Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изыскание иммуномодуляторов для повышения эффективности бруцелллезных вакцин

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изыскание иммуномодуляторов для повышения эффективности бруцелллезных вакцин"

А

На правах рукописи

Аа&о

ШУРАЛЕВ ЭДУАРД АРКАДЬЕВИЧ

ИЗЫСКАНИЕ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ для ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ БРУЦЕЛЛЕЗНЫХ

ВАКЦИН

03.00.07 - Микробиология

16.00.03-Ветеринарная микробиология, вирусология, Эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат Дйссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Казань - 1999

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (г.Казань) и Казанской государственной академии ветеринарной медицины.

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук Г.А. БЕЛОЗЕРОВА

доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки РФ, заслуженный ветврач РСФСР, профессор K.M. CAJIMAKOB

доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки РТ, профессор A.M. АЛИМОВ

доктор ветеринарных наук, заслуженный ветврач РТ и РФ, профессор М.А. САФИН

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательски»

институт бруцеллеза и туберкулеза (БШ1ИБТЖ)

(О о

Защита состоится « го 2000 г. в часов на

¡аседании диссертационного совета Д-120^15.01 ~во Всероссийском научно-1сследовательском ветеринарном инстшуге по адресу: 420075, г.Казань-75, 1аучный городок - 2, ВНИВИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского тучно-исследовательского ветеринарного института (г.Казань). .

Автореферат разослан « 1999 г.

Ученый секретарь лссертационного совета, андидат ветеринарных наук, таршнй научный сотрудник В.И. СТЕПАНОВ

s> >

j/ 1 у/, <7 О

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Бруцеллез остается одной из актуальных облем для ветеринарии и здравоохранения. Несмотря на многие правительст-нные постановления, в настоящее время еще не везде обеспечено полное бла-получие животноводческих хозяйств по данному заболеванию. Основным ктором в комплексе противобруцеллезных мероприятии является использо-ние высокоактивных средств специфической профилактики, которые создали бы у привитых животных иммунитет достаточной напряженности при збовыраженной серопозитивности.

На территории нашей страны, для специфической профилактики бруцел-ia крупного рогатого скота и овец применялись и применяются живые вак-кы из штаммов B.abortus 19 и 82, B.melitensis Rev-1 (К.М.Салмдтов, 1977, ^.Уласевич и соавт., 1980, А.А.Новицкий и соавт., 1983, И.А.Косадов, 1992, С.Димов и соавт., 1993, П.К.Аракелян и соавт., 1997 и др.). Однако они име-существенные недостатки? высокую и продолжительную агглютиноген-лъ, абортогенноегь, остаточную вирулентность (А.А.Султанов, 1992, Д.Чекишев и соавт., 1993, В.М.Авилов и соавт., 1999, F.Ciuchini et al., 1986, "ensterbank, 1986, F.C.Viana et al., 1986 и др.).

В 1979г. п лаборатории по изучению бруцеллеза ВНИВИ (г.Казань) ^.Белозеровой и К.М.Салмаковым был получен слабоагглютиногентшй 1мм B.abortus 82-ПЧ, который не обладает абортогенностыо \.Белозерова, 1993). Этот шгамм и вакцина из пего были всесторонне изучена лабораторных животных и крупном рогатом скоте в лабораторных и про-одственных условиях, при :л ом установлена ее высокая противоэпизоотиче-я и иммунологическая эффективность.

Однако ю литературных источников известно, что ни одна из имеющихся сегодняшний день вакцин не создает 100%-ного защитного эффекта от целлезной инфекции. В последние годы с целью повышения активности дств специфической профилактики проводятся'изыскания веществ, способ: направленно воздействовать на иммунную систему — иммуномодуляторов С.Переходова и соавт., 1990, О.Н.Иванова, 1995, А.А.Петров и соавт., 1996, .Мельниченко и соавт., 1998, L.Banizzi et al., 1986, J.Krzyzanowski et al., M.Fernandez et al., 1997 и др.).

Сохранение высокой степени риска широкого распространения бруцел-I среди сельскохозяйственных животных и проявления эпидемической ее ;кции вызывает необходимость усовершенствования системы специфиче-í профилактики данной инфекции путем повышения эффективности суще-ющих вакцин, что и определило выбор темы и направления наших иссле-1НИЙ.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явля-— изучить влияние различных иммуномодуляторов на поствакциналышй уногенез и изыскать препарат, повышающий эффективность живых бру-

целлезных вакцин. Для реализации намеченной, цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить антигенные свойства вакцинных штаммов B.abortus 19, 82 и 82-ПЧ и отобрать из них штамм, обладающий более слабыми агглютиногенны-ми свойствами;

2. Изыскать наиболее эффективные иммуномодуляторы, которые не оказывали бы вредного биологического воздействия на бруцеллы in vitro;

3. Изучить на лабораторных животных влияние иммуномодуляторов на формирование и течение поствакцинального иммунитета при бруцеллезе;

4. Установить напряженность иммунитета у овец, привитых живыми бруцеллезными вакцинами в сочетании с иммуномодуляторами.

1.3. Научная новизна. Впервые в сравнительных опытах на лабораторных животных и овцах изучены антигенные и иммуногенные свойства живых вакцин из штаммов B.abortus 19, 82 и 82-ПЧ; изучено влияние различных иммуномодуляторов на бруцеллы вакцинного штамма 82-ПЧ, а: также на формирование и течение иммуногенеза,, вызванного вакциной из этого штамма; установлена высокая эффективность иммуноферментного анализа при изучении поствакцинального иммуногенеза при бруцеллезе в сравнении с общепринятыми серологическими реакциями (РА, РСК, РБП); впервые подобраны иммуномодуляторы - тиосульфат натрия и. тимоген, повышающие иммунологическую эффективность живой бруцеллезной вакцины из штамма 82-ПЧ на морских свинках и овцах.

1.4. Практическая значимость. Результаты проведенных исследований вошли в следующие нормативно-технические документы:

1) Временное наставление по применению живой нативной вакцины из штамма 82-ПЧ бруцелла абортус против бруцеллеза овец. — Утв. директором ВНИВИ (г.Казань) 10.12.99г.;

2) Рекомендации по иммунизации овец против бруцеллеза вакциной из штамма B.abortus. 82-ПЧ в сочетании с иммуномодулятором - тиосульфатом натрия. — Утв. директором ВНИВИ (г.Казань) 10.12.99г.

1.5. Основные положения, выдвигаемые на защиту:

— Антигенные свойства вакцинного штамма B.abortus 82-ПЧ в сравнении с вакцинами из штаммов 19 и 82;

— Влияние различных иммуномодулирующих препаратов (ксимедона, тимогена, тиосульфата натрия, дибазола и левамизола) на бруцеллы вакцинного штамма 82-ПЧ in vitro; •

— Сочетанное введение иммуномодуляторов с живыми противобруцел-лезными вакцинами и их влияние на специфические и неспецифические факторы иммунитета;

— Иммуногенная активность вакцинных штаммов B.abortus 19, 82 и 82-ПЧ при сочетанном применении с различными иммуномодуляторами на морских свинках и овцах.

1.6. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета ВНИВИ' в виде ежегодных рабочих

программ и отчетов (1996 - 1999гг.); на Республиканской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и животноводства (Казань, 1997); на I Республиканской научно-практической конференции "Молодые ученые - агропромышленному комплексу" (Казань, 1998); на Международной научной конференций, посвященной 125-летию КГАВМ (Казань,

1998); на III Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1998); на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998); на научно-производственной конференции, посвященной 50-летию Калининградской НИВС (Калининград, 1998); на международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ (Покров, 1998); на юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (Екатеринбург 1999); на Международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня. рождения члена-корреспондента ВАСХНИЛ В.Т.Кото^ (Воронеж,

1999); на Республиканской научно-производственной конференции "Актуальные проблемы животноводства и ветеринарии" (Казань, 1999).

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных

работ.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 208 страницах и включает общую характеристику работы, обзор литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения.

Работа иллюстрирована 34 таблицами и 5 рисунками. Список литературы включает 319 источников, в том числе иностранных - 98.

X СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в 1996 т 1999гг. согласно Государственному плану научных исследований (номер Госрегистрации 01970002404) на базе лаборатории бактерийных инфекций Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г.Казань), кафедры патологической анатомии Казанской государственной академии ветеринарной медицины и коллективного предприятия "Октябрь" Арского района Республики Татарстан.

В опытах использовали 153 морские свинки, 84 кролика и 230 овец.

С целью изыскания эффективного иммуномодулятора для стимуляции иммуногенеза при противобруцеллезной вакцинации изучали свойства различных регламентированных пренаратов, в т.ч. ксимедона, тиосульфата натрия, тимогена, дибазола, левамизола.

При проведении исследований применяли микробиологические, серологические, гематологические, биохимические, иммунологические, аллергические, бактериологические, иммуноморфологические, гистохимические и другие методы.

С целыо изучения гуморального иммунитета в исследованиях использовали серологические реакции: агглютинации (РА) и связывания комплемента (РСК), роз-бенгал пробу (РБП) и иммунофсрментный анализ (ИФА). При постановке реакций использовали единый бруцеллезный и роз-бенгал антигены Херсонской биофабрики и R-антиген, изготовленный из инагглютиногенного штамма В.abortus R-1096. РА, РСК и РБП ставили согласно существующим наставлениям.

Реакцию ИФА ставили в непрямом варианте с применением стандартного единого бруцеллезного антигена. При иммуноферментном анализе сывороток крови кроликов использовали антитела диагностические против иммуноглобулинов (Ig). кролика, меченные пероксидазой, производства ИЭМ им.Гамалеи. При постановке ИФА с сыворотками крови овец использовали конъюгат, приготовленный в условиях лаборатории. С этой целыо вначале выделяли Ig из овечьей сыворотки путем осаждения сульфатом аммония с последующей диализацией по методике J.Brock, описанной в справочнике "Иммунологические .методы" под редакцией Г.Фримеля (1987). С целыо получения диагностических сывороток нолученные иммуноглобулины вводили кроликам методом эффективной иммунизации небольшими количествами антигена в модификации Н.А.Хисматуллиной и соавт. (1992). Полученные антисыворотки метили пероксидазой по методике Н.А.Хисматуллиной (1987). Полученные серологические данные выражали в титрах и в десятичном логарифме (lg).

При изучении клеточного иммунитета использовали реакцию гиперчуз-ствительности замедленного типа (ГЧЗТ) и опсоно-фагоцитарную реакцию (ОФР). ГЧЗТ изучали с использоваш!ем бруцеллина ВИЭВ, который вводили внугрикожно. Учет реакции проводили спустя 24 и 48 часов после введения аллергена, при этом кутиметром измеряли утолщение кожной складки на месте инъекции бруцеллина.

• ОФР ставили по методике В.А.Штритера, описанной И.А.Косиловым (1992). При этом определяли фагоцитарную активность (ФА) по В.С.Госгеву, вычисляли также фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ).

Из гематологических методов использовали метод прямого спонтанного розеткообразовашш (Е-РОК), который ставили согласно разработанным во ВНИВИ (г.Казань) методическим рекомендациям (А.З.Равилов и соавт.,1999).

Биохимическими методами изучали содержание общего белка и его фракций. При этом в первом случае применяли рефрактометрический метод, определение белковых фракций сыворотки крови проводили турбидиметриче-ским методом (В.Г.Колб и соавт., 1976).

Микробиологическими методами изучали влияние иммуномодуляторов на бруцеллы вакцинного штамма in vitro. С этой целыо готовили различные концентрации иммуномодулирующих препаратов, смешивали их с одномиллиардной взвесью двухсуточной агаровой культуры штамма 82-ПЧ. Готовые смеси выдерживали при комнатной температуре определенное время и делали высевы на агар (ППГГА). Посевы инкубировали в термостате при 37°С и наблюдали за характером роста культур.

Бактериологические методы исследований использовали для выделения культур бруцелл га организма привитых и зараженных животных. Для этого из органов и лимфатических узлов делали высевы на питательные среды. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 3 недель, просматривая каждую неделю выделенные культуры бруцелл, которые затем идентифицировали при помощи реакции микроагглютинэции на предметном стекле с применением S-и R-сывороток и микроскопии. При исследовании учитывали индекс инфици-рованности (ИИ) и процент иммунных животных.

Материалом для патоморфологических и гистологических исследований служили кусочки внутренних органов и тканей. Патматериал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, спирт-формалине (9:1). Уплотнение материала проводили путем заливки в парафин но общепринятой методике. Гистосрезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Исследования проводились в 4 этапа. На первом этапе изучали антиген-гае свойства живых бруцеллезных вакцин в опытах на кроликах, i is птором -влияние различных иммуномодуляторов на бруцеллы вакцинного штамма 82-ПЧ in vitro. Третий этап исследований включал 6 опытов на лабораторных животных (кролики, морские свинки) по изучению поствакцинального иммуно-, генезапри сочетанном применении живой бруцеллезной вакцины с иммупомо-дуляторами. Четвертый этап работы заключался в производственном исш.п л-нии сочетанного применения вакцины из штамма В.abortus 82-ПЧ с иммуномо-дуляторами на овцематках.

Все полученные данные подвергались статистической обработке по методическим рекомендациям, разработанным Р.Х. Тукшаитовым и Н.Р. Нигма-туллиным (1984), с использованием критерия Стыодента. В некоторых случаях пользовались критерием Фишера, предлагаемых! для статистической обработки О.Н. Преображенским и Р.Х. Тукшаитовым (1997).

Некоторые этапы экспериментальной части работы выполняли совместно с научными сотрудниками ВНИВИ - с.н.с., к.в.н. P.A. Салахут-адшовым, с.н.с., к.б.н. H.A. Хисматуллиной, с.н.с., к.б.н. К.Т. Ишмухамето-шм, н.с., к.в.н. E.JI. Матвеевой, ассистентом кафедры патанатомии КГАВМ Г.С. Чанборисовым.

2.2. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ B.ABORTUS 19, 82 И 82-ПЧ НА КРОЛИКАХ

На первом этапе работы с целыо изучения антигенных свойств гтротиво-¡руцеллезных вакцин нами был поставлен опыт на 9 кроликах, подобранных по [ринципу аналогов. Животных разделили на 3 группы по 3 головы в каждой, "роликов первой группы иммунизировали вакциной из шт. 19, второй - шт.82, рстьей - шт. 82-ПЧ. Суспензии культур вакцинных штаммов в дозе 10 млрд [.к. вводили подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 2 мл. У привитых сивотных брали кровь спустя 3, 7, 10, 15, 22, 30, 45 и 60 суток после вакцина-mi. Сыворотки крови исследовали в РА, РСК и РБП.

Агглютинины во всех группах начинали выявляться с 3-х сугок, причем у кроликов первой и второй групп в 100% случаев, а в третьей - у 67%. Далее наблюдался рост титров антител и в течение месяца в РА позитивно реагировали животные всех групп. Наиболее высокими показатели были на 10-е сутки, причем, в группе животных, привитых культурой шт. 19, они достигали уровня 1280 - 5120 ME, а у иммунизированных вакцинами из шт.82 и 82-ПЧ - 320 -640 и 80 - 160, соответственно. Спустя 60 суток после вакцинации все животные, привитые бруцеллами шт.82-ПЧ, были негативными. В РБП все кролики реагировали позитивно, начиная с 7-х сугок, причем животные третьей группы оставались серопозитивными к чеченце месяца, а первой и второй - до 2 мес.

Комплемснтсвязывгиощие антитела во всех группах выявлялись, начиная с 7-х суток. Максимальные тигры отмечались на 15 - 22-е сутки: в первой îpynne на уровне 1:80 - 1:160, во второй - 1:20 - 1:40 и в третьей - 1:10-.1:20. Иммунизация вакциной из шт.82-ПЧ вызывала синтез антител, выявляемых в РСК в течение месяца. Животные, привитые культурой шт.19, реагировали в высоких титрах в РА и РСК до конца сроков исследовании.

Таким образом, в опытах на кроликах установлено, что наименьшей антигенной активностью обладает вакцинный штамм В.abortus 82-ПЧ, который и был использован для дальнейших исследований.

2.3. ПЗЫСЮШИЕ ИММУПОМОДУЛИРУЮЩИХ ПРЕП АРА TOB, НЕ ОКАЗЫВАЮЩИХ ВРЕДНОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

НА БРУЦЕЛЛЫ IN VITRO На втором этапе исследований ставилась задача отобрать иммуномоду-лирутощие препараты, которые не оказывали бы губительного воздействия на бруцеллы вакцинного шт.82-ПЧ in vitro. С этой целью проводились исследования регламентированных и предлагаемых различными авторами препаратов.

Среди первоначально исследованных препаратов некоторые были забракованы в виду плохой растворимости, сложности приготовления суспензии с вакцинной культурой и т.д. Для работы отобрали пять иммуномодуляторов, которые подлежали исследованиям в концентрациях; кспмедон - 10%, тимоген — 0,01%, дибазол - I/o, тиосульфат натриа - 30% н левамизол - 10%. Растворы автоклавировали в течение 0,5 часа в режшге !,5 атм.

Иммуномодулирующие препараты в указанных концентрациях смешивали с равным объемом одномиллиардной взвеси двухсуточной агаровой культуры бруцелл. Смеси выдерживали при комнатной температуре с экспозицией 0,5, 1, 3, 6, 12 и 24 часа, после чего делали шееэы на косячки агара. Посеву инкубировали в термостате и наблюдали за ишекпэностыо роста культ ур.

В контрольной серии, где вместо раствора пммуномодулятора использовали изотонический раствор NaCl, во все сроки наблюдали хороший рост культур. При экспозиции 0,5 часа во всех пробирках наблюдался равномерный рост, характерный для бруцелл шт.82-ПЧ, кроме случая с дибазолом: здесь рост от-

сутствовал. Экспозиция I, 3, 6, 12 и 24 часа не влияла на качество роста культур в случаях с 0,01%-ным раствором тимогепа и 30%-ным — тиосульфата натрия.

При смешивании суспензии бруцелл с 10%-ным раствором кснмедона и экспозиции 6-24 часов наблюдалось замедление роста. Аналогичная ситуация отмечалась и с 10%-ным левамизолом — при 24 часовой выдержке. Меньшая же экспозиция на интенсивность роста культур в этих сериях не влияла.

Далее нами была поставлена задача изыскать оптимальную концентрацию дибазола, пригодную для сочетанного введения с вакцинным шт.82-Г1Ч. Исследовашпо подлежали растворы 0,5, 0,1, 0,01 и 0,001%-ной концентрации. Оптимальным был установлен 0,01%-ный раствор.

С целыо изучения влияния указанных препаратов на жизнеспособность бруцелл проводили следующие исследоиги 1ия. Аналогичным образом смешивали суспензию культуры вакцинного шт.82-Г1Ч с опп;мальными растворами им-муномодуляторов. В качестве контроля использовали 0,85%-пый расгвор ИаС1. Смеси выдерживали с той же экспозицией, после чего последовать детыми разведениями доводили концентрацию бруцелл до 1 тыс. м.к. в 1 мл-с использованием изотонического раствора уторила натрия. 1 мл разведенной суспензии высевали на 5 чашек Петри с агаром, инкубировали в термостате и подсчитывали число колоний.

Установлено, что все изученные препараты в указанных концентрациях не оказывали губительного влияния на жизнеспособность бруцелл в течение 24 часов. Число живых клеток в 0,2 мл взвеси в разных сериях колебалось от 182,2±3,4 до 200,6+2,9, что соответствует концсшрации 911 - 1003 м.к. в 1 мл разведе1шой суспензии.

На основании полученных данных в дальнейших исследованиях изучалось действие указанных препаратов на поствакцинальный иммуногенез при сочетанием их применении с вакциной из штамма 82-ПЧ.

2.4. ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ НА ФОРМИРОВАНИЕ И ТЕЧЕНИЕ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНОГО ИММУНОГЕНЕЗА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Влияние препаратов па антигенные свойства вакцинного штамма. В опыте №3 изучали антителогенез у кроликов, иммунизнрованных культурой вакцинного шт.82-ПЧ в сочетании с пммуномодуляторами. Для серологических исследований у животных брали кровь спустя 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 75 и 90 суток после вакцинации. Агглютинины выявлялись, начиная с 3 - 4-х суток после вакцинации, а комплементсвязывающис антитела - с 7-х суток. Максимального уровня агглютинины достигали к 10-м суткам, причем наибольшим показатель ^ был в группе жпиошых, иммунизированных вакциной в сочетании с тиосульфатом натрия (2.14±0,13), а наименьшим - с ксимедоном ;1,48±0,08). Уровень антител в РСК достигал максимальных значений на 14 -21-е сутки, причем достоверно выраженных различий в группах не наблюдаюсь, а показатель составлял 0.7610,07 - 1,24:'. 0,13. Все животные реагирова-

ли отрицательно в РСК на 60-е, а в РА - на 75-е сутки (на этот срок позитивно реагировало только 40% животных, стимулированных тиосульфатом натрия). Достоверно высокие показатели получены при исследованиях методом ИФА. У кроликов, привитых в сочетании с тиосульфатом натрия, титры антител были максимальными (1§=2,36±0,13). Комплементсвязывающие антитела к II-антигену выявлялись в более высоких титрах, чем к единому бруцеллезному антигену, причем максимальные значения полученные на 14 - 21-е сутки, наблюдались в той же группе — 1,72±0,08, а позитивной реакция сохранялась до 90-х суток.

При иммунизации кроликов вакциной из штамма 82-ПЧ в сочетании с тимогеном наблюдалась активизация синтеза антител на 21 - 60-е сутки, что выражалось более высокими показателями в реакциях ИФА и РСК с Я-антигеном. Ксимедон оказывал угнетающее действие на антителогенез, что сопровождалось более низкими титрами антител, а дибазол и левамизол выраженного влияния на антигенные свойства вакцинного штамма не оказывали.

Таким образом, в опытах на кроликах установлено, что тимоген и, в особенности, тиосульфат натрия, усиливают гуморальный иммунный ответ на введение вакцины га штамма 82-ПЧ.

Изучение уровня иммунокомпетентиых клеток в периферической крови привитых кроликов. С целью изучения влияния иммуномодуляторов на иммунокомпетентную систему организма был поставлен опыт на кроликах, которых иммунизировали вышеуказанным образом. Спустя 2, 4, 7, 14, 21, 30 и 45 суток после вакцинации у животных брали кровь и методом прямого спонтанного розеткообразования определяли содержание Т- и В-лимфоцитов в периферической крови. В результате было установлено, что вакцинальный иммуногенез при бруцеллезе характеризуется выраженной перестройкой иммунокомпе-те'нтной системы, причем наблюдалось увеличение содержания как Т-, так и В-клеток лимфоидной системы. Изменения сопровождались увеличением числа не только лимфоцитов, но и общего количества лейкоцитов. Сочетание вакцины с ксимедоиом и тимогеном активизирует выработку Т-лимфоцитов, причем абсолютное содержание Т-клеток у кроликов, стимулированных ксимедоном, на 14-21-е сутки превышало контрольный уровень на 28,7 - 32,4%, а при применении тимогена достоверно высокое содержание Т-лимфоцитов наблюдалось в период с 7-х по 30-е сутки после вакцинации, превосходя уровень шпактных животных в 1,9 - 3,0 раза. Применение тимогена дало достоверно высокие показатели абсолютного числа Т-клеток, начиная с 4-х суток после вакцинации, причем они превышали данные группы кроликов, привитых культурой исходного шт. 82-ПЧ, в 1,5 - 2,5 раза.

Тиосульфат натрия выраженного влияния на тимусзависимые лимфоциты не оказывал, хотя содержание Т-клеток регистрировалось на высоком уровне, однако иммуногенез сопровождался выраженным усилением синтеза В-клеток иммунной системы. Уже начиная с 4-х суток после вакцинации уровень

¡-лимфоцитов достоверно превышал показатели, полученные на кроликах, м ривитых только вакциной, на 32 - 83%. 11

Таким образом, тимоген и тиосульфат натрия при сочетанном их введе-ии с вакциной из штамма 82-ПЧ, оказывают выраженное стимулирующееиЛ лияние на иммунокомпетентную систему организма, что проявляется досто-"Тг ерным увеличением содержания Т- и В-клеток лимфоидной системы в пери-"™ ерической крови иммунизированных животных.

пф

Содержание белка и его фракций в сыворотке крови иммунизирован- '' ых кроликов в динамике иммуногенеза. Неспецифические гуморальные фак-п э эры иммунитета также важны в развитии поствакцинального иммуногенеза. К111' им относятся белок сыворотки крови и его фракции. Мы изучали влияние вак-:;|/ инации на соотношение различных фракций белка в сыворотке крови. Иммун-ый процесс при вакцинации культурой шт.82-ПЧ характеризовался снижением Зсолютного количества альбуминов в первые 7 суток после вакцшадии наьи 3,0 - 28,3%, а с 14-х суток постепенным подъемом до первоначального уровня, эторый достигался к 30 - 45-\£ суткам. Применение иммуномодуляторов не называло выраженного влияния на такую закономерность, В отношении гло-^ улиновых фракций наблюдался подъем их абсолютного числа, а максимально> уровня они достигали на 14 - 21-е сутки во всех группах, причем у кроликов, " эивитых исходным шт.82-ПЧ, показатель содержания глобулинов превышал1''" шные интактной группы животных на 74 - 76%. Менее активно синтез глобу-шов проходил у животных, которым вводили ксимедон. Уровень абсолютно-'"' » количества глобулиновых фракций превышал первоначальный только на 48 50%. Наиболее активный синтез белков глобулярной природы наблюдался у"'1' юликов, привитых бруцеЛлами вакцинного штамма в сочетании с тиосульфа->м натрия - максимальные показатели превышали данные контроля на 105 - ЛУ-18%. У животных, стимулированных тимогеном, содержание глобулинов в ,1воротке крови, было выше контрольных значений на 72 - 75%.

Менее всего иммунизация влияла на относительное и абсолютное содер^4" ание Р-глобулинов. Во все сроки исследований и во всех группах этот показа-'1 -Л ль достоверно не отличался от первоначального уровня и составлял 10,4±1,6^| 13,6±1,5 г/л (13,2±1,6 - 18,9±1,7% от общего белка). Достоверные изменения,,^. 1блюдались в а- и у-глобулиновых фракциях. ^^

Так, уровень а-глобулинов в сыворотке крови иммунизированных кроли-1В увеличивался, начиная со 2-х суток, причем максимальные значения былиа;,^ •лучены на 7 - 14-е сутки, когда их содержание превышало первоначальный Ш!1 ювень на 72 - 79%. Уже на 21-е сутки показатели в опытной и контрольной , уппах достоверно не отличались. Применение ксимедона не оказывало выра-_ £П :нного влияния на синтез а-глобулинов. Наиболее высокие показатели со- :п[! ржания белков данной фракции получены в группе животных, стимулиро- О.оо нных тимогеном. Уровень а-глобулинов достоверно превосходил показатели!/цг

контрольной группы на 4 - 21-е сутки на 66 - 146%, а в группе, где применяли тиосульфат натрия, - на 2 - 21-е сутки на 60 - 84%.

Содержание у-глобулинов в сыворотке крови, привитых шт.82-ПЧ кроликов, было достоверно выше на 7 - 30-е сутки после вакцинации, превышая контрольные значения в 2,2 - 5,2 раза. Менее активно синтез у-глобулинов протекал при применении ксимедона, в этой группе достоверные изменения наблюдались на 14 - 30-е сутки-после вакцинации, однако уровень белка данной фракции был достоверно ниже такового у кроликов, привитых только шт. 82-ПЧ, на 13 - 39%. Высокий уровень у-глобулинов также наблюдался у кроликов, стимулированных тимогеном, хотя он был несколько ниже, чем при вакцинации без иммуностимуляции. Наиболее высокие показатели получены при применении тиосульфата натрия, которые на 33 - 99% превосходили данные, полученные при вакцинации без иммуостимуляции! . . , .

Таким образом, установлено, что тимоген активизирует синтез а-глобулинов, а тиосульфат натрия - у-глобулинов.

Влияние иммуномодуляторов на бактериологические особенности течения постващинального иммуногенеза, вызванного бруцеллами штамма 82-ПЧ, у морских свинок В опытах на морских свинках изучали влияние иммуномодуляторов на сроки диссеминации и элиминации бруцелл в организму иммунизированных животных. Течение иммуногенеза у морских свинок, привитых культурой исходного шт. 82-ПЧ, характеризовалось регионарным размножением бруцелл в течение 3-х суток после вакцинации и переходом в генерализованную форму на 6-е сутки. Максимальная обсеменярмость организма наблюдалась на 14 - 30-е сутки, когда ИИ в группе составлял 50,0 - 56,7%, после чего происходила элиминация бруцелл из организма привитых животных и уже на 60-е сутки только у одного животного из трех было выделено 2 культуры из регионарного лимфоузла и селезенки .(ИИ - 6,7%). Применение иммуномодуляторов по-разному влияло на сроки диссеминации. Введение ксимедона препятствовало миграции бруцелл по организму, а на 6-е сутки исследований культуры высевались из регионарных и контррегионарных лимфоузлов и только у одного животного - из селезенки (ИИ - 26,7%). Максимальные значения ИИ получены на 14 - 30-е сутки и составили 30,0 - 36,7%. Однако на сроки элиминации инфекта выраженного влияния данный прейарат не оказывал: на 60-е сутки ИИ также был на уровне 6,7%. ,

Тимоген оказал некоторое пролонгирующее действие на регионарную фазу иммуногенеза - до 6-х суток, при этом культуры выделялись только из регионарных лимфоузлов, а на 14-е - еще из контрцегионарных, селезенки и костного мозг. Отдаленных лимфоузлов бруцеллы вакцинного штамма достигали на 30 - 45-е сутки, причем ИИ в эти сроки был максимальным - 56,7 - 63,3%. При этом на сроки элиминации бруцелл из организма это не повлияло и уже на 60-е сутки культуры высевались только из регионарных и контррегионарных лимфатических узлов, а ИИ составил 10,0%. Возможно такой феномен связан с© способностью тимогена влиять на макрофагальную реакцию и тем самым

вызывать задержку микроорганизмов в регионарных лимфоузлах в фагоцитированном виде. Однако бруцеллы не подвергаются активному лизису в непре-мированных макрофагах, а в последующем развитии иммуногенеза происходит синтез сенсибилизированных Т-лимфоцитов, которые премируют макрофаги, а они в свою очередь становятся иммуноактивными и фагоцитируя бруцеллы вакцинного штамма легко их лизируют, в связи с чем происходит бысграя элиминация вакцинной культуры из организма.

Прй применении тиосульфата натрия в качестве иммуномодулятора при вакцинации культурой шт.82-П11' происходило сокращение регионарной фазы иммуногенеза с быстрым переходом в генерализованную форму. Уже на 3-й сутки ИИ в группе составлял 13,3%, а на 6-е — культуры выделялись не только из регионарных и контррегионарных, но и отдаленных лимфоузлов, а также из селезенки и костного мозга 'Максимальная обсеменяемость организма бруцелла-ми вакцинного штамма Наблюдалась на 6 - 21-е сутки вакцинального процесса с ИИ 53,3 - 66,7%, а начиная с 30-х суток наблюдалась элиминация микроорганизмов из организма. На 60-е сутки была выделена только одна культура от одного животного из парааортального лимфоузла (ИИ составил 3,3%).

Таким образом, в опытах на морских, свинках установлено, что ксимедон препятствует миграции бруцелл с места введения; при применении тимогена наблюдается пролонгация регионарной фазы, сочетанное введение вакцины с тиосульфатом натрия создает условия рдя более активной репродукции бруцелл и быстрой обсеменяемости организма привитого животного. .....

Показатели клеточного иммунитета у морских свинок при противо-бруцеллезной вакцинации. С. целью изучения показателей клеточного иммунитета ставили опсонотфагоцитарную. реакцию с использованием убитых нагреванием бруцелл вирулентного шт.54. До вакцинации ФА составляла 44,2±2,4 -45,4±1,8%. Уже на 15-е сутки после вакцинации культурой шт.82-ПЧ наблюдалось некоторое усиление ФА. Фагоцитарная активность лейкоцитов была максимальной на 60-е сутки, когда уровень ФА превышал контрольный в 1,3 раза Затем наблюдалось некоторое ослабление ОФР, хотя на 90-е-сутки после вакцинации оставалась достоверно высокой. .„ , ■

В первые сроки исследований ФА лейкоцитов крови морских свинок,-привитых в сочетании с ксимедоном, быладостоверно выше, чем при вакцинации без иммуностимуляции. Однако через 90 суток после иммунизации показатели данной группы были в 1,5 - 2,0 раза ниже, чем у животных, привитых только культурой вакцинного штамма ■ ^ :

Наиболее высокой ФА наблюдалась в группе морских свинок, стимулированных тимогеном. Уже на 15-е сутки все показатели достоверно превышали первоначальный уровень. . ,.....: • >. :' :

У животных, иммунизированных с применением тиосульфата натрия, показатели фагоцитарной активности крови оставались высокими и в отдаленные сроки исследований (90-е сутки). -

Аналогичным образом изменялись и показатели ФИ и ФЧ. Во все сроки исследований и во всех 'группах эти показатели были достоверно выше таковых, полученных до иммунизации. Уровень ФИ и ФЧ в группе морских свинок, иммунизированных культурой шт.82-НЧ'без'йммуностимуляции, максимального значения достигали на 60-е сутки поствакцинального периода, превышая первоначальные значения в 1,8 й 2,2 раза, соответственно. В группе животных, стимулированных ксимедоном, данные показатели были на 22 - 33% выше, чем при иммунизации без иммуноМодуляций, в первые сроки исследований (1530-е сутки), а тимогеном - на 38 - 102%. Уровень ФИ и ФЧ у морских свинок, которым вакцину вводили с'тиосульфатом натрия, достоверно отличался от данных группы нестимулиров'аиных;животных только на 90-е сутки вакцинального процесса, превышая показатели' последних на 18 - 25%.

Сочетание вакцинации '-с' йммуномодуляцией влияло также на реакцию ГЧЗТ на введение бруцеллина' у'морских свинок. Начиная с 30-х суток реакция была выраженной вОвссх группах животных, привитых вакцинами из шт. 19, 82 и 82-ПЧ, в т.ч. и С'иммуномодуляторами.' Применение дибазола при иммунизации культурой шт.82-ПЧ не оказало «выраженного влияния на реакцию ГЧЗТ. Сочетание вакцины с ксимедоном нёгат1шно отразилось на аллергической реакции на бруцеллин, которая была ниже на 28 — 31%, чем в группе нестимули-рованных животных. Несколько выше "реакция была у животных, привитых ваюршой в сочетании с тиосульфатоМиагрия. Применение левамизола вызвало достоверное усиление аллергической реакции только на 30-е сутки, а тимогена - во все сроки исследований, причем в последнем случае на 22 - 39% выше, чем у морских свинок, привитых «нициалыгбй культурой.

Таким образом, в опытах iia морских свинках установлено, что при иммунизации морских свинок культурой штамма 82-ПЧ в сочетании с тимогеном, наблюдается достоверное усиление фагоцитарной активности и аллергической реакции, тиосульфат натрия и левамизол также оказывали стимулирующее влияние на клеточные факторы uMMymrrcta!" ';

Изучение ¡напряженности иммунитета у вакцинированных против бруцеллеза морских свинок. Влияние иммуномодуляторов на иммуногенность противобруцеллезной вакцины из шт.82-ПЧ в сравнительном аспекте с вакцинами из нгг.19 и 82 изучали на морских сванках. Для этого 8 групп животных по 5 голов в каждой иммунизировали соответствующими вакцинами из шт. 82-ПЧ, 82 и 19 в сочетании с ксимедоном, тимогеном, тиосульфатом натрия, дибазолом и левамизолом. Девятая группа была интактной. Через 3 месяца после вакцинации проводили экспериментальное заражение опытных животных культурой вирулентного шт. В.abortus 54. Для этого вначале была проведена титрация заражающей дозы вирулентной культуры, по результатам которой было установлена минимальная инфицирующая доза (МИД), которая составила 5 м.к. Опытных и интактных животных заражали культурой urr.54 в 10-кратной МИД, равной 50 м.к.

штамма 19 приводила к синтезу высокого уровня агглютининов — до 1280 МЕ. 11очпт1ишые животные регистрировались до конца сроков наблюдений (4 мес.).

15 РБП позитивные результаты в группе иммунизированных культурой ипаммл 82-ПЧ овец отмечались в течение трех недель, штамма 82 - двух месяце», а штамма 19 —до конца сроков наблюдений (4 мес.).

11римсненис иммуномодулиторов в сочетании с вакциной из шт.82-ПЧ выраженного влияния на синтез антител, выявляемых в РА, не оказывало. Так, только и группе овец, привитых сочетапо с тиосульфатом натрия, уровень агглютининов превышал показания группы нсстимулировашплх животных на 14-е сутки вакцинального процесса на 17,7%. В остальных группах и в другие сроки исследований достоверных различий не наблюдалось. Аналогичная ситуация наблюдалась и при исследовании в реакции с роз-бспгал антигеном.

Комплсментсвизывающие антитела в РСК с единым бруцеллезным антигеном в сыворотках крови овец, вакцинированных культурами штаммов 19 и 82, выявлялись начиная с 7-х суток, а во всех группах, иммунизированных штаммом 82-114, — с 14-х, при этом максимальный уровень достигался на 21-е сутки. В группе животных, привитых штаммом 19, титры достигали — 1:80 — 1:160, а введение вакцинных культур штаммов 82 и 82-ПЧ вызывало синтез антител, выявляемых в РСК, н титрах до 1:40 и 1:20, соответственно. Сыворотки крови оставались позитивными до 30-х суток при вакцинации шт.82-ПЧ, до 45-х - шт.82 и до 90-х - шт. 19. Применение иммуномодулиторов в сочетании с вакциной не привело к достоверным различиям п показаниях РСК в сравнительном аспекте с иммунизацией шт.82-ПЧ без иммуностимуляцни.

Наиболее высокие тигры антител к единому бруцеллезному антигену в сыворотках крови выявлялись методом ИФА в группе овец, привитых вакциной из шт. 19, до 1:1600, причем животные оставались позитивными до конца сроков наблюдений (4 мес.). После иммунизации культурами шт.82 и 82-ПЧ максимальные показатели составили 1:800 и 1:100, а животные продолжали реагировать позитивно до 90-х и 45-х суток, соответственно.

В группах овец, стимулированных нммуномодуляторами наблюдались некоторые сравнительные отличия. Так, во все сроки исследований достоверно высокие показатели ИФА получены при применении тиосульфата натрия с максимальным титром антител 1:400, а позитивными привитые животные оставались до 75-х суток. В остальных группах выраженных достоверных отличий не наблюдалось.

Сыворотки крови также исследовали в РСК с Я-антигеиом. Все пробы, полученные от животных, привитых шт. 19, давали отрицательную реакцию. В группах овец, вакцинированных культурами штаммов 82 и 82-ПЧ, синтез Я-антнтел наблюдался на 7 - 60-е сутки с максимальными показателями титров до 1:80 и 1:40, соответственно, которые отмечались на 21-е сутки после иммунизации.

Дибазол и левамиэол не вызывали достоверных отличий в реакции, а при использовании ксимедопа отмечалось угнетение синтеза комнлсмептсвжм ваюших шггптел во все сроки исследований. При вакцинации овец тт.82-ПЧ в

Спустя 25 суток после инокуляции вирулентного ппамма проводили серологические и посгмортальные бактериологические исследования.

Исследованиями установлено, что морские свинки контрольной (интакт-ной)группы реагировали позитивно в серологических реакциях, причем агглютинины выявлялись и титрах 640 - 2560 МП, а комплемент связывающие антитела - 1:20 - 1:80, при этом ИИ в группе составил 68%. У животных, привитых шт. 19 иммунитет составил 80%, только у одного животного отмечалась регионарная инфекция, при этом ИИ в группе регистрировался па уровне 4%, в РА позитивно реагировало тоже одно животное в тигре 1:10. При иммунизации культурами штаммов 82 и 82-ПЧ иммунитет наблюдался у 60% животных, при этом ИИ в группах был в 6,8 раз ниже, чем в контрольной, а сыворотки крови неиммунных животных реагировали в РА и РСК в титрах 1:10 - 1:40 и 1:5 -1:10, соответственно.

Сочетание вакцинации с введением иммуномодуля торов оказывало различное влияние на иммуногенность вакцинного штамма 82-ПЧ. Так, в группах морских свинок, имммунизированных с ксимедоном и левамизолом, отмечалось некоторое снижение иммуногенных свойств, а ИИ составил соответственно 30 и 22%. Иммунитет в этих ipynnax составил только 40%, а сыворотки крови инфицированных животных реагировали в 1'А и РСК в тиграх 1:10 - 1:640 и 1:5 - 1:40, соответственно. Применение дибазола в качестве иммуномодулируюицето препарата не оказывало достоверного влияния на иммуногенность вакцинного штамма. Иммуномодуляторы тиосульфат натрия и тимоген повысили нммуногенные свойства штамма 82-ПЧ, мри этом п первом случае все животные были стерильны, в случае же с тимогеном культура вирулентного шт. В.abortus 54 была выделена только у двух особей из регионарного лимфоузла, а ИИ в группе был в 2,5 раза ниже, чем при иммунизации без иммуностимуляции.

Таким образом, в опытах на морских свинках установлена иммуностимулирующая эффективность тиосульфата натрия и тимогена при сочетаином их применении с вакциной из штамма 82-ПЧ.

2.5. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ШШУНОМОДУЛЯТОРОВ ПРИ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКЕ ОВЕЦ

Влияние иммупомодуляторов пи поствакциналъные иммунологические показатели у овец. Развитие иммунитета у овец, иммунизированных вакциной из штамма 82-ПЧ в сочетании с иммуномодуляторами.изучали в сравнительном аспекте с вакцинацией культурами штаммов 19 и 82. Вначале опреде-тяли влияние препаратов на серологические показатели. В результате установ-тено, что агглютинины в РА у животных, привитых шт.82-114, выявлялись в течение 30 суток после вакцинации, причем максимального уровня они дости-~алн на 7-е сутки - 40 - 80 ME. У овец, вакцинированных культурой штамма 52, синтез агглютинирующих антител угасал к 75-м суткам, а максимальные токазатели на 7-е сутки составляли 80 -320 ME. Иммунизация овец культурой

сочетании с тиосульфатом натрия установлен достоверно высокий уровень II-антнтел (до 1:80), причем позитивной реакция оставалась до 90-х суток. Интерес представляют и результаты, полученные в группе животных, стимулированных тимогеном. Сравнительно высокие показатели получены в группе животных, стимулированных тимогеном, но в более поздние сроки (21 — 60-е сутки), т.е. речь идет о пролонгации гуморального иммунного ответа.

У вакцинированных овец также изучали клеточный иммунитет постановкой реакции ГЧЗТ с применением бруцеллнна ВИЭВ. Во все сроки исследований показания опытных групп достоверно превышали уровень контрольных животных, а максимальные значения отмечались на 60-е сутки исследований. Наиболее высокой аллергическая реакция наблюдались в группе привитых шт. 19 овец — 50,0±2,1 — 72,2±2,3/с. Достоверно слабее реакция проявлялась у животных, вакцнииропазнпых культурой игг.82-Г1Ч, — 40,8±1,6 — 57,1+2,9%. У иммунизированных же вакциной из штамма 82 — 43,6±2,2 — 61,9±2,5%. Применение иммуиомодуляторов не оказало выраженного влияния на реакцию ГЧЗТ только в случаях с тиосульфатом натрия и дибазолом. В группе же животных, которым вводили кспмедоп, наблюдалось некоторое ослабление аллергической реакции на 6,5 — 21,6%, а применение тнмогена и лсвамизола в качестве иммуностимулирующих препаратов привело к усилению ответом реакции па введение бруцеллина на 16,3 — 24,5 и 21,5 —34,3%, соответст венно.

ш:пр;:.1!сги1!ссг,:!! иммунитета у с,прпгитих противо-бруцеялезиямн бш;г,:и:ами с сочетании с и.ш.!муно.',:оду:ги::о!:и'.;::. Основным показателем эффективности применения вакцинного препарата является его иммупогенность. С этой целью спустя 7 месяцев после иммунизации был поставлен опыт па 21 овцематке по изучению напряжен: юсти иммунитета. Животных подвергали экспериментальному зара":;ени:о предварительно оптированной вирулентной культурой штамма 13.mcliter.sis 102-Н в дозе 75 тыс. м.к., равной 5-кратной МИД.

Исследованиями было установлено, что у всех животных контрольной группы инфекционный процесс, вызванный бруцеллами штамма 102-Н, характеризовался генерализованной формой с'ИИ а группе 43,5%. Овцематки данной группы реагировали позитивно в серологических реакциях, причем агглютинины выявлялись на уровне 320 — 640 МЕ, а комплементсвязывшощие антитела — в титрах 1:20 — 1:40. Во всех трех группах животных, привитых штаммами 19, 82 и 82-ПЧ, без использования иммуиомодуляторов, иммунитет составил 67%, однако показания ИИ в ¡руппах йыли различны - 4,4, 7,3 и 10,2%, соответственно. При серологических исследованиях зараженных животных указанных выше групп реагировали позитивно в РА одна голова (привитая штаммом 82-ПЧ), а в РСК положительные-результаты получены у животных групп, вакцинированных культурами штаммов 82 и 82-ПЧ.

При бактериологическом исследопашт ^вец, <■•- ..унизированных культурой штамма 82-ПЧ п сочетании с кал'едопом, уст уовлено, что введение препарата нсгапшно оградилось на показаниях иммуногенности вакцинного

штамма. Так, иммунным оказалось только одно животное из группы, т.е. имму нитет составил 33%, причем ИИ в группе был наиболее высоким — 17,4%. Дан ные животные также реагировали позитивно в серологических реакциях: уро вень агглютининов в РЛ составил 40 — 320 ME, а комплементсвязывшощие ан титела выявлялись в титрах 1:5 — 1:20.

Все животные, привитые вакцинным шт.82-ПЧ в сочетании с тиосульфа том натрия, были стерильны. В группе же, где использовали тимоген, стериль ный иммунитет наблюдался у 67% — у одного животного было выделено ДВ1 культуры вирулентного штамма из регионарных лимфоузлов, а в с^рологиче ских реакциях в указанных группах не было получено позитивных результатов.

Патоморфологическими исследованиями установлено, что наблюдаемьк изменения у привитых животных в виде лимфоидно-гипсрпластической, мак рофагалыюй и плазмоклеточной реакций в лимфоузлах и селезенже позволяют судить о выраженной иммуноморфологической перестройке организма, позволяющей выдерживать заражающую дозу бруцелл вирулентных штаммов. У животных, иммунизированных с применением тиосульфата натрия и тимогена отмечается более выраженная плазматизация мякотных шнуров в регионарных контррегионарных и отдаленных лимфоузлах.

Таким образом, в опытах на овцах доказано, что культуры вакцинны> штаммов В.abortus 19, 82 и 82-ПЧ обладают выраженными иммуногеннымь свойствами. Сочетание вакцины из шт.82-ПЧ с тиосульфатом натрия или тимо-геном создает более напряженный иммунитет.

3. ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние различных иммуномодуляторов на формирование и течение поствакцинального иммунитета при бруцеллезе. Впервые установлено, что тиосульфат натрия и тимоген при сочетанием введении с живой вакциной из штамма В.abortus 82-ПЧ повышают ее иммуногенную активность. '

2. Впервые изучены антигенные свойства вакцинного штамма 82-ПЧ на овцах и подтверждена его слабая агглютиногенность. Кролики и овцы, привитые этой вакциной, через 45 - 60 суток в РА и РСК реагировали негативно, в то время как животные, иммунизированные культурами штаммов 82 и 19, оставались позитивными соответственно до 2-х, 4-х и более месяцев.

3. Иммуномодуляторы ксимедон (10%), тимоген (0,01%), тиосульфат натрия (30%), дибазол (0,01%) и левамизол (10%) не оказывают вредного биологического воздействия на бруцеллы in vitro.

4. При введении вакцины из штамма 82-ПЧ в организме кроликов и овец отмечается образование S- и R-антител, при этом S-антитеда исчезают в основном через 1,5 месяца, R-анпггела сохраняются более 2,5 месяцев. Сочетанное введение вакцины с тиосульфатом натрия приводит к увеличению титров специфических антител, выявляемых в ИФА с S-антигеном и РСК с R-антигеном, в 2-4 раза и продолжительности их синтеза до 3-х месяцев, с тимогеном - v усилению am нтелогенеза на 21 - 60-е сутки. Указанные препараты не влияют

на сроки серопозитивности животных в регламентированных серологических реакциях (РА, РСК, РБП).

5. Иммуногенез у кроликов, вызванный после введения вакцины из штамма 82-ПЧ, характеризуется активизацией неспецифических факторов иммунитета, что выражается в увеличении содержания в крови Т- и В-лимфоцитов и уровня а- и у-глобулинов. При сочетании вакцины с тимогеном образование Т-клеток происходит активнее в 1,5 - 2,5, а-глобулинов - в 1,7 -2,5 раза, а с тиосульфатом натрия - В-клеток и у-глобулиноз - в 1,3-2,0 раза.

6. Вакцинация культурой штамма 82-ПЧ приводит к быстрому обсеменению бруцеллами организма морских свинок (в течение 30 суток), после чего наблюдается их элиминация (к 3-му месяцу). При введении вакцины в сочетании с тиосульфатом натрия отмечается активизация репродукции микроорганизмов вакцинного штамма, с ксимедоном - угнетение миграции бруцелл, а с тимогеном - пролонгация регионарной фазы иммуногенеза.

7. Введение вакцин из штаммов 19, 82 и 82-ПЧ активизирует факторы клеточного иммунитета, при этом отмечаются повышение фагоцитарной активности лейкоцитов и более выраженная аллергическая реакция на бруцеллин. Сочетанное введение вакцины из штамма 82-ПЧ с тиосульфатом натрия и тимогеном усиливает показатели этих реакций.

8. Иммунизация морских свинок и овец вакцинами из штаммов 19, 82 и 82-ПЧ вызывает образование иммунитета различной напряженности. Применение тиосульфата натрия и тимогена в сочетании с вакциной из штамма 82-ПЧ повышает напряженность противобруцеллезного иммунитета. При этом пато-морфологическими исследованиями в организме зараженных после иммунизации овец установлена более выраженная плазматизация мякотных шнуров в регионарных, контррегионарных и отдаленных лимфоузлах, что подтверждает повышенные защитные свойства организма.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЙ

Результаты проведенных исследований воигли в следующие нормативно-технические документы:

1. Временное наставление по применению' живой нативной вакцины из штамма- 82-ПЧ бруцелла абортус против бруцеллеза овец. — Утв. директором ВНИВИ (г.Казань) 10.12,991г.;

2) Рекомендации по иммунизации овец, против бруцеллеза вакциной из штамма В.аЬоЛиэ 82-ПЧ в сочетании с иммуномодулятором - тиосульфатом натрия. — Утв.' директором ВНИВИ (г.Казань): 10.12.99г.

Согласно указанных НТД.при иммунизации овец против бруцеллеза живой вакциной из слабоагглютиногенного штамма182-ПЧ рекомендуется:

- непосредственно перед применением вакцину разводить стерильным 30%-ным раствором тиосульфата натрия;

- разведенную вакцину животным вводить з дозе 75 млрд м.к. в объеме

2,5 кгл;

- иммунизировать все поголовье овцематок и молодняка, начиная с 4

месячного возраста в неблагополучных и благополучных (угрожаемых) по б

целлезу хозяйствах (отарах);

- проводить диагностические исследования на бруцеллез в РА, РСЬ

РИД не ранее 2 месяцев после вакцинации.

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Шуралев Э.А., Чанборисов С.С. Изучение серопозитивности кроликов, в цинированных против бруцеллеза // Тез. докл. Респ. науч.-произ. конф. по туалыгым проблемам ветеринарии и животноводства, Казань, 1997. — С. 62

2. Шуралев Э.А., Чанборисов С.С., Белозерова Г.А. К вопросу о применен иммуномодулирующих препаратов при вакцинации сельскохозяйственн животных против бруцеллеза //В кн.: "Молодые ученые - агропромышл« ному комплексу", Казань, 1998. — С. 64 - 65.

3. Шуралев Э.А., Белозерова Г.А., Салахутдинов P.A., Чанборисов С.С. Вл1 ние иммуномодуляторов на агглютиногенность противобруцеллезной ваш ны из штамма 82-ПЧ // Матер, междунар. конф., посвящ. 125-летию КГ AB Казань, 1998, Ч.1.-С. 119-120.

4. Шуралев Э.А., Салахутдинов P.A., Белозерова Г.А., Чанборисов С.С. Резу. таты серологических исследований овец, иммунизированных противоб] целлезными вакцинами в сочетании с иммуномодуляторами // Там же. С. 120-121.

5. Чанборисов С.С., Шуралев Э.А. Данные серологических исследований и i казатели бляшкообразующих клеток у кроликбв, привитых живыми про'ти бруцеллезными вакцинами // Тез. докл. Третьей Респ. науч. конф молод ученых и специалистов, Казань, 1998, кн.1 "Естественнонаучное нацрав. ние".-С. 82-83.

6. Шуралев Э.А., Белозерова Г.А., Чанборисов С.С., Салахутдинов P.A. Спи фическая профилактика бруцеллеза овец // В кн.: "Диагностика, лечение профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Вете[ пария", Киров, 1998. - С. 276 - 277.

7. Шуралев Э.А., Чанборисов С.С., Белозерова Г.А. О применении иммунои дуляторов при вакцинации животных против бруцеллеза // Там же. С. 277-278.

8. Шуралев Э.А., Чанборисов С.С., Салахутдинов P.A., Белозерова Г.А. Cepoj гические данные, полученные на кроликах, привитых разными противоб] целлезными вакцинами в сочетании с иммуномодуляторами // Матер, нау произ. конф. "Актуальные вопросы профилактики и лечения заболевай сельскохозяйственных и домашних животных", Калининград, 1998. — С. 60

9. Шуралев Э.А., Чанборисов С.С., Белозерова Г.А., Салахутдинов P.A. Изу1 ние серопозитивности овец, иммунизированных противобруцеллезными т данами в сочетании с иммуномодуляторами // Там же. — G. 63.

0. Шуралев Э.А., Белозерова Г.А., Чанборисов С.С., Салахутдинов РА. Изучение влияния иммуномодулирующих препаратов на антигенные и иммуноген-ные свойства противобруцеллезной вакцины из штамма 82-ПЧ // В кн.: "Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями.животных", Покров, 1998. — С. 353 - 354.

1. Плотникова Э.М., Шуралев Э.А. Сравнительная оценка бактериологического и серологического методов индикации возбудителя бруцеллеза в. объектах ветеринарного надзора // В кн.: "Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных", Воронеж, 1999. — С. 169 - 170.

2. Чанборисов С.С., Шуралев Э.А. Патоморфологические изменения в органах кроликов, привитых вакциной из штамма 82-ПЧ против бруцеллеза // Там же. -С. 183 - 184.

3. Шуралев Э.А., Салмаков K.M., Белозерова Г.А., Чанборисов С.С. Изучение иммуногенности вакцины из штамма В.abortus 82-ПЧ на морских свинках при сочетанном применении с иммуномодуляторами // В кн.: "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария", Екатеринбург, 1999. - С. 297 - 298.

4. Шуралев Э.А., Хисматуллина H.A., Чернов А.Н. Иммуноферментный анализ гуморального иммунитета у животных при сочетанной иммунизации бруцеллезной вакциной с иммуномодуляторами // Там же. — С. 298 - 299.

5. Чанборисов С.С., Шуралев Э.А., Салахутдинов P.A. Патоморфологическая оценка напряженности иммунитета у овец, привитых противобруцеллезной вакциной из шт. 82-ПЧ // Матер. Респ. науч.-произ. конф. "Актуальные проблемы животноводства и ветеринарии", Казань, 1999. — С. 64 - 65.

6. Шуралев Э.А., Салмаков K.M., Белозерова Г.А., Салахутдинов P.A.,. Чанборисов С.С., Мальцев Т.С. Эффективность применения иммуномодуляторов при вакцинопрофилактике бруцеллеза // Там же. — С. 66 - 67.