Изучение закономерностей эволюции гипервариабельных и консервативных участков генома ВИЧ-1

Пазилин, Алексей Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение закономерностей эволюции гипервариабельных и консервативных участков генома ВИЧ-1
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение закономерностей эволюции гипервариабельных и консервативных участков генома ВИЧ-1"

На правах рукописи

Пазилин Алексей Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ЭВОЛЮЦИИ ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНЫХ И КОНСЕРВАТИВНЫХ УЧАСТКОВ ГЕНОМА

ВИЧ-1.

03.00.03.-молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Доктор биологических наук,

профессор Гараев Мансур Мухамедович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор биологических наук,

профессор Тарантул Вячеслав Залманович Доктор медицинских наук, чл. - корр. РАМН, профессор Урываев Леонид Викторович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исследовательский институт вирусных препаратов им О.Г.Анджапаридзе

РАМН, Москва.

Защита состоится « 20 » и^р 2005 г в ( 2.___часов

на заседании диссертационного Совета Д 001.20.01 при ГУ НИИ

вирусологии им Д И Ивановского РАМН (адрес 123098 Москва, ул Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского

Автореферат разослан » ^_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

Н.П.Косякова

2.006-<L_

S^9 ВВЕДЕНИЕ ¿/¿"/SV/

Актуальность проблемы.

Одной из важных особенностей вирусов явияется высокий уровень их генетической изменчивости, обусловленный большими репродукционными потенциями этих объектов, с одной стороны, и прессом селективных факторов хозяйских организмов с другой. Виды вирусов, существующие как наборы генетически гетерогенных вариантов за счет гипервариабельности отдельных участков генома, получили название "квазивидов" (Coffin, 1995). Генетическая гетерогенность была обнаружена не только при анализе состава вирусных популяций от множества пациентов, но и при изучении вируса в пределах одного инфицированного (McNearney et al., 1992). Прежде всего такая ситуация характерна для вирусов с длительным периодом персистенции. Из всех известных в настоящее время вирусов максимальный уровень изменчивости отмечен для группы лентивирусов и, в частности, для вируса иммунодефицита человека (ВИЧ): различия между штаммами этого вируса по отдельным областям генома достигают 30-40%%. Однако все это разнообразие вариантов ВИЧ-1 удалось классифицировать на ограниченное число групп. В частности, в пределах вида ВИЧ-1 выделяют, три группы субтипов: группа «О», группа «М» и группа «N» (Robertson, 2000).

Среди гипервариабельных областей генома ВИЧ-1 особый интерес представляет петля области V3, поверхностного гликопротеина gpl20, которая состоит из 33-35 аминокислотных остатков, в зависимости от штамма вируса. К настоящему времени накоплено много данных о значимости V3 петли для проявления вирусом различных биологических свойств. Данная область участвует в формировании вирусных структур, взаимодействующих с корецепторами мишеневых клеток. В связи с этим существует определенная корреляция между структурой V3 петли и преимущественным использованием того либо иного корецептора, что определяет тропизм вируса (Westerwelt et al., 1992; O'Brien et al., 1998; Dragic et a!., 2001). В составе V3 петли локализуется основная нейтрализующая антигенная детерминанта ВИЧ-1. картированная в

РОС. НАЦИОНАЛЬНА* i

БИБЛИОТЕК* I

—- w

позициях 14-21 (С1епс1 е1 а1, 1991; Ра1кег а1., 1989; ТакаЬавЫ е1 а1„ 1992; Семилетов и др., 1994). Однако сведения о направленности и характере изменчивости основной нейтрализующей детерминанты в ходе развития заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов в литературе практически отсутствуют.

Одной из самых консервативных областей генома вируса является область ро1, и, в частности, последовательности гена, кодирующего обратную транскриптазу (ОТ) - ключевого фермента ВИЧ-1, обеспечивающего вирусную репликацию. Изучение генетической изменчивости данной области генома является важным для практического здравоохранения, поскольку, мутации устойчивости вируса к группе лекарственных препаратов нуклеозидной и ненуклеозидной природы, широко применяемых в химиотерапии ВИЧ инфекции, расположены в последовательностях гена ОТ.

В связи с этим нами была предпринята попытка ретроспективно проследить направленность изменчивости гипервариабельной и консервативной областей в когорте ВИЧ-инфицированных, имеющих в качестве источника заражения единственного пациента «О». В качестве удобной модели для проведения исследований была выбрана популяция пациентов, сформированная в результате внутрибольничной вспышки ВИЧ-инфекции на юге России в 1988-89 гг. (Ростовско-Элистинская вспышка) (Покровский, 1991)

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось изучение эволюции гипервариабельных и консервативных участков генома ВИЧ-1. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести определение нуклеотидной последовательности и анализ петли УЗ у вариантов вируса полученных в 1991-1992 гг. и 2000-2001 гг. от пациентов Ростово-Элистинской вспышки с целью определения

направленности и закономерности эволюции данной области на популяционном уровне.

2. Создание клонотек вирусных участков генома, кодирующих область V3 от пациентов 1991-1992 гг. и 2000-2001 гг. для проведения структурного анализа и выявления закономерностей эволюционного процесса этой области генома у отдельных пациентов.

3. Провести анализ гена обратной транскриптазы области pol у вариантов вируса G субтипа Ростово-Элистинской вспышки, полученных в 1991-1994 гг., 2000-2001 гг. и 2003-2004 гг.

4. Провести анализ мутаций устойчивости, возникающих при действии азидотимидином (АЗТ), а также другими нуклеозидными (НИ) и ненуклеозидными (ННИ) ингибиторами обратной транскриптазы.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Показано направление эволюции V3 петли на популяционном уровне у вариантов вируса при длительной персистенции в организме хозяина

2. Установлено, что уровень внутрипациентной вариабельности и направление эволюции соответствует данным, полученным при анализе популяции в целом.

3. Продемонстрировано, что изменчивость гена ОТ нарастает по мере увеличения времени персистенции вируса в организме инфицированного.

4. Установлено, что полимераза исследуемых вариантов вируса, принадлежит субтипу G ВИЧ-1.

5. Установлено, что мутации устойчивости к АЗТ, а также другим НИ и ННИ у G субтипа не отличаются от таковых для В субтипа.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Популяционный и внутрипациентный анализ последовательностей В эпитопа V3 gpl20 ВИЧ-1 позволил установить, что основное направление эволюционных изменений выражается в реципрокных заменах L14F и F20L.

Эти замены обеспечивают дальнейшее изменение в «верхушке» УЗ петли с вРв наАРа

2. Уровень изменчивости области УЗ у пациентов Ростово-Элистинской вспышки возрастает по мере прогрессии заболевания и длительности персистенции вируса в организме ВИЧ-инфицированного.

3. Проведен молекулярно-генетический анализ фрагмента 87-817 н.о. гена ОТ ВИЧ-1 7 образцов 1991-1994 гг., 17 - 2000-2001 гг. и 13 - 2003-2004 гг. от пациентов Ростово-Элистинской вспышки 1989 года.

4. Различия по аминокислотному составу между субтипами в гене ОТ варьируют, в среднем, от 3% до 10%, в зависимости от функционального домена. Различия по нуклеотидному составу составляют 8% - 11 %.

5. Мутации, возникающие при терапии АЗТ у вариантов субтипа в, не отличаются от соответствующих, описанных для субтипа В. Мутации, поддерживающие устойчивость к другим НИ и НИИ у субтипа в такие же как у субтипа В.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на «10й Международной конференции СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 26-31 мая 2002 г.); на 13-ом Международном симпозиуме по ВИЧ и появляющимся инфекционным заболеваниям, (Тулон, Франция 3.06.04-5.06.04).

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержит 12 таблиц и 14 рисунков. По результатам работы опубликовано 7 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве основной модели для проведения данного исследования была выбрана группа ВИЧ-инфицированных, сформированная, по данным молекулярно-эпидемиологического расследования, от общего источника (Покровский, 1991; Гараев, 1993) Данная группа была образована в 1989 годах за счет распространения G субтипа ВИЧ-1 среди детей, находившихся в больничных стационарах Северо-Кавказского региона, Калмыцкой ССР, Астраханской и Волгоградской областей (Ростово-Элистинская вспышка). Трансмиссия вируса в этой популяции осуществлялась за счет использования нестерильного медицинского инструментария при парентеральных процедурах. Пациент «О» для этой популяции - грудной ребенок, рожденный от ВИЧ-позитивных родителей. Отец инфицированного ребенка мог быть заражен в период с 1980 по 1981 год, когда он находился в Республике Конго В результате на Юге России было инфицировано более 250 человек, при этом основные очаги заболевания были расположены в больничных стационарах Роства-на-Дону и Элисты (Покровский, 1991; Bobkov et al., 1994, Cheingsong-Popov et al., 1993).

В работе использовались образцы, собранные на территории Ростовской области в 1991-1994 гг., 2000-2001 гг. и 2003-2004гг.

Амплификацию области V3 осуществляли с использованием праймеров ED5/ED12 в качестве внешних и ED31/ED33 в качестве внутренних (Delward et al., 1993). Подбор праймеров для амплификации фрагмента гена обратной транскриптазы проводили с использованием нуклеотидных последовательностей различных изолятов ВИЧ-1, доступных в базах данных Лос Аламос и Gene Bank. Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе (ABI PRISM 3100, USA). Для компьютерной обработки нуклеотидных последовательностей использовали пакет программ DNAstar v.3.12 (Lasergene, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Ретроспективный анализ популяциоиной изменчивости области УЗ Ростово-Элистинской когорты ВИЧ-инфицированных.

В работе по изучению изменчивости УЗ петли использовали 10 образцов полученных в 1991-1992 гг. и 16 - 2000-2001 гг. Определение нуклеотидной последовательности УЗ петли и трансляция ее в аминокислотную, позволило установить структуру УЗ исследуемой популяции Последовательности были выровнены и из них были определены консенсусы, характерные для данной популяции в 1992 и 2001 гг.

Уровень изменчивости для последовательностей 1992 года составил величину 5,2 %, в то время как для последовательностей 2001 года - 15,5% (рис.1). Эти данные указывают на нарастание генетической изменчивости последовательностей кодирующих область петли УЗ ВИЧ-1 при увеличении времени персистенции вируса в организме инфицированного пациента.

Представляло интерес провести анализ распределения вариабельных позиций в структуре УЗ в последовательностях образцов 1991-1992 гг. и 20002001 гг. Данные представлены в таблице 1. Из приведенных данных следует, следует, что гипервариабельные позиции 2, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 22, 25 и 34 являются общими для обеих групп последовательностей. С другой стороны, важно отметить резкое снижение уровня вариабельности для позиции 32 и появление новых сайтов гипервариабельности в позициях 4, 5, 10 и 21 в алайнменте 2000-2001гг. Появление новых сайтов, очевидно, обусловлено расширением спектра точек приложения отбора к области УЗ при общем сохранении направленности его действия на протяжении 10 лет персистенции вируса в организме инфицированного. В пользу этого также свидетельствует анализ распределения частот значимых и незначимых замен по структуре УЗ петли. В целом для исследуемой популяции отношение

Таблица 1.

Положение гипервариабильных позиций и количество значимых и незначимых замен в структуре кодонов УЗ петли gpl20 ВИЧ-1.

количество замен в алайменте В' 1991-1992 годов 2000-2001 годов

позиции отношение отношение

кодона незначимых значимых общее незначимых замен к Незначимых значимых общее незначимых замен к

значимым* значимым*

1 0 0 0 * 0 0 0 #

2 3 5 8 0, 6 0 4 4 0

3 i 0 1 # 0 0 0 #

4 0 0 0 # 5 0 5 *

5 2 с 2 # 1 8 9 0,125

6 0 1 1 0 0 0 0 #

7 0 2 2 0 С 0 0 #

8 0 0 0 # 0 0 0 #

9 2 0 1 # 0 0 0 #

10 0 1 1 0 0 5 5 0

11 0 3 3 0 0 2 2 0

12 0 0 0 # 0 0 0 #

13 3 16 19 0,1875 3 9 12 0,333333

14 8 9 17 0,888889 0 10 10 0

15 4 3 7 1,33333 0 6 6 0

16 1 0 1 # 0 0 0 #

17 1 0 1 # 1 0 1 #

18 0 7 7 0 0 10 10 0

19 5 2 7 2,5 2 5 7 0,4

20 3 16 19 0,1В75 0 13 13

21 2 1 3 2 1 7 8 0,142857

22 0 9 » 0 1 7 8 0,142857

23 0 2 2 с 0 0 0 #

24 3 0 3 # 2 0 2 0

25 0 8 8 0 0 1? 12 0

26 2 0 2 * 0 1 1 0

27 0 3 3 0 с 2 2 0

28 0 0 0 # 3 0 3 #

29 0 0 0 # 0 4 4 0

30 1 0 1 # 1 1 2 1

31 1 0 1 # 0 0 0 #

32 0 7 7 0 0 1 1 0

33 0 0 0 # 0 0 0 #

34 0 4 4 0 0 6 6 0

35 0 0 0 # 0 0 0 #

Сред. 1, 17* 2,83* 4* 0, 4 0, 51* 3, 29* 3,8* 0,16

Примечание. Серым цветом обозначены пшервариабильные позиции. - Знак «#» проставлен в случаях когда нет возможности определить значение отношения незначимых замен к значимым из-за отсутствия значимых замен (0 в знаменателе дроби). *) - Среднее значение соответствующей величены

незначимых замен к значимым у последовательностей 1991-1992 гг. составляло 0,4, в то время как у последовательностей 2000-2001 гг. это значение было ниже и составило 0,16 (р< 0,01). Снижение численного значения указанного соотношения для УЗ петли может быть результатом двух факторов. Один из них - это накопление значимых мутаций, закрепляемых отбором при длительном периоде персистенции возбудителя в организме хозяина. Второй механизм может быть обусловлен изменением направления или усилением действия отбора.

Сравнение между собой консенсусов, соответствующих последовательностям 1991-1992 гт. и 2000-2001 гг., показывает, что эволюционные изменения УЗ в исследуемой популяции имеют ограниченный характер (рис.1). Они заключаются в замене лейцина, находящегося в позиции 14 на фенилаланин и фенилаланин в позиции 20 на лейцин; кроме того, происходит замена серина в позиции 13 на гистидин и треонина в позиции 22 на аланин. Мутации в позициях 14 и 20 носят синонимичный характер, т.е. представляют собой вариант замены одной гидрофобной аминокислоты на другую. Следует отметить, что анализ этих замен показал связь в этих мутационных событиях, т.е. о том, что замена в позиции 14 лейцина на фенилаланин, приводит к появлению лейцина или близкого по свойствам изолейцина вместо фенилаланина в позиции 20. Действительно, в 17 из 26 проанализированных последовательностей, мы наблюдали реципрокные замены лейцина или изолейцина на фенилаланин в этих позициях. Эти наблюдения являются косвенным подтверждением данных о участие аминокислотных остатков в позициях 14 и 20 совместно с изолейцинами в позициях 12, 26, 27 в формировании гидрофобного ядра, лежащего под верхушкой УЗ (последовательность вРв) (К\уоп§ е1 а1., 1998).

1.2. Анализ В-эпитопа УЗ-петли в когорте ВИЧ-инфицированных.

Ранее проведенный в нашей лаборатории пептидный анализ позволил прокартировать позиции основного нейтрализующего эпитопа УЗ петли. Было

показано, что В эпнтоп располагается с 14 по 21 аминокислотный остаток (Семилетов и др., 1994).

A) CON 1992 CTRPNNNTRKSISLGPGQñFYTTGEIIGDIRQAHC

ЮЗ -----------------------------------

102(5)* -----------------------------------

105 -----------------------------------

106(2) ------------------------D----------

114 -----------------------------------

122(4) ------------HV-----L-A-------------

123(1) -------------FA----------------R—

104(3) ------------N------W-A-------------

101 ------1---RM-----HV-------V--------

Ю7 -------------F-----L-A-------------

B) CON 2000 CTRPNNNTRKSIHFGPGQALYATGEIIGDIRQAHC

262(1) ---------R—S-A----1----A-V--------

255 ---------R--S-A-----V---D----------

268 -------------1-----F-----------K-Y-

263 -S--G--------L---A---T-------------

2048(2) -------------Iñ--------------------

237 ----------G--L---STI----Q----------

283 ----G-------SL-----F-T—D-V------Y-

2049(3) ----G-----C--LA---T—С-------------

282(4) -----------------A---------------Y-

204 5 ----------R-AL----LFHT—A----------

284 ------------S-A— E--H---A----------

278 ---------T—S-A-----H---D---N------

273(5) -V----------SI-----F-I-----------Y-

267 ---------R—GL------V---V---VR---Y-

285 -I—G----T—RI----IF----DV---T-K-Y-

B) . CON 1992 CTRPNNNTRKSISLGPGQAFYTTGEIIGDIRQAHC CON 2000 ------------HF-----L-A-------------

Рисунок 1. Аминокислотные последовательности V3 петли gpl20 ВИЧ-1 у изученных пациентов Трехбуквенным кодом обозначены шифры пациентов, CON - консенсуссные последовательности соответствующих алайментов А). Последовательности 1991-1992 гг. Б). Последовательности 2000-2001 гг ; В) Сравнение консенсусных последовательностей. »)-В скобках указаны пациенты, для которых материал был получен дважды

Из трех (позиции 13, 14, 20) наиболее вариабельных аминокислотных остатков области УЗ, два (позиции 14 и 20) входят в состав В-эпитопа, а один (позиция 13) непосредственно примыкает к нему. Такая топография расположения гипервариабельных аминокислотных остатков, по-видимому,

отражает сильное давление отбора на эти позиции со стороны иммунной системы хозяина.

Необходимо отметить, замены в позициях 14 и 20 носят реципрокный характер, в связи с этим для дальнейшего анализа основное внимание было сосредоточено на позициях 14 и 15. Сравнение консенсусных последовательностей, а также анализ полных алайнментов дают основание для утверждения о том, что у всех изученных вариантов вирусов в этих позициях присутствует одна из 7 структур. Состав и частота встречаемости приведены в таблице 2. Из приведенных данных следует, что среди последовательностей 1991-1992 гг. структура ЬО встречается наиболее часто и составляет 70% от общего числа образцов. В образцах 2000-2001 гг. частота встречаемости структуры Ьв уменьшается примерно в 2 раза и составляет 32%. При этом структуры Ю, РО и РА выявляются в 55% случаев против прежней величины, составлявшей примерно 20%. Одновременно с этим в популяции, хотя и с незначительной частотой, появляются структуры ЬА и 1А, которые ранее не обнаруживались.

Таблица 2.

Частота встречаемости различных сочетаний аминокислот в 14 и 15 позициях УЗ петли gpl20 ВИЧ-1 в образцах, полученных от пациентов в 1991-1992 и 2000-2001 годах

структура* частота встречаемости, указанной структуры В-эпитопа в образцах**

1991-1992 годов 2000-2001 годов

ЬЙ 70% (7) 32% (5)

Тй 10» (1) <6% (0)

<10% (0) 17% (3)

ге 10% (1; и% (2)

ГА 10% (1) 2Ь% (4)

ЬА <10% (0) 6% (1)

1А <10% (0) 6% (1)

Примечание. *) В графе «структура» однобуквенным кодом обозначены аминокислоты, располагающиеся в 14 и 15 позициях УЗ петли. **) Частота встречаемости данной структуры В-эпитопа приведена в процентах от общего числа последовательностей соответствующего года, в скобках проставлено абсолютно количество последовательностей, содержащих в 14 и 15 позициях указанные аминокислоты.

Таким образом, из полученных данных можно сделать заключение о том, что, по-видимому, исходной для исследуемой когорты является структура LG, так как она наиболее характерна для пациентов с ранними стадиями ВИЧ-инфекции. При дальнейшем развитии инфекционного процесса получают развитие варианты вируса, несущие структуры IG, FG, которые впоследствии меняются на структуру FA.

Мы решили проследить возможные эволюционные изменения, происходящие в этой структуре. Структура LG, является, вероятно, исходной для данной популяции и кодируется исключительно кодонами TTA-GGA (рис. 2). Благодаря мутации (А на Т или С) по 3-й позиции триплета ТТА, кодирующего лейцин в положении 14, в этой позиции появляется фенилапанин. В дальнейшем мутации G на С по 2-й букве глицинового кодона (позиция 15) приводят к появлению аланина в этом положении (структура FA). Структура LA является производной от структуры FA, точнее, от того варианта этой последовательности, где F14

I-G L-G F - G F - A L - A

ATA-GCA TTA-GGA TTC-GGA ТфОССА CTC-GCA TTT-GGA TTT-GCA ATT-GCA I - A

Рисунок 2. Последовательность мутационных событий в кодонах, детерминирующих 14 и 15 аминокислотные позиции в составе V3 петли. Жирным шрифтом выделены нуклеотидные позиции, в которых происходят замены.

кодируется триплетом TTC. Здесь в результате замены 1-го Т на С в позиции 14 вновь появляется лейцин. Возникновение структуры IA также является следствием дальнейшей эволюции структуры FA, но другой ее разновидности, где F кодируется триплетом ТТТ. Благодаря замене в составе этого кодона 1-го Т на А в позиции 14 появляется изолейцин. Описанная последовательность мутационных событий, на наш взгляд, является основным путем эволюции структуры В-эпитопа у изучаемой группы пациентов. Дополнительным путем, не получающим дальнейшего развития, является формирование структур VG и

Ю, причем первая из них образуется за счет замены Т на О по 1-й букве триплета ТТА, благодаря этому лейцин в положении 14 замещается валином. Структура Ю, где позиция 14 представлена изо лейцином, возникает из-за замены 1-го Т того же кодона на А. Полученные данные свидетельствуют об ограниченности количества возможных вариантов В-эпитопа области УЗ в исследуемой когорте пациентов. Ограниченное число вариантов, возникающих в ходе эволюции, указывает на то, что изменчивость эпидемически связанных вариантов вируса носит небеспредельный характер.

1.3. Анализ изменчивости УЗ- петли у отдельных пациентов.

Последовательности УЗ от 5 пациентов в 1991-1992 гг. и в 2000-2001 гг. были использованы для создания клонотеки.

В результате клонирования были получены 62 рекомбинантные плазмиды, в том числе по 8 плазмид для пациентов (1) (1992 г.), (1) (2001 г.) и (3) (1992 г.), (3) (2001 г.), 6 и 5 - для (5) (1992 г.) и (5) (2001 г.), 3 и 6 - для (4) и (4) (1992 и 2001 тт.), а также 2 и 8 - для (2) и (2) (1992 и 2001 гг.) соответственно. Для полученных последовательностей были определены консенсусы, которые были характерны для них в 1992 и 2001 гг.

Анализ полученных данных дал возможность оценить уровень изменчивости исследуемой области генома у отдельных пациентов. При определении этой величины для каждого пациента было проведено попарное сравнение всех полученных нуклеотидных последовательностей с консенсусом. Соответствующие выборки из массива количества несовпадающих нуклеотидов (выраженные в процентах) были использованы для определения степени различий (Таблица 3). Из табличных данных следует, что при длительной персистенции вируса наблюдается увеличение уровня его изменчивости. Для исследуемой группы средний уровень вырос в период с 1992 г. по 2001 г. с 2,2% до 4,2% (р< 0,07). Следует отметить, что уровень вариабельности УЗ от разных пациентов колебался в пределах от 0% до 6,67% для образцов 1992 г. и от 0,95 до 11,43%% - 2001 г. При сравнении В-эпитопа вариантов вируса,

выделенных от отдельных пациентов в 1992 и 2001 гг., было установлено, что в составе этой структуры нет вариантов, отличающихся от определенных ранее, при популяционном анализе. Из представленных в таблице данных о частоте встречаемости соответствующих структур видно, что в составе последовательностей 1992 г. обнаруживаются только структуры Ьв и Ю, исключение составляют последовательности от одного пациента, у которых были обнаружены Рв и РА в позициях 14 и 15.

Таблица 3

Уровень виутрипациентной генетической изменчивости.

Шифр пациента В образцах 1992 года в образцах 2001 года

Мш Мах X в Мш Мах X й

1 0 5,7 1,78 1,6 0,95 6,67 3,45 1,45

2 0 1,9 0,95 1,34 1,9 11,43 6,7 3,53

3 0 3,8 1,78 1,56 0,95 11,43 5,35 3,9

4 0,95 3,8 2,2 1,45 0,95 3,8 1,9 1,18

5 1,9 6,67 4,12 2,6 0,95 10,48 3,79 3,78

В целом для группы 0 6,67 2,2 1,17 0,95 11,43 4,2 1,84

Примечание- В таблице приведены минимальные (Мш) и максимальные (Мах) значения уровня виутрипациентной генетической изменчивости (%), а так же среднее значения этих величин (X) и значения средних квадратичных отклонений (в)

В образцах 2001 г., было обнаружено, что частота встречаемости структуры Ю уменьшалась, в то время как структура УЗ не была обнаружена вообще. При этом отмечалось увеличение частоты встречаемости структур РО и БА.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у отдельно взятых пациентов характер аминокислотных замен в позициях 14 и 15 области УЗ петли, соответствует закономерностям, выявленным нами при популяционном анализе.

Таким образом, анализ структуры В-эпитопа показал, что, в случае, когда группа пациентов имеет единый источник инфицирования, анализ изменчивости отдельных эпитопов в составе вирусных последовательностей от одного пациента дает возможность составить представление или даже

предсказать направленность эволюции соответствующих структур у вариантов вируса от других пациентов.

Таблица 4.

Частота обнаружения различных сочетаний аминокислот в 14 и 15 позициях УЗ gpl20 ВИЧ-1 в образцах 1992 и 2001 годов.

структура частота встречаемости вариантов В-эпитопа

В последовательностях 1992 года В последовательностях 2001 года

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

LG - 2 7 2 2 - - - - -

IG - - 1 1 2 2 - 1 - 5

FG 3 - - - - 5 5 - 6 -

FA 5 - - - 1 - 7 - -

1А - - - - - - 2 - - -

LA - - - - 1 - I - - -

Примечание: В таблице приведены абсолютные значения часюты встречаемости соответствующих структур В-эпитопа в составе области V3 gpl20 вариантов вируса от пациентов изучаемой группы.

2. Анализ консервативного региона генома ВИЧ-1.

В качестве консервативной области была взяга последовательность фрагмента гена ОТ. Данный регион является наиболее консервативным, поскольку чрезвычайно важен для репродукции вируса и в меньшей степени подвержен изменчивости.

2.1. Подбор праймеров для амплификации гена обратной транскриптазы.

Для подбора олигонуклеотидов использовали следующие критерии: длина праймера; процент GC-nap; образование вторичной структуры и димеров; способность к неспецифическому связыванию с матрицей; наличие нуклеотидных замен на 3'-конце праймера, относительно матрицы. Основываясь на анализе нуклеотидных последовательностей гена pol, нами были подобраны праймерные олигонуклеотиды, необходимые для амплификации исследуемой области. Участок, ограниченный этими

праймерами, соответствует 730 н.о. и кодирует фрагмент гена обратной транскриптазы, в котором заключены все основные мутации устойчивости к нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам фермента (Рисунок

3).

Ж4-1МГ

PCT.TMI.,..,,.,

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИГПАЭА

IPOL8

Рисунок 3. Позиции расположения праймеров на гене pol Позиции праймеров указаны согласно последовательности штамма НХВ2 В гене обратной транскриптазы обозначены ее функциональные домены.

2.2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей вариантов вируса G субтипа.

Для определения систематического положения гена pol, изучаемых вариантов вируса, было проведено их сравнительное генотипирование. Полученные мастер-секвенсы фрагмента гена обратной транскриптазы 87-817 н.о. от пациентов были использованы для построения алайнмента с гомологичными последовательностями 29 вариантов различных субтипов группы М, отобранных из баз данных Gene Bank и JIoc Аламоса. В качестве "outgroup" была использована последовательность изолята из Сенегала (Ac№AJ302646) группы «О». Данный алайнмент был использован для построения филогенетического древа, используя метод «ближайших соседей» (рис.4). На рисунке видно, что изучаемые варианты вируса образуют отдельную ветвь, которая кластерируется с другими вариантами ВИЧ-1, относящимися к G субтипу. Это свидетельствует о том, что полимераза изучаемых вариантов вируса принадлежит G субтипу. Согласно данным рисунка 4 структура области

87-817 представлена только в 4 различных вариантах, соответствующих

КСзпкпх>пА12«239 [)Кепуа*Г«?Оей

О идэпйа 1188824

■ 6(ЗаЬопМ2в727 ■ ВРгапо»в04321

■ Вй>пмА«2«07 ' С |гхЯаАЯ067154 ■ СгатЬиАР28в224 ' СВтзгИАНЖШ НСАЯЛГ00340в Н ВЫдшт АР 100128 АЦдагаЙМИЗгО Аикга|пвАР413987 АТггаапЙАГ381872

А2С0П50 АГ280238 А2Сур|и«АР2вв237

ОЗя*да1АЙ02Мв

15 10

Рисунок 4. Филогенетические взаимоотношения исследуемой популяции с другими вариантами вируса группы М.

Группа исследуемых вариантов вируса выделена серым цветом.

субтипам G, J, А, и варианту общему для остальных субтипов. Такой характер ветвления не соответствовал филогенетическим деревьям, построенным с использованием последовательностей полноразмерного гена ОТ, а также при построении с использованием кодирующих последовательностей всей области pol. Не обнаружив аналогии в форме филогенетических деревьев полноразмерного ОТ и участка 87 - 817 но, нами была предпринята попытка вычленить область, которая обеспечивает такой «нетипичный» характер ветвления. С этой целью был проведен анализ деревьев построенных так называемым «оконным» методом. Для этого ген ОТ был разбит на фрагменты различной длины, начиная от ста до четырехсот нуклеотидов, и для каждого участка были построены свои филогенетические деревья. Однако нам не удалось обнаружить фрагмент, который давал бы филогенетическое древо, соответствующее участку 87 - 817 но. Известно, что в составе фермента ОТ выделяют несколько функциональных субдоменов (пальцы, ладонь, большой палец и соединение). Представляло интерес провести сравнительный анализ филогенетических деревьев для последовательностей, кодирующих отдельные функциональные домены ОТ. При построении таких филогенетических деревьев, кладограмму схожую с деревом последовательности 87 - 817 но., образует только домен «ладони» ОТ.

2.3. Анализ синонимичных и несинонимичных замен в функциональных доменах ОТ.

Мы провели сравнение аминокислотного и нуклеотидного состава функциональных доменов полимеразы G и В субтипов ВИЧ-1. Основные различия между субтипами в структуре фермента проявляются в основном в заменах аминокислот синонимичного характера. Замены, приводящие к изменению смысла аминокислоты, располагаются в субдоменах большого пальца («БП») и соединения («С»). Следует отметить, что различия между субтипами распределены не равномерно в разных доменах ОТ. Различия в

домене пальцев («П») составляют 2,4% и 9,7%, ладони («JI») 4,3%, домена «БП»11,4% и домена «С» 13,5%.

Анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих отдельные домены ОТ этих субтипов позволил установить, что процент различий составляет в домене «П» 4,7% и 8,6%, домене «БП» 10,1% и в домене «С» 6,7%. Различия в домене «Л» составляли 5,7% и 7,6%. Необходимо отметить, что большинство нуклеотидных замен в доменах «П», «БП» и «С» приводят к изменению аминокислот в соответствующих позициях. В то же время процент нуклеотидных различий в домене «JI» в два раза выше, чем аминокислотных.

Аналогичные сравнения были проведены и с другими субтипами группы М. Было обнаружено, что аминокислотный состав «JI», в основном, остается не подвержен изменениям, различия между различными субтипами ВИЧ-1 варьировали от 3% между субтипами G и С до 9,7% между субтипами G и J. При этом уровень различий по нуклеотидному составу был выше и составлял в среднем 8-9%%. Это может быть связано с тем, что данная область находится под более жестким действием отбора и свидетельствует о большей консервативности «Л», в отличие от других регионов ОТ, поскольку именно в этом домене находится активный центр полимеразы. В то же время соотношение синонимичных замен к несинонимичным в других функциональных доменах ОТ находилось приблизительно на одном уровне.

Нами была обнаружено, что в изучаемой популяции вируса, позиция 102 гена ОТ представлена глутамином, в то время как у вариантов ВИЧ-1 различных субтипов эта позиция имеет крайне консервативный характер и представлена только лизином. Частота появления глутамина в позиции 102 составляла величину менее 0,1%, как следует из проведенного нами анализа 1199347 последовательностей различных субтипов ВИЧ-1, представленных в Gene Bank.

Мы провели анализ вариабельности исследуемой области фермента данной популяции в зависимости от продолжительности инфекционного процесса. Для анализа были взяты последовательности не содержащие сайтов

устойчивости к АЗТ и другим НИ и ННИ. Анализ полученных алайментов от последовательностей 1991-1994 гг., 2000-2001 гг. и 2003-2004 гг. показал, что вариабельность гена ОТ увеличивается гораздо медленнее, чем вариабельность УЗ. Уровень различий в гене ОТ составлял в 1991-1994 гг. 1,86% и в 2000-2001 гг. 2,11% по сравнению с областью УЗ, где уровень вариабельности в те же периоды времени составлял 5,2% и 15,5% соответственно.

Анализ консенсусных последовательностей, характерных для данной популяции в начале 90-х годов, 2000-2001 гг. и 2003-2004 гг. показал три основных сайта отличий в позициях 31, 35 и 104. В консенсусах 1991-1994 гг. в позиции 31 мы наблюдали валин, в то время как в 2000-2001 гг. и 2003-2004 гг. в этой позиции находился изолейцин. В позиции 35 в 1991-1994 гг. и 2000-2001 гг. преобладающим был изолейцин, а в 2003-2004 гг. в этой позиции был отмечен треонин. В позиции 104 в 1991-1994 гг. и 2003-2004 гг был обнаружен аргинин, тогда как в 2000-2001 гг. в этой позиции был определен лизин.

Таким образом, проведя анализ изменчивости гена ОТ мы установили, что изменчивость данной области генома нарастает в зависимости от продолжительности инфекционного процесса, однако нам не удалось выявить направленность эволюционного процесса, что, вероятно, может объясняться недостаточностью выборки.

2.4. Анализ мутаций устойчивости возникающих при терапии азидотимидином.

Среди 37 образцов субтипа в Ростово-Элистинской вспышки ВИЧ-инфекции, для которых была определена нуклеотидная последовательность, мутации устойчивости к АЗТ были обнаружены у 17 вариантов. Сопоставление аминокислотных замен, связанных с устойчивостью к АЗТ, описанных для В субтипа и изучаемых последовательностей приведены в таблице. Как следует из данных таблицы 5, мутации, поддерживающие устойчивость вариантов вируса к АЗТ у в субтипа ВИЧ-1 не отличаются от соответствующих для субтипа В.

Мы провели анализ мутаций устойчивости к АЗТ исследуемой популяции в зависимости от времени получения образцов. У двух из семи вариантов вируса полученных в период 1992-1994 гг. в позиции 41

Таблица 5

Мутации устойчивости к ЛЗТ у вариантов вируса исследуемой популяции

Аминокислотные позиции мутации поддерживающих устойчивость к АЗТ

первичные

215

вторичные

41 67

210 219

Дикий тип ОТ

1,С, D. N. S

М I D

Мутации АЗТ устойчивости В с\бгип

Y. F

L 1 \ W

Мутации АЗТ устойчивости у пациентов

Мутации в одной позиции у пациентов

271

2602

2636

283

136

Мутации

в двух позициях

151

123

2628

2112

Мутации

в трех позициях

Мутации в четырех позициях

Му гации

в пяти позициях

М I D

М D

? у*

к ^жш

Жщ,

Примечание В заштрихованных квадратах показаны мутации устойчивости.

наблюдалась компенсаторная мутация М на L, при изменении аминокислоты в позиции 215, не являющейся устойчивой. У двух вариантов мы наблюдали 5 мутаций устойчивости к азидотимидину. Из 17 образцов, собранных в период 2000-2001 гг., мутации устойчивости были обнаружены у 8 вариантов вируса.

При этом мутации, которые согласно литературным данным обеспечивают высокий уровень устойчивости, обнаруживались только в четырех образцах. Из 13 образцов, полученных в период 2003-2004 гг., у пяти были отмечены мутации устойчивости, при этом только в одном случае был обнаружен набор мутаций, обеспечивающих высокий уровень устойчивости (Gurusinghe A.D. et al., 1995, Harrigan P.R. et al. 1996 , Hooker D J. et al., 1996). Четыре других образца содержали либо одну первичную, либо две мутации или только вторичные мутации, или одну первичную и одну вторичную.

Таким образом, уровень устойчивости к АЗТ в исследуемой популяции является относительно не высоким, а максимальное количество устойчивых фенотипов было обнаружено в период 2000-2001 годах, что отражает степень применения азидотимидина Из вариантов вируса собранных в последние два года практически не было устойчивых к терапии АЗТ.

Таблица 6

Мутации устойчивости к НИ и ННИ

Аминокислотные позиции мутаций устойчивости к НИОТ иННИОТ 44 74 75 92 103 108 118 135 181 184

Дикий тип ОТ Е L V L К V V I Y M

Мутации устойчивости к НИОТ иННИОТ у В субтипа D V I,L, М,Т 1 N I I М С V

Мутации 263 Е V V L ■mm V V 1 Y M

устойчивости к НИОТ и ННИОТу 278 Е L V ; ftr, к V V I Y M

283 Е V L к V V I Y M

пациентов 285 Е L L к V V I Y M

2112 Е L ■VI L к V V I Y

2113 Е L V L к V ■ • 1 Y M

2597 Ш! SftBtt L V L к v 4.ti£j>J I Y

2603 Е L V L к V V I Y M

2628 Е L V L к V M

Примечание' В заштрихованных квадратах показаны мутации устойчивости.

2.4. Анализ мутаций устойчивости к другим нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам ОТ.

Почти все пациенты на период получения от них образцов крови в 20002004 годах, получали терапию различными комбинациями НИ или ННИ. Анализ популяции на чувствительность к этим ингибиторам показал, что обнаруженные замены также не отличаются от описанных для В субтипа. Из 37 изученных образцов, мутации устойчивости к этим ингибиторам были обнаружены у 9 вариантов (Таблица 6). Шесть из девяти, у которых были обнаружены мутации устойчивости, были получены в период 2000-2001 годов. У образцов собранных в период 2003-2004 годов, устойчивостью к НИ и ННИ обладали только три.

Сравнение мутаций устойчивости у вариантов вируса, выделенных в разные периоды времени показало, что варианты, выделенные в начале 90-х годов, вообще не имеют таких изменений, что связано с отсутствием химиотерапии препаратами данной группы в тот период времени. Варианты, полученные в 2000-2001 гг. имеют одну-две мутации устойчивости к другим нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам, в то время как варианты, выделенные в 2003-2004 годах, содержат уже до трех таких мутаций. Полученные данные, вероятно, являются отражением факта перехода на комплексную терапию различными комбинациями химиопрепаратов.

ВЫВОДЫ

1. Установлены закономерности эволюции гипервариабельного домена УЗ §р 120 у вариантов ВИЧ-1 в пробах крови детей, инфицированных во время Ростово-Элистинской вспышки 1988-1989 гг..

Показано, что прогрессирование ВИЧ-инфекции сопровождается нарастанием числа мутаций в области УЗ петли, приводящих к замене аминокислотных остатков в позициях 14, 15, 20 как у индивидуальных пациентов, так и в популяции вцелом.

2. В зависимости от длительности ВИЧ-инфекции уровень изменчивости петли УЗ возрастает с 5,2% (1991-1992 гг.) до 15,5% (2000-2001 гг.). Прогрессирование заболевания коррелирует со снижением частоты встречаемости аминокислотных остатков 1,0 в позициях 14 и 15, характерных для образцов 1991-1992 гг., и заменой этой последовательности на доминирующие варианты Ю, Ив, БА в пробах крови 2000-2001 гг Такая тенденция характерна для вариантов ВИЧ-1 отдельных пациентов и всей популяции (26 пациентов).

3. Впервые определена первичная структура фрагмента гена обратной транскриптазы ВИЧ-1 протяженностью 730 нуклеотидных остатков (позиции 87-817 н.о.) у вариантов ВИЧ-1 от 37 пациентов изучаемой популяции. Методом филогенетического анализа установлено, что гены полимераз исследованных вариантов близки между собой и относятся к субтипу в ВИЧ-1, что дополняет сведения о характеристике, циркулирующего в популяции варианта вируса.

4. Установлено, что различия аминокислотных консенсусных последовательностей обратной транскриптазы, характерные для популяции ВИЧ-1 1991-1994 гг., 2000-2001 гг. и 2003-2004 гг., локализованы в позициях 31, 35 и 104. В зависимости от продолжительности ВИЧ-инфекции уровень изменчивости гена обратной транскриптазы возрастал с 1,86% (1991-1994 гг.) до 2,32% (2003-2004 гг.).

5. Мутации гена обратной транскриптазы, обеспечивающие устойчивость к азидотимидину и другим нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам, у субтипа в ВИЧ-1 не отличаются от характерных для субтипа В.

Список опубликованных работ.

1 Пазилин А.С., Леликова Г.И., Кириллова Л.Д., Гараев М.М. Субтипирование области gag вариантов вируса иммунодефицита человека типа 1, распространенных на территории Российской Федерации // Мат. 10

международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», Санкт-Петербург, 21-22 мая 2002, с.65.

2.Гараев М.М., Пазилин A.C., Леликова Г.И., Никитина Л.Д, Кириллова Л.Д. Генотипирование области gag вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа с гетеросексуальным путем трансмиссии // В сб. Профилактическая медицина - практическому здравоохранению ММА им. И.М.Сеченова.Москва.-2003 .-стр.292-297.

3.Ромашкин П.А., Саухат С.Р., Шемшура А.Б., Пазилин A.C., Матяш Е.В., Гараев М.М. Ретроспективный анализ популяционной изменчивости области V3 gpl20 в когорте ВИЧ-инфицированных, имеющих единый источник заражения // Вопр. вирусол. - 2003. - №4. стр. 20-26.

4.Ромашкин П.А., Саухат С.Р., Шемшура А.Б., Пазилин A.C., Гараев М.М. Анализ изменчивости области V3 gpl20 у отдельных пациентов в когорте ВИЧ-инфицированных, имеющих единый источник заражения // Вопр. вирусол. - 2004. - №4. стр. 15-20.

5.Бурунова В.В., Щелканов М.Ю., Тишкова Ф.Х., Стариков Н.С., Пазилин A.C., Белоброва Е А., Петренко М.С., Юдин А.Н., Самуилов В.Д., Гараев М.М., Львов Д.К. Серотипирование на основе УЗ-имитирующих пептидов вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Республике Таджикистан среди лиц, употребляющих наркотики внутривенно // Вопр. вирусол. - 2004. - №4. стр. 30-39.

ô.Garaev М.М., Pazilin A.S., Shemshura A.B., Saukhat S.R. Mutations Conferring Drug-resistance of the Reverse Transcriptase of Human Immunodeficiency Virus Subtype G // Abstract of the 13 th International Symposium on HIV & Emerging diseases. 2004 June 3-5, Toulon, France

7.Пазилин A.C., Саухат C.P., Шемшура А.Б., Никитина Л.Д., Гараев М.М. Генетическая характеристика гена обратной транскриптазы субтипа G ВИЧ-1 // Вопр. вирусол. - в печати.

Принято к исполнению 20/05/2005 Исполнено 20/05/2005

Заказ № 889 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2006-4 8349

№1 1 ~

✓О

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пазилин, Алексей Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Организация генома ВИЧ-1.

1.2. Структурная организация обратной транскриптазы.

1.2.1. Структура фермента.

1.2.2. Конформациопные изменения в Р66 при связывании матрицы-затравки и дНТФ.

1.2.3. дНТФ-связывающий сайт.

1.2.4. Стадии в цикле иолимеразной реакции.

1.3. Обратная транскрипция.

1.4. Эволюция лекарственной устойчивости.

1.5. Классификация ингибиторов полимераз.

1.6. Нуклеотидные и нуклеозидные ингибиторы ОТ.

1.6.1. Механизм резистентности к нуклеозидным ингибиторам.

1.6.2. Мутации, ассоциированные с устойчивостью к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам.

1.6.3. Паттерны кросс-резистентности.

1.7. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы.

1.8. Взаимодействия между мутациями к НИ и НИИ.

1.9. Межсубтиповая вариабельность.

1.10. Третий гипервариабельный домен (V3) gp 120.

1.10.1. Структура V3.

1.10.2. Вирусный тропизм.

1.10.3. Проникновение вируса в клетку.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Пациенты.

2.2. Забор крови и выделение лимфоцитов.

2.3. Выделение тотальной ДНК.

2.4. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.5. Электрофорез ДНК.

2.6. Приготовления ДНК для секвенирования.

2.7. Секвенирование ДНК.

2.8. Построение алайментов и филогенетический анализ.

2.9. Клонирование последовательностей V3 петли ВИЧ-1.

2.9.1. Получение рекомбинантных плазмид.

2.9.2. Приготовление компетентных клеток.

2.9.3. Трансформация плазмидной ДНК.

2.9.4. Селекция плазмид, несущих последовательности V3 петли.

2.9.5. Выделение плазмидной ДНК.

2.10. Анализ вариабельности области pol.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Ретроспективный анализ популяционной изменчивости области V3 Ростово-Элистинской когорты ВИЧ-инфицированных.

3.1.1. Анализ изменчивости V3 петли.

3.1.2. Анализ В-эпитопа УЗ-петли в когорте ВИЧ-инфицированных.

3.2. Анализ изменчивости V3- петли у отдельных пациентов.

3.3. Анализ консервативного региона генома ВИЧ-1.

3.3.1. Анализ вариабельности области pol ВИЧ-1 и подбор праймеров для амплификации.

3.3.2. Определение нуклеотидных последовательностей продуктов амплификации.

3.3.3. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей вариантов вируса G субтипа.

3.3.4. Анализ синонимичных и несинонимичных замен в функциональных доменах ОТ.

3.3.5. Анализ мутаций устойчивости возникающих при терапии азидотимидином.

3.3.6. Анализ мутаций устойчивости к другим нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам ОТ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение закономерностей эволюции гипервариабельных и консервативных участков генома ВИЧ-1"

Одной из важных особенностей вирусов является высокий уровень их генетической изменчивости, обусловленный большими репродукционными потенциями этих объектов, с одной стороны, и прессом селективных факторов хозяйских организмов с другой. Виды вирусов, существующие как наборы генетически гетерогенных вариантов за счет гипервариабельности отдельных участков генома, получили название "квазивидов" (Coffin, 1995). Генетическая гетерогенность была обнаружена не только при анализе состава вирусных популяций от множества пациентов, но и при изучении вируса в пределах одного инфицированного (McNearney et al., 1992). Прежде всего такая ситуация характерна для вирусов с длительным периодом персистенции. Из всех известных в настоящее время вирусов максимальный уровень изменчивости отмечен для группы лентивирусов и, в частности, для вируса иммунодефицита человека (ВИЧ): различия между штаммами этого вируса по отдельным областям генома достигают 30-40%%. Однако все это разнообразие вариантов ВИЧ-1 удалось классифицировать на ограниченное число групп. В частности, в пределах вида ВИЧ-1 выделяют, три группы субтипов: группа «О», группа «М» и группа «N» (Robertson, 2000).

Среди гипервариабельных областей генома ВИЧ-1 особый интерес представляет участок, кодирующий петлю области V3, поверхностного гликопротеина gpl20, которая состоит из 33-35 аминокислотных остатков в зависимости от штамма вируса. К настоящему времени накоплено много данных о значимости V3 петли для проявления вирусом различных биологических свойств. Данная область участвует в формировании вирусных структур, взаимодействующих с корецепторами клеток-мишеней. В связи с этим существует определенная корреляция между структурой V3 петли и преимущественным использованием того либо иного корецептора, что определяет тропизм вируса (Westerwelt et al., 1992; O'Brien et al., 1998; Dragic et al., 2001). В составе V3 петли локализуется основная нейтрализуемая антигенная детерминанта ВИЧ-1, картированная в позиции 14-21 (Clerici et al., 1991; Palker et al., 1989; Takahashi et al., 1992; Семилетов и др., 1994). Однако сведения о направленности и характере изменчивости основной нейтрализующей детерминанты в ходе развития заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов в литературе практически отсутствуют.

Одной из самых консервативных областей генома вируса является область pol, и, в частности, последовательности гена, кодирующего обратную транскриптазу (ОТ) - ключевого фермента ВИЧ-1, обеспечивающего вирусную репликацию. Изучение генетической изменчивости данной области генома является важным для практического здравоохранения, поскольку мутации устойчивости вируса к группе лекарственных препаратов нуклеозидной и ненуклеозидной природы, широко применяемых в химиотерапии ВИЧ инфекции, расположены в последовательностях гена ОТ.

В связи с этим нами была предпринята попытка ретроспективно проследить направленность изменчивости гипервариабельной и консервативной областей в когорте ВИЧ-инфицированных, имеющих в качестве источника заражения единственного пациента «О». В качестве удобной модели для проведения исследований была выбрана популяция пациентов, сформированная в результате внутрибольничной вспышки ВИЧ-инфекции на юге России в 1988-89 гг. (Ростово-Элистинская вспышка) (Покровский, 1991).

Цель и задачи исследования.

1. Провести определение нуклеотидной последовательности и анализ петли V3 у вариантов вируса, полученных в 1991-1992 гг. и 2000-2001 гг. от пациентов Ростово-Элистинской вспышки, с целью определения направленности и закономерности эволюции данной области на популяционном уровне.

2. Создание клонотек вирусных участков генома, кодирующих область V3, от пациентов 1991-1992 гг. и 2000-2001 гг., для проведения структурного анализа и выявления закономерностей эволюционного процесса этой области генома у отдельных пациентов.

3. Провести анализ гена обратной транскриптазы области pol у вариантов вируса G субтипа Ростово-Элистинской вспышки, полученных в

1991-1994 гг., 2000-2001 гг. и 2003-2004 гг.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Показано направление эволюции V3 петли на популяционном уровне у вариантов вируса при длительной персистенции в организме хозяина.

4. Установлено, что полимераза исследуемых вариантов вируса, принадлежит субтипу G ВИЧ-1.

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Уровень изменчивости области V3 у пациентов Ростово-Элистинской вспышки возрастает по мере прогрессии заболевания и длительности персистенции вируса в организме ВИЧ-инфицированного.

3. Проведен молекулярно-генетический анализ фрагмента 87-817 н.о. гена ОТ ВИЧ-1 7 образцов 1991-1994 гг., 17 - 2000-2001 гг. и 13 - 20032004 гг. от пациентов Ростово-Элистинской вспышки 1989 года.

4. Различия по аминокислотному составу между субтипами в гене ОТ варьируют, в среднем, от 3% до 10%, в зависимости от функционального домена. Различия по нуклеотидной последовательности составляют 8% -11%.

5. Мутации, возникающие при терапии АЗТ у вариантов субтипа G, не отличаются от соответствующих, описанных для субтипа В. Мутации, поддерживающие устойчивость к другим НИ и ННИ у субтипа G, такие же как у субтипа В.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Пазилин, Алексей Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Установлены закономерности эволюции гипервариабельного домена V3 gp 120 у вариантов ВИЧ-1 в пробах крови детей, инфицированных во время Ростово-Элистинской вспышки 1988-1989 гг.

Показано, что прогрессирование ВИЧ-инфекции сопровождается нарастанием числа мутаций в области V3 петли, приводящих к замене аминокислотных остатков в позициях 14, 15, 20 как у индивидуальных пациентов, так и в популяции вцелом.

2. В зависимости от длительности ВИЧ-инфекции уровень изменчивости петли V3 возрастает с 5,2% (1991-1992 гг.) до 15,5% (20002001 гг.). Прогрессирование заболевания коррелирует со снижением частоты встречаемости аминокислотных остатков LG в позициях 14 и 15, характерных для образцов 1991-1992 гг., и заменой этой последовательности на доминирующие варианты IG, FG, FA в пробах крови 2000-2001 гг. Такая тенденция характерна для вариантов ВИЧ-1 отдельных пациентов и всей популяции (26 пациентов).

3. Впервые определена первичная структура фрагмента гена обратной транскриптазы ВИЧ-1 протяженностью 730 нуклеотидных остатков (позиции 87-817 н.о.) у вариантов ВИЧ-1 от 37 пациентов изучаемой популяции. Методом филогенетического анализа установлено, что гены полимераз исследованных вариантов близки между собой и относятся к субтипу G ВИЧ-1, что дополняет сведения о характеристике циркулирующего в популяции варианта вируса.

5. Мутации гена обратной транскриптазы, обеспечивающие устойчивость к азидотимидину и другим нуклеозидным и ненуклеозидн(Мм ингибиторам, у субтипа G ВИЧ-1 не отличаются от характерных для субтипа В.

Благодарности

Хочу выразить глубокую благодарность и признательность своему научному руководителю М.М. Гараеву за постоянную помощь и неослабленное внимание к работе, критичесую оценку и ценную помощь при оформлении диссертации.

Искренне признателен сотруднику Северо-Кавказского регионального центра по борьбе и профилактике со СПИД - Шемшуре А.Б., а также всем сотрудникам НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского с кем мне посчастливилось общаться в ходе выполнения работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди огромного разнообразия РНК содержащих вирусов, вирус иммунодефицита человека обладает, пожалуй, наибольшим уровнем генетической изменчивости. К настоящему моменту варианты ВИЧ-1 разделяют на три группы «О», «N» и «М» (Robertson, 2000). Наибольшее распространение получила группа «М», которая обеспечивает в настоящее время пандемию вируса.

Несмотря на огромное количество информации об изменчивости вируса, к моменту проведения настоящего исследования в литературе практически нет данных, отражающих закономерности его эволюции.

В связи с этим была предпринята попытка определить направленность изменчивости вирусного генома при длительной персистенции вируса в организме хозяина. Особый интерес представляло изучение эволюции гипервариабельных и консервативных областей генома. В качестве гипервариабельной области была взята нуклеотидная последовательность, кодирующая V3 петлю поверхностного гликопротеина gpl20. В качестве консервативной области - ген pol и, в частности, область, кодирующая ОТ.

Моделью для проведения настоящей работы послужила популяция пациентов, сформированная в результате внутрибольничной вспышки ВИЧ-инфекции на юге России в 1988-1989 гг. (Ростово-Элистинская вспышка).

Анализ УЗ-петли у исследуемых вариантов вируса показал, что уровень изменчивости этой области в 1992 г. составлял 5,2%, тогда как к 2001 г. эта величина возрастала до 15,5%. При сопоставлении уровня вариабельности со стадией заболевания было обнаружено, что последовательности 1991-1992 гг. от пациентов со стадией заболевания 2В, практически не имеют отличий от консенсусной последовательности УЗ-петли, характерной для того периода. У последовательностей с более поздними стадиями заболевания (ЗА, ЗБ, ЗВ) уровень изменчивости был выше и находился в пределах от 4,3% до 8,6%. У последовательностей 2001 г. от пациентов со стадиями заболевания ЗА-ЗВ различий с консенсусной последовательностью было больше. Уровень вариабельности колебался от 4,3% до 17,1%. С одной стороны, уровень изменчивости зависит от стадии развития инфекционного процесса, а с другой - вариабельность возрастает с увеличением периода персистенции вируса даже при отсутствии прогрессии заболевания. Дальнейшие исследования показали, что эволюционные изменения V3 в исследуемой популяции имеют ограниченный характер. Они заключаются в замене лейцина, находящегося в позиции 14, на фенилаланин и фенилаланин в позиции 20 на лейцин. Анализ этих замен показал связь в этих мутационных событиях, т.е. замена в позиции 14 лейцина на фенилаланин, приводит к появлению лейцина или близкого по свойствам изолейцина вместо фенилаланина в позиции 20. Реципрокный характер замен, вероятно, свидетельствует об участии этих аминокислотных остатков совместно с изолейцинами в позициях 12, 26, 27 в формировании гидрофобного ядра, лежащего под верхушкой V3 (последовательность GPG) (Kwong et al., 1998).

Анализ В-эпитопа петли V3 показал, что исходной для исследуемой когорты является структура LG, так как она наиболее характерна для пациентов с ранними стадиями ВИЧ-инфекции. При дальнейшем развитии инфекционного процесса получают развитие варианты вируса, несущие структуры IG, FG, которые впоследствии меняются на структуру FA.

На следующем этапе был проведен анализ V3-петли вариантов вируса, полученных от отдельных пациентов в разное время. При длительной персистенции вируса средний уровень вариабельности возрастает в период с 1992 г. по 2001 г. с 2,2% до 4,2%. При сравнении распределения гипервариабельных аминокислотных позиций области V3 от отдельных пациентов с аналогичными данными при общепопуляционном анализе, было установлено, что положение гипервариабельных сайтов в последовательностях 1992 г. всегда совпадает с положением позиций, определенных как гипервариабельные для популяции того периода в целом.

У вирусных последовательностей, изолированных в 2000-2001 гг., наряду с характерными для популяции того периода, отмечается появление индивидуальных гипервариабельных позиций. Таким образом, обнаружение общих гипервариабельных сайтов при сравнении изменчивости у отдельных пациентов и внутри популяции свидетельствует о действии общих факторов отбора в разные периоды развития инфекционного процесса.

Сравнение В-эпитопа вариантов вируса, выделенных от отдельных пациентов в 1991-1992 и 2000-2001 гг., показало, что в составе этой структуры нет вариантов, отличающихся от определенных ранее, при популяционном анализе.

Кроме анализа гипервариабельного участка генома ВИЧ-1, целью настоящего исследования было проведение анализа консервативного региона генома. В качестве такого региона был выбран ген ОТ. Нами были подобраны праймера и отработаны условия для амплификации этого участка генома. В результате были получены вирусные последовательности фрагмента гена ОТ, соответствующие участку 87-817 п.н.

Определенные нуклеотидные последовательности были использованы в филогенетическом анализе. Исследуемые варианты вируса кластерируется с другими вариантами ВИЧ-1, относящимися к G субтипу. Таким образом, полимераза изучаемых вариантов вируса принадлежит субтипу G. На следующем этапе работы было проведено сравнение аминокислотных и нуклеотидных последовательностей функциональных доменов гена ОТ между различными субтипами ВИЧ-1. Основные отличия в структуре фермента наблюдаются в основном в заменах аминокислот синонимичного характера. Замены на несинонимичные аминокислоты сосредоточены, в основном, в доменах «БП» и «С». Уровень нуклеотидных различий во всех доменах несколько выше, чем аминокислотных. При этом в «Л» и «П» обнаруживаются в основном замены, не приводящие к изменению аминокислоты, в то время как в доменах «БП» и «С» преобладали замены, изменяющие аминокислоту. «Л» по аминокислотному составу практически не отличается у различных субтипов. Различия между субтипами ВИЧ-1 варьировали от 0% до 9,7%. При этом уровень различий по нуклеотидной последовательности был выше и составлял в среднем 8-9%. Такая консервативность домена может быть связана с тем, что данная область находится под более жестким действием отбора, в отличие от других регионов ОТ, поскольку именно в этом домене находится активный центр полимеразы.

Особый интерес представляло изучение изменчивости гена ОТ при длительной персистенции вируса в организме. Анализ консенсусных аминокислотных последовательностей 1991-1994 гг., 2000-2001 гг. и 20032004 гг. показал, что уровень изменчивости полимеразы находится на очень низком уровне. Мы обнаружили всего 3 аминокислотные замены в позициях 31, 35, 104. Уровень нуклеотидной вариабельности был также невысоким (было обнаружено 6 замен). Проведенный анализ алайнментов изучаемого фрагмента у вариантов вируса, полученных в периоды 1991-1994 гг., 20002001гг. и 2003-2004 гг., показал низкий уровень изменчивости этой области генома. Уровень изменчивости у вирусов в 1991-1994 гг. составлял 1,86%, в 2000-2001 гг. - 2,11% , а в 2003-2004 гг. - 2,32%. Таким образом, общий уровень изменчивости гена ОТ возрастает, но остается на достаточно низком уровне по сравнению с гипервариабельной V3-областью, где эти значения составляли 5,2% и 15,5%, соответственно. Нам также не удалось выявить направленность эволюции данного участка, что возможно, связано с недостаточностью выборки.

Важной особенностью обратной транскриптазы является то, что именно на нее направлено основное действие используемых в настоящее время лекарственных препаратов. Мы изучили мутации, поддерживающие устойчивость к АЗТ, а также другим НИ и ННИ, обнаруженные у вариантов вируса субтипа G. Выявленные мутации при действии данных агентов не отличаются от описанных ранее для В субтипа.

Суммируя вышесказанное можно заключить, что в результате проведенной работы с использованием молекулярно-биологических и молекулярно-генетических методов исследования были выявлены основные закономерности эволюции отдельных областей вирусного генома, а также определен уровень изменчивости изучаемых областей при длительной персистенции вируса в организме.

112

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пазилин, Алексей Сергеевич, Москва

1. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Селимова JI.M. Молекулярная и вирусологическая специфика эпидемии ВИЧ-инфекции в России и странах СНГ. // Вестн. Рос. Акад. Мед. Наук 2003. - С. 83-85.

2. Покровский В.В., Ерамова И.Ю. и др. Внутрибольничная вспышка ВИЧ инфекции в Элисте // Ж. Микробиол.Эпидемиол. Иммунол. — 1990. — Т.4. с. 17-23.

3. Ржанинова А.А. Антитела к основной нейтрализующей детерминанте вируса иммунодефицита человека. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

4. Albert J. and Fenyo E.M. Simple, sensitive and specific detection of HIV-1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers. // J.Clin. Microbiol. 1990. - V.28 - P. 1560-1564.

5. Allain B, Rascle JB, de Rocquigny H, et al. CIS elements and trans-acting factors required for minus strand DNA transfer during reverse transcription of the genomic RNA of murine leukemia virus. // J Mol Biol. — 1998. — V.277. -P. 225-235.

6. Amand R, Moore J, Jaffe H. et al. DNA and protein heterogeneity in serial isolates of human immunodeficiency virus (ШУ-1): indication of change in vivo.//Microbios. 1987. - V.52.-P. 191-201.

7. Argos P. A sequence motif in many polymerases. Nucleic Acids Res 1988;16:9909-9916.

8. Bacheler L, Jeffrey S, Hanna G, et al. Genotypic correlates of phenotypic resistance to efavirenz in virus isolates from patients failing nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor therapy. // J. Virol. 2001. - V.75. - P. 49995008.

9. Bacheler L, Ploughman L, Hertogs K, Larder B. Impact of baseline NNRTI resistance on the efficacy of efavirenz combination therapy in NNRTI therapy-naive pateints (study DMP 266-006). // Antiviral Therapy 2000a. V.5.-P. 70.

10. Bacheler LT, Anton ED, Kudish P. et al. Human immunodeficiency virus type 1 mutations selected in patients failing efavirenz combination therapy. Antimicrob. Agents Chemother. 2000b. - V.44. - P. 2475-2484.

11. BackNK, Nijhuis M, Keulen W, et al. Reduced replication of 3TC-resistant HIV-1 variants in primary cells due to a processivity defect of the reverse transcriptase enzyme. // EMBO J. 1996. - V. 15. - P. 4040-4049.

12. Baldanti F, Paolucci S, Maga G. et al. Nevirapine-selected mutations Y181I/C of HIV-1 reverse transcriptase confer cross-resistance to stavudine. //ATOS-2003.-V.17.-P. 1568-1570.

13. Bedinger P, Moriarty A, von Borstel RC et al. Internalization of the human immunodeficiency virus does not require the cytoplasmic domain of CD4. // Nature- 1988.-V.334.-P. 162-165.

14. Bennetts, В. H., Teutsch, S. M., Buhler, M. M. et al. The CCR5 deletion mutation fails to protect againstmultiple sclerosis. // Human Immunology -1997.-V.58.-P. 52-59.

15. Berger EA, Murphy PM, Farber JM. Chemokine receptors as HIV-l coreceptors: Roles in viral entry, tropism, and disease. // Annu. Rev. Immunol. 1999. -V. 17. - P. 657-700.

16. Bordier B, Tarrago-Litvak L, Sallafranque-Andreola ML. et al. Inhibition of the p66/p51 form of human immunodeficiency virus reverse transcriptase by tRNA(Lys). // Nucleic Acids Res. 1990. - V.l 1. - P. 429-436.

17. Boyer PL, Sarafianos SG, Arnold E, Hughes SH. Nucleoside analog resistance caused by insertions in the fingers of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase involves ATP-mediated excision. // J. Virol. 2002. - V.76. - P. 9143-9151.

18. Brautigam С. A., Steitz Т. A. Structural and functional insights provided by crystal structures of DNA polymerases and their substrate complexes. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. - V.8. - P. 54-63.

19. Brenner B, Turner D, Oliveira M. et al. A V106M mutation in HIV-1 clade С viruses exposed to efavirenz confers cross-resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. // AIDS 2003. - V. 17. - P. 1-5.

20. Catasti P, Bradbury M. E. Gupta G. Structure and Polymorphism of HIV-1 Third Variable Loops. // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - №.14. - P. 8236-8242.

21. Cen S, Niu M, Kleiman L. The connection domain in reverse transcriptasefacilitates the in vivo annealing of tRNALys3 to HIV-1 genomic RNA. // Retrovirology 2004. - V.19. - P.33.

22. Cheng-Mayer C., Seto D., Tateno M. et al. Biologic features of HIV-1 that correlate with virulence in the host. // Science 1988. - V.240. - P. 80-82.

23. Coakley E. P., Gillis J. M., Hammer S. M. Phenotypic and genotypic resistance patterns of HIV-1 isolates derived from individuals treated with didanosine and stavudine. // AIDS 2000. - V.14. - P. 9-15.

24. Coffin JM. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. // Science 1995. - V.267. - P. 483-489.

25. Connor R. I., Sheridan К. E., Ceradini D., et al. Change in coreceptor use coreceptor use correlates with disease progression in HIV-l-infected individuals. //J. of Exp. Med. 1997. - V.185. - P. 621-628.

26. Das K, Ding J, Hsiou Y, et al. Crystal structures of 8-C1 and 9-C1 TIBO complexed with wild-type HIV-l RT and 8-C1 TIBO complexed with the Tyrl81Cys HIV-l RT drug-resistant mutant. // J. Mol. Biol. 1996. - V.264. -P. 1085-1111.

27. De Jong J., De Ronde A., Keulen W. et al. Minimal requirements for the human immunodeficiency virus type 1 V3 domain to support the syncytium-inducing phenotype: analysis by aingle amino acid aubstitution. // J. Virol. — 1992. V.66. - P. 6777-6780.

28. De Ronde A., van Dooren M., van Der Hoek L. et al. Establishment of new transmissible and drug-sensitive human immunodeficiency virus type 1 wild types due to transmission of nucleoside analogue-resistant virus. // J. Virol. -2001.-V.75.-P. 595-602.

29. Dean M., Carrington M., Winkler C. et al. Genetic restriction of HIV-l infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene. //Science 1996.- V.273.-P. 1856-1862.

30. DeClercqe E. Non nucleoside reverse transcriptase inhibitors: An overview in insights in HIV disease management. // Meniscus Health Care Commun. -1997. V.6. - P. 2—9.

31. Delward E.L., Sphaer E.G., McCutchan F.E. et al. Genetic relationships determined by a heteroduplecx mobility assay: analysis of HIV env genes. // Science 1993. - V.262. -P. 1257-1261.

32. Deng H, Liu R, Ellmeier W. et al., Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-l. //Nature 1996. - V.20. - P. 661-666.

33. Ding J., Hughes S. H., Arnold E. Proteinnucleic acid interactions and DNA conformation in a complex of human immunode®ciency virus type 1 reverse transcriptase with a double-stranded DNA template-primer. // Biopolymers -1997.-V.44.-P. 125-138.

34. Doublie S. Ellenberger T. The mechanism of action of T7 DNA polymerase. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. - V.8. - P. 704-712.

35. Dragic T. An overview of the determinants of CCR5 and CXCR4 co-receptor function. // J. of Gen. Virol. 2001. - V.82. - P. 1807-1814.

36. Dragic Т., Trkola A., Lin S. W. et al. Amino-terminal substitutions in the CCR5 coreceptor impair gpl20 binding and human immunodeficiency virus type 1 entry. // J. Virol. 1998. - V.72. - P. 279-285.

37. Druillennec S., Caneparo A., de Rocquigny H., Roques B.P. Evidence of interactions between the nucleocapsid protein NCp7 and the reverse transcriptase of HIV-l. //J. Biol. Chem. 1999. -V. 16. - P. 11283-11288.

38. Elgavish Т., VanLoock M.S., Harvey S.C. Exploring three-dimensional structures of the HIV-l RNA/tRNALys3 initiation complex. // J. Mol. Biol. -1999.-V.285.-P. 449-453.

39. Fantini J., Tamalet C., Yahi N. Secondary structure predictions of HIV-1 reverse transcriptase provide new insights into the development of drug-resistance genotypes. // AIDS 2001. - V. 15. - P. 1191-1192.

40. Felsenstein J. Evolutionary trees from gene frequencies and quantitative characters: finding maximum likelihood estimates. // Evolution 1981. -V.35.-P. 1229-1242.

41. Felsenstein J. Parsimony in systematics: biological and statistical issues. // Ann. Rev. ofEcol. and System. 1983. - V. 14. - P. 313-333.

42. Feng Y., Broder С. C.,. Kennedy P. E, Berger E. A. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor. // Science 1996. - V.272. - P. 872-877.

43. Fitzgibbon J.E., Howell R.M., Haberzettl C.A. et al. Human immunodeficiency virus type 1 pol gene mutations which cause decreased susceptibility to 2',3-dideoxycytidine. // Antimicrob. Agents Chemother. -1992.-V.36.-P. 153-157.

44. Fouchier R.A., Groenink M., Kootstra N.A. et al. Phenotype-associated sequence variation in the third variable domain of the human immunodeficiency virus type 1 gpl20 molecule. // J. Virol. -1992. — V.66. — P. 3183-3187.

45. Frost S.D., Nijhuis M., Schuurman R. et al. Evolution of lamivudine resistance in human immunodeficiency virus type 1-infected individuals: the relative roles of drift and selection. // J. Virol. 2000. - V.74. - P. 6262-6268.

46. Gallego O., Corral A., de Mendoza C. et al. Prevalence of G333D/E in naive and pretreated HIV-infected patients. // AIDS Res. Hum. Retroviruses 2002. -V.18.-P. 857-860.

47. Garcia-Lerma J.G., Nidtha S., Blumoff K. et al. Increased ability for selection of zidovudine resistance in a distinct class of wild-type HTV-l from drug-naive persons. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. - V.98. - P. 1390713912.

48. Gelderblom H.R. Assembly and morphology of HIV: potential effect of structure on viral function. // AIDS 1991. - V.5. - P. 617-637.

49. Gomes P., Diogo I., Goncalves M.F., et al. Different pathways to nelfinavir genotypic resistance in HIV-l subtypes В and G. // 9th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. 2002. - Seattle, WA. - Abst. 46

50. Gonzales M.J., Wu T.D., Taylor J. et al. Extended spectrum of HIV-l reverse transcriptase mutations in patients receiving multiple nucleoside analog inhibitors. // AIDS 2003. - V. 17. - P. 791-799.

51. Goudsmit J., Boucher C.A., Meloen R.H. et al. Human antibody response to a strain-specific HIV-l gpl20 epitope associated with cell fusion inhibition. // AIDS. 1988. - V.2. — P. 157-164.(a)

52. Goudsmit J., Kuiken C.L., Nara P.L. Linear versus conformational variation of V3 neutralization domains of HIV-l during experimental and natural infection. // AIDS 1989. - V.3. - P. 119-123.

53. Grant R., Liegler Т., Spotts G., Hecht F. Declining nucleoside reverse transcriptase inhibitor primary resistance in San Francisco. // Antiviral Therapy 2003. - V.8. - P. 134.

54. Grossman Z., Istomin V., Averbuch D. et al. Greater genetic variation at NNRTI-associated resistance positions in patients infected by subtype C. // 10th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections 2003. -Boston, MA. - abst. 624

55. Gurusinghe A.D., Land S.A., Birch C. et al Reverse transcriptase mutations in sequential HIV-l isolates in a patient with AIDS // J. Med. Virol. 1995. -Vol.46.-P.238-243.

56. Harrigan P.R., Kinghorn I., Bloor S. et al. Significance of amino acid variation at human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase residue 210 for zidovudine susceptibility // J. Virol. 1996. - Vol.70. — P.5930-5934.

57. Harrigan P.R., Wynhoven В., Montaner J. et al. Mutations at reverse transcriptase codon 103: phenotypic resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor and clinical correlates. // Antiviral Therapy — 2003. — V.8.-P. 120.

58. He J., Chen Y., Farzan M., et al. CCR3 and CCR5 are co-receptors for HIV-1 infection of microglia. //Nature 1997. - V.385. - P. 645-649.

59. Horuk R. Molecular properties of the chemokine receptor family. // Trends Pharmacol. Sci. 1994. - V.15. -P. 159-65

60. Hsiou Y., Ding J., Das K. et al. The Lysl03Asn mutation of HIV-1 RT: a novel mechanism of drug resistance. // J. Mol. Biol. 2001. - V.309. — P. 437-445.

61. Huang H., Chopra R., Verdine G.L. et al. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance. // Science 1998. - V.282. - P. 1669-1675.

62. Huang W., Gamarnik A., Limoli K. et al. Amino acid substitutions at position 190 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase increase susceptibility to delavirdine and impair virus replication. // J. Virol. -2003.-V.77.-P. 1512-1523.

63. Isel C., Lanchy J., LeGrice S. F. J. et al. Specific initiation and switch to elongation of human mmunodeficiency virus type 1 reverse transcription require the post-translational modifications of primer tRNA3 Lys. // EMBO J. 1996.-V.15.-P. 917-924.

64. Jacks Т., Power M.D., Masiarz F.R. et al., Characterization of ribosomal frameshifiting in HIV-1 gag-pol expression. // Nature 1988. - V.21. - P. 280-2873.

65. Jacks Т., Varmus H.E. Expression of the Rous sarcoma virus pol gene by ribosomal frameshifting. // Science 1985. - V.230. - P. 1237-1242.

66. Jacobo-Molina A., Ding J., Nanni R.G et al Crystal structure of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase complexed with double-stranded DNA at 3.0 A resolution shows bent DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. - Vol.90. - P.6320-6324.

67. Jiang M., Мак J., Ladha A. et al. Identification of tRNAs incorporated into wild-type and mutant human immunodeficiency virus type 1. // J. Virol. -1993.-V.67.-P. 3246-3253.

68. Jordan I., Enssle J., Guttler E., et al. Expression of human foamy virus reverse transcriptase involves a spliced pol mRNA. // Virology — 1996. — V.224.-P. 314-319

69. Kantor R., Katzenstein D., Camacho R. et al. Genotypic analyses of RT and protease sequences from persons infected with non-subtype В HIV-l. // 10th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. 2003. - Boston, MA. - abst. 623 (a)

70. Kantor R., Lee E., Johnston E., et al. Rapid flux in non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance mutations among subtype С HIV-l-infected women after single dose nevirapine. // Antiviral Therapy — 2003. V.8. P. 85. (b)

71. Kellam P., Boucher C.A.B., Larder B.A. Fifth mutation in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase contributes to the development of high-level resistance to zidovudine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992.-Vol.89.-P.1934-1938.

72. Keulen W., Back N.K., Boucher C.A. et al. Initial appearance of the 184Ile variant in lamivudine-treated patients is caused by the mutational bias of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. // J. Virol. -1997. V.71. - P. 3346-3350.

73. Keulen W., van Wijk A., Schuurman R. et al Increased polymerase fidelity of lamivudine-resistant HIV-l variants does not limit their evolutionary potential.//AIDS 1999. - V.13.-P. 1343-1349.

74. Kleim J.P., Bender R., Kirsch R., et al. Mutational analysis of residue 190 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. // Virology1994.-V.200.-P. 696-701.

75. Kohlstaedt L.A., Wang J., Friedman J.M. et al. Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-l reverse transcriptase complexed with an inhibitor. // Science 1992. - V.256. P. 1783-1790.

76. Lacey S.F., Larder B.A. Novel mutation (V75T) in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase confers resistance to 2',3'-didehydro-2',3'- dideoxythymidine in cell culture. // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. - V.38. -P 1428-1432.

77. Landman R., Schiemann R., Thiam S. et al. Once-a-day highly active antiretroviral therapy in treatment-naive HIV-l-infected adults in Senegal. // AIDS 2003. -V. 17. - P. 1017-1022.

78. Lanier E., Irlbeck D., Ross L., Gerondelis P. et al. Prediction of NRTI options by linking RT genotype and phenotype breakpoings. // 10th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. 2003. - Boston, MA. - abst. 586

79. Larder B.A., Coates K.E., Kemp S.D. Zidovudine-resistant human immunodeficiency virus selected by passage in cell culture // J. Virol. — 1991. V.65. - P.5232—5236.

80. Larder В.A., Kemp S.D. Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT) // Science 1989. — V.246. -P.l 155-1158.

81. Larder B.A., Kellam P., Kemp S.D. Zidovudine resistance predicted by direct detection of mutations in DNA from HIV-infected lymphocytes. // AIDS 1991.-V.5.-P. 137-144.

82. Leigh Braun A J. Sequence variability in the human immunodeficiency viruses: pattern and process in viral evolution. // AIDS. — 1992. — V.6. — P.l 178-1184.

83. Levy J.A. Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection. // Microbiol. Rev. 1993. - V.57. P. 183-289.

84. Lukashov V.V., Karamov E.V., Eremin V.F. et al. Extreme founder effect in an HIV type 1 subtype A epidemic among drug users in Svetlogorsk, Belarus. // AIDS Res. Hum. Retroviruses 1998. - V.20. - P. 1299-1303.

85. Maddon P.J., McDougal J.S., Clapham P.R. et al. HIV infection does not require endocytosis of its receptor, CD4. // Cell 1988. - V.54. - P. 865-874.

86. Mansky L.M. Retrovirus mutation rates and their role in genetic variation. //J. Gen. Virol. 1998.- V.79. - P. 1337-1345.

87. McNearney Т., Hornickova Z., Markham R. et al. Relationship of human immunodeficiency virus type 1 sequence heterogeneity to stage of disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. - V.89.-P. 10247-10251.

88. Meltzer M.S. Skillman D.R., Hoover D.L. et al. Macrophages and the human immunodeficiency virus. // Immunol Today. — 1990. V.l 1. - P. 217223.

89. Mendoza C.D., Rodriguez C., Corral A. et al. Evidence for a different transmission efficiency of viruses with distinct drug-resistant genotypes. // Antiviral Therapy 2003. -V.8. - P. 144.

90. Meyer P.R., Matsuura S.E., Mian A.M. et al. A mechanism of AZT resistance: an increase in nucleotide-dependent primer unblocking by mutant HIV-l reverse transcriptase. // Mol. Cell 1999. - V.4. - P. 35-43.

91. Miller M., Margot N., Hertogs K. et al. Antiviral activity of tenofovir (PMPA) against nucleoside-resistant clinical HIV samples. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2001. - V.20. - P. 1025-1028.

92. Miller V., Ait-Khaled M., Stone C. et al. HIV-l reverse transcriptase (RT) genotype and susceptibility to RT inhibitors during abacavir monotherapy and combination therapy. // AIDS 2000. - V. 14. - P. 163-171.

93. Montes В., Segondy M. Prevalence of the mutational pattern E44D/A and/or VI181 in the reverse transcriptase (RT) gene of HIV-l in relation to treatment with nucleoside analogue RT inhibitors. // J. Med. Virol. 2002. -V.66.-P. 299-303.

94. Moore J.P., Nara P.L. The role of the V3 loop of gpl20 in HIV infection. // AIDS. 1991.-V.5.-P. 21-33.

95. Morris L., Pillay C., Chezzi C., Lupondwana P. et al. Low frequency of the V106M mutation among HIV-l subtype C-infected pregnant women exposed to nevirapine. // AIDS 2003. -V. 17. - P. 1698-1700.

96. Muesing M.A., Smith D.H., Cabradilla C.D. et al. Nucleic acid structure and expression of the human AIDS/lymphadenopathy retrovirus. // Nature -1985. V.7. - P. 450-458.

97. O'Brien W., Koyanagi Y., Namazie A. et. al. HIV-l tropism for mononuclear phagocytes can be dermined by region of gp 120 outside the CD4-biding domain. // Nature 1998. - V.348. - P. 69-73.

98. Palker T.J., Clark M.E., Langlois A.J. et al. Type-specific neutralization of the human immunodeficiency virus with antibodies to env-encoded synthetic peptides. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. - V.85.-P. 1932-1936.

99. Parikh U., Koontz D., Hammond J. et al. K65R: a multi-nucleoside resistance mutation of low but increasing frequency. // Antiviral Therapy -2003. V.8. - P. 152.

100. Parkin N., Chappey C., Petropoulos C., Hellmann N. HIV-l reverse transcriptase mutations that suppress zidovudine resistance also increase in vitro susceptibility to tenofovir, but not stavudine. // Antiviral Therapy -2003. V.8. - P. 34.

101. Peters G.G., Hu J. Reverse transcriptase as the major determinant for selective packaging of tRNA's into Avian sarcoma virus particles. // J. Virol. -1980.-V.36.-P. 692-700.

102. Phillips A.N., Miller V., Sabin C. et al. Durability of HIV-l viral suppression over 3.3 years with multi-drug antiretroviral therapy in previously drug-naive individuals. // AIDS 2001. - V.15. - P. 379-2384.

103. Pollakis G., Abebe A., Kliphuis A. et al. Phenotypic and genotypic comparisons of CCR5- and CXCR4-tropic human immunodeficiency virus type 1 biological clones isolated from subtype C-infected individuals. // J. Virol. 2004. - V.78. - P. 2841-2852.

104. Pollakis G., Kang S., Kliphuis A. N-Linked Glycosylation of the HIV Type-1 gpl20 Envelope Glycoprotein as a Major Determinant of CCR5 and CXCR4 Coreceptor Utilization. // J. Biol. Chem. 2001. - V.276. - P. 1343313441.

105. Quan Y., Gu Z., Li X. et al. Endogenous reverse transcription assays reveal high-level resistance to the triphosphate of (-)2 '-dideoxy-3 '-thiacytidine by mutated Ml84V human immunodeficiency virus type 1. // J. Virol. 1996. -V.70.-P. 5642-5645.

106. Restle Т., Pawlita M., Sczakiel G. et al., Structure-function relationships of HIV-l reverse transcriptase determined using monoclonal antibodies. // J. Biol. Chem. 1992. - V.267. - P. 14654-14661.

107. Rhee S.Y., Gonzales M.J., Kantor R. et al. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase and protease sequence database. // Nucleic Acids Res. — 2003.-V.31.-P. 298-303.

108. Richman D.D., Havlir D., Corbeil J. et al. Nevirapine resistance mutations of human immunodeficiency virus type 1 selected during therapy. // J. Virol. 1994. -V.68. - P.1660-1666.

109. Rini J.M., Stanfield R.L., Stura E.A. et al., Crystal structure of a human immunodeficiency virus type 1 neutralizing antibody, 50.1, in complex with its V3 loop peptide antigen. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. - V.90. - P. 6325-6329.

110. Rini J.M., Schulze-Gahmen U., Wilson I. A. Structural evidence for induced fit as a mechanism for antibody-antigen recognition. // Science — 1992.-V.255.-P. 959-965.

111. Rittinger K., Divita G., Goody R.S. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase substrate-induced conformational changes and the mechanism of inhibition by nonnucleoside inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1995.-V.15.-P. 8046-8049.

112. Robert-Guroff M., Goedert J J., Naugle С J. et al. Spectrum of HIV-1 neutralizing antibodies in a cohort of homosexual men: results of a 6 year prospective study. // AIDS Res. Hum. Retroviruses 1988. - V.4. - P. 343350.

113. Rodgers D.W., Gamblin S J., Harris B.A. et al. The structure of unliganded reverse transcriptase from the human immunodeficiency virus type 1. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. - V.92. - P. 1222-1226.

114. Ross T.M., Cullen B.R. The ability of HIV type 1 to use CCR-3 as a coreceptor is controlled by envelope VI/V2 sequences acting in conjunction with a CCR-5 tropic V3 loop. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. - V.95. -P. 7682-7686.

115. Sarafianos S.G., Clark A.D., Das K. et al. Structures of HIV-l reverse transcriptase with pre- and post-translocation AZTMP-terminated DNA. // Embo J. 2002. -V.21. -P.6614-6624.

116. Sarafianos S.G., Das K., Ding J. et al. Touching the heart of HIV-l drug resistance: the fingers close down on the dNTP at the polymerase active site. //Chem. Biol. 1999. - V.6.-P. 137-146.

117. Sawaya M., Prasad R, Wilson S.H. et al. Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with gapped and nicked DNA: evidence for an induced fit mechanism. // Biochemistry 1997. - V.16. - P. 11205-11215.

118. Shafer R. Genotypic Testing for HIV-l Drug Resistance In: Kuiken CL, Foley B, Hahn BH, et al. Human retroviruses and AIDS: a compilation and analysis of nucleic and amino acid sequences. 2003. -Los Alamos, NM: Los Alamos National Laboratory.

119. Shulman N., Bosch R., Mellors J., Albrecht M. Genetic correlates of phenotypic hypersusceptibility to efavirenz among 446 baseline isolates from five ACTG studies. // Antiviral Therapy 2003. - V.8. - P. 48.

120. Sonigo P., Alizon M., Staskus K. S. et al. Nucleotide sequence of the visna lentivirus: relationship to the AIDS virus. // Cell 1985. - V.42. - P. 369382.

121. St. Clair M.H., Richards C.A., Spector Т., et al. 3'-Azido-3'-deoxythymidine triphosphate as an inhibitor and substrate of purified human immunodeficiency virus reverse transcriptase. // Antimicrob. Agents Chemother. 1987. - V.31. - P. 1972-1977.

122. Sugiura W., Matsuda Z., Yokomaku Y. et al. Interference between D30N and L90M in selection and development of protease inhibitor-resistant human immunodeficiency virus type 1. // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. — V.46.-P. 708-715.

123. Tan C.K., Civil R., Mian A.M. et al. Inhibition of the RNase H activity of HIV reverse transcriptase by azidothymidylate. // Biochemistry — 1991. — V.30.-P. 4831—4835.

124. Tantillo C., Ding J., Jacobo-Molina A. et al. Locations of anti-AIDS drug binding sites and resistance mutations in the three-dimensional structure of

125. HIV-l reverse transcriptase. Implications for mechanisms of drug inhibition and resistance. // J. Mol. Biol. 1994. - V.243. - P. 369-387.

126. Temin H.M. Reverse transcription in the eukaryotic genome: retroviruses, pararetroviruses, retro transposons, and retrotranscripts. // Mol. Biol. Evol. -1985. V.6. - P. 455-468.

127. Termsmette M., Lange J.M., de Goede R.E. et al. Association between biological properties of human immunodeficiency virus variants and risk for AIDS and AIDS mortality. // Lancet 1989. - V.6. - P. 983-985.

128. Tisdale M., Alnadaf Т., Cousens D. Combination of mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase required for resistance to the carbocyclic nucleoside 1592U89. // Antimicrob. Agents Chemother. -1997.-V.41.-P. 1094-1098.

129. Toni Т., Masquelier В., Bonard D. et al. Primary HIV-l drug resistance in Abidjan (Cote d'lvoire): a genotypic and phenotypic study. // AIDS 2002. — V.16.-P. 488-491.

130. Topping R., Demoitie M.A., Shin N.H., Telesnitsky A. Cis-acting elements required for strong stop acceptor template selection during Moloney murine leukemia virus reverse transcription. // J. Mol. Biol. — 1998. — V.281. — P. 1— 15.

131. Torti C., Gilleece Y., Hertogs K. et al. R21 IK and L214F do not invariably confer high level phenotypic resistance to thymidine analogs in zidovudine-naive patients with Ml 84V. // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2001. -V.26.-P. 514-515.

132. Van Laethem K., Witvrouw M., Balzarini J. et al. Patient HIV-l strains carrying the multiple nucleoside resistance mutations are cross-resistant to abacavir. // AIDS 2000. - V. 14. - P. 469-471.

133. Velazquez-Campoy A., Vega S., Freire E. Amplification of the effects of drug resistance mutations by background polymorphisms in HIV-l protease from African subtypes. // Biochemistry 2002. - V.41. - P. 8613-8619.

134. Vogt M.W., Hartshorn K.L., Furman P.A. et al. Ribavirin antagonizes the effect of azidothymidine on HIV replication. // Science 1987. - V.235. — P. 1376-1379.

135. Wainberg M.A., Drosopoulos W.C., Salomon H. et al. Enhanced fidelity of ЗТС-selected mutant HIV-l reverse transcriptase. // Science 1996. — V.271. -P. 1282-1285.

136. Wang Z. X., Berson J. F., Zhang T. Y. et al. CXCR4 sequences involved in coreceptor determination of human immunodeficiency virus type-1 tropism. Unmasking of activity with M-tropic Env glycoproteins. // J. Biol. Chem. -1998. 273. - P. 15007-15015.

137. Whitcomb J.M., Huang W., Limoli K. et al. Hypersusceptibility to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors in HIV-l: clinical, phenotypic and genotypic correlates. // AIDS 2002. - V. 16. - P. 41-47.

138. White-Scharf M.E., Potts B.J., Smith L.M. et al. Broadly neutralizing monoclonal antibodies to the V3 region of HIV-l can be elicited by peptide immunization. // Virology 1993. - V.192. - P. 197-206.

139. Willey R.L., Rutledge R.A., Dias S. et al. Identification of conserved and divergent domains within the envelope gene of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. -V.83.-P. 5038-5042.

140. Winters M.A., Merigan T.C. Variants other than aspartic acid at codon 69 of the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase gene affect susceptibility to nuleoside analogs. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. -V.45.-P. 2276-2279.

141. Wyatt R., Sodroski J. The HIV-1 envelope glycoproteins : fusogens, antigens and immunogens. // Science 1998. - V.280. - P. 1884-1888.

142. Zack J.A., Haislip A.M., Krogstad P., Chen I. Incompletely reverse-transcribed human immunodeficiency virus type 1 genomes in quiescent cells can function as intermediates in the retroviral life cycle. // J. Virol. 1992. — V.66.-P. 1717-1725.

143. Zhang D., Caliendo A.M.^-Eron J J. et al. Resistance to 2',3'-dideoxycytidine conferred by a mutation in codon 65 of the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. - V.38. - P. 282-287.

Информация о работе

Пазилин, Алексей Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изучение закономерностей эволюции гипервариабельных и консервативных участков генома ВИЧ-1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы