolecules. 29: 8517-8522.

31. Bezrukov S.M., Rand R.P., Vodyanoy I., Parsegian V.A. 1998. Lipid packing stress and polypeptide aggregation: alamethicin channel probed by proton titration of lipid charge. Faraday Discuss. Ill: 173-183.

32. Bezrukov S.M. 2000. Functional consequences of lipid packing stress. Current Opinion in Colloid Interface Sci. 5: 237-243.

33. Bidasee K.R., Xu L., Meissner G., Besch H.R. Jr. 2003. Diketopyridylryanodine has three concentration-dependent effects on the cardiac calcium-release channel/ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 278: 14237-14248.

34. Bhat R.A., PanstrugaR. 2005. Lipid rafts in plants. Planta. 223: 5-19.

35. Blasiak L.C., Vaillancourt F.H., Walsh C.T., DrennanC.L. 2006. Crystal structure of the non-haem iron halogenase SyrB2 in syringomycin biosynthesis. Nature. 440:368-371.

36. BIasko K., Schagina L.V., Agner G., Kaulin Y.A., Takemoto J.Y. 1998. Membrane sterol composition modulates the pore forming activity of syringomycin E in human red blood cells. Biochim. Biophys. Acta. 1373: 163169.

37. Brodey C.L., Rainey P.B., Tester M., Johnstone K. 1991. Bacterial blotch disease of the cultivated mushroom is caused by an ion channel forming lipodepsipeptide toxin. Mol. Plant-Microbe Interactions. 4: 407-411.

38. Brock W., Stark G., Jordan P.C. 1981. A laser-temperature-jump method for the study of the rate of transfer of hydrophobic ions and carriers across the interface of thin lipid membranes. Biophys. Chem. 13: 329-348.

39. Brockman H. 1994. Dipole potential of lipid membranes. Chem. Phys. Lipids. 73: 57-79.

40. Brockman H.L., Momsen M.M., Brown R.E., He L., Chun J., Byun H.S., Bittman R. 2004. The 4,5-double bond of ceramide regulates its dipole potential, elastic properties, and packing behavior. Biophys. J. 87:1722-1731.

41. Buber E., Stindl A., Acan N.L., Kocagoz Т., Zocher R. 2002. Antimycobacterial activity of lipodepsipeptides produced by Pseudomonas syringae pv. syringae B359. Nat. Prod. Lett. 16:419-423.

42. Bull С., Wadsworth M., Sorensen К., Takemoto J., Austin R., Smilanick J. 1998. Syringomycin E produced by biological control agents controls green mold on lemons. Biol. Control. 12: 89-95.

43. Camoni L., Di Giorgio D., Marra M., Aducci P., Ballio A. 1995. Pseudomonas syringae pv. syringae phytotoxins reversibly inhibit the plasma membrane H(+)-ATPase and disrupt unilamellar liposomes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 214: 118-124.

44. Carneiro C.M., Merzlyak P.G., Yuldasheva L.N., Silva L.G., Thinnes F.P., Krasilnikov O.V. Probing the volume changes during voltage gating of Porin 31BM channel with nonelectrolyte polymers. Biochim. Biophys. Acta. 2003. 1612: 144-153.

45. Carpaneto A., Dalla Serra M., Menestrina G., Fogliano V., Gambale F. 2002. The phytotoxic lipodepsipeptide syringopeptin 25A from Pseudomonas syringae pv. syringae forms ion channels in sugar beet vacuoles. J. Membr. Biol. 188: 237-248.

46. Chapman M.L., VanDongen A.M. 2005. К channel subconductance levels result from heteromericpore conformations. J. Gen. Physiol. 126: 87-103.

47. Chernomordik L.V., Lekina E., Frolov V., Bronk P., Zimmerberg J. 1997. An early stage of membrane fusion mediated by the low pH conformation of influenza hemagglutinin depends upon membrane lipids. J. Cell. Biol. 136: 81-93.

48. Cladera J., O'Shea P., Hadgraft J., Valenta C. 2003. Influence of molecular dipoles on human skin permeability: Use of 6-ketocholestanol to enhance the transdermal delivery of bacitracin. J. Pharm. Sci. 92: 1018-1027.

49. Clarke R.J. 1997. Effect of lipid structure on the dipole potential of phosphatidylcholine bilayers. Biochim Biophys Acta. 1327: 269-278.

50. Colombini M. 1989. Voltage gating in the mitochondrial channel, VDAC. J. Membr. Biol. Ill: 103-111.

51. Colombini M., Blachly-Dyson E., Forte M. 1996. VDAC, a channel in the outer mitochondrial membrane. In Ion Channels, Vol. 4. T. Narahashi, editor. Plenum Press, New York. 169-202.

52. Colton K., Satterfield C.N. 1975. Diffusion and partitioning of macromolecules within finely porous glass. AIChE J. 21:. 289-298

53. Cseh R., Benz R. 1998. The adsorption of phloretin to lipid monolayers and bilayers cannot be explained by langmuir adsorption isotherms alone. Biophys. J. 74: 1399-1408.

54. Cseh R., Hetzer M., Wolf K., Kraus J., Bringmann G., Benz R. 2000. Interaction of phloretin with membranes: on the mode of action of phloretin at the water-lipid interface. Eur. Biophys. J. 29: 172-183.

55. Dalbey R.E. 1990. Positively charged residues are important determinants of membrane protein topology. Trends Biochem. Sci. 15: 253-257.

56. De Gennes P.-G. 1979. Scaling Concepts in Polymer Physics, Cornell University Press, Ithaca, New York. 46-53

57. De Lucca A.J., Jacks T.J., Takemoto J., Vinyard В., Peter J., Navarro E., Walsh T.J. 1999. Fungal lethality, binding, and cytotoxicity of syringomycin E. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 371-373.

58. DeVay J.E., Lukezic F.L., Sinden S.L., English H., Coplin D.L. 1968. A biocide produced pathogenic isolates of Pseudomonas syringae and its possible role in the bacterial canker disease of peach trees. Phytopathology. 58: 95-101.

59. Desai S.A., Rosenberg R.L. 1997. Pore size of the malaria parasite's nutrient channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 2045-2049.

60. Duclohier H., Alder G., Kociolek K., Leplawy M.T. 2003. Channel properties of template assembled alamethicin tetramers. J. Pept. Sci. 9: 776-783.

61. Duclohier H., Alder G.M., Bashford C.L., Bruckner H., Chugh J.K., Wallace B.A. 2004. Conductance studies on trichotoxin A50E and implications for channel structure. Biophys. J. 87: 1705-1710.

62. Duffin R.L., Garrett M.P., Flake K.B., Durrant J.D., Busath D.D. 2003. Modulation of lipid bilayer interfacial dipole potential by phloretin, RH 421, and б-ketocholestanol as probed by gramicidin channel conductance. Langmuir. 19: 1439-1442.

63. Feigin A.M., Takemoto J.Y., Wangspa R., Teeter J.H., Brand J.G. 1996. Properties of voltage-gated ion channels formed by syringomycin E in planar lipid bilayers. J Membr Biol. 149:41-47.

64. Feigin A.M., Schagina L.V., Takemoto J.Y., Teeter J.H., Brand J.G. 1997. The effect of sterols on the sensitivity of membranes to the channel-forming antifungal antibiotic, syringomycin E. Biochim. Biophys. Acta. 1324: 102-110.

65. Fesenko E.E., Geletyuk V.I., Kazachenko V.N., Chemeris N.K. 1995. Preliminary microwave irradiation of water solutions changes their channel-modifying activity. FEBS Lett. 366: 49-52.

66. Fessenden J.D., Feng W., Pessah I.N., Allen P.D. 2004. Mutational analysis of putative calcium binding motifs within the skeletal ryanodine receptor isoform, RyRl. J. Bio.l Chem. 279: 53028-53035.

67. Flewelling R.F., Hubbell W.L. 1986a. Hydrophobic ion interactions with membranes. Thermodynamic analysis of tetraphenylphosphonium binding to vesicles. Biophys. J. 49: 531-540.

68. Flewelling R.F., Hubbell W.L. 1986b. The membrane dipole potential in a total membrane potential model. Applications to hydrophobic ion interactions with membranes. Biophys. J. 49: 541-552.

69. Franklin J.C., Cafiso D.S. 1993. Internal electrostatic potentials in bilayers: measuring and controlling dipole potentials in lipid vesicles. Biophys. J. 65: 289299.

70. Fuller N., Benatti C.R., Rand R.P. 2003. Curvature and bending constants for phosphatidylserine-containing membranes. Biophys. J. 85: 1667-1674.

71. Gawrisch К., Ruston D., Zimmerberg J., Parsegian V.A., Rand R.P., Fuller N. 1992. Membrane dipole potentials, hydration forces, and the ordering of water at membrane surfaces. Biophys. J. 61: 1213-1223.

72. Gorczynska E., Huddie P.L., Miller B.A., Mellor I.R., Vais H., Ramsey R.L., Usherwood P.N. 1996. Potassium channels of adult locust (Schistocerca gregaria) muscle. Pflugers Arch. 432: 597-606.

73. Goudet C„ Benitah J.P., Milat M.L., Sentenac H., Thibaud J.B. 1999. Cluster organization and pore structure of ion channels formed by beticolin 3, a nonpeptidic fungal toxin. Biophys J. 77: 3052-3059.

74. Goulian M., Mesquita O.N., Fygenson D.K., Nielsen C., Andersen O.S., Libchaber A. 1998. Gramicidin channel kinetics under tension. Biophys. J. 74: 328-337.

75. Grilley M.M., Stock S.D., Dickson R.C., Lester R.L., Takemoto J.Y. 1998. Syringomycin action gene SYR2 is essential for sphingolipid 4-hydroxylation in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 273: 11062-11068.

76. Grosberg A.Yu. Khokhlov A.R., 1994. Statistical Physics of Macromolecules, American Institute of Physics, AIP Press, New York. 121-122.

77. Grygorzuk R., Simon M. 1986. Single К channels in the apical membrane of amphitrocytes. Biochim. Biolphys. Acta. 861: 385-388.

78. Gu L.Q., Cheley S., Bayley H. 2003. Electroosmotic enhancement of the binding of a neutral molecule to a transmembrane pore. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 15498-15503.

79. Haque M.E., Lentz B.R. 2004. Roles of curvature and hydrophobic interstice energy in fusion: studies of lipid perturbant effects. Biochemistry. 43: 3507-3517.

80. Hamill O.P., Martinac B. 2001. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiol. Rev. 81: 685-740.

81. Harrington M.A., Kopito R.R. 2002. Cysteine residues in the nucleotide binding domains regulate the conductance state of CFTR channels. Biophys. J. 82: 12781292.

82. Hirakura Y., Lin M.C., Kagan B.L. 1999. Alzheimer amyloid abetal-42 channels: effects of solvent, pH, and Congo Red. J. Neurosci. Res. 57: 458-466.

83. Hille B. 2002. Ion channels of excitable membranes. Sinaeur, Sunderland, MA.

84. Hodgkin A.L., Huxley A.F. 1952. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. 117: 500-544.

85. Hunter M., Giebisch G. 1987. Multi-barrelled К channels in renal tubules. Nature. 327: 522-524.

86. Hladky S.B. 1974. The energy barriers to ion transport by nonactin across thin lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 352: 71-85.

87. Hwang T.C., Koeppe R.E. 2nd, Andersen O.S. 2003. Genistein can modulate channel function by a phosphorylation-independent mechanism: importance of hydrophobic mismatch and bilayer mechanics. Biochemistry. 42: 13646-13658.

88. Janisiewicz W.J., Conway W.S., Leverentz B. 1999. Biological control of postharvest decays of apple can prevent growth of Escherichia coli 0157:H7 in apple wounds. J. Food Prot. 62: 1372-1375.

89. Jordan P.C. 1983. Electrostatic modeling of ion pores. II. Effects attributable to the membrane dipole potential. Biophys. J. 41: 189-195.

90. Jordan P.C. 1987. How pore mouth charge distributions alter the permeability of transmembrane ionic channels. Biophys. J. 51:297-311.

91. Julmanop С., Takano Y, Takemoto J.Y, Miyakawa T. 1993. Protection by sterols against the cytotoxicity of syringomycin in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Gen. Microbiol. 139:2323-2327.

92. Kaplan M.R, Cho M.H, Ullian E.M, Isom L.L, Levinson S.R, Barres B.A. 2001. Differential control of clustering of the sodium channels Na(v)1.2 and Na(v)1.6 at developing CNS nodes of Ranvier. Neuron. 30: 105-119.

93. Kaulin Y.A, Schagina L.V., Bezrukov S.M, Malev V.V, Feigin A.M., Takemoto J.Y, Teeter J.H, Brand J.G. 1998. Cluster organization of ion channels formed by the antibiotic syringomycin E in bilayer lipid membranes. Biophys. J. 74:2918-2925.

94. Keller S.L, Bezrukov S.M, Gruner S.M, Tate M.W, Vodyanoy I, Parsegian V.A. 1993. Probability of alamethicin conductance states varies with nonlamellar tendency of bilayer phospholipids. Biophys J. 65: 23-27.

95. Khuse J, Betz H, Kirsch J. 1995. The inhibitory glycine receptor: architecture, synaptic localization, and molecular pathology of a postsynaptic ion-channel complex. Curr. Opin. Neurobiol. 5: 318-323.

96. Kijima Y, Mayrleitner M, Timerman A.P, Saito A, Schindler H, Fleischer S. 1993. A cardiac clathrin assembly protein forms a potassium channel in planar lipid bilayers. J. Biol. Chem. 268: 16253-16258.

97. Kindzelskii A.L, Petty H.R. 2005. Ion channel clustering enhances weak electric field detection by neutrophils: apparent roles of SKF96365-sensitive cation channels and myeloperoxidase trafficking in cellular responses. Eur. Biophy.s J. 35: 1-26.

98. Kong Y, Shen Y, Warth Т.Е., Ma J. 2002. Conformational pathways in the gating of Escherichia coli mechanosensitive channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 5999-6004.

99. Korchev Y.E., Bashford C.L., Alder G.M., Kasianowicz J.J., Pasternak C.A. 1995. Low conductance states of a single ion channel are not «closed». J. Membr. Biol. 147: 233-239.

100. Kourie J.I., Hanna E.A., Henry C.L. 2001. Properties and modulation of alpha human atrial natriuretic peptide (alpha-hANP)-formed ion channels. Can. J. Physiol. Pharmacol. 79: 654-664.

101. Kourie J.I., Culverson A.L., Farrelly P.V., Henry C.L., Laohachai K.N. 2002. Heterogeneous amyloid-formed ion channels as a common cytotoxic mechanism: implications for therapeutic strategies against amyloidosis. Cell Biochem. Biophys. 36: 191-207.

102. Krasilnikov O.V., Sabirov R.Z., Ternovsky V.I., Merzliak P.G., Muratkhodjaev J.N. 1992. A simple method for the determination of the pore radius of ion channels in planar lipid bilayer membranes. FEMS Microbiol. Immunol. 5: 93-100.

103. Krasilnikov O.V., Sabirov R.Z. 1992. Comparative analysis of latrotoxin channels of different conductance in planar lipid bilayers. Evidence for cluster organization. Biochim. Biophys. Acta. 1112: 124-128.

104. Krasilnikov O.V., Merzlyak P.G., Yuldasheva L.N., Azimova R.K., Nogueira R.A. 1997. Pore-forming properties of proteolytically nicked staphylococcal alpha-toxin: the ion channel in planar lipid bilayer membranes. Med. Microbiol. Immunol. 186: 53-61.

105. Krasilnikov O.V., Merzlyak P.G., Yuldasheva L.N., Nogueira R.A. 1998a. Channel-sizing experiments in multichannel bilayers. Gen. Physiol. Biophys. 17: 349-363.

106. Krasilnikov O.V., Da Cruz J.B., Yuldasheva L.N., Varanda W.A., Nogueira R.A. 1998b. A novel approach to study the geometry of the water lumen of ion channels: colicin la channels in planar lipid bilayers. J. Membr. Biol. 161: 83-92.

107. Krasilnikov O.V., Bezrukov S.M. 2004. Polymer partitioning from non-ideal solutions into protein voids. Macromolecules. 37: 2650-2657.

108. Krouse M.E., Schneider G.T. Gage P.W. 1986. A large anion-selective channel has seven conductance levels. Nature. 319: 58-60.

109. Kuga S.J. 1981. Pore size distribution analysis of gel substances by size exclusion chromatography. J. Chromatogr. 206:449-461.

110. Latorre R., Donovan J.J. 1980. Modulation of alamethicin-induced conductance by membrane composition. Acta Physiol. Scand. Suppl. 481: 37-45.

111. Latorre R., Alvarez O. 1981. Voltage-dependent channels in planar lipid bilayer membranes. Physiol. Rev. 61: 77-150.

112. Lavermicocca P., Iacobellis N.S., Simmaco M., Graniti A. 1997. Biological properties and spectrum of activity of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol. Mol. Plant Pathol. 50: 129-140.

113. Lin H., Bhatia R., Lai R. 2001. Amyloid beta protein forms ion channels: implications for Alzheimer's disease pathophysiology. FASEB J. 15: 2433-2444.

114. Luchian Т., Mereuta L. 2006. Phlorizin- and 6-ketocholestanol-mediated antagonistic modulation of alamethicin activity in phospholipid planar membranes. Langmuir. 22: 8452-8457.

115. Lundbaek J.A., Maer A.M., Andersen O.S. 1997. Lipid bilayer electrostatic energy, curvature stress, and assembly of gramicidin channels. Biochemistry. 36: 5695-5701.

116. Maget-Dana R., Ptak M. 1990. Iturin lipopeptides: interactions of mycosubtilin with lipids in planar membranes and mixed monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 1023:34-40.

117. Malev V.V., Schagina L.V., Gurnev P.A., Takemoto J.Y., Nestorovich E.M., Bezrukov S.M. 2002. Syringomycin E channel: a lipidic pore stabilized by lipopeptide? Biophys. J. 82: 1985-1994.

118. Malkov D.Y., Sokolov V.S. 1996. Fluorescent styryl dyes of the RH series affect a potential drop on the membrane/solution boundary. Biochim. Biophys. Acta. 1278: 197-204.

119. Matsuzaki K. 1998. Magainins as paradigm for the mode of action of pore forming polypeptides. Biochim. Biophys. Acta. 1376: 391-400.

120. Matsuzaki К., Sugishita К., Ishibe N., Ueha M., Nakata S., Miyajima K., Epand R.M. 1998. Relationship of membrane curvature to the formation of pores by magainin2. Biochemistry. 37: 11856-11863.

121. M'Baye G., Shynkar V.V., Klymchenko A.S., Mely Y., Duportail G. 2006. Membrane dipole potential as measured by ratiometric 3-hydroxyflavone fluorescence probes: accounting for hydration effects. J. Fluoresc. 16: 35-42.

122. McLaughlin S.G., Dilger J.P. 1980. Transport of protons across membranes by weak acids. Physiol. Rev. 60: 825-863.

123. Melnik E., Latorre R., Hall J.E., Tosteson D.C. 1977. Phloretin-induced changes in ion transport across lipid bilayer membranes. J. Gen. Physiol. 69: 243257.

124. Merzlyak P.G., Yuldasheva L.N., Rodrigues C.G., Carneiro C.M., Krasilnikov O.V., Bezrukov S.M. 1999. Polymeric nonelectrolytes to probe pore geometry: application to the alpha-toxin transmembrane channel. Biophys. J. 77: 3023-3033.

125. Meves H., Nagy K. 1989. Multiple conductance states of the sodium channel and of other ion channels. Biochim. Biophys. Acta. 988: 99-105.

126. Miller C. 1982. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299: 401-411.

127. Montall M., Mueller P. 1972. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69: 3561-3566.

128. Naumov A.P., Kaznacheyeva E.V., Kiselyov K.I., Kuryshev Y.A., Mamin A.G., Mozhayeva G.N. 1995. ATP-activated inward current and calcium-permeable channels in rat macrophage plasma membranes. J. Physiol. 486: 323337.

129. Nestorovich E.M. Rostovtseva Т.К., Bezrukov S.M. 2003. Residue ionization and ion transport through OmpF channels. Biophys. J. 85: 3718-3729.

130. Nestorovich E.M., Sugawara E., Nikaido H., Bezrukov, S.M. 2006. Pseudomonas aeruginosa porin OprF: properties of the channel. J. Biol. Chem. 281, 16230-16237.

131. Niu X., Magleby K.L. 2002. Stepwise contribution of each subunit to theл icooperative activation of BK channels by Ca .Proc. Natl .Acad. Sci. USA. 99: 11441-11446.

132. O'Connell K.M., Martens J.R., Tamkun M.M. 2004. Localization of ion channels to lipid Raft domains within the cardiovascular system. Trends Cardiovasc. Med. 14:37-42.

133. Parsegian V.A., Bezrukov S.M., Vodyanoy I. 1995. Watching small molecules move: interrogating ionic channels using neutral solutes. Biosci Rep. 15:503-514.

134. Patton J.L., Lester R.L. 1991. The phosphoinositol sphingolipids of Saccharomyces cerevisiae are highly localized in the plasma membrane. J. Bacteriol. 173:3101-3108.

135. Peng S., Blachly-Dyson E., Forte M., Colombini M. 1992. Large scale rearrangement of protein domains is associated with voltage gating of the VDAC channel. Biophys. J. 62: 123-131 .

136. Peter B.J., Kent H.M., Mills I.G., Vallis Y., Butler P.J., Evans P.R., McMahon H.T. 2004. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303: 495-499.

137. Peterson U., Mannock D.A., Lewis R.N., Pohl P., McElhaney R.N., Pohl E.E. 2002. Origin of membrane dipole potential: contribution of the phospholipid fatty acid chains. Chem. Phys. Lipids. 117: 19-27.

138. Peyronnet O., Nieman В., Genereux F., Vachon V., Laprade R., Schwartz J.L. 2002. Estimation of the radius of the pores formed by the Bacillus thuringiensis CrylC delta-endotoxin in planar lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 1567: 113-122.

139. Pickar A. D., Benz R. 1978. Transport of oppositely charged lipophilic probe ions in lipid bilayer membranes having various structures. J. Membr. Biol. 44:353-376.

140. Premkumar L.S., Qin F., Auerbach A. 1997. Subconductance states of a mutant NMDA receptor channel kinetics, calcium, and voltage dependence. J. Gen. Physiol. 109:181-189.

141. Premkumar L.S., Agarwal S., Steffen D. 2002. Single-channel properties of native and cloned rat vanilloid receptors. J. Physiol. 545: 107-117.

142. Queyroy A., Verdetti J. 1992. Cooperative gating of chloride channel subunits in endothelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1108: 159-168.

143. Quist A., Doudevski I., Lin H., Azimova R., Ng D., Frangione В., Kagan В., Ghiso J., Lai R. 2005. Amyloid ion channels: a common structural link for protein-misfolding disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 10427-10432.

144. Rice S.O. Mathematical analysis of random noise. In Selected papers on noise and stochastic processes. Edit. Wax N. New York: Dover, 1954. P. 133-294.

145. Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N., Kotova E.A. 1997. Effect of the dipole potential of a bilayer lipid membrane on gramicidin channel dissociation kinetics. Biophys. J. 73: 850-854.

146. Rostovtseva Т.К., Nestorovich E.M., Bezrukov S.M. 2002. Partitioning of differently sized poly(ethylene glycol)s into OmpF porin. Biophys. J. 82: 160-169.

147. Rostovtseva Т.К., Tan W., Colombini M. 2005. On the role of VDAC in apoptosis: fact and fiction. J. Bioenerg. Biomembr. 37: 129-142.

148. Sack J.T., Aldrich R.W. 2006. Binding of a gating modifier toxin induces intersubunit cooperativity early in the Shaker К channel's activation pathway. J. Gen. Physiol. 128:119-132.

149. Shapovalov G., Lester H.A. 2004. Gating transitions in bacterial ion channels measured at 3 microns resolution. J. Gen. Physiol. 124: 151-161.

150. Sargent D.F., Bean J.W., Schwyzer R. 1989. Reversible binding of substance P to artificial lipid membranes studied by capacitance minimization techniques. Biophys. Chem. 34: 103-114.

151. Scaloni A., Bachmann R.C., Takemoto J.Y., Barra D., Simmaco M., Ballio A. 1994. Stereochemical structure of syrigomycin, a phytotoxic metabolite of Pseudomonas syringae pv. syringae. Nat. Prod. Lett. 4: 159-164.

152. Schagina L.V., Gurnev Ph.A., Takemoto J.Y., Malev V.V. 2003. Effective gating charge of ion channels induced by toxin syringomycin E in lipid bilayers. Bioelectrochemistry. 60:21-27.

153. Schmitt E.K., Vrouenraets M., Steinem C. 2006. Channel activity of OmpF monitored in nano-BLMs. Biophys. J. 91: 2163-2171.

154. Segre A., Bachmann R.C., Ballio A., Bossa F., Grgurina I., Iacobellis N.S., Marino G., Pucci P., Simmaco M., Takemoto J.Y. 1989. The structure of syringomycins Al, E and G. FEBS Lett. 255: 27-31.

155. Severina I.I., Muntyan M.S., Lewis K., Skulachev V.P. 2001. Transfer of cationic antibacterial agents berberine, palmatine, and benzalkonium through bimolecular planar phospholipid film and Staphylococcus aureus membrane. IUBMB Life. 52: 321-324.

156. Sheppard J.D., Jumarie C., Cooper D.G., Laprade R. 1991. Ionic channels induced by surfactin in planar lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1064: 13-23.

157. Silvius J.R. 2003. Role of cholesterol in lipid raft formation: lessons from lipid model systems. Biochim. Biophys. Acta. 1610: 174-183.

158. Sobko A.A., Kotova E.A., Antonenko Y.N., Zakharov S.D., Cramer W.A. 2004. Effect of lipids with different spontaneous curvature on the channel activity of colicin El: evidence in favor of a toroidal pore. FEBS Lett. 576: 205-210.

159. Sobko A.A., Kotova E.A., Antonenko Y.N., Zakharov S.D., Cramer W.A. 2006. Lipid dependence of the channel properties of a colicin El-lipid toroidal pore. J. Biol. Chem. 281: 14408-14416.

160. Song J., Midson C., Blachly-Dyson E., Forte M., Colombini M. 1998a. The topology of VDAC as probed by biotin modification. J. Biol. Chem. 273: 2440624413.

161. Song J., Midson C., Blachly-Dyson E., Forte M., Colombini M. 1998b. The sensor regions of VDAC are translocated from within the membrane to the surface during the gating processes. Biophys. J. 74: 2926-2944.

162. Sorensen K.N., Kim K.H., Takemoto J.Y. 1996. In vitro antifungal and fungicidal activities and erythrocyte toxicities of cyclic lipodepsinonapeptides produced by Pseudomonas syringae pv. syringae. Antimicrob. Agents Chemother. 40:2710-2713.

163. Starke-Peterkovic Т., Turner N. Else P.L., Clarke R.J. 2005. Electric field strength of membrane lipids from vertebrate species: membrane lipid composition and Na+-K+-ATPase molecular activity. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288: R663-670.

164. Stojilkovic K.S., Berezhkovskii A.M., Zitserman V.Yu., Bezrukov S.M., 2003. Conductivity and microviscosity of electrolyte solutions containing polyethylene glycols, J. Chem. Phys. 119:. 6973-6978.

165. Szabo I., Adams C., Gulbins E. 2004. Ion channels and membrane rafts in apoptosis. Pflugers Arch. 448: 304-312.

166. Takemoto J.Y. 1992. Bacterial phytotoxin syringomycin and its interaction with host membranes. In D.P.S. Verma (ed.), Molecular signals in plant microbe communications, CRC Press, Inc.

167. Tanna В., Welch W, Ruest L, Sutko J.L., Williams A.J. 2005. Voltage-sensitive equilibrium between two states within a ryanoid-modified conductance state of the ryanodine receptor channel. Biophys. J. 88: 2585-2596.

168. Tejedor F.J, Bokhari A, Rogero 0, Gorczyca M, Zhang J, Kim E, Sheng M, Budnik V. 1997. Essential role for dig in synaptic clustering of Shaker K+ channels in vivo. J. Neurosci. 17: 152-159.

169. Teraoka I. 2001. Polymer Solutions. An Introduction to Physical Properties, Wiley, New York.156-157.

170. Tieleman D.P, Berendsen H.J. 1998. A molecular dynamics study of the pores formed by Escherichia coli OmpF porin in a fully hydrated palmitoyloleoylphosphatidylcholine bilayer. Biophys. J. 74: 2786-2801.

171. Tillman T.S, Cascio M. 2003. Effects of membrane lipids on ion channel structure and function. Cell Biochem. Biophys. 38: 161-190.

172. Uemoto Y, Suzuki S, Terada N, Ohno N, Ohno S, Yamanaka S,

173. Komada M. 2007. Specific role of the truncated betalV-spectrin Sigma6 in sodium «channel clustering at axon initial segments and nodes of ranvier. J. Biol. Chem. 282: 6548-6555.

174. Walsh U.F, Morrissey J.P, O'Gara F. 2001. Pseudomonas for biocontrol of phytopathogens: from functional genomics to commercial exploitation. Curr. Opin. Biotechnol. 12: 289-295.

175. Yamamoto D, Suzuki N. 1987. Blockage of chloride channels by HEPES buffer. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 230: 93-100.

176. Yuldasheva L.N, Merzlyak P.G, Zitzer A.O, Rodrigues C.G, Bhakdi S, Krasilnikov O.V. 2001. Lumen geometry of ion channels formed by Vibrio cholerae EL Tor cytolysin elucidated by nonelectrolyte exclusion. Biochim. Biophys. Acta. 1512: 53-63.

177. Zakharian E, Reusch R.N. 2004. Streptomyces lividans potassium channel KcsA is regulated by the potassium electrochemical gradient. Biochem. Biophys. Res. Commun. 316:429-436.

178. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

179. Ostroumova O.S., Malev V.V., Kaulin Yu.A., Gurnev Ph.A., Takemoto J.Y., Schagina L.V. 2005. Voltage-dependent synchronization of gating of syringomycin E ion channels. FEBS Letters. 579 (25), 5675-5679.

180. Kaulin Yu.A., Takemoto J.Y., Schagina L.V., Ostroumova O.S., R. Wangspa, Teeter J.H., Brand J.G. 2005. Sphingolipids influence the sensitivity of lipid bilayers to fungicide, syringomycin E. J. Bioenerg. Biomembr. 37 (5), 339-348.

181. Остроумова O.C., Гурьнев Ф.А., Такемото Д., Щагина Л.В., Малев В.В. 2005. Кинетические характеристики одиночных ионных каналов и стационарная проводимость модифицированных фитотоксинами липидных бислоев. Цитология. 47(4): 338-343.

182. Остроумова О.С., Малев В.В., Щагина Л.В., 2006. Кооперативность функционирования ионных каналов, образованных фитотоксинами, сирингомицином Е и сирингостатином А. Биологические мембраны. 23 (5), 412-419.

183. Ostroumova O.S., Gurnev Р.А., Schagina L.V., Bezrukov S.M. 2007. Asymmetry of syringomycin E channel studied by polymer partitioning. FEBS Letters. 581 (5), 804-808.

Информация о работе

Остроумова, Ольга Сергеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.25

Диссертация

Многоуровневая проводимость ионных каналов, образованных циклическими липодепсипептидами Preudomonas Syringae в липидных бислоях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы