Изучение взаимодействия токсинов яда кобры Naja oxiana с мембранами методом ЯМР спектроскопии

Лесовой, Дмитрий Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение взаимодействия токсинов яда кобры Naja oxiana с мембранами методом ЯМР спектроскопии
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия токсинов яда кобры Naja oxiana с мембранами методом ЯМР спектроскопии"

на правах рукописи УДК 577.322.5

Лесовон Дмитрий Михайлович

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТОКСИНОВ ЯДА КОБРЫ Naja oxiana С МЕМБРАНАМИ МЕТОДОМ ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2006

Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и 10. А. Овчинникова Российской академии наук, на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ).

Научный руководитель:

Доктор химических наук, заведующий Арсеньев Александр Сергеевич

лаборатории структурной биологии ИБХ РАН

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Шайтан Константин Вольдемарович

профессор МГУ

доктор химических наук,

профессор МИТХТ Каплун Александр Петрович

ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Ведущая организация: Федерального агентства по

здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится " 20 " декабря 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу. 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408-57-00,408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан" 18 " ноября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент

^—---

Брагин В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследований

Мембраны играют ключевую роль как в структурной организации, так и в функционировашш всех клеток. Функционирование биомембран контролируется как их белковыми, так и липндными составляющими, преимущественно фосфолипндамн. Получение и интерпретация структурной информации да&г возможность понять связь между взаимодействием компонент мембраны и их функцией.

Среди мембранных белков хорошо известны такие структурные мотивы как i трансмембранные и периферические а-спнрали, Р-бочонкн. В последнее время в качестве

источника новых структурных мотивов, обеспечивающих связывание с мембранами, исследуются р-складчатые полипептиды, в частности, токсины из яда змей. Яд кобры Naja oxiana содержит циготоксины и нейротоксины, обладающие общим структурным мотивом (Рис, 1). В данной работе были изучены цитотоксины I и JI (CTI и CTII) и нейротоксин II (NTII). Суммарное содержание этих токсинов в сухом яде составляет около 40 %. Эти токсины являются небольшими ( ~ 60 аминокислотных остатков) основными белками, так как они содержат 9—12 положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина. Они характеризуются трехпетельной укладкой полипептидной цепи, формируемой тяжами антипараллельной р-структуры, стабилизированной 4-мя дисульфидными связями (Рис. 1). Хотя аминокислотные последовательности и структурный мотив цктотоксинов и нейротоксинов гомологичны, спектры их биологической активности существенно отличаются.

Цитотоксины проявляют гемолитическую и цитотоксическую активности, способны приводить к деполяризации мембран миофибрил. Некоторые цитотоксины проявляют кардиотоксическую активность при малых концентрациях, приводя к увеличению частоты сердцебиения, а при больших концентрациях могут вызывать остановку сердца. Исследуются токсические эффекты цитотоксинов на клетки опухоли. Предполагается, что различие в цитотоксической активности молекул связано не с деталями вторичной структуры белков, а со спецификой взаимодействия боковых цепей аминокислотных остатков с липидами. Было показано, что структура молекул цитотоксинов сохраняется при встраивании в липидное окружение. Связывание цитотоксинов с фосфолипндамн определяет их способность приводить к лизису различных клеток. Предполагалось, что эти эффекты проявляются благодаря способности цитотоксинов взаимодействовать с липидами и биологическими мембранами посредством комбинации как электростатических, так и гидрофобных сил. В экспериментах с модельными липндными мембранами показано, что цитотоксины приводят к слиянию фосфолипидных везикул, изменению термотропных характеристик фосфолипидных мембран, индуцируют фазовое разделение в смесях анионных и цвитгернонных фосфолипидов. Данные исследования привели к делению цитотоксинов на Р- и S- типы, которые различаются присутствием пролина-31 (30) или серина-29 (28) в окончании второй петли (Рис. 1а). Тем не менее веб еще отсутствует понимание связи между способами взаимодействия цитотоксинов с липидами и функцией цитотоксинов в биомембране. Для прояснения этой связи было изучено связывание цитотоксинов CTII и CTI с фосфолипндамн, исследовано влияние цитотоксинов на упаковку фосфолипидов в * составе модельных мембран.

Нейротоксины из яда кобр являются высокоэффективными ингибиторами никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР). Мембранная же активность нейротоксинов, в отличие от цитотоксинов, изучена крайне слабо, хотя предполагается, что и для нейротоксинов мембраносвязанное состояние играет важную роль при взаимодействии с никотиновым ацетилхолиновым рецептором (нАХР). Поэтому представляет интерес детально исследовать взаимодействие нейротоксинов с мембранами, таким образом, получить информацию о мембраноактивном сайте молекулы токсина и его кооперагивности с сайтом, блокирующем нАХР.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ 2flofai;/(i?f6>

а)

10_20 30 40 SO 60

I II1 I

CHI lkckklvplf sktcpagknl cykmfmvaap hvpvkrgcid vcpkssllvk yvccntdkcn cti: lkcnklvpia yktcpegknl cykmemmsdl tipvkrgcid vcpknsllvk yvccntdrcn NTII: lechmqqssq ppttktcsge tncykkwwsd hrgtiiergc gcpkvkpgvn lnccrtdrcn n 1 10 20 30 40 SO 60

CTII CTI NTII

PlIC. 1

а) Аминокислотные последовательности трёх токсинов из яда среднеазиатской кобры Naja oxiana. Для цитотоксинов жирным шрифтом выделены остатки пролина-30 и серина-28 в окончании второй петли. Дисульфидные связи показаны над аминокислотной последовательностью токсинов (вверху) и их пространственные структуры (внизу). Для цитотоксинов номера остатков указаны сверху, а для нейротоксина приведены под аминокислотной последовательностью, б, в, г) Ленточные представления структур молекул токсинов. Жёлтым цветом показаны дисульфидные связи (структуры взяты из PDB-банка: код 1СВ9 для CTII, 1RL5 для С'П и 1NOR для NTII).

При исследовании липид/белковых взаимодействий важно получить структурно-динамическую информацию как о белке в связанном с мембраной состоянии, так и о характеристиках самой липидной мембраны особенно их изменениях вследствие взаимодействия с белком. В ЯМР спектроскопии в качестве модельных мембран используются липидные бислои, так как, обладая большим радиусом кривизны, они наиболее близки по своим характеристикам к биомембранам. При исследовании бислойных модельных мембран всё более широкое применение находит методика анализа 31Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий. С ростом стационарных магнитных полей современных ЯМР спектрометров всё большее значение приобретают эффекты ориентирования молекул фосфолипидов в магнитном поле спектрометра. Для анализа 31Р-ЯМР спектров таких систем необходима разработка эффективных и доступных научному сообществу методов анализа экспериментальных спектров. В диссертации представлены разработанные методики анализа 3|Р-ЯМР спектров, реализованные в виде доступной научному сообществу программы «Р-Р1Т».

Поэтому представляет интерес разработка подходов, позволявших преодолеть данные ограничения и охарактеризовать состояние белка в связанном с бислойной мембраной состоянии. В диссертации описаны предложенные в работе методики применеши ЯМР спектроскопии высокого разрешения для характеристики связанного с лнпндным бислоем состояния белка.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является определение характера изменений в лнпндной бнслойной мембране вследствие взаимодействия с цитотоксинами (CTI и СТО) и нейротокснном (NTII), а так же определение роли мембраносвязанного состояния неПротоксина II на этапе взаимодействия с никотиновым ацетилхолнновым рецептором.

Методы исследования

В диссертационной работе использованы взаимодополняющие методики спектроскопии ЯМР, позволяющие охарактеризовать как индуцированные белком изменения в липидной мембране, так и расположение белков при связывании с липидным бислоем.

Методика "Р-ЯМР спектроскопии широких линий использована для определения изменений в состоянии фосфолипидов вследствие взаимодействия с молекулами исследуемых токсинов.

Расположение молекул нейротоксина II при связывании с бислойной фосфолипидной мембраной определено с помощью гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения, позволившей охарактеризовать изменения химических сдвигов сигналов белка вследствие связывания с мембраной.

Теоретические методики молекулярного моделирования использованы для детализации модели связывания белков с бислойной фосфолипидной мембраной.

Научная новнзна работы

Полученные экспериментальные данные позволяют охарактеризовать различия встраивания токсинов CTI, CTII и NTII в бисяойные фосфолипидные мембраны, роль поверхностной плотности заряда биспоя. Методами 'Н- и 3 Р- ЯМР определены области взаимодействия молекул цитотоксинов с бислойной анионной мембраной. Полученные экспериментальные данные согласуются с теоретическими данными по взаимодействию рассматриваемых токсинов с мембраной. При изучении связывания цитотоксинов с мембранами дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG) показано, что, встраиваясь в мембрану, они влияют как на ориентацию «головок» фосфолипидов, так и могут приводить к изменению еб упругих характеристик. При соотношениях белок/липид выше некоторой пороговой величины происходит разрушение бислойной упаковки липндов в мембране и образование изотропной фазы. Исследованы факторы, определяющие стехиометрию изотропной фазы и условия ее формирования. Таким образом, удалось проанализировать механизм взаимодействия цитотоксинов с их мишеныо - липидным бислоем.

Исследовано влияние свойств липидной мембраны на связывание NTII с бислоем. Методами 'Н-, 31Р- и гетероядерной ЯМР спектроскопии изучено взаимодействие NTII с липвдными мембранами, моделирующими нативное окружение нАХР, состава диолеилфосфатидилхолин(ооРС)/диолеилфосфатидилсерин(ООРЗ)/холестерол(С1ю1)=3:1:1 и DOPS. При связывании NTII с бислоем, как и для случая цитотоксинов, нейротоксин влияет на характер упаковки липидов, однако не приводит к разрушению бислоя. Были получены и проанализированы кривые связывания NTII с липидной мембраной, исследован характер встраивания молекул NTII в бислой. Получены данные, характеризующие изменения в упаковке и расположении фосфолипидов, вследствие связывания NTII. Методами гетероядерной ЯМР спектроскопии высокого разрешения с использованием MN меченного NTII определён сайт связывания молекулы NTII с

липндным бислоем. ЯМР данные по расположению сайта связывания NTII с бпелойной лнпндной мембраной дополнены теоретическими результатами молекулярного моделирования. Полученные данные позволяют предложить «механизм мембранного катализа» при поиске лигандом (NTI1) мембранного рецептора (нАХР): 1) повышение концентрации положительно заряженного NTII у анионной мембраны согласно теории Гуи-Чапмена; 2) формирование «нужной» для связывания с нАХР ориентации NTII на мембране; 3) замена трёхмерного диффузионного поиска в растворе молекулой нейротоксина ацетилхолинового рецептора на более быстрый поиск посредством латеральной диффузии NTII в мембраносвязанном состоянии.

Научная и практическая ценность (

Научная значимость работы определяется новизной и важностью перечисленных выше результатов. Основные направления их практического использования таковы:

• полученные модели взаимодействия трйхпетельных токсинов с бислойными липидными мембранами, а так же роль этого взаимодействия в функционировании токсинов помогают понять молекулярные механизмы взаимодействия нейротоксина с нАХР, влияния цитотоксинов на предотвращение формирования тромбов в кровеносных сосудах (предотвращение сердечного приступа и инсульта), а также токсических эффектов яда кобр на различные клетки, в частности, клетки опухоли;

• разработанные в диссертации методы анализа 3|Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий могут применяться для обработки экспериментальных спектров бислойных липосом с частичной ориентацией фосфолипидов в магнитном поле спектрометра, также позволяя получать дополнительную информацию об упругих характеристиках липидного бислоя;

• использованные в работе подходы по применению гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения могут быть использованы для построения модели связывания белков на биологических мембранах.

Апробация работы

Основные материалы, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на семинарах в «Институте биоорганической химии» им. М. М. Шемякина и 10. А. Овчинникова, представлены па международных конференциях: VIII Международный Семинар по Магнитному Резонансу (Ростов-на-Дону, Россия, 2006), Международном Симпозиуме и Летней Школе «Ядерный Магнитный Резонанс в Конденсированной Материи» (Санкт-Петербург, Россия, 2005 г. и 2006 г.), Зимней Международной Молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2003 г. и 2005 г.). Полученные результаты докладывались также на XIV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Крым, Украина, 2006).

Публикации

Основные результаты диссертации изложены в 3 статьях в реферируемых изданиях и 8 тезисах докладов, представленных на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, трёх глав, включая литературный обзор, результатов и обсуждения, заключения и выводов. Общий объем работы составляет 106 страниц, включая 33 иллюстрации, 1 таблицу и список литературы, содержащий 137 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении обоснована необходимость и актуальность иссяедоваши механизмов мембранной акпшностн цито- и нейротоксинов га яда Naja oxiana. Кратко изложены имеющиеся на сегодняшний день сведен!и о функции шгтотоксннов и нейротоксинов.

Глава 1. Обзор литературы

При исследовании взаимодействия белков с липидами использованы методики "Р-ЯМР спектроскопии широких линий. Существенная часть работы посвящена усовершенствованию методик анализа 31Р-ЯМР спектров фосфолипидов. Поэтому для описания теоретических основ метода, сравнения с другими доступными методиками и программами, характеристики области применения созданной программы и интерпретации полученных результатов литературный обзор диссертационной работы посвящйн методике "Р-ЯМР спектроскопии широких линий в исследовании липид/белковых взаимодействий.

Глава 2. Материалы и методы

Во второй главе приведены использованные классические методики ЯМР и предложенные в работе их модификации, условия работы с исследуемыми веществами, сведения об использованном в работе оборудовании, методах обработки экспериментальных ЯМР данных.

В экспериментах были использованы как нативные, выделенные из яда кобры Naja oxiana, цито- и нейротоксины (полученные в лаборатории рецепции нейропептидов института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и 10. А. Овчинникова РАН д.х.н. 10. Н. Уткиным) так и их 15Ы-меченые аналоги и мутантные формы (полученные в лаборатории инженерии белка института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и 10. А. Овчинникова РАН Я.С. Ермолюком, Е. Н., Люкмановой и А. В. Щукиным). В качестве модельных бислойных липидных мембран бьгли использованы моно- и мультиламеллярные липосомы требуемого липидного состава, для приготовления которых использовались коммерчески доступные липиды (фирма AVANTI) без дополнительной очистки.

Гетероядерные ЯМР спектры получены на ЯМР спектрометре Varían Unity 600 с рабочей частотой на протонах 600 МГц. Одномерные 3|Р- и 'Н- ЯМР спектры получены на спектрометре Bruker DRX500 с рабочей частотой на протонах 500 МГц.

31 Р-ЯМР спектры анализировались с помощью разработанного в диссертации метода, реализованного в виде программы «P-FIT», написанной на языке Mathematica (Wolfram Research). Метод базируется на использовании новой аналитической формулы, учитывающей частичную ориентацию фосфолипидов в магнитном поле, которая позволяет существенно улучшить как точность компьютерного анализа "Р-ЯМР спектров фосфолипидных липосом, так и получать дополнительную информацию о характере упаковки фосфолипидов.

Предложенный в диссертации метод анализа возмущений химических сдвигов NH сигналов белка в 'Н-15Ы HSQC ЯМР спектре при связывании с мембраной основан на получении экспериментальных условий, при которых происходит обмен между двумя состояниями белка. Анализ 'Н- N HSQC ЯМР спектров проводился с использованием программы VNMR (VARIAN). В результате, эта методика предоставила возможность преодолеть ограничения метода ЯМР высокого разрешения на размер используемых модельных мембран при изучении липид/белковых взаимодействий, позволяя использовать бислойные липосомы, наиболее полно моделирующие свойства нативных биомембран.

Методом Монте-Карло исследовалось взаимодействие цитотоксинов с неявно заданной моделью мембраны (программа FANMEM). Методом полноатомной молекулярной динамики исследовалось взаимодействие нейротоксина II с липидным бнслоем (программа GROMACS). Расчеты проводились в сотрудничестве с А. Г. Коншиной и Ю. А. Космпскпм.

Глава 3. Результаты

Связывание токсинов с мембранами. 'Н-ЯМР спектроскопия Для определения диапазона соотношений липид/токсин, в котором молекулы токсинов полностью связаны с липидным бислоем, были получены 'Н-ЯМР спектры водных растворов этих токсинов в температурном диапазоне 30-55°С в присутствии увеличивающегося количества липидных бислойных мембран (мультиламеллярных липосом). Возрастание содержания липидов в образцах приводило к падению интенсивности сигналов вплоть до их полного исчезновения вследствие иммобилизации белка в результате связывания с липидами. 'Н-ЯМР сигналы токсинов исчезают при соотношениях DPPG/CTII=10, DPPG/CTI=4 и DOPS/NTII=6, поэтому в дальнейшей работе использовали соотношения липид/белок больше этих значений для обеспечения условий полного связывания токсинов с липидами.

Следует отметить, что наименьшие соотношения липид/белок, при которых проявляются спектральные линии 'Н-ЯМР токсинов, не зависят от фазового состояния липидного бислоя. Предположительно это связано с определяющим характером электростатических сил на этапе связывания положительно заряженных молекул токсинов с анионными фосфолипидами, так как гидрофобные взаимодействия, в отличие от электростатических, существенно зависят от фазового состояния бислоя. Определяющий характер электростатических сил при связывании так же подтверждается отсутствием связывания рассмотренных токсинов с цвиттерионными фосфолипидными бислоями фосфатидилхолина (PC). Интересно отметить, что соотношения липид/белок, при которых достигается полное связывание катионных молекул токсинов с отрицательно заряженными фосфолипидами, близко к формальным зарядам этих токсинов при рН 5.5: +9 для CTII и +5 для CTI и NTII.

При этом, как показано методами: оптической спектроскопии кругового дихроизма, молекулярного моделирования и ЯМР спектроскопии, стабилизированная четырьмя дисульфидными связями, трбхпетельная укладка полипептидной цепи токсинов сохраняется при взаимодействии с липидной мембраной.

Влияние связывания токсинов на состояние мембраны 31Р-ЯМР спектроскопия С помощью 'Н-ЯМР спектроскопии удалось охарактеризовать условия формирования связанного состояния токсинов с бислойной липидной мембраной. Описанные ниже экспериментальные данные нацелены на получение информации об этом состоянии: характеристики индуцированных токсинами как изменений в липидном бислое, так и его разрушении с формированием изотропной фазы. Так как форма линии 3|Р-ЯМР спектра мембран чувствительна к анизотропным движениям молекул фосфолипидов и, следовательно, к полиморфным переходам между такими состояниями, как бислойные упаковки липидов, гексагональная фаза и изотропная фаза. Такие переходы могут быть индуцированы рассматриваемыми токсинами при взаимодействии с мультиламелляриыми липосомами бислойных мембран DPPG для цитотоксинов и DOPS для нейротоксина (Рис. 2).

Рис. 2

Изменения формы линии 31Р-ЯМР спектров мультиламеллярных липосом DPPG (а, б) и DOPS (в) вследствие связывания токсинов. Соотношение липид/белок (Л/Б) приведено рядом со спектрами, синим цветом показаны составляющие спектров.

В результате аппроксимации экспериментальных спектров, полученных при варьировании температуры и соотношения липид/белок, теоретическими были количественно определены: процентное содержание изотропного сигнала в спектре (ISO), степень деформации (с/а, где с и о- полуоси эллипсоидальной мультиламеллярной липосомы), и анизотропия химического сдвига (СSA) ядер 31Р молекул фосфолипидов в зависимости от температуры (Рис. 3) и соотношения DPPG/токсин (Рис. 4).

Формирование изотропной фазы

Формирование изотропной составляющей спектра происходит вследствие динамического усреднения CSA. Цитотоксины приводят к такому усреднению посредством разрушения бислойной упаковки фосфолипидов с формированием инвертированных комплексов токсин/фосфолипид. На Рис. За показаны температурные зависимости содержания изотропного сигнала в 31Р-ЯМР спектрах DPPG в присутствии цитотоксинов. Как видно из Рис. 3, при соотношении липид/белок=14:1 изотропный сигнал практически не наблюдается для CTI при температуре Т<Тф (где Тф~41°С-температура фазового перехода гелевого состояния в жидкокристаллическое для молекул DPPG). При температурах Т>Тф интенсивность изотропной составляющей для CTI примерно в 10 раз меньше чем для CTII. Для CTII, в отличии от CTI, наблюдается S образная зависимость интенсивности изотропного сигнала (Рис. За). Процентное содержание изотропного сигнала возрастает на 70 % в узком температурном интервале 38-42°С, включающего Тф. Откуда следует, что встраивание цитотоксина II в мембрану и последующее разрушение бислойной упаковки зависит от фазового состояния бислоя и, следовательно, от наличия «свободного пространства» между головками фосфолипидов.

4so,%

.1.75 с/а

1.50 1.25 1.00

dppg/cti=14:1

dppg/cth=14:1

dppg

-i-i

î ? т -г Т т I ♦

- i i a j.

Рис. 3

Температурные зависимости интегральной интенсивности изотропной составляющей 3|Р-ЯМР спектров ЭРРб в присутствии токсинов СТН и СТ1 (а) и деформации мультиламеллярных липосом БРРО магнитным полем спектрометра в присутствии и без токсинов СТН и СТ1 (отношение продольной и поперечной осей эллипсоида вращения с/а) (б). Соотношения ОРРО/токсин приведены на графиках.

30 35 40 45 50

Зависимости интенсивности изотропного сигнала от соотношения липид/белок показаны на Рис. 4а. Значение ISO возрастает практически линейно с уменьшением этого соотношения для СТН при значениях менее 20:1. Аналогичная зависимость наблюдается и для CTI (Рис. 4а). Однако для CTI пороговое значение, при котором начинается рост изотропного сигнала, смещено к меньшим значениям (—15:1). При 50°С изотропная фаза достигает интенсивности 100% при DPPG/CTII -10:1 и DPPG/CTI~6:1 (Рис. 4а). Такое различие может быть связано с отличиями в суммарном заряде этих цитотоксинов (+9 и +5 при рН 5.5 соответственно) и, как следствие, отличиями в стехиометрии комплексов изотропной фазы. Таким образом, изотропная фаза соответствует нейтральным комплексам липид/токсин, стехиометрия которых определяется зарядами молекул токсинов.

Вне зависимости от фазового состояния бислойной мембраны и соотношения DOPS/NTII связывание нейротоксина II не приводило к формированию изотропного сигнала в 31Р-ЯМР спектрах DOPS. Следовательно, NTII не нарушает упаковку фосфолипидного бислоя.

Влияние токсинов па анизотропию химического сдвига

В гелевом состоянии мембран не наблюдалось влияния связывания рассматриваемых токсинов на анизотропию химического сдвига ядра "Р головной группы фосфолипидов. В жидкокристаллическом состоянии липидного бислоя наблюдалось изменение CSA лишь в присутствии CTI и NTII. Связывание СТН не приводило к изменению CSA фосфолипидов. Для иллюстрации отличий CTI и СТН приведены зависимости значении CSA от соотношения липид/токсин для мембран в жидкокристаллическом состоянии (Рис. 46). Видно, что в случае CTI, уменьшение соотношения DPPO/CTI от 100:1 до 10:1 приводит к падению значений CSA на ~7 м. д. В отличии от CTI, значения CSA для всех исследованных соотношений DPPG/CTII как в гелевом так и в жидкокристаллическом состоянии (Рис. 46) (59 ±2 и 37±1м. д. соответственно) совпадают с соответствующими значениями для мембран чистого DPPG.

Наблюдение этого эффекта для CTI я его отсутствие для СТО может свидетельствовать, что только CTI но не СТО способен индуцировать изменения в конформации или движениях «головки» фосфолнпида.

При связывании NTII с бислоями DOPS происходило уменьшение CSA от 49 м.д. до 31 м.д, 5 % DOPS при соотношении DOPS/NTII=14:l и 10 % DOPS при соотношении D0PS/NT1I=7:1 (Рис. 2в). Стехиометрия влияния NTII на DOPS говорит о том, что одна молекула NTII влияет на анизотропию химического сдвига ~1 молекулы DOPS. Формирование компоненты с изменённой анизотропией химического сдвига свидетельствует о возмущении нейротоксином II конформации или движений «головок» DOPS.

а) iso,%

CSA

Рис. 4

Изменения параметров 3|Р-ЯМР спектров

мультиламеллярных липосом ОРРб в присутствия молекул токсинов при 50°С. С помощью компьютерной

__декомпозиции

100 Л/Б экспериментальных

спектров были получены зависимости процентного содержания изотропной фазы (а), анизотропии химического сдвига (б) и параметра степени

деформации мультиламеллярной липосомы магнитным ТОО Л/Б полем спектрометра с/а (в) от соотношения

липид/белок (Л/Б).

20 40 60 80 100 Л/Б

Влияние токсинов на эластичность фосфолнпидного бислоя Молекулы фосфолипидов обладают диамагнитной анизотропией, что приводит к их ориентированию в магнитном поле. Как следствие, форма фосфолипидных липосом в магнитном поле спектрометра претерпевает деформацию из сферической в эллипсоидальную, с направлением продольной оси эллипсоида параллельно магнитному полю. Это приводит к перераспределению интенсивности в анизотропных 31Р-ЯМР спектрах бислойных мембран между высокопольным и низкопольным плечами спектра.

Как видно из Рис. 36 и Рис. 4в шгготоксины влияют на деформацию мультиламеллярных липосом магнитным полем спектрометра. При возрастании количества цитотоксина, связанного с бислоями ОРРО, происходит уменьшение степени

деформации мультиламеллярных липосом с/а. Предполагается, что уменьшение степени деформации липосом происходит из-за возрастания модуля упругости ri бислоёв DPPQ за счёт изменений в бислойной упаковке липидов при взаимодействии с молекулами цитотоксинов. Зависимости деформации липосом DPPQ при связывании с CTI и СТИ от соотношения липид/белок показаны на Рис. 4в. При достижении соотношением DPPG/CTII значений порядка 14:1 деформация липосом не наблюдается, то есть липосомы становятся сферическими (с/а~ 1) (Рис. 4в). Уменьшение соотношения DPPG/цитотоксин приводит к уменьшению значений с/а во всём исследованном температурном диапазоне. Тем не менее даже при значениях DPPG/цитотокснн выше 100:1 кривая не совпадает со значениями с/а для липосом, сформированных из чистого DPPG (Рис. 36). Значения деформации липосом (с/а) при связывании CTI оказываются большими, в сравнении с СТ11, во всём исследованном диапазоне значений DPPG/цитотоксин при Т>Тф (Рис. 4в).

Температурные зависимости значений с/а липосом DPPG в присутствии CTI и CTI1 при выбранном соотношении DPPG/uhtotokchh=14:1 показаны на Рис. 36. Как в гелевом, так и в жидкокристаллическом состоянии мембран CTII предотвращает деформацию мультиламеллярных липосом DPPG в большей степени чем CTI.

Связывание NTI1 с бислоями DOPS в жидкокристаллическом состоянии не приводило к заметному изменению степени деформации липосомы магнитным полем с/а. Следовательно NTII не оказывает существенного влияния на модуль упругости г) бислоёв DOPS.

Вожущение значений химических сдвигов сигналов NTH при связывании с фосфопипидпьш биспоем При последовательном титровании NTII 100 нм моноламеллярными липосомами DOPC/DOPS/Xonecrepon=3:l:l полное связывание (уширение 'H-1SN HSQC ЯМР спектра NTH) было достигнуто при соотношении липид/ЫТН=40:1. При повышении в образце концентрации KCl согласно теории Гуи-Чапмена происходит увеличение экранирования поверхностного заряда бислоя, приводящее к ослаблению электростатического притяжения катионных молекул NTII отрицательно заряженным бислоем состава DOPC/DOPS/XonecTcpo;i=3:1:1. При достижении концентрации 30тМКС1 и более происходило увеличение интенсивностей сигналов 'H-15N HSQC ЯМР спектра, что говорит о возрастании концентрации NTII в растворе за счёт увеличения экранирования заряда анионного DOPS. Выход значений интенсивностей сигналов 'H-15N SHQC ЯМР спектра на плато (соответствующий исчезновению связывания NTII с мембраной) наблюдался при концентрации KCl более 150 тМ. Таким образом, были получены зависимости интенсивностей сигналов нейротоксина от концентрации KCl как основной, так и боковых цепей (Рис. 5).

Для описания зависимостей значений интенсивностей NH сигналов аминокислотных остатков пропорциональных концентрации NTII в растворе от концентрации KCl была использована теоретическая модель Гуи-Чапмена, учитывающая различие положительных зарядов NTII в растворе и мембраносвязанном состоянии. С помощью этой модели удалось получить теоретические аппроксимации экспериментальных кривых связывания NTII с бислоем ООРС/ООР$/Холестерол=3:1:1 в зависимости от концентрации KCl. Для аминокислотных остатков, значения интенсивностей сигналов которых отмечены синим цветом на Рис. 5а, в, как было сказано выше, предполагалась прямая пропорциональность между интенсивностями сигналов NH групп основной цепи и концентрацией NTII в растворе. В качестве примера (Рис. 5д) приведены экспериментальные данные и теоретическая кривая связывания для интенсивности NH сигнала одного из таких аминокислотных остатков. Таким образом, были получены усреднённые (по набору аминокислотных остатков) значения эффективных зарядов белка в растворе и на мембране 5.4 ± 0.5 и 4.7 ± 0.5 соответственно, которые оказались близки к формальному заряду +5 молекулы NT1I при рН=5.5.

а) б)

NTII+DOPC/DOPS/Chol(3:l:l) NTH

KCl, мМ KCl, мМ

в) Основная цепь г) Боковые цепи

. CnTIIb растворе, мМ

д) 31--

40 100 150 Kcl, мМ

Рис. 5

Падение интенсивностей сигналов NH основной цепи (а) аминокислотных остатков в 'Н-,5N HSQC спектрах молекулы NTII в частично связанном с мембраной состоянии (лииид/ЫТ11=40:1) в сравнении с аналогичной зависимостью в отсутствии липидных мембран (б). Значения интенсивностей нормированы на интенсивности сигналов в спектре NTII в не связанном с мембраной состоянии при 230 мМ KCl.

Зависимость значения интенсивностей NH сигналов основной цепи (в) и боковых цепей (г) от номера аминокислотного остатка, д) Экспериментальная зависимость (синий цвет) интенсивности NH сигнала аминокислотного остатка основной группы от концентрации KCl и её теоретическая аппроксимация по модели Гуи-Чапмена (чёрный цвет).

Рассмотрим более детально значения относительных (с нормировкой на значения интенсивносгей сигналов NTII в раствора} интенсивносгей сигналов NH основной цепи в диапазоне 73-S3 мМ KCI (Рис. 5а). Наблюдается разделение значений интенсивносгей на две группы (на Рнс. 5а обозначенные синим и красным цветами). Для сравнения приведены интенсивности сигналов NTII в зависимости от концентрации КС1 в отсутствии липосом, где как видно из Рис. 56, подобного разделения не наблюдалось. Красным цветом отмечены значения интенсивносгей для остатков Glu2, Cjs3, GIn6, Cysl7. Asn22, GIy41, Asn50, Arg5S. На Рис. 5 приведены средние (в диапазоне 73-S3 мМ KCI) значения интенсивносгей сигналов NH для основной (в) и боковых (г) цепей (жёлтым цветом отмечены значения интенсивностей сигналов NH боковых цепей остатков б и 50). В диапазоне концентраций К.С1 (73-83 мМ) происходит обмен между состояниями NTH, связанным с мембраной, и NTII в растворе.

В связанном с мембраной (моноламеллярная липосома 100 /га) состоянии скорость поперечной релаксации Тг NTII много больше, чем для NTII в растворе. Для случая Tj скшшкс^Тз свободное теоретически и экспериментально показано, что интенсивность сигнала белка уменьшается при увеличении разницы химических сдвигов между этими двумя состояниями. Таким образом, для аминокислотных остатков (помеченных на Рис. 5в красным и Рис. 5г жёлтым цветом) происходит наибольшее изменение химического сдвига сигналов NH при связывании токсина с мембраной.

Известно, что рядом с анионной мембраной происходит уменьшение диэлектрической проницаемости среды, локальное уменьшение рН и изменение концентрации ионов соли. Варьирование этих параметров растворителя показало незначительные средние изменения химических сдвигов NH сигналов остатков Glu2, Cys3, Glnó, Cysl7, Asn22, Gly41,Arg5S в то время как изменения химических сдвигов NH основной и боковой цепи Asn50 в семь раз превосходили средние значения. Таким образом наиболее вероятно, что Asn50 не взаимодействует напрямую с липидами.

На Рис. 6 показано расположение NH групп аминокислотных остатков Glu2, Cys3, Glnó, Cysl7, Asn22, Gly41, Arg58 на структуре NTII. Из Рис. 6 видна их пространственная локализация, что указывает на взаимодействие NTII с мембраной этой областью (Рис. 6).

Рнс. б

Модель взаимодействия NTII с поверхностью мембраны. Обозначены аминокислотные остатки, NH сигналы которых претерпевают наибольшее изменение значения химического сдвига при связывании с мембраной.

Влияние аминокислотных замен на расположение молекулы NTII на мембране Для изучения роли сайта связывания NT1I с мембраной была получена мутантная форма NTII с двумя аминокислотными заменами Glu2GIn и Asp57Asn в сайте связывания молекулы с мембраной (Рис. 6). Исследование влияния этих замен (увеличивающей положительный заряд белка) на активность NTII методом конкурентного ингибирования

связывания !251-а-бунгаротокснна с иАХР в мембранах из электрического органа ската Torpedo califormca показало, что активность мугантной формы NTII в сравнении с иативным NTH уменьшилась в 3 раза. Другие замены аминокислотных остатков в молекулах нейротоксинов не затрагивающие сайта связывания нейротоксинов с нАХР и приводящие к увеличению заряда не меняют либо повышают активность нейротоксинов по ингибированию нАХР. Аналогично эксперименту с нативным NTII с помощью метода гетероядерного ЯМР, используя NTII с заменами Glu2GIn и Asp57Asn, были получены зависимости интенсивностей NH сигналов аминокислотных остатков в условиях обмена между связанным с мембраной и свободным состояниями мугантной формы NTII.

а) Основная цепь

б)

Боковые цепи

10 20 30 40 50 60 аминокислотный остаток

0 10 20 30 40 50 60 аминокислотный остаток

Рис. 7

Зависимость значения интенсивностей 'l-I-l5N сигналов в IISQC спектрах мутантной формы NTII основной цепи (а) и боковых цепей (б) от номера аминокислотного остатка. Значения интенсивностей нормированы на интенсивности сигналов в спектре мутантной формы NTII в не связанном с мембраной состоянии. Аминокислотные остатки обозначены аналогично Рис. 5в, г.

В отличие от нативного NTII, для мутантной формы NTII анализ полученных экспериментальных данных показал отсутствие существенных различий в поведении химических сдвигов NH аминокислотных остатков при взаимодействии с мембраной DOPC/DOPS/ХолестершрЗ: 1:1 (Рис. 7а, б). Это говорит об отсутствии предпочтительного сайта связывания с липидным бислоем и, как следствие, преобладающей ориентации мутантной формы NTII на мембране, что в сумме с данными по ухудшению ингибирования нАХР подтверждает предположение о роли сайта связывания нативного NTII в ограничении ориентационной свободы и формировании "предпочтительной" для взаимодействия с нАХР ориентации молекулы NTII (Рис. 6).

Взаимодействие токсинов с мембраной: молекулярное моделирование С помощью метода Монте-Карло для взаимодействия цитотоксинов с неявно заданной моделью мембраны было определено расположение молекул на мембране. Как CTI1, так и CTI проникают в мембрану гидрофобными окончаниями трйх петель: аминокислотные остатки 5-10 (петля I), 24-36 (петля II) и 46-50 (петля III) (Рис. 8а, б, в),что хорошо согласуется с полученными ранее данными спектроскопических исследований СТИ и CTI в модельных мембранах.

а)

CTII LKClitTOJ

СП:

¿bcPAGWJL

TliYp

LKCIgp.'PK. V^jrCPEGWlL _

NTII: lechi.'qjsso ppttktcsge tucykktcisd hrgtiiergc 1 10 20 30 40

:cid vc65shxi1 yvccittdkc;!

ID VCKilSLL'.fi YVCCHTDRCIl

CTII

gcpkvkpgvij lhccrtdrch ii 50 60

CTI

ч NTII

гидрофобный потенциал гидрофильный

о>

гидрофобный

мембрана

элоктростзтичсскии потенциал отрицательный положительный

—

Рис. 8

Аминокислотные последовательности (а) и пространственные структуры CTI (б), CTII (в) и NTII (г) с распределением электростатического (Еэл) потенциала и молекулярного гидрофобного потенциала. Дисульфидные связи представлены над последовательностью. Заряженные аминокислотные остатки окружающие петли цитотоксинов обозначены синим цветом и заключены в прямоугольники. Гидрофобные остатки в окончании петель цитотоксинов обозначены зеленым цветом. Структуры белков даны в ленточном представлении и соответствуют состояниям с наименьшей энергией, найденным с помощью молекулярного моделирования. Все виды даны при одном расположении молекул токсинов. Граница раздела мембрана-раствор обозначена горизонтальной линией. Показана молекула DOPS в связанном с NTII состоянии, обозначены аминокислотные остатки NTII формирующие водородные связи с DOPS (г).

С другой стороны, одинаковые модели связывания, полученные для CTI и CTII в неявно заданной мембране, не позволяют охарактеризовать тонкие отличия в поведении этих токсинов на границе бислой-вода. Для решения данной задачи была произведена оценка различий «свободной энергии» (ДД G) между мсмбранно-связанным и водным состояниями CTI и CTII. В данном случае термин «энергия» используется для суммы внутренней энергии белка и энергии, возникающей вследствие взаимодействия белка с гетерогенной средой, моделирующей мембрану {Есольватащи), где энергия самой мембраны предполагается постоянной. С помощью анализа низкоэнергетических состояний, найденных с помощью метода информационного поиска Монтс Карло, были найдены значения ДД G -6.8 и -14.1 Ккал/моль (1 кал=4.184 Дж) для CTI и CTII соответственно. Следовательно СТН связывается с мембраной более сильно, чем CTI, хотя их модели встраивания очень похожи.

Как было показано выше, при взаимодействии NTII с липидным бислоем ООРС/ООР8/Холестерол-3:1:1, моделирующим нативное липидное окружение нАХР, решающую роль играет электростатическое взаимодействие с анионным фосфолипидом DOPS. Для детализации описания этого взаимодействия были проведены теоретические расч&гы полноатомной молекулярной динамики при взаимодействии молекул NTII с фосфолипидным бислоем DOPS. Анализ данных показал согласованность теоретической модели расположения NTII на липидном бислое с полученной экспериментально (Рис. 8г). Также в результате теоретического моделирования был определен предпочтительный сайт связывания нейротоксином II головками фосфолипидов DOPS (Рис. 8г). Молекула NTII участвует в связывании одной молекулы DOPS, что как было показано методом 3|Р-ЯМР спектроскопии, приводит к изменению анизотропии химического сдвига ядра "Р фосфатного фрагмента DOPS. При связывании фосфатидилсерина происходит образование водородных связей с аминокислотными остатками Avg58, Asp57 и Glu2 молекулы NTII.

Взаимодействие трёхпетельных токсинов с липидпой мембраной: комбинированное рассмотрение Принимая во внимание экспериментальные результаты по взаимодействию трёхпетельных токсинов с липидными мембранами и рассматривая их молекулярные свойства, полученные с помощью методов молекулярного моделирования, возникает следующая картина взаимодействия токсинов с мембраной (Рис. 9).

Связывание катионных токсинов с отрицательно заряженной мембраной происходит вследствие электростатического взаимодействия, приводящего к связыванию белков с поверхностью мембраны (Рис. 96, в переход 1—>2). На схеме (Рис. 96, в состояние 2) представлено жидкокристаллическое состояние мембраны, хотя переход 1—»2 также реализуется и для гелевого состояния линидного бислоя. Предполагается, что этот процесс слабо зависит от фазового состояния мембраны и главным образом определяется электростатическим зарядом белка и поверхностной плотностью заряда мембраны. Так, для электростатически нейтрального бислоя связывания всех токсинов не наблюдалось.

Белок электростатически иммобилизованный на поверхности липид/вода далее встраивается в мембрану гидрофобно. Это положение справедливо для молекул цитотоксинов и анионных мембран DPPO в жидкокристаллическом состоянии. Молекулы нейротоксина II, как было показано выше, не встраиваются в гидрофобную область мембраны взаимодействуя лишь с областью полярных «головок» липидного бислоя. Основным фактором, обеспечивающим гидрофобное встраивание цитотоксинов является наличие в их молекулах единой гидрофобной области, сформированной тремя петлями молекулы (Рис. 86, в).

Сайты взаимодействия токсинов с мембраной

неиротоксина

Механизм связывания цитотоксинов с мембраной

б)

Механизм связывания неиротоксина с мембраной

а) Молекулы СТ1, СТН и 1ЧТП, совмещенные по основной цепи, б) Схематичное представление моделей связывания трехпетсльных цитотоксинов с липидными мембранами. На рисунке представлен лишь верхний монослой бислойной мембраны. Количество молекул липидов, представленных на рисунке не соответствует стехиометрии взаимодействия, обсуждаемой в тексте, в) Предполагаемый "Мембранно-опосредованный путь" поиска нейротоксином И мембранного рецептора нАХР. N111 из межклеточного раствора (1) к поверхности клеточной мембраны (2) и достижения нАХР (3) посредством латеральной диффузии.

Глубина их встраивания в мембрану ограничена гидрофильным поясом, сформированным положительно заряженными остатками лизина и аргинина. Процесс встраивания описывается константой гидрофобного связывания к,. Эта константа зависит от гидрофобного потенциала поверхности молекулы белка, встроенного в гидрофобную область мембраны. Поэтому равновесие более смещено к состоянию 3 (Рис. 96) для СТИ в сравнении с CTI. Как результат, влияние CTI на модуль упругости бислоя DPPG и, следовательно, деформацию липосом в магнитном поле менее значительно в сравнении с CTII. Вследствие отсутствия протяженных гидрофобных участков поверхности молекул NTII взаимодействует лишь с полярной областью «головок» липндной мембраны. Следовательно, влияние NTII на модуль упругости бислоя и степень деформации липосом в магнитном поле мало в сравнении с эффектами цитотоксинов.

Накопление цитотоксинов во встроенном в гидрофобную область мембраны состоянии 3 приводит к достижению критической концентрации белка, выше которой происходит разрушение бислойной упаковки липидов. Формируется изотропная фаза (Рис. 96, состояние 4) образование которой описывается константой равновесия ¿посреди факторов, влияющих на као, можно указать способность пептидов изменять кривизну липидной поверхности. Это свойство зависит от расположения молекулы белка относительно липидов и от организации различных мембранных фосфолипидов в соответствии с их «формой молекулы». Вероятно эта способность зависит от комбинации электростатических и гидрофобных свойств молекул цитотоксинов, приводящих к формированию электрически нейтральных стехиометричных комплексов молекул токсинов с фосфолипидами.

Переходы между состояниями, представленными на Рис. 9, отражаются в виде следующих изменений формы линии Р-ЯМР спектра: если состояние 1 (Рис. 96, в) соответствует 31Р-ЯМР спектру мультиламеллярных липосом в отсутствии токсина, то состояние 2 (Рис. 96, в) преимущественно характеризуется изменениями значений CSA. Это состояние наблюдается в чистом виде лишь для NTII, но не для CTI и CTII. Его вклад практически отсутствует для CTII, связанного с DPPG в жидкокристаллической фазе. Состояние 3 (Рис. 96) характеризуется нсвозмущённым значением CSA. Тем не менее вследствие гидрофобного встраивания происходит изменение характера упаковки липидов приводящее к сильным изменениям характеристики упругости мембраны и, следовательно, приводящее к изменению степени деформации липосом в магнитном поле с/а. Это состояние в случае CTII приводило к падению значений с/а до 1, соответствующей недеформированным (сферическим) липосомам. Состояние 4 (Рис. 96) представлено в 31Р-ЯМР спектре только в виде изотропного сигнала. Это состояние наблюдалось для обоих цитотоксинов в отличие от нейротоксина.

Биологическая роль мембраносвязанного состояния токсинов

Описанные мсмбраносвязывающие свойства токсинов из яда кобры Naja oxiana связаны с их биологической активностью. Связывание цитотоксинов с мембраной приводит к изменению поверхностной плотности заряда липидного бислоя и нарушениям его бислойной упаковки (Рис. 96). Эти эффекты способствуют действию фосфолипаз. Появление лизофосфолипидов в комбинации со способностью цитотоксинов разрушать бислойную упаковку мембраны приводит к разрушению клеточных биомембран.

Для NTII, блокирующего нАХР, в диссертационной работе предложен механизм «мембранного катализа»:

1) Первоначально повышается примембранная концентрация NTII под действием электростатических взаимодействий между анионным бислоем и катионным NTI1 (Рис. 9в, переход 1 -> 2). Таким образом, происходит электростатическая аккумуляция NTII на поверхности мембраны.

2) Второй шаг механизма «.мембранного катализа» происходит в мембраносвязанном состоянии лнпшда. За счёт связывания с мембраной нейротокспна II происходит ограничение орнентацнонной свободы с позиционированием окончания второй петли молекулы в состоянии, доступном для ингибнровання нАХР (Рис. 9в, состояние 2). Расположение NTII на поверхности бнелоя и селективность к мембранному окружению рецептора обеспечиваются специфичностью взаимодействия головных групп фосфолишщов с боковыми цепями аминокислотных остатков сайта Я нейротокспна.

3) Преимуществом третьего шага механизма «мембранного катализа» является замена пространственного диффузионного поиска рецептора лигандом в растворе на более быстрый двумерный латеральный диффузионный поиск в мембраносвязанном состоянии, из которого происходит первичное распознавание лиганда рецептором (Рис. 9в переход 2-»3). Следовательно, происходит выигрыш за счёт понижения размерности диффузионного поиска рецептора нАХР лигандом NTII с трёхмерной диффузии в растворе на двумерную в мембраносвязанном состоянии.

Заключение

Разработан метод анализа "Р-ЯМР спектров широких линий, имеющий ряд преимуществ при анализе экспериментальных спектров фосфолипидных дисперсий, реализованный в виде программы «P-FIT». Получена новая аналитическая формула формы линии 31Р-ЯМР спектра, учитывающая частичную ориентацию фосфолипидов в магнитном поле, которая позволяет существенно улучшить как точность компьютерного анализа 31Р-ЯМР спектров фосфолипидных липосом, так и получать дополнительную информацию о характере упаковки фосфолипидов. Программой может производиться декомпозиция 3|Р-ЯМР спектров с произвольным количеством перекрывающихся сигналов с анализом их параметров. В данной работе продемонстрировано практическое использование данной программы при анализе формы линии 31Р-ЯМР спектров липосом фосфолипидов в присутствии и без белков. Программа написана на языке Mathematica (Wolfram Research), доступна научному сообществу, и на данный момент используется в ряде других лабораторий.

Разработан метод гетероядерной ЯМР спектроскопии высокого разрешения, позволяющий анализировать возмущения значений химических сдвигов сигналов белка в результате его связывания с липидным бислоем. Данный подход основан на получении экспериментальных условий, при которых происходит обмен менаду двумя состояниями белка: свободным и связанным - с бислойной липидной мембраной. В результате, эта методика дай' возможность преодолеть ограничения метода ЯМР высокого разрешения на размер используемых модельных мембран при изучении липид/белковых взаимодействий, позволяя использовать моноламеллярные бислойные липосомы, наиболее полно моделирующие свойства нативных биомембраи.

цнтотоксинов. Таким образом, удалось раскрыть механизм взаимодействия цнтотокеннов с их мишеныо - лнпндным бнелоем (Рис. 96). Определена возможная роль связывания NTII с мембраной и ориентация токсина относительно лнпидного бислоя на этапе связывания с нАХР (Рис. 9в). Полученные данные дают основание предположить «механизм мембранного катализа» при поиске нейротоксином II мембранного никотинового ацетилхолинового рецептора.

Выводы:

1) Разработана программа для анализа экспериментальных 3|Р-ЯМР спектров фосфолипидных дисперсий с использованием аналитического выражения формы линии теоретического спектра, учитывающего эффекты ориентации молекул липидов в магнитном поле спектрометра. Это позволяет повысить как точность аппроксимации экспериментального спектра теоретическим так и получить дополнительную информацию о свойствах мембраны.

2) Разработана методика использования ЯМР спектроскопии высокого разрешения, позволяющая охарактеризовать изменения химических сдвигов сигналов белка при связывании с липидным бислоем.

3) Определено влияние молекул токсинов на упаковку липидов в составе бислойной мембраны и условия ей разрушения. Определены сайты связывания токсинов с мембраной. Получены модели взаимодействия цитотоксинов CTI, CTII и нейротоксина NTII с липидным бислоем.

4) Предложен механизм мембранного катализа при связывании нейротоксина II с никотиновым ацетилхолиновым рецептором.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Д. М. Лесовой, Э. В. Бочаров, П. В. Дубовский, М. А. Дубинный, Е. Н. Люкманова, А.В. Щукин, Ю.Н. Уткин, Д А. Долгих, А.С. Арсеньев «Разные биологические функции общего структурного мотива токсинов яда кобры Naja oxiana» // VIII Международный Семинар по Магнитному Резонансу (Спектроскопия, Томография и Экология), Ростов-на-Дону, Россия, 11-16 сентября 2006, Материалы Семинара, с. 66.

2. D. М. Lesovoy, Е. V. Bocharov, Е. N. Lyukmanova, А. V. Schukin, Е. N. Tkach and A. S. Arseniev «Characterisation of protein/lipid bilayer interaction by liquid NMR technique» // International Symposium and Summer School "Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter" 3rd Meeting "NMR in Heterogeneous Systems", Saint Petersburg, Russia, 9-13 July 2006, Book of Abstracts, p.77.

3. D. M. Lesovoy, E, V, Bocharov, E. N. Lyukmanova, E. N. Tkach, A. V. Schukin, I. E. Kasheverov, V. I. Tsetlin, D. A. Dolgikh, A. S. Arseniev «Interaction of Neurotoxin II with lipid bilayer mimicking native membrane» // XIV International conference "New information technologies in medicine, biology, pharmacology and ecology", Crimea, Ukraine 31 May-9 June 2006, Book of Abstracts, p.281-283.

4. M. A. Dubinnyi, D. M. Lesovoy, P. V. Dubovskii, V.V. Chupin, A.S. Arseniev « Modeling of 31P-NMR spectra of magnetically oriented phospholipid liposomes: A new analytical solution» // Solid State Nuclear Magnetic Resonance, 29(4), 2006 Jun, p. 305-11.

5. Д. M. Лесовой, M. А. Дубинный, П. В. Дубовский «Анализ 3|Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий с помощью программы «Р-FIT» // XVII зимняя международная молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" секция "Физико-химические методы исследования биологически активных соединений", Москва, 7-10 февраля 2005, Тезисы докладов и стендовых сообщений с. 69.

6. P. V. Dubovskii, D. М. Lesovoy, М. A. Dubinnyi, A. G. Konshina, Y. N. Utkin, R. G. Efremov, A. S. Arseniev «Interaction of three-finger toxins with phospholipid membranes:

comparison of S- and P-type cytotoxins» ¡1 The Biochemical journal. 3S7(Pt 3). 2005 May 1. p. S07-S15.

7. E. V. Bocharov. A. G. Sobol, К. V. Pavlov, S. A. Krachkovskii. A. V. Zhuravlyova, D. M. Lesovoy, E. N. Lyukmanova, A. V. Schukin, Y. S. Ermolyuk, E. N. Tkach, A. S. Aiseniev «Functional dynamics of proteins revealed by NMR study of L7/L12, TGF- 33, bamase and neurotoxin II» // International Symposium and Summer School "Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter" 2nd Meeting "NMR in Heterogeneous Systems", Saint Petersburg, Russia, 11-15 July 2005, Book of Abstracts, p.33,

S. Д. M. Лесовой, П. В. Дубовский «Взаимодействия токсинов из яда кобры Naja oxiana с фосфолипндными мембранами» // XV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии н биотехнологии" секция "Физико-химические методы исследования биологически активных соединений", Москва, 10-14 февраля 2003, Тезисы докладов и стендовых сообщений с. 46.

9. P. V. Dubovskii, D. М. Lesovoy, М. A. Dubinnyi, Y. N. Utkin, A. S. Arseniev « Interaction of the P-type cardiotoxin with phospholipid membranes» // European journal of biochemistry, 270(9), 2003 May, p. 2038-2046.

10. Д. M. Лесовой, П. В. Дубовский, А. С. Арсеньев «Изучение методом 31Р-ЯМР взаимодействия кардиотоксина с модельными фосфолипндными мембранами» // XLIV Юбилейная научная конференция МФТИ посвященная 50-летию создания МФТИ "Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук", Москва-Долгопрудный 23-30 ноября 2001, Труды Конференции часть IV, с. 37.

11. Д. М. Лесовой, М. Н. Жмак, Е. Н. Люкманова, П. В. Дубовский «Взаимодействие аналога пептида слияния из гемагглютинина вируса гриппа с фосфолипндными липосомами: изучение методом 31Р-ЯМР» // Успехи современного естествознания, номер 10,2004, с. 38-39.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Лесовой, Дмитрий Михайлович

Список использованных сокращений.

1 Введение.

1.1 Актуальность темы исследований.

1.2 Цель и задачи исследования.

1.3 Научная новизна работы.

1.4 Научная и практическая ценность.

1.5 Выбор темы литературного обзора.

2 31Р-ЯМР спектроскопия широких линий в исследовании липид/белковых взаимодействий (обзор литературы).

2.1 Область применения методики.

2.1.1 Возможности метода в определении характера упаковки липидов.

2.1.1.1 Детектирование фазового состояния бислоя.

2.1.1.2 Действие белков на бислой - возмущения в структуре бислоя.

2.1.1.3 Исследования небислойных упаковок липидов.

2.1.2 Используемые мембранные системы.

2.1.2.1 Реконструированные мембраны.

2.1.2.2 Биологические мембраны.

2.2 Теоретические аспекты 31Р-ЯМР фосфолипидов.

2.3 Примеры применения 31Р-ЯМР спектроскопии в исследованиях липид/белковых взаимодействий.

2.4 Анализ и обработка 31Р-ЯМР спектров модельных фосфолипидных мембран.

2.4.1 Методики обработки 3,Р-ЯМР спектров фосфолипидных дисперсий.

2.4.1.1 Метод «Первого спектрального момента».

2.4.1.2 Депакинг.

2.4.1.3 Аппроксимация экспериментального спектра теоретическим

2.4.2 Возможности доступных программ для анализа формы линии

3,Р-ЯМР спектров.

3 Материалы и методы.

3.1 Использованные препараты и способы приготовления образцов.

3.2 Получение и анализ ЯМР спектров.

3.3 Использованные методики молекулярного моделирования.

3.4 Расчёт электростатических и гидрофобных свойств молекул токсинов

3.5 Измерение активности нейротоксина II.

4 Результаты и обсуждения.

4.1 Связывание токсинов с мембранами. ^-ЯМР спектроскопия.

4.2 Влияние связывания токсинов на состояние мембраны: 31Р-ЯМР спектроскопия.

4.2.1 Формирование изотропной фазы.

4.2.2 Влияние токсинов на анизотропию химического сдвига фосфолипидов.

4.2.3 Влияние токсинов на эластичность фосфолипидного бислоя.

4.3 Топология взаимодействия NTII с фосфолипидным бислоем.

4.3.1 Влияние аминокислотных замен на расположение молекулы NTII на мембране.

4.4 Электростатические свойства молекул токсинов.

4.5 Детализация топологии взаимодействия токсинов с мембраной.

4.5 Распределение полярных и гидрофобных свойств на доступной поверхности токсинов.

4.6 Взаимодействие трёхпетельных токсинов с липидной мембраной: комбинированное рассмотрение.

4.6.1 Биологическая роль мембраносвязанного состояния токсинов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение взаимодействия токсинов яда кобры Naja oxiana с мембранами методом ЯМР спектроскопии"

1.1 Актуальность темы исследований

Мембраны играют ключевую роль в структурной организации всех живых клеток. Функционирование биомембран контролируется как их белковыми, так и липидными составляющими, преимущественно фосфолипидами. Получение и интерпретация структурной информации о липид-белковых системах даёт возможность понять связь между взаимодействием компонент мембраны и их функцией [1,2].

Среди мембранных белков хорошо известны такие структурные мотивы как трансмембранные и периферические а-спирали, Р-бочонки. В последнее время в качестве источника новых структурных мотивов, обеспечивающих связывание с мембранами, исследуются Р-складчатые полипептиды, в частности, токсины из яда змей. Яд кобры Naja oxiana содержит как цитотоксины так и нейротоксины, обладающие общим структурным мотивом (Рис. 1). Суммарное содержание этих токсинов в сухом яде составляет около 40 % [3]. Токсины являются небольшими ( ~ 60 аминокислотных остатков) основными белками, так как они содержат 9-12 положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина. Они характеризуются трёхпетельной укладкой полипептидной цепи, формируемой тяжами антипараллельной Р-структуры, стабилизированной 4-мя дисульфидными связями (Рис. 1а-в) [4-7]. Хотя аминокислотные последовательности и структурный мотив цитотоксинов и нейротоксинов гомологичны, спектры их биологической активности существенно отличаются [8-12].

Цитотоксины проявляют гемолитическую и цитотоксическую активности, способны приводить к деполяризации мембран миофибрилл [8, 13, 14]. Некоторые цитотоксины проявляют кардиотоксическую активность при малых концентрациях, приводя к увеличению частоты сердцебиения, а при больших концентрациях могут вызывать остановку сердца [15].

Исследуются токсические эффекты цитотоксинов на клетки опухоли [1620]. Предполагается, что различие в цитотоксической активности молекул связано не с деталями вторичной структуры белков, а со спецификой взаимодействия боковых цепей аминокислотных остатков с липидами [20], так как было показано, что структура молекул цитотоксинов сохраняется при встраивании в липидное окружение [5, 20-23]. Связывание цитотоксинов с фосфолипидами определяет их способность приводить к лизису различных клеток [8, 16, 24, 25]. Предполагается, что эти эффекты обусловлены способностью цитотоксинов взаимодействовать с липидами и биологическими мембранами посредством комбинации как электростатических так и гидрофобных сил [ 26 ]. В экспериментах с модельными липидными мембранами показано, что цитотоксины приводят к слиянию фосфолипидных везикул [27-30], изменению термотропных характеристик фосфолипидных мембран [31], индуцируют фазовое разделение в смесях анионных и цвиттерионных фосфолипидов [ 32 ]. Данные исследования привели к делению цитотоксинов (Рис. 1а, б) на Р- и S-типы, которые различаются присутствием аминокислотных остатков пролина-31(30) или серина-29(28) в окончании второй петли [33]. Тем не менее всё ещё отсутствует понимание связи между способами взаимодействия цитотоксинов с липидами и функцией цитотоксинов в биомембране. Для прояснения этой связи было изучено связывание цитотоксинов CTII и CTI с фосфолипидами, исследовано влияние цитотоксинов на упаковку фосфолипидов в составе модельных мембран.

CTII

CTI

NTII

Рис. 1

Ленточные представления структуры CTII (a), CTI (б) и NTII (в) молекул токсинов. Жёлтым цветом показаны дисульфидные связи (структуры взяты из PDB-баика: код 1СВ9 для CTII, 1RL5 для CTI и 1 NOR для NTII).

Для получения более полной информации о взаимодействии трехпетельных токсинов с липидными мембранами важно рассмотреть структурно сходные с цитотоксинами белки, отличающиеся по гидрофобным свойствам и заряду. Как было сказано выше NTII (Рис. 1в) обладает сходной трёхпетельной структурой, но отличается от цитотоксинов спектром активности. Нейротоксины из яда кобр являются высокоэффективными ингибиторами никотинового ацетилхолинового рецептора [34, 35]. Мембранная же активность нейротоксинов, в отличие от цитотоксинов, изучена крайне слабо, хотя предполагается, что и для нейротоксинов мембраносвязанное состояние играет важную роль при взаимодействии с нАХР [36, 37]. Поэтому представляет интерес детально исследовать взаимодействие нейротоксинов с мембранами и, таким образом, получить информацию о мембраноактивном сайте молекулы нейротоксина и его кооперативное™ с сайтом, блокирующем нАХР.

11 методика анализа Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий [40-46]. С ростом стационарных магнитных полей современных

ЯМР спектрометров все большее значение приобретают эффекты ориентирования молекул фосфолипидов в магнитном поле спектрометра

30, 47-52]. Для анализа 31Р-ЯМР спектров таких систем необходима разработка эффективных и доступных научному сообществу методов анализа экспериментальных спектров. В диссертации представлены разработанные

11 методики анализа Р-ЯМР спектров фосфолипидных липосом реализованные в виде доступной научному сообществу программы «Р-FIT».

При ЯМР исследованиях белков, связанных с бислойной мембраной, по причине большого размера бислойных мембранных систем и, как следствие, замедления вращательной диффузии белка классические ЯМР методики высокого разрешения неприменимы из-за уширения ЯМР сигналов в спектре белка. Поэтому представляет интерес разработка подходов, позволяющих преодолеть данные ограничения и охарактеризовать состояние белка в связанном с бислойной мембраной состоянии [38, 39]. В диссертации описана предложенная в работе методика применения ЯМР спектроскопии высокого разрешения для характеристики связанного с липидным бислоем состояния белка.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Лесовой, Дмитрий Михайлович

4.8 Выводы:

Разработана программа для анализа экспериментальных 31Р-ЯМР спектров фосфолипидных дисперсий с использованием аналитического выражения формы линии спектра, учитывающего эффекты ориентации молекул липидов в магнитном поле спектрометра. Это позволяет повысить как точность аппроксимации экспериментального спектра теоретическим так и получить дополнительную информацию о свойствах липидной мембраны.

Разработана методика использования гетероядерной ЯМР спектроскопии высокого разрешения, для изучения взаимодействия белка с бислойной липидной мембраной.

Определено влияние молекул токсинов на упаковку липидов в составе бислойной мембраны и условия её разрушения. Получены модели взаимодействия цитотоксинов CTI, CTII и нейротоксина NTII с липидным бислоем, отражающие биологические функции этих токсинов.

Предложен механизм мембранного катализа при связывании нейротоксина II с никотиновым ацетилхолиновым рецептором.

Благодарности

Считаю своим долгом выразить глубокую признательность научному руководителю, профессору, доктору химических наук Александру Сергеевичу Арсеньеву, который обеспечил возможность выполнения настоящей диссертационной работы, оказывая постоянное внимание и помощь на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Хочу поблагодарить весь коллектив нашей лаборатории за помощь в выполнении экспериментальной работы и плодотворные обсуждения. Особую признательность хочу выразить сотрудникам лаборатории Э.В. Бочарову, П.В. Дубовскому и М.А. Дубинному.

Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН: Е.Н. Люкмановой, А.В. Щукину и Я.С. Ермолюку и сотруднику лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН д.х.н. Ю.Н. Уткину за предоставление белков для исследований, а также д.х.н. И.Е. Кашеверову за исследования активности NTII и его аналогов.

Благодарю коллектив группы молекулярного моделирования нашей лаборатории и особенно руководителя группы Р.Г. Ефремова и сотрудников группы Ю.А. Косинского и А.Г. Коншину за неоценимый вклад в работу.

Работа финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований и министерства Образования и Науки.

4.7 Заключение

7 1

Разработан метод анализа Р-ЯМР спектров широких линий, имеющий ряд преимуществ при анализе экспериментальных спектров фосфолипидных дисперсий, реализованный в виде программы «Р-FIT».

7 I

Получена новая аналитическая формула формы линии Р-ЯМР спектра, учитывающая частичную ориентацию фосфолипидов в магнитном поле, которая позволяет существенно улучшить как точность компьютерного

71 анализа Р-ЯМР спектров фосфолипидных липосом, так и получать дополнительную информацию о характере упаковки фосфолипидов. С использованием программы может производиться декомпозиция 3'Р-ЯМР спектров с произвольным количеством перекрывающихся сигналов с анализом их параметров. В данной работе продемонстрировано практическое

7 I использование данной программы при анализе формы линии Р-ЯМР спектров липосом фосфолипидов в присутствии и без белков. Программа написана на языке Mathematica (Wolfram Research), доступна научному сообществу, и на данный момент используется в ряде других лабораторий.

Разработан метод определения сайта связывания белка с мембраной на основе гетероядерной ЯМР спектроскопии высокого разрешения.

Методика позволяет анализировать возмущения значений химических сдвигов сигналов белка в результате его связывания с липидным бислоем. Данный подход основан на получении экспериментальных условий, при которых происходит обмен между двумя состояниями белка: свободным и связанным с бислойной липидной мембраной. В результате, эта методика даёт возможность преодолеть ограничения метода ЯМР высокого разрешения на размер используемых модельных мембран при изучении липид/белковых взаимодействий, позволяя использовать моноламеллярные бислойные липосомы, наиболее полно моделирующие свойства нативных биомембран.

Связывание токсинов яда кобры Naja oxiana с липидным бислоем определяется поверхностной плотностью заряда мембраны, в то время как различия в их расположении в бислое определяются свойствами поверхности молекул токсинов, обладающих общей трёхпетельной структурой (Рис. 33а). Показано, что цитотоксины взаимодействуют с анионной липидной мембраной окончаниями трёх петель молекулы (Рис. 336), а нейротоксин II противоположной от петель Я-областью (Рис. 33в состояние 2). Причём для CTI, в сравнении с CTII, равновесие смещено к состоянию без гидрофобного встраивания в мембрану (Рис. 336 состояние 2). Встраиваясь в мембрану, токсины влияют как на ориентацию «головок» фосфолипидов, так и могут приводить к изменению её упругих характеристик. В случае цитотоксинов при соотношениях белок/липид выше некоторой пороговой величины происходит разрушение бислойной упаковки липидов в мембране и образование изотропной фазы, стехиометрия которой определяется зарядами цитотоксинов. Таким образом, удалось раскрыть механизм взаимодействия цитотоксинов с их мишенью - липидным бислоем (Рис. 336). Определена возможная роль связывания NTII с мембраной и ориентация токсина относительно липидного бислоя на этапе связывания с нАХР (Рис. 33в). Полученные данные дают основание предположить «механизм мембранного катализа» при поиске нейротоксином II мембранного никотинового ацетилхолинового рецептора.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Лесовой, Дмитрий Михайлович, Москва

1. Lee,A.G. (2003) Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim Biophys Acta, 1612,1-40.

2. Jensen,M.O. & Mouritsen,O.G. (2004) Lipids do influence protein fiinction-the hydrophobic matching hypothesis revisited. Biochim Biophys Acta, 1666,205-226.

3. Гришин,E.B., Сухих,А.П., Адамович,Т.Б., & Овчинников,Ю.A. (1976) Выделение, свойства и аминокислотная последовательность двух цитотоксинов из яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana. Биоргапическая химия, 2,1018-1034.

4. Dubovskii,P.V., Lesovoy,D.M., Dubinnyi,M.A., Konshina,A.G., Utkin,Y.N., Efremov,R.G., & Arseniev,A.S. (2005) Interaction of three-finger toxins with phospholipid membranes: comparison of S- and P-type cytotoxins. Biochem J, 387, 807-815.

5. Dementieva,D.V., Bocharov,E.V., & Arseniev,A.S. (1999) Two forms of cytotoxin II (cardiotoxin) from Naja naja oxiana in aqueous solution: spatial structures with tightly bound water molecules. Eur. J Biochem , 263,152-162.

6. Golovanov,A.P., Lomize,A.L., Arseniev,A.S., Utkin,Y.N., & Tsetlin,V.I. (1993) Two-dimensional 1H-NMR study of the spatial structure of neurotoxin II from Naja naja oxiana. Eur. J. Biochem , 213,1213-1223.

7. Gilquin,B., Bourgoin,M., Menez,R., Le Du,M.H., Servent,D., Zinn-Justin,S., & Menez,A. (2003) Motions and structural variability within toxins: implication for their use as scaffolds for protein engineering. Protein Sci., 12,266-277.

8. Kini,R.M. (2002) Molecular moulds with multiple missions: functional sites in three-finger toxins. Clin Exp Pharmacol Physiol, 29,815-822.

9. Tsetlin,V. (1999) Snake venom alpha-neurotoxins and other 'three-finger' proteins. Eur J Biochem, 264,281-286.

10. Hall,Z.W. (1999) Alpha neurotoxins and their relatives: foes and friends? Neuron, 23,45.

11. Kumar,T.K.S., Jayaraman,G., Lee,C.S., Arunkumar,A.I., Sivaraman,TM Samuel,D., & Yu,C. (1997) Snake venom cardiotoxins-structure, dynamics, function and folding. J. Biomol Struct Dyn, 15,431-463.

12. Kumar,T.K.S., Pandian,S.T.K., Jayaraman,G., Peng,H.-J., & Yu,C. (1999) Understanding the Structure? Function and Folding of Cobra Toxins. Proc. Natl. Sci Counc, 23,1-19.

13. Fletcher,J.E., Hubert,M., Wieland,S.J„ Gong,Q.H., & Jiang,M.S. (1996) Similarities and differences in mechanisms of cardiotoxins, melittin and other myotoxins. Toxicon, 34, 1301-1311.

14. Lin,S.R., Chang,L.S., & Chang,K.L. (2002) Separation and structure-function studies of Taiwan cobra cardiotoxins. J. Protein Chem ,21, 81-86.

15. Iwaguchi,T., Takechi,M., & Hayashi,K. (1985) Cytolytic activity of cytotoxin isolated from Indian cobra venom against experimental tumor cells. Biochem Int., 10,343-349.

16. Hinman,C.L., Jiang,X.L., & Tang,H.P. (1990) Selective cytolysis by a protein toxin as a consequence of direct interaction with the lymphocyte plasma membrane. Toxicol Appl Pharmacol, 104,290-300.

17. Stevens-Truss,R., Messer,W.S., Jr., & Hinman,C.L. (1996) Heart and T-lymphocyte cell surfaces both exhibit positive cooperativity in binding a membrane-lytic toxin. J Membr. Biol, 150, 113-122.

18. Dubovskii,P.V., Dementieva,D.V„ Bocharov,E.V., Utkin,Y.N., & Arseniev,A.S. (2001) Membrane binding motif of the P-type cardiotoxin. J Mol Biol, 305,137-149.

19. Dubovskii,P.V., Lesovoy,D.M., Dubinnyi,M.A., Konshina,A.G., Utkin,Y.N., Efremov,R.G., & Arseniev,A.S. (2006) Structure of cytotoxin I (CTI) from Naja Oxiana in complex with DPC micelle . Catalog: Protein Data Bank, 1ZAD.

20. Dufton,M.J. & Hider,R.C. (1991) In Snake Toxins pp. 259-302. Pergamon Press Inc., New York.

21. Harvey, A.L. (1991) In Handbook of Natural Toxins (Tu,A.T., ed), pp. 85-106. Marcel Dekker Ink., New York.

22. Vincent,J.P., Balerna,M., & Lazdunski,M. (1978) Properties of association of cardiotoxin with lipid vesicles and natural membranes. A fluorescence study. FEBS Lett, 85,103108.

23. Aripov,T.F., Gasanov,S.E., Salakhutdinov,B.A., Rozenshtein,I.A., & Kamaev,F.G. (1989) Central Asian cobra venom cytotoxins-induced aggregation, permeability and fusion of liposomes. Gen Physiol Biophys, 8,459-473.

24. Chien,K.Y., Huang, W.N., Jean,J.H., & Wu, W.G. (1991) Fusion of sphingomyelin vesicles induced by proteins from Taiwan cobra (Naja naja atra) venom. Interactions of zwitterionic phospholipids with cardiotoxin analogues. J Biol Chem , 266,3252-3259.

25. Batenburg,A.M., Bougis,P.E., Rochat,H., Verkleij,A.J., & de Kruijff,B. (1985) Penetration of a cardiotoxin into cardiolipin model membranes and its implications on lipid organization. Biochemistry, 24,7101-7110.

26. Carbone,M.A. & Macdonald,P.M. (1996) Cardiotoxin II segregates phosphatidylglycerol from mixtures with phosphatidylcholine: (31 )P and (2)H NMR spectroscopic evidence. Biochemistry, 35,3368-3378.

27. Hucho,F. & Schiebler, W. (1977) Biochemical investigations of ionic channels in excitable membranes. Mol Cell Biochem , 18,151-172.

28. Nirthanan,S. & Gwee,M.C. (2004) Three-finger alpha-neurotoxins and the nicotinic acetylcholine receptor, forty years on. J Pharmacol Sci, 94,1-17.

29. Young,H.S., Herbette,L.G., & Skita,V. (2003) Alpha-bungarotoxin binding to acetylcholine receptor membranes studied by low angle X-ray diffraction. Biophys J, 85,943-953.

30. Saez-Briones,P., Krauss,M., Dreger,M., Herrmann,A., Tsetlin,V.I., & Hucho,F. (1999) How do acetylcholine receptor ligands reach their binding sites? Eur. J Biochem, 265, 902-910.

31. Rule,G.S. & Hitchens,T.K. (2006) Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy. Springer, Pittsburgh.

32. Grisshammer,R., Buchanan,S.K., & et al. (2006) Structural Biology of Membrane Proteins. RSCPublishing, Cambridge.

33. Dufourc,E.J., Mayer,C., Stohrer,J., Althoff,G., & Kothe,G. (1992) Dynamics of phosphate head groups in biomembranes. Comprehensive analysis using phosphorus-31 nuclear magnetic resonance Iineshape and relaxation time measurements. Biophys J, 61, 42-57.

34. Ziegler,A., Blatter,X.L., Seelig,A., & Seelig,J. (2003) Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry, 42,9185-9194.

35. Геннис,Р. (1997) Биомембраны. Молекулярная структура и функции. Мир.

36. Auger,М. (2000) Biological membrane structure by solid-state NMR. Curr. Issues Mol Biol, 2,119-124.

37. Watts, A. (1998) Solid-state NMR approaches for studying the interaction of peptides and proteins with membranes. Biochim. Biophys Acta, 1376,297-318.

38. Sue,S.C., Rajan,P.K., Chen,T.S., Hsieh,C.H., & Wu,W. (1997) Action ofTaiwan cobra cardiotoxin on membranes: binding modes of a beta-sheet polypeptide with phosphatidylcholine bilayers. Biochemistry, 36,9826-9836.

39. Brumm,T., Mops,A., Dolainsky,C\, Bruckner,S., & Bayerl,T.M. (1992) Macroscopic orientation effects in broadline NMR-spectra of model membranes at high magnetic filed strength. Biophys J, 61, 1018-1024.

40. Picard,F., Paquet,M.J., Levesque.J., Belanger,A., & Auger,M. (1999) 31P NMR first spectral moment study of the partial magnetic orientation of phospholipid membranes. Biophys J, 77,888-902.

41. Jansson,M., Thurmond,R.L., Trouard,T.P., & Brown,M.F. (1990) Magnetic alignment and orientational order of dipalmitoylphosphatidylcholine bilayers containing palmitoyllysophosphatidylcholine. Chem Phys Lipids, 54, 157-170.

42. Jansson,M., Thurmond,R.L., Barry,J.A., & Brown,M.F. (1992) Deuterium NMR study of intrmolecular interactions in Lamellar phases containing palmitoyllysophosphatidylcholine. J Phys Chem , 96,9532-9544.

43. Sternin,E., Schafer,H., PoIozovJ.V., & Gawrisch,K. (2001) Simultaneous determination of orientational and order parameter distributions from NMR spectra of partially oriented model membranes. J Magn Reson, 149,110-113.

44. Seelig,J., Borle,F., & Cross,T. A. (1985) Magnetic ordering of phospholipid membranes. Biochim Biophys Acta, 814,195-198.

45. Smith,S.A., Levante,T.O., Meier,B.H., & Ernst,R.R. (1994) Computer-simulations in magnetic-resonance an object-oriented programming approach. Journal of Magnetic Resonance, 106, 75-105.

46. Bak,M., Rasmussen,J.T., & Nielsen,N.C. (2000) SIMPSON: a general simulation program for solid-state NMR spectroscopy. J Magn Reson, 147,296-330.

47. Massiot,D., Fayon,F., Capron,M., King,I., Le Calve,S., Alonso,B., Durand,J.-0., Bujoli,B., Gan,Z., & Hoatson,G. (2002) Modelling one- and two-dimentional solid-state NMR spectra. Magnetic Resonance in chemistry, 40,70-76.

48. Malcolm,I.C., Wu,Y.Z., & Higinbotham,J. (2003) The simulation of 3IP NMR line shapes of lipid bilayers using an analytically soluble model. Solid State Nucl. Magn Reson, 24,1-22.

49. Seelig,J. (1978) 31P nuclear magnetic resonance and the head group structure of phospholipids in membranes. Biochim Biophys Acta, 515,105-140.

50. Wohlgemuth,R., Waespe-Sarcevic,N., & Seelig,J. (1980) Bilayers of phosphatidylglycerol. A deuterium and phosphorus nuclear magnetic resonance study of the head-group region. Biochemistry, 19,3315-3321.

51. Vitkova,V., Meleard,P., Pott,Т., & Bivas,I. (2006) Alamethicin influence on the membrane bending elasticity. Eur. Biophys J., 35,281-286.60. de Kruijff,B. (1997) Lipid polymorphism and biomembrane function. Curr. Opin Chem Biol., 1,564-569.

52. Ranee,М. & Byrd,R.A. (1983) Obtaining High-Fidelity Spin-1/2 Powder Spectra in Anisotropic Media: Phase-Cycled Hahn Echo Spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance, 52,221-240.

53. Bystrom,T., Strandberg,E., Kovacs,F.A., Cross,T.A., & Lindblom,G. (2000) Influence of transmembrane peptides on bilayers of phosphatidylcholines with different acyl chain lengths studied by solid-state NMR. Biochim Biophys Acta, 1509,335-345.

54. El Jastimi,R., Edwards,K., & Lafleur,M. (1999) Characterization of permeability and morphological perturbations induced by nisin on phosphatidylcholine membranes. Biophys J, 77,842-852.

55. Morein,S., Strandberg,E., Killian,J.A., Persson,S., Arvidson,G., КоерреД.Е., & Lindblom,G. (1997) Influence of membrane-spanning alpha-helical peptides on the phase behavior of the dioleoylphosphatidylcholine/water system. Biophys J, 73,3078-3088.

56. Bonev,B.B., Gilbert,R.J., Andrew,P. W„ Byron,O., & Watts,A. (2001) Structural analysis of the protein/lipid complexes associated with pore formation by the bacterial toxin pneumolysin. J Biol Chem , 276,5714-5719.

57. Naito,A., Nagao,T., Obata,M., Shindo,Y., Okamoto,M., Yokoyama,S., Tuzi,S., & Saito,H. (2002) Dynorphin induced magnetic ordering in lipid bilayers as studied by (31)P NMR spectroscopy. Biochim Biophys Acta, 1558,34-44.

58. Fenske,D.B. & Jarrell,H.C. (1991) Phosphorus-31 two-dimensional solid-state exchange NMR. Application to model membrane and biological systems. Biophys. J, 59, 55-69.

59. Schafer,H., Madler,B., & Sternin,E. (1998) Determination of orientational order parameters from 2H NMR spectra of magnetically partially oriented lipid bilayers. Biophys J, 74,1007-1014.

60. Helfrich,W. (1973) Lipid bilayer spheres: deformation and birefringence in magnetic fields. Physics Letters, 43a, 409-410.

61. Qiu,X., Mirau,P.A., & Pidgeon,C. (1993) Magnetically induced orientation of phosphatidylcholine membranes. Biochim Biophys Acta, 1147,59-72.71 . Meleard,P., Gerbeaud,C., Pott,Т., Fernandez-Puente,L., Bivas,I., Mitov,M.D.,

62. Dufourcq,J., & Bothorel,P. (1997) Bending elasticities of model membranes: influences of temperature and sterol content. Biophys J, 72,2616-2629.

63. Pinheiro,T.J. & Watts,A. (1994) Lipid specificity in the interaction of cytochrome с with anionic phospholipid bilayers revealed by solid-state 31P NMR. Biochemistry, 33,24512458.

64. Hayer-Hartl,M., Brophy,P.J., Marsh,D„ & Watts, A. (1993) Interaction of two complementary fragments of the bovine spinal cord myelin basic protein with phosphatidylglycerol bilayers, studied by 2H and 3IP NMR spectroscopy. Biochemistry, 32,9709-9713.

65. Spooner,P.J. & Watts,A. (1991) Reversible unfolding of cytochrome с upon interaction with cardiolipin bilayers. 2. Evidence from phosphorus-31 NMR measurements. Biochemistry, 30,3880-3885.

66. Marassi,F.M. & Macdonald,P.M. (1991) Response of the headgroup of phosphatidylglycerol to membrane surface charge as studied by deuterium and phosphorus-31 nuclear magnetic resonance. Biochemistry, 30,10558-10566.

67. Seelig,J., Macdonald,P.M., & Scherer,P.G. (1987) Phospholipid head groups as sensors of electric charge in membranes. Biochemistry, 26, 7535-7541.

68. Roux,M., Neumann,J.M., Hodges,R.S., Devaux,P.F„ & Bloom,M. (1989) Conformational changes of phospholipid headgroups induced by a cationic integral membrane peptide as seen by deuterium magnetic resonance. Biochemistry, 28,23132321.

69. Hori,Y., Demura,M., Niidome,T., Aoyagi,H., & Asakura,T. (1999) Orientational behavior of phospholipid membranes with mastoparan studied by 31P solid state NMR. FEBSLett, 455,228-232.

70. Naito,A., Nagao,T., Norisada,K., Mizuno,T., Tuzi,S., & Saito,H. (2000) Conformation and dynamics of melittin bound to magnetically oriented lipid bilayers by solid-state (31)P and (13)C NMR spectroscopy. Biophys J, 78,2405-2417.

71. Picard,F., Pezolet,M., Bougis,P.E., & Auger,M. (2000) Hydrophobic and Electrostatic Cardiotoxin-Phosphilipid Interaction as seen by Solid-StateNMRSpectmscopy. Canadian Journal of Analytical Sciences and Spectroscopy, 45,72-83.

72. McCabe,A.E. & Wassal,S.R. (1997) Rapid deconvolution of NMR powder spectra by weighted fast Fourier transformation. Solid State Nucl Magn Reson , 10,53-61.

73. Bloom,M., Davis,J.H., & Mackay,A.L. (1981) Direct dtermination of the oriented sample NMR spectrum from the powder spectrum with local axial symmetry. Chemical Physics Letters, 80,198-202.

74. Schafer,H., Madler,B., & Volke,F. (1995) De-pake-ing of NMR powder spectra by nonnegative least-squares analysis with Tikhonov regularization. J Magn Reson, 116, 145-149.

75. Smith,S.A., Levante,T.O., Meier,B.H., & Ernst,R.R. (2004) Computer-simulations in magnetic-resonance an object-oriented programming approach. Journal of Magnetic Resonance, 106,75-105.

76. Bocharov,E.V., Lyukmanova,E.N., Ermolyuk,Y.S., Schulga A.A., PIuzhnikov,K.A.,

77. Dolgikh,D.A., Kirpichnikov,M.P., & Arseniev,A.S. (2003) Resonance assignment of 13C/I5N labeled snake neurotoxm II from Naja ox,ana Resm ? ^ 247-254.

78. Dubovskii,P.V., Lesovoy,D.M., Dubinnyi,M.A., Utkin,Y.N., & Arseniev,A.S. (2003) Interaction of the P-type cardiotoxin with phospholipid membranes. Eur. J. Biochem , 270,2038-2046.

79. Piotto,M., Saudek,V., & SkIenar,V. (1992) Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. J Biomol NMR, 2,661-665.

80. Lippens,G., Dhalluin,C., & Wieruszeski,J.M. (1995) Use of a water flip-back pulse in the homonuclear NMR spectroscopy of aqueous solutions. J Biomol NMR, 5,327-331.

81. В artels,C., Xia,T., BiIleter,M., Guntert,P., & Wuthrich,K. (1995) The program XEASY for computer-supported NMR spectral analysis of biological macromolecules. Biomol. NMR, 6,1-10.

82. Dubinnyi,M.A., Dubovskii,P.V., Utkin,I., Simonova,T.N., Barsukov,L.I., & Arsen'ev,A.S. (2001) HSR study of the interaction of cytotoxin II with model membranes]. Bioorg Khim , 27, 102-113.

83. Beschiaschvili,G. & Seelig,J. (1990) Melittin binding to mixed phosphatidylglycerol/phosphatidylcholine membranes. Biochemistry, 29, 52-58.

84. Seelig,J. (1997) Titration calorimetry of lipid-peptide interactions. Biochim Biophys Acta, 1331, 103-116.

85. Schwarz,G. & Beschiaschvili,G. (1989) Thermodynamic and kinetic studies on the association of melittin with a phospholipid bilayer. Biochim. Biophys Acta, 979, 82-90.

86. Korchuganov,D.S., Nolde,S.B., Reibarkh,M.Y., Orekhov,V.Y., Schulga,A.A., Ermolyuk,Y.S., Kirpichnikov,M.P., & Arseniev,A.S. (2001) NMR study of monomer-dimer equilibrium of barstar in solution. J. Am Chem Soc., 123,2068-2069.

87. Dubinnyi,M.A., Lesovoy,D.M., Dubovskii.P.V., Chupin,V.V., & Arseniev,A.S. (2006) Modeling of 31P-NMR spectra of magnetically oriented phospholipid liposomes: A new analytical solution. Solid State Nucl Magn Re son, 29,305-311.

88. Berendsen,H.J.C., van der Spoel,D., & van Drunen,R. (1995) GROMACS. Сотр. Phys Comm, 91,43-56.100. van Gunsteren,W.F. & Berendsen,H.J.C. (1987) Gromos-87 manual. Biomos BV Nijenborgh, 4,9747.

89. Efremov,R.G., Volynskii,P.E., Nolde,D.E., Dubovskii,P.V„ & Arseniev,A.S. (2001) Implicit two-phase solvation model as a tool to assess conformation and energetics in membrane-mimic media. Theor. Chem Acc , 106,48-54.

90. Efremov,R.G., Nolde.D.E., Vergoten.G., & Arseniev,A.S. (1999) A solvent model for simulations of peptides in bilayers. I. Membrane-promoting alpha-helix formation. Biophys J, 76,2448-2459.

91. Mezei,M. & Beveridge,D.L. (1986) Free energy simulations. Ann N Y. Acad Sci., 482, 1-23.

92. Efremov,R.G., Volynsky,P.E., Nolde,D.E., Dubovskii,P.V., & Arseniev,A.S. (2002)1.teraction of cardiotoxins with membranes: a molecular modeling study. Biophys J, 83, 144-153.

93. Furet,P., Sele,A., & Cohen,N.C. (1988) 3D molecular lipophilicity potential profiles: a new tool in molecular modelling. J. Mol Graphics, 6,182-200.

94. Honig,B., Sharp,K.A., & Yang,A.S. (1993) Macroscopic models of aqueous solutions: biological and chemical applications. J Phys Chem ,97, 1101-1109.

95. Elremov,R.G. & Vergoten,G. (1995) Ilydrofobic nature of membrane-spanning alpha-helical peptides as revealed by Monte Carlo simulations and molecular hydrophobicity potential analysis. J. Phys. Chem, 99,10658-10666.

96. Picard,F., Pezolet,M., Bougis,P.E., & Auger,M. (1996) Model of interaction between a cardiotoxin and dimyristoylphosphatidic acid bilayers determined by solid-state 3IP NMR spectroscopy. Biophys J, 70, 1737-1744.

97. Bychkova,V.E.,Dujsekina,A.E.,Klenin,S.l.,Tiktopulo,E.I.,Uversky,V.N.,& Ptitsyn,O.B. (1996) Molten globule-like state of cytochrome с under conditions simulating those near the membrane surface. Biochemistry, 35,6058-6063.

98. Antil,S., Servent,D., & Menez,A. (1999) Variability among the sites by which curaremimetic toxins bind to torpedo acetylcholine receptor, as revealed by identification of the functional residues of alpha-cobratoxin. J Biol Chem, 21 A, 34851-34858.

99. Уткин,Ю.Н., Цетлин,В.И., & Хухо,Ф. (1999) Структурная организация никотиновых холинергических рецепторов. Биологические мембраны, 16,118-134.

100. Hucho,F. & Weise,C. (2001) Ligand-Gated Ion channels. Angew Chem Int ,40,3100-3116.

101. Teixeira-Clerc,F., Menez,A., & Kessler,P. (2002) How do short neurotoxins bind to a muscular-type nicotinic acetylcholine receptor? J. Biol. Chem , 277,25741-25747.

102. Bourne,Y., Talley,T.T., Hansen,S.B., Taylor,P., & Marchot,P. (2005) Crystal structure of a Cbtx-AChBP complex reveals essential interactions between snake alpha-neurotoxins and nicotinic receptors. EMBOJ, 24, 1512-1522.

103. Kaiser,E.T. & Kezdy,F.J. (1984) Amphiphilic secondary structure: design of peptide hormones. Science, 223,249-255.

104. Bader,R. & Zerbe,0. (2005) Are hormones from the neuropeptide Y family recognized by their receptors from the membrane-bound state? Chembiochem, 6, 1520-1534.

105. Lee,S.Y. & MacKinnon,R. (2004) A membrane-access mechanism of ion channel inhibition by voltage sensor toxins from spider venom. Nature, 430,232-235.

106. Garcia,M.L. (2004) Ion channels: gate expectations. Nature, 430,153-155.

107. Suchyna,T.M., Tape,S.E., Koeppe,R.E., Andersen,O.S., Sachs,F., & Gottlieb,P.A. (2004) Bilayer-dependent inhibition of mechanosensitive channels by neuroactive peptide enantiomers. Nature, 430,235-240.

108. Dai,Q., Zajicek,J., Castellino,F.J., & Prorok,M. (2003) Binding and orientation of conantokins in PL vesicles and aligned PL multilayers. Biochemistry, 42,12511-12521.

109. Schwyzer,R. (1995) 100 years lock-and-key concept: are peptide keys shaped and guided to their receptors by the target cell membrane? Biopolymers, 37,5-16.

110. Sargent,D.F. & Schwyzer,R. (1986) Membrane lipid phase as catalyst for peptide-receptor interactions. Proc Natl. Acad Sci. U. S A, 83,5774-5778.

111. Sargent,D.F., Bean,J.W., & Schwyzer,R. (1988) Conformation and orientation of regulatory peptides on lipid membranes. Key to the molecular mechanism of receptor selection. Biophys Chem , 31, 183-193.

112. Castanho,M.A. & Fernandes,M.X. (2006) Lipid membrane-induced optimization for ligand-receptor docking: recent tools and insights for the "membrane catalysis" model. Eur. Biophys J, 35,92-103.

113. Lopes,S.C., Fedorov,A., & Castanho,M.A. (2005) Lipidic membranes are potential "catalysts" in the Iigand activity of the multifunctional pentapeptide neokyotorphin. Chembiochem, 6,697-702.

114. Kristiansen,P.E., Fimland,G., Mantzilas,D., & Nissen-Meyer,J. (2005) Structure and mode of action of the membrane-permeabilizing antimicrobial peptide pheromone plantaricin A. J Biol Chem , 280,22945-22950.

115. Makriyannis,A., Tian,X., & Guo,J. (2005) How lipophilic cannabinergic ligands reach their receptor sites. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 77,210-218.

116. Mason,R.P. & Chester, D. W. (1989) Diffusional dynamics of an active rhodamine-labeled 1,4-dihydropyridine in sarcolemmal lipid multibilayers. Biophys J, 56, 1193-1201.

117. Herbette,L.G., Rhodes,D.G., & Mason,R.P. (1991) New approaches to drug design and delivery based on drug-membrane interactions. Drug Des Dehv, 7,75-118.

Информация о работе

Лесовой, Дмитрий Михайлович
кандидата физико-математических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Изучение взаимодействия токсинов яда кобры Naja oxiana с мембранами методом ЯМР спектроскопии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы