Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами"

на правах рукописи УДК 577.322.5

ДУБИННЫЙ Максим Анатольевич

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ЦИТОТОКСИНОВ NAJA OXIANA И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С МИЦЕЛЛАМИ И БИОМЕМБРАНАМИ

03.00,02 -Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ф изи ко- математических наук

Москва - 2006

Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, на кафедре фиэн ко-хим и ческой биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ).

Научный руководитель: Арссньек Александр Сергеевич

доктор химических наук заведующий лабораторией структурной биологии ИБХ РАН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, Польшаков Владимир Иванович

ведущий нацчный сотрудник ФГУП «Центр по химии лекарственных средств»

кандидат физико-математических наук, Горделнй Валентин Иванович

директор Центра биофизики и физико-химии надмолекулярных структур МФТИ

ФГУ "Российский кардиологический Ведущая организация: научно-ироизводсгвенный комплекс

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Защита состоится " 13 " декабря 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета K212.1S6.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408-57-00,408-56-27,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан "11" ноября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент

Ерагин В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы,

Яды змей семейства Elapidae - сложная смесь биологически активных полипеггтидов, которая включает кейротоксины, цитотокснны, фосфолипазы и другие биологически активные компоненты. Нейротоксины взаимодействуют с ацетилхолиновыми рецепторами, блокируя передачу нервного импульса. Цитотокснны гомологичны нейротоксинам по аминокислотой последовательности и пространственной структуре, но отличаются широким спектром биологической активности.

Различные представители семейства цитотоксинов способны усиливать сердцебиение при низких концентрациях и вызывать остановку сердца при высоких концентрациях (за что они получили другое название кардиотоксины\ вызывать деполяризацию мышечных клеток. В больших концентрациях цитотокснны вызывают лизис фосфолипидных везикул и клеточных мембран, дестабилизируют структуру липидного биелоя, вызывают межмембранное смешивание липидов. Цитотокснны способны связываться с гепарином, который способствует проникновению цитотоксинов в мембрану. Цитотокснны обладают повышенной токсичностью по отношению к раковым клеткам. Большинство исследованных цитотоксинов вызывают гибель клеток по механизму цитолиза, за исключением цитотоксина ni Naja aira, для которого показана апоптотическая активность по отношению к клеткам лейкемии человека К562, клеткам рака кишечника Со1о205, а так же CDS'*' лимфоцитам человека. Считается перспективным создание противораковых средств на основе природных или модифицированных цитотоксинов.

Цитотокснны представляют собой ß-струкгурные амфифильные одноцепочечные белки длиной 59-62 аминокислотных остатка н массой 6-7 кДа. В настоящий момент известны аминокислотные последовательности 81 цитотоксина из ада змей рода Naja, из них только для ] 1 цитотоксинов проводились структурные исследования и получена пространственная структура методом ЯМР или рентгеноструктурного анализа. Все известные цитотокснны имеют высокую степень гомологии по аминокислотной последовательности и пространственной структуре. Пространственная структура цитотоксинов включает два ß-слоя по два и три ß-тяжа в каждом, а так же три функционально важных «петлим цитотоксина. Структура стабилизирована четырьмя консервативными дисульфкдными связями. Небольшие различия в аминокислотной последовательности и пространственном строении трех петель цитотоксинов определяют различие в спектре их биологической активности,

В настоящий момент не представляет сомнений, что биологическое действие цитотоксинов на клетку включает взаимодействие с липидной мембраной, в частности, с плазматической мембраной клетки. Изучение структуры и функции мембранных белков наталкивается на целый ряд методических трудностей. Мембраносвязанный белок не дает спектра ЯМР высокого разрешения и не может быть закристаллизован, что затрудняет использование стандартных методик определения пространственной структуры белка. Один из путей преодоления данной трудности — использование детергентных мицелл как систем моделирующих мембранное окружение. Вследствие меньшей молекулярной массы и меньшего времени вращательной корреляции по сравнению с бислойными липидными структурами, детергентные мицеллы позволяют наблюдать спектр ЯМР высокого разрешения и во многих случаях делают возможным расчет пространственной структуры белка.

Не смотря на наличие соответствующих методик, в настоящий момент детали взаимодействия цитотоксинов с липидными мембранами недостаточно изучены и вызывают разногласия между различными группами исследователей. Пространственная структура в комплексе с мицеллой получена только для одного цитотоксина, это структура цитотоксина II из яда Naja oxiana, все остальные структуры получены в водном растворе (методом

ЯМР) или в кристалле (методом рентгеноструктурного анализа). За исключением того же цитотоксина II не изучено влияние лигашного окружения на пространственную структуру цитотоксинов, недостает прямых данных об участках шгготоксинов, вовлеченных в непосредственное взаимодействие с мембраной/мицеллой. Различные исследователи предполагают существование функционально важных комплексов ш нескольких молекул цито-токсина на поверхности мембраны, однако прямых подтверждений существования таких комплексов в мембранах/детергентных мицеллах в настоящий момент не получено.

Исль и плачи исследования.

Данная работа ставит целью комплексное изучение двух цитотоксинов из яда кобры Naja oxiana: цитотоксинов I и II методами ЯМР н ЭПР спектроскопии. Данная цель подразумевает:

1. Получение пространственной структуры цитотоксина! из яда Naja axiana в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ методом ЯМР высокого разрешения. Анализ полученных структур и их сопоставление с известными аналогами - трехпетлевьши белками из ядов змей.

2. Измерение рКя боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков, анализ влияния липидного окружения на структуру и свойства заряженных аминокислотных остатков цитотоксина I.

3. Изучение взаимодействия цитотоксинов с мицеллой/липидной мембраной. Мониторинг связывания цитотоксинов с мицеллой методом ЯМР и с лнпидной мембраной методом ЭПР с использованием спин-меченого аналога цитотоксина II.

Методы исследования.

В работе применяются методы гомоядерной одномерной и двумерной 'Н ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Для моделирования мембранного окружения при расчете структуры цитотоксина I использованы дейтерированные мицеллы додецилфосфатндил-холина (ДФХ). Отнесение сигналов белка производится методом последовательного отнесения сигналов, водородные связи выделяются на основе скоростей дейтерообмена амид-ных протонов. Ограничения на торсионные углы определяются из значений констант спи н-спинового взаимодействия. .Связанная молекула воды идентифицируется при помощи ROESY спектроскопии, ее наличие проверяется методом молекулярной динамики в явно заданном растворителе. Структура белка рассчитывается на основе ограничений, полученных из двумерных NOESY спектров белка и констант спин-спинового взаимодействия минимизацией штрафной функции в программе CYANA.

Константы рКл депротоиирования боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков определяются по изменению химических сдвигов в двумерных спектрах ЯМР.

Взаимодействие цитотоксинов с мицеллой ДФХ изучается мониторингом химических сдвигов в двумерных спектрах белка и коэффициента трансляционной диффузии белка методом градиентного спин-эха. Для анализа полученных данных разрабатывается оригинальная математическая модель, которая позволяет одновременно анализировать изменения химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белок/мицелляр-ного комплекса.

Взаимодействие цитотоксина II с модельной л ипидной мембраной изучается методом ЭПР спектроскопии с использованием спин-меченого аналога цитотоксина Кривая связывания с липидной мембраной анализируется в рамках модели Гуи-Чапмена.

Научная новизна н практическая значимость паЯоты,

Все результаты, изложенные в настоящей работе, получены впервые.

1. Получена структура высокого разрешения для цитотоксина I в водном растворе и а комплексе с мицеллой ДФХ, Обнаружена связанная молекула воды в составе второй петли цитотоксина I в водном растворе. Показано, что при связывании с мицеллой ДФХ происходит сильное изменение структуры второй петли цитотоксина. Факт существенного изменения структуры цитотоксина при связывании с мицеллой показан для цитогоксинов впервые. Две структуры высокого разрешения депонированы в Банк Данных Белков (PDB) с кодом IRLS (щгтотокснн I в водном растворе) и IZAD (цитотокснн I в комплексе с мицеллой ДФХ).

2. Анализ pH — зависимостей химических сдвигов цитотоксина! показал высокую консервативность свойств заряженных остатков Asp40 и Asp57 и выявил особую роль остатка Asp29 в конформации второй петли молекулы.

3. По данным об изменении химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии построена модель связывания токсинов с мицеллой. Показано, что для корректного описания диффузионных данных необходимо учесть долю объема, занятую мицеллами в растворе и вытеснение части детергента из состава мицеллы при связывании молекулы цитотоксина. Согласно данной модели шгготоксины связываются с мицеллой ДФХ антикооператив но, что свидетельствует против формирования комплекса из нескольких молекул токсина. Константа связывания первой молекулы с'мицеллой согласуется с константой связывания спин-меченого цитотоксина С липидным бислоем.

4. Изучено связывание сп'ин-меченото аналога цитотоксина II с модельной липидной мембраной, кривая связывания описана моделью Гуи-Чапмена и определена константа связывания цитотоксина с липидной мембраной.

Разработанные в настоящей диссертации методики представляют самостоятельный интерес и могут быть применены к исследованию других мембраиосвязывающихся белков. Модель динамического равновесия в системе белок-мицелла может быть использована при анализе ЯМР данных для определения количества молекул белка, связанного с мицеллой, выявления кооперагивности/антикооперагивност связывания белков с мицеллой, а так же для оценки объема белка, погруженного в мицеллу через способность белка вытеснять часть детергента при связывании с мицеллой. Несмотря на то, что изменение химических сдвигов и трансляционной диффузии традиционно используются при изучения формирования белок-белковых и белок—лигандны х комплексов, изучение формирования комплекса белка с мицеллой на основе аналогичных данных является новым подходом.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на российских и международных конференциях посвященных спектроскопии ЯМР: открытая российско-шведская конференция «методы ЯМР во взаимодействии белок-белок и белок-ДНК» (Моксва, 2000); X юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине и экологии (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф 2002); VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино, Россия, 2002), XVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005).

Публикации.

Основные результаты диссертации изложены в 4 тезисах докладов и в б статьях в реферируемых российских и зарубежных журналах.

ОГгьем я структура работы.

Диссертация состоит из введения, двух глав, включая литературный обзор, заключения и выводов. Общий объем работы составляет 97 страниц текста, включая 12 рисунков, 7 таблиц и список литературы, содержащий 95 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВВДЕШ1Е.

Во введении обоснована необходимость и актуальность исследования структур шгго-токсииов, в особенности в среде, моделирующей мембранное окружение фосфолипидного бислоя. Кратко формулируются основные цели и задачи исследования: получение про* странственной структуры цитотоксина I высокого разрешения методом ЯМР в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, измерение рК. боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков, анализ взаимодействия цитотоксинов с мицеллой и липндной мембраной.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава состоит из двух частей. В первой проводится обзор семейства «трехпальцевых» («трехпетлевых») белков из ядов змей, обсуждается широкое разнообразие функций белков со сходной структурной организацией. Кратко рассмотрена биологическая активность, структура и связь структуры и функции для нейрстоксинов (длинные и короткие а-нейротоксины, к-токсины, мускариноеые токсины), ингибиторов ацетилхолинэстеразы (фасцикулинов), блокатороп кальциевых каналов L-типа, дендроаспинов (дезинтегрннов) и цитотоксинов (кардиотоксинов). Показана высокая степень структурного сходства белков данных типов. Приведены два примера ошибочного отнесения трехпетлевых белков к другому функциональному типу, когда цитотоксин, проявляющий слабую ЦИТОТОКСИЧ-ность, в последствии оказывается дезинтегрином или ингибитором ацетилхолинэстеразы. 1В качестве обобщения сделан вывод о том, что наиболее значимые аминокислотные остатки для каждого из видов токсинов находятся в трех функционально важных петлях молекулы.

Во второй части приведен обзор структурных и функциональных исследований цитотоксинов. Всего в настоящий момент методом рентгенострукгурного анализа получено б пространственных структур для 5 цитотоксинов из яда змей рода Naja и методом ядерного магнитного резонанса 12 структур для 9 цитотоксинов. При этом только одна из известных структур (цитотоксин II N. oxiana) получена в водном растворе в комплексе с мицеллой ДФХ, так же в одном случае (цитотоксин Ш N. aira) удалось получать кристалл в комплексе с детергентом додецилсульфатом натрия. В обоих случаях не обнаружено заметного различия в структуре белка при переходе из водного раствора в липидное окружение. Наибольшие различия в пространственной структуре цитотоксинов локализованы в области трех функционально важных петель белков. На основе данных о структуре и спектре биологической активности белков рассмотрены способы классификации цитотоксинов: деление цитотоксинов на S- и Р- тип по признаку присутствия остатков Ser28 или РгоЗО н структуре второй петли молекулы н деление на цитотоксины I и II типа по наличию полосы в спектре кругового дихроизма на длине волны 225 им.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Вторая глава состоит из четырех частей. Первая часть посвящена расчету структуры цитотоксина IК oxiana в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ методом ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Во второй части исследуются рН-завнсимости химических сдвигов цитотоксина I, определяются значения рКа боковых цепей отрицатель- ■ но заряженных аминокислотных остатков в растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ обсуждается роль зарядов в структуре цитотоксина. В третьей части обсуждаются различные модели связывания белка с мицеллой детергента. Выводится ряд уравнений, которое позволяют описать изменение химического сдвига и трансляционной диффузии белка ири различных соотношениях белок/детергент. В четвертой части изучается связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с модельной липидной мембраной. Изотерма связывания описывается уравнением Гун-Чапмена, определяется константа связывания цитотоксина И с липидной мембраной.

Материалы и методы изложены отдельно для каждой части.

В червой части второй главы подробно изложены применяемые в с методы ЯМР спектроскопии, приготовление образцов, сбор ЯМР данных и расчет структуры. Среди наиболее важных моментов структурной части работы следует упомянуть следующее.

В процессе отнесения сигналов цитотоксина в водном растворе были обнаружены два набора спиновых систем для аминокислотных остатков 4-13 (первая петля цитотоксина) и : остатка G1y37 (рис. 1): Две формы белка представлены в растворе в соотношений 5:1. Аналогичное явление ранее наблюдалось дня цитотоксина II N. oxiana в водном растворе. Конформационная гетерогенность обусловлена изомеризацией пептидной связи VaJ7-ProS: для основной формы белка данная пептидная связь имеет транс-, а для минорной -цис- конформацию. Из предыдущих исследований цитотоксина II известно, что минорная форма цитотоксина не взаимодействует с мицеллой ДОХ, аналогично не взаимодействует с мицеллой ДФХ н минорная форма цитотоксина I. Расчет структуры производился только с использованием сигналов основной формы цитотоксина.

Рис. I. Область ff-H" сигналов в TOCSY спектре цитотоксина I в водном растворе. Указаны номера остатков, дающих два набора кросс-пиков вследствие изомеризации пептидной связи Val7'ProS (остатки 4-13 и 37). Жирным шрифтом выделены сигналы основной формы белка (транс- конфигурация пептидной связи), курсивом -сигналы минорной формы белка (цис- конфигурация пептидной связи).

м.д.

4.00

5.00

10.00 9.00 8.00 7.00 М.Д.

H" Met26 H" Met26 H" Met26

Н^ейбЦ.Л.

9.4

9.2

9.0

Рис. 2. Фрагменты спектра ЯОЕ$Т-75 мс цитотоксина { в водном растворе при различных температурах, (а) 10'С; (б) 30 "С и (с) 50 *С. Овалом отмечен отрицательный кросс-пик между сигналами н" \fet26 и Н^О. Показаны так же кросс-пики между н" \iet26 и Н° РИе25, Н" \iet26 которые использовались при отнесении сигналов.

Анализ ROESY спектров цитотоксина в водном окружении при трех температурах (10, 30 и 50°С, рис. 2) выявил интенсивный отрицательный кросс-пик ROE с сигнала Н Met26 на сигнал воды. Данный сигнал может быть интерпретирован либо как признак существования долгоживущей связанной с белком молекулы воды, либо как присутствие лабильной гидроксильной группы боковой цепи белка в непосредственной окрестности Н* Met26. Предварительные расчеты пространственной структуры цитотоксина показали, что ближайший к Н* Met26 лабильный протон (ОН Ser28) удален на расстояние более JA. Медленная скорость дейтерообмена Н Met26 говорит о наличии водородной связи с его участием, однако в ходе предварительных расчетов структуры подходящий акцептор водородной связи обнаружен не был. Все приведенные данные однозначно свидетельствуют о наличии связанной воды в петле II цитотоксина. Связанная вода в аналогичном положении наблюдалась в структурах цитотоксинов, полученных как методом рентгеноструктур-ного анализа, так и методом ЯМР-спектроскошш. Наличие долгоживущей прочно связанной молекулы воды было подтверждено методом молекулярной динамики с явно заданным растворителем. В течение интервалов времени от одной до пяти наносекунд различные молекулы растворителя оккупировали один и тот же сайт во второй петле цитотоксина, удерживаясь в нем при помощи четырех водородных связей: с атомами Н" Met26, СО Asp29, О1 Asp29 и СО Не32 (рис, 3(а), 4(а)). Все указанные водородные связи вместе с водородными связями, удерживающими пять ß-тяжей цитотоксина, были включены в расчет структуры.

Всего для расчета структуры цитотоксина 1 в водном окружении было использовано 107 констант спин-спинового взаимодействия, 270 ограничений на торсионные углы, ограничения на 34 водородные связи (25 водородных связей с участием атомов основной цепи) и 517 верхних ограничений на межатомные расстояния. Окончательный набор из 20 структур характеризуется среднеквадратичным отклонением (СКО) 0.31А по атомам основной цепи и 0.87Á по всем тяжелым атомам. Те же значения СКО по элементам вторичной структуры (ß-тяжам) равны 0.20Á и 0.86А, соответственно. Набор структур вместе с использованными при расчете ограничениями и локализованной молекулой прочно связанной воды депонирован в Банк Данных Белков (PDB) под кодом 1RL5 (рис. 3(а)).

При расчете структуры цитотоксина в комплексе с мицеллой ДФХ возникла дополнительная трудность, связанная с сильным ослаблением сигналов в области окончания второй петли цитотоксина, поэтому однозначного отнесения сигналов основной цепи остатков Ser2S и Asp29 получить не удалось. Такое ослабление сигналов по-видимому объясня-

(а) Цитотоксгш I в водном растворе

(б) Цитотоксин I в комплексе с мицеллой ДФХ

Рис. 3. Стереоизображение пространственной структуры цитотоксина ! (20 структур) е водном растворе (а) и в комплексе с мицеллой ДФХ (6). Основная цепь показана синим цветом, п атомы основной цепи — красным, СО атомы — желтым, боковые цепи—розовым, водородные связи - зеленым, прочно связанная мапегула воды на рис. (а) — серым цветом. Римскими цифрами!-Ш обозначены номера петель цитотоксина.

ется наличием конформ анионного перехода, скорость которого удовлетворяет условию «промежуточного обмена» в шкале времени ЯМР, при котором скорость обмена между двумя конформациями молекулы близка к разнице резонансных частот протонов.

Изменение условий регистрации спектров ЯМР (температура, рН среды, концентрация ДФХ) не привела к улучшению их качества. Сигнал связанной воды в о&пастн второй петли обнаружен не был, поэтому связанная вода в расчете структуры не участвовала. Для корректного определения конформации второй петли цитотоксина сигналы МОЕЭУ спектра второй петли (аминокислотные остатки с Мй2б по Пе32) калибровались отдельно от остальных Ж)Е кросс-пиков. Такой подход позволил извлечь достаточно информации из ЯМР спектра для определения конформации второй петли молекулы и обнаружить сильное изменение структуры данного участка белка по сравнению со структурой в водном растворе (рис. 4(а) и (б)).

Всего для расчета структуры цитотоксина I в комплексе с мицеллой ДФХ было использовано 121 константа спин-спинового взаимодействия, 260 ограничений на торсионные углы, ограничения на 24 водородные связи (18 водородных связей с участием атомов основной цепи) и 523 верхних ограничений на межатомные расстояния. Окончательный набор из 20 структур характеризуется СКО 031А по атомам основной цепи и 0.94А по всем тяжелым атомам. Те же значения СКО по элементам вторичной структуры (р-тяжам)

(б) Цитотоксин ! в комплексе с мицеллой ДФХ

Рис. 4. Стереоизображение структуры петли II {остатки 24-34) цитотоксина / в водкам растворе (а) и в комплексе с мицеллой ДФХ (6). На рис. (а) показана прочно связанная молекула воды, которая образует водородные связи с остатками Meí26, Asp29, Не32. Очевидно изменение ориентации боковой цепи Asp29 при связывании с мицеллой. Пунктиром обозначены водородные связи белок - белок и белок - связанная вода.

равны 0.I8Á и 0.93А, соответственно. Набор структур вместе с использованными при расчете ограничениями депонирован в Банк Данных Белков под колом IZAD (рис. 3(6)).

Вп второй части второй главы обсуждаются рИ зависимости химических сдвигов цитотокаша 1 в растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ и определяются значения рКо боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков.

рИ зависимости химических сдвигов цитотоксина I измерялись по серии двумерных NOESY спектров в диапазоне значений рМ 2.0-6.0 с шагом 0.3-0.5 единицы рН. Зависимость химического сдвига сигнала ядра 5 от рН в случае титрования одной ионогениой группы описывается уравнением;

Здесь Sí> и S; — химический сдвиг атома при высоких и низких значениях рН, соответственно. Значения, 5/,, 5/ а рК„ определялись нелинейной регрессией экспериментальных зависимостей к уравнению (1). Большое положительное значение Д8 = Sа - 5/ (изменение химического сдвига при титровании) позволяет выявить водородные связи, которые образует титрующаяся заряженная труппа, а значение рК<, (в сравнении со значением рК<, для свободной аминокислоты) говорит о ее локальном окружении.

Цитотоксин I содержит 4 аминокислотных остатка с отрицательно заряженной боковой цепью: Gluló, Asp29, Asp40 и Asp57. Последние два остатка консервативны и присутствуют в большинстве известных цитотоксниов. При титровании заряженной группы Asp57

наиболее сильно изменяется химический сдвиг ){" Lys2 (AS « +0.78 н.д.), что говорит о наличии водородной связи между карбоксильной группой аспарагиновой кислоты и И* атомом лизина. Аналогичная водородная связь присутствует в известных рештеновских структурах цитотоксинов и не противоречит имеющимся ограничениям на расстояния и торснонные углы цитотоксина I. Введение водородной связи между COO" Asp57 и II" Lys2 позволяет существенно улучшить локальное качество структуры по сравнению с другими структурами цитотоксинов, полученными методом ЯМР, Пространственная близость N- и С- концевых остатков является общим свойством токсинов с трехпетлсвой структурой (за исключением длинных нейротокеинов, в которьсх присутствует дополнительный С-концевой пептидный фрагмент). Низкое значение pK„ Asp57 (2.3 по сравнению с 3.7 для свободной аспарагнновой кислоты) свидетельствует о близости положительно заряженного остатка. Такими остатками согласно полученной пространственной структуре являются боковые цепи Lys2 и Arg58. Значения химических сдвигов и рКа аспарагнно* вой кислоты не изменяются при переходе из водного растворе в мицеллярное окружение, что говорит о том, что данная область белка удалена от поверхности мицеллы, в согласии с принятой моделью комплекса цнтотоксин/мицелла.

Аналогичный анализ позволяет установить две водородные связи с группы COO" Asp4û на атомы Hv Asp40 и Vat41, которые так же присутствуют в известных рентгеновских структурах. Низкое значение рК» Asp40 определяется присутствием в ближайшей окрестности боковой цепи LyslS, Титрование боковой цепи остатка Glul6 практически не вызывает изменений химических сдвигов, значение рК„ Glu 16 (3.7J) близко к значению для свободной аминокислоты (4.3) и не изменяется при встраивании в мицеллу ДФХ. Следовательно, данная ионогениая группа экспонирована в водное окружение и находится в области белка, удаленной от мицеллы, что так же согласуется со структурными данными.

Из всех отрицательно заряженных групп боковая цепь А$р29 наиболее чувствительна к переходу цитотоксина из водного окружения в мицеллу ДФХ. Этот расположенный во второй петле заряженный остаток уникален для цитотоксина I и может играть важную роль в его функционировании. В предыдущей части было показано, что конформация боковой цепи Asp29 существенно изменяется при переходе цитотоксина из раствора в мицеллу (рис. 4(a) и (б)), то же можно сказать и о значении рКл данного остатка. Если в водном окружении значение рК<, А$р29 меньше знамения свободной аминокислоты на 0.23 единицы рН, то после связывании цитотоксина с мицеллой значение рК„ становится больше соответствующего свободного значения на 0.93 единицы. Вместе с кон формацией данного остатка меняется и вся конформация второй петли белка, из псе «уходит» связанная вода. Все это говорит о том, что боковая цепь Asp29 и, по-видимому, вся вторая петля цитотоксина 1 погружаются в липидное окружение мицеллы ДФХ.

В третьей части второй главы обсуждаются различные модели связывания белка с мицеллой детергента н их применение для анализа изменений химического сдвига сигналов в спектре ЯМР и трансляционной диффузии белка при связывании с мицеллой.

Взаимодействие белка с мицеллой является сложным динамическим процессом. Мицелла представляет собой сравнительно небольшой агрегат из нескольких десятков молекул детергента и обычно имеет форму близкую к сферической. Мсмбраноактпвные и мембраносвязывающиеся белки обычно способны связываться с мицеллами подходящего состава. Обычно мицелла способна связывать несколько молекул белка, при зтом нельзя исключать изменения размера мицеллы при связывании каждой последующей молекулы белка. Метод ЯМР позволяет наблюдать изменение химических сдвигов сигналов белка и коэффициента трансляционной диффузии комплекса белок/мицелла в зависимости от соотношения белок/детергент. В третьей части настоящей главы предлагается аналитическая модель для анализа химического Сдвига и коэффициента трансляционной диффузии в системе белок/мицелла.

Ш ТАМ

Рис. 5. Схематическое представление связывания двух (п - 2) молекул белка с мицеллой. Свободная мицелла состоит из Мц молекул детергента (слева внизу, показаны черным цветам). Первая молекула белка связывается с мицеллой с константой ко и вытесняет ДМ молекул детергента, новая мицелла состоит из М] ■= Мц — АМ молекул детергента. Вытесненный детергент распределяется между остальными мицеллами (показаны вверху серым цветом). Аналогично вторая молекула белка связывается с константой А/ и вытесняет еще А\4молекул детергента.

Для моделирования изменения химических сдвигов белка предложена модель, основанная на следующих допущениях (см. рис. 5):

1. Одна мицелла способна связывать не более N молекул белка. Величину Сбудем условно называть «валентностью мицеллы» по отношению к данному белку;

2. Обмен между различными олигомерными состояниями белка является быстрым в масштабах ЯМР эксперимента;

3. Все молекулы белка, связанные с мицеллой, имеют одинаковые химические сдвиги. Так же совпадают химические сдвиги у комплексов, содержащих различное количество молекул белка;

4. Связывание л-Я молекулы белка с мицеллой, содержащей п — 1 молекул белка, описывается константой бимолекулярного равновесия *„;

5. Размер мицеллы может зависеть от количества связанных молекул белка. Мицелла, содержащая л молекул белка (п = О, М), состоит из ЛЛ молекул детергента;

Для описания зависимости коэффициента трансляционной диффузии дополнительно были введены еще два предположения;

6. Коэффициент трансляционной диффузии комплекса белок^мииелла хорошо аппроксимируется уравнением Стокса-Эйнштейна (приближение сферического комплекса эква-валентного объема);

7. Влияние вытесненного объема на трансляционную диффузию комплексов хорошо приближается линейным членом в метели Токуя мн и Оппенгейма.

Под вытесненным объемом подразумевается доля объема раствора, занятого мицеллами детергента.

В работе выведена общая модель для описания химического сдвига 5 и измеряемого в эксперименте коэффициента трансляционной диффузии Д белка:

5 = Д8[1-|) (2)

г + |(,-3,9247Ф)^] (4)

дня трансляционной диффузии. Здесь уравнение (3) описывает трансляционную диффузию без умета эффекта вытесненного объема, уравнение (4) учитывает влияние вытесненного объема на коэффициент трансляционной диффузии частиц. В уравнениях (2)-(4) используются следующие обозначения: ¿5 — изменение химического сдвига при полном связывании белка с мицеллой, - коэффициент трансляционной диффузии свободного белка в растворе, Р - концентрация свободного (не связанного с мицеллами) белка в растворе, Р, — общая концентрация белка в растворе, £, — общая концентрация детергента в растворе, ф - объемная доля мицеллярных частиц в растворе.

Концентрация свободного белка в растворе определяется из следующей системы уравнений:

р.шр+г1< <5>

Здесь г - степень связывания белка с детергентом (отношение концентрации связанного с детергентом белка к общей концентрации детергента). Первое из уравнений (5) описывает кривую связывания белка с мицеллой, второе задает условие сохранения общего количества белка в растворе. В уравнения (3), (4) и (5) входят суммы $,(Р), ЗДР) и 5о(Р), которые выражаются через константы связывания к„ и размеры мицелл М„ для олигомерных комплексов с различным количеством молекул белка п:

N ря

да

ВшО

$„(*>>= (7)

Г7-7Г (8)

Здесь для удобства введено обозначение:

\к,кг...к„, пгI К* \1 л «О

(5)

Безразмерный параметр ц равен отношению объема одной молекулы детергента к объему молекулы белка.

Приведенные выше уравнения позволяют описать изменения химических сдвигов сигналов белка и коэффициента трансляционной диффузии белка, если заданы константы связывания к„ и размеры мицелл А/„. Дня того чтобы применить данную модель к экспериментальным данным, необходимо сделать дальнейшие предположения относительно возможных К и М„. Если предположить все константы и размеры мицелл полностью произвольными и подлежащими определению из экспериментальных данных, то уже для N = 3 получится б параметров, подлежащих определению га эксперимента. Большое количество свободных параметров приводит к сильной избыточности модели уже при весьма умеренных N. Кроме того, количество параметров, подлежащих определению сильно за-

а

цитотоксин I I.S д

ЗА

6 a

bV

4 'о м \ Да

Jj* цитотоксинП 17

г F rf" Ь. цитотокенн 1

0 Г 1 цнтотохенн II "■"а"-

О 10 2D 3» 40 50 60 UP * 10 ÍO 50 « Í0 60 LíP

Рис. 6. Результат моделирования химических сдвигов (слева) и трансляционной диффузии (справа) гртотоксииовlull.

висит от «валентности мицеллы» N, что затрудняет сравнение моделей с разными N между собой. Для разрешения этой трудности в дальнейшем в работе предполагается, что величины Jfc* и М„ являются простыми функциями от и и рассматриваются два вида таких функций.

Дня параметров к„ вводится две возможные модели; постоянные к,

*„«*„= const (10)

н экспоненциально изменяющиеся к„:

= • (")

что соответствует антикооперативному связыванию при р > 1 и кооперативному связыванию при р < 1. Для размеров мицелл М„ так же вводится две возможные модели: постоянные Мп\

= ЛУ„ = const (12)

и линейно уменьшающиеся М„:

Мл=Л/0-иДМ (13)

Комбинация одного из уравнений (10), (11) с одним из уравнений (12Х (13) дает одну из четырех возможных моделей связывания белка с мицеллой. В случае постоянных констант связывания А, (10) в работе выведено замкнутое выражение для сумм (б)-(8). При этом уравнение для суммы S¡£P) и коэффициента трансляционной диффузии D, белка содержат трансцендентную функцию Лерча. В этом случае теория может быть условно обобщена на произвольные (не только целые) значения N, что можно использовать для определения эффективной «валентности мицеллы» из экспериментальных данных методом нелинейной регрессии.

Справедливость предложенной теории была проверена при анализе связывания цкго-токеннов I и II N oxiana с мицеллами ДФХ (рис. 6.). Анализ экспериментальных данных показал, что оптимальной моделью связывания цитотоксинов является модель, которая учитывает (i) эффект вытесненного объема (4), (И) изменение констант связывания по закону (11) и (iii) изменение размера мицеллы по закону (13). Для цитотоксина I наилучший результат получен при JV = 3 (молекулы белка на мицеллу) для цитотоксина II — при N"4, Константа связывания первой молекулы белка с мицеллой для цитотоксина I составила приблизительно fc> - 70 мкм, для цитотоксина II ¿о - 7 мкм. При этом оба цитотоксина при связывании вытесняют от 7 до 10 молекул детергента. Константа связывания цитотоксина с мицеллой может быть пересчитана в константу связывания с лишщным бислоем при помощи простого соотношения:

(14)

Что дает оценку для константы связывания с бислоем для цитотоксина I А'л^, - 2.3*10* M"1, а для цнтотоксина II K^ç, ™ 2.3хЮ3 M"',

В четвертой ч*«ти второй главы изучается связывание спин-меченого аналога цнтотоксина 11 с модельной липидной мембраной. Спин-меченый аналог цнтотоксина был получен присоединением нитрокенльной спиновой метки к боковой цепи Lys35, Спектры ЭПР спин-меченого аналога цнтотоксина в водном растворе (рис. 7(а)) и при связывании с липидной мембраной (рис. 7(6)) позволяют отчетливо различить свободное и мембранос-вязаиное состояние цнтотоксина и получить кривую связывания цитотоксина с бислоем

Полученные экспериментальные данные анализировали в рамках модели Гуи-Чапмена, которая в данной работе была модифицирована с целью учета отличия заряда белка в растворе (г«) от заряда после связывания с липидной мембраной {:р»У

здесь К (М"'> — константа связывания белка с мембраной, которая наблюдалась бы в отсутствие электростатического взаимодействия между белком и липидной мембраной, -средний заряд липидной молекулы (=£ " -0.1 для использованных в данном эксперименте фосфолипидных липосом), р - доля липидной поверхности, доступной белку для связывания (р = 0,5), г,—заряд ионов электролита (г,« 1), Ь - параметр, учитывающий концентрацию электролита (6 = 15.2 для 25 мМ ацетатного буфера рН 5.5). Кривая связывания дает выражение для концентрации свободного белка в растворе О/от степени связывания белка с мембраной г. Вывод уравнения (15) основывается на предположении, что связывание заряженного белка с заряженной мембраной происходит в два этапа: (¡) электростатическое притяжение/отталкивание белка и мембраны, которое изменяет локальную концентрацию белка вблизи поверхности мембраны и (и) встраивание белка в мембрану с константой К с последующим изменением заряда мембраны.

В работе обсуждается физический смысл заряда белка в водном растворе (=/>?) и в комплексе с липидной мембраной (г™). Показано, что значительное различие двух зарядов может существенно повлиять на оценку константы связывания из экспериментальных данных. В случае цитотоксина II различие зарядов связано с изменением рКл боковой цепи остатка Ню31, которое изменяется от значения 5.15 в водном растворе до 5.75 в ком-

Рис. 7. Спектры ЭПР спин мещеного аналога цитотоксина И в водном растворе (а) и * комплексе с модельной липидной мембраной, состоящей из на 90% из яичного фосфита-дилхолина и на 10% из димиристоилфосфатидилглицерина (6). Кривая связывания спин-меченого цитотоксина II с модельной мембраной (в), полученная методом ЭПР.

(рис. 7(в)),

(15)

о

ÎÎ4S678S Ср/, мкМ

плексе с мицеллой ДФХ. Предположив, что аналогичное изменение имеет место при связывании с липидной мембраной, вводится дополнительное ограничение zm— гм + 0.5, что приводит к оценке значений параметров г«« 3.9, г™ ■» 4.4 и ЛГ - (8±3)х 103 М*1. Полученное значение константы связывания с липидной мембраной близко к полученному в предыдущей части значению К&„я " 2.3* 103 М*' для цитотоксина II, что подтверждает корректность используемых методик анализа экспериментальных данных.

Наблюдаемое различие в константе связывания цитогоксинов I и II Naja oxiana соответствуют различию в биологической активности цитогоксинов. Наблюдаемое изменение в структуре второй петли цитотоксина I при взаимодействии с мицеллой ДФХ в сравнении с отсутствием аналогичных изменений в структуре цитотоксина II представляет наглядный пример связи структуры и функции цитогоксинов из рода змей семейства Naja.

ВЫВОДЫ.

1. Методом ЯМР высокого разрешения рассчитана пространственная структура цитотоксина I Naja oxiana в двух средах: в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Структуры депонированы в Банк Данных Белков (PDB) с кодом 1RL5 (в водном растворе) и IZAD (в комплексе с мицеллой ДФХ).

2. Показано наличие связанной воды в петле II цитотоксина в водном растворе и ее отсутствие в комплексе с мицеллой ДФХ

3. Показано значительное изменение конформацни функционально важной петли II при переходе цитотоксина из водного раствора в липндное окружение.

4. Изучены pH-зависимости химических сдвигов цитотоксина I. Показано, что наблюдаемые изменения химических сдвигов и констант рКл, а так же их изменение при переходе из раствора в мицеллу находятся в согласии с полученными пространственными структурами, системой водородных связей и принятой моделью расположения цитотоксина на поверхности липидной мембраны.

5. Предложена математическая модель для описания химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белка при связывании с мицеллой.

6. На примере цитогоксинов I и II Naja oxiana показано, что совместный анализ химических сдвигов и коэффициента трансляционной диффузии позволяет оценить коопера-тивность/антикооперативность связывания белка с мицеллой, эффект вытеснения детергента из мицеллы и ожидаемую константу связывания белка с липидной мембраной.

7. При помощи спин-меченого аналога цитотоксина П Naja oxiana изучено связывание цитотоксина с липидной мембраной. Оценены значения эффективного заряда и константы связывания цитотоксина с мембраной. Последняя величина находится в согласии с константой, полученной при анализе связывания белка с мицеллой детергента.

8. На примере двух цитогоксинов из яда Naja oxiana продемонстрирована связь структуры и функции для данного класса белков.

Материалы диссертации изложены в следующих работи;

1. Уткин Ю.Н., Дубовский П.В., Дубинный М.А.. Жаравин В.А., Симонова Т.Н., Барсуков Л.И., Арсеньев A.C.. Спин-меченый по Lys35 щгготоксин II из яда кобры Naja oxiana для исследования его взаимодействия с фосфолипидными мембранами методом ЭПР. // Биоорган, химия, 1999, т. 25, № 12, с. 930-932.

2. Hubinnvi M Д.. Dubovskii P.V., Utkin Yu.N., SimonovaT.N., Barsukov L.I., Arseniev A.S. EPR study of the interaction of cytotoxin II from Naja oxiana with phospholipid membranes.

// Open Russian-Swedish Conference "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition", Moscow, Russia, 26 June-2 July, 2000, p.34

3. Дубинный M.А,. Дубовский П.В., Уткин Ю.Н., Симонова Т.Н., Барсуков Л.И., Арсеньев А.С. Изучение методом ЭПР взаимодействия цитотоксина II из ада кобры Naja oxiana с фосфолипидными мембранами. // Биоорган, химия, 2001, т. 27, № 2, с. 102-113.

4. Дубинный М.А.. Дубовский П.В., Уткин Ю.Н., Арсеньев А.С. Механизм рН-зависимой активации цитотоксина II из яда кобры Naja oxiana. It X юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине н экологии. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф. 2002. Труды, с. 373-375.

5. Дубинный М.А.. Дубовский П.В., Уткин ЮЛ., Сырцев Н.Г1, Арсеньев А.С. Анализ структуры комплекса белок-мицелла методом липедиых спиновых меток: новый количественный подход на примере цитотоксина II. // VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, Москва-Пущино, Россия, 25 ноября -2 декабря 2002 г., тезисы докладов, с. 54-55.

6. Dubovskii P.V., Lesovoy D.M., Dubinnvi M.A.. Utkin Yu.N., Arseniev A.S. Interaction of the P-type cardiotoxin with phospholipid membranes. // Eur. J. Biochem. 2003. v. 270 (9), p. 2038-2046.

7. Феофанов A.B., Шаронов Г.В., Дубинный M. А.. Астапова М.В,, Кудели на И.А., Дубовский П.В., Родионов Д.И., Уткин Ю.Н., Арсеньев А.С.. Сравнительное исследование структуры и активности цитотоксинов из яда кобр Naja oxiana, Naja kaouthia и Naja haje. // Биохимия, 2004, т. 69, № 10, C.1410-142I.

8. Dubovskii P.V., Lesovoy D.M.. Dubinnyj M Аг Konshina A.G., Utkin Yu.N., Efremov R,G. and Arseniev A.S. Interaction of three-finger toxins with phospholipid membranes: comparison ofS-type versus P-type cytotoxin. //Biochem. J., 2005, v. 387, p. 807-815.

9. Лесовой Д.М., Дубинный M.А.. Дубовский П.В. Анализ "Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий с помощью программы P-F1T. // XVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2005, Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 69.

10. Dubinnvi M A., Lesovoy D.M., Dubovskii P.V., Chupin V.V. and Arseniev A.S. Modeling of JlP-NMR Spectra of Magnetically Oriented Phospholipid Liposomes. A new analytical solution. // Solid Stale Nucl. Magn, Reson., 2006, v. 29, p. 309-315.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Дубинный, Максим Анатольевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

§ 1. Семейство трехпетлевых (трехпальцевых) белков из яда змей

§ 2. Структурные исследования цитотоксинов.

Глава 2. Результаты и обсуждение

§ 1. Исследование структуры ЦТ I методом ЯМР.

1.1. Приготовление образцов и сбор ЯМР данных

1.2. Отнесение сигналов и расчет структуры.

1.3. Поиск прочно связанных молекул воды в ЦТ I.

§ 2. Исследование ионогенных групп ЦТ I и ЦТ II.

2.1. Анализ данных по рН-зависимости химических сдвигов цитотоксинов.

2.2. Ионогенные группы боковых цепей цитотоксина I

§ 3. Исследование динамического равновесия в системе цитотоксин/мицелла ДФХ.

3.1. Модель для анализа химического сдвига в системе белок/мицелла.

3.2. Модель для анализа коэффициента трансляционной диффузии белка в комплексе с мицеллой.

3.3. Модели для кп и Мп

3.4. Эксперименты по измерению зависимости химических сдвигов и трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II от концентрации ДФХ

3.5. Анализ изменений химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов

ЦТ I и ЦТ II.

§ 4. Связывание спин-меченого ЦТ II с модельной липидной мембраной

4.1. Материалы и методы.

4.2. Модель Гуи-Чапмена.

4.3. Связывание СМЦТ II с липидной мембраной.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами"

Актуальность темы. Яды змей семейства Elapidae - сложная смесь биологически активных полипептидов, которая включает нейротоксины, цитотоксины, фосфолипазы и другие биологически активные компоненты. Нейротоксины взаимодействуют с ацетилхолиновыми рецепторами, блокируя передачу нервного импульса. Цитотоксины гомологичны ней-ротоксинам по аминокислотной последовательности и пространственной структуре, но отличаются широким спектром биологической активности.

Различные представители семейства цитотоксинов способны усиливать сердцебиение при низких концентрациях и вызывать остановку сердца при высоких концентрациях (за что они получили другое название кардиотоксины), вызывать деполяризацию мышечных клеток. В больших концентрациях цитотоксины вызывают лизис фосфолипид-ных везикул и клеточных мембран, дестабилизируют структуру липид-ного бислоя, вызывают межмембранное смешивание липидов. Цитотоксины способны связываться с гепарином, который способствует проникновению цитотоксинов в мембрану. Цитотоксины обладают повышенной токсичностью по отношению к раковым клеткам. Большинство исследованных цитотоксинов вызывают гибель клеток по механизму цитолиза, за исключением цитотоксина III Naja atra, для которого показана апоптотическая активность по отношению к клеткам лейкемии человека К562, клеткам рака кишечника Со1о205, а так же CD8+ лимфоцитам человека. Считается перспективным создание противораковых средств на основе природных или модифицированных цитотоксинов.

Цитотоксины представляют собой /^-структурные амфифильные од-ноцепочечные белки длиной 59-62 аминокислотных остатка и массой 6-7 кДа. В настоящий момент известны аминокислотные последовательности 81 цитотоксина из яда змей рода Naja, из них только для 11 цитотоксинов проводились структурные исследования и получена пространственная структура методом ЯМР или рентгеноструктурного анализа. Все известные цитотоксины имеют высокую степень гомологии по аминокислотной последовательности и пространственной структуре. Пространственная структура цитотоксинов включает два /?-слоя по два и три ß-тяжа в каждом, а так же три функционально важных «петли» цитотокси-на. Структура стабилизирована четырьмя консервативными дисульфид-ными связями. Небольшие различия в аминокислотной последовательности и пространственном строении трех петель цитотоксинов определяют различие в спектре их биологической активности.

В настоящий момент не представляет сомнений, что биологическое действие цитотоксинов на клетку включает взаимодействие с липидной мембраной, в частности, с плазматической мембраной клетки. Изучение структуры и функции мембранных белков наталкивается на целый ряд методических трудностей. Мембраносвязанный белок не дает спектра ЯМР высокого разрешения и не может быть закристаллизован, что затрудняет использование стандартных методик определения пространственной структуры белка. Один из путей преодоления данной трудности — использование детергентных мицелл, как систем моделирующих мембранное окружение. Вследствие меньшей молекулярной массы детергент-ные мицеллы позволяют наблюдать спектр ЯМР высокого разрешения и во многих случаях делают возможным расчет пространственной структуры белка.

Несмотря на наличие соответствующих методик, в настоящий момент детали взаимодействия цитотоксинов с липидными мембранами недостаточно изучены и вызывают разногласия между различными группами исследователей. Пространственная структура в комплексе с мицеллой получена только для одного цитотоксина, это структура цитотокси-на II из яда Naja oxiatia, все остальные структуры получены в водном растворе (методом ЯМР) или в кристалле (методом рентгеноструктур-ного анализа). За исключением того же цитотоксина II не изучено влияние липидного окружения на пространственную структуру цитотоксинов, недостает прямых данных об участках цитотоксинов, вовлеченных в непосредственное взаимодействие с мембраной/мицеллой. Различные исследователи предполагают существование функционально важных комплексов из нескольких молекул цитотоксина на поверхности мембраны, однако прямых подтверждений существования таких комплексов в мем-бранах/детергентных мицеллах в настоящий момент не получено.

Цель исследования. Данная работа ставит целью комплексное изучение двух цитотоксинов из яда кобры Naja oxiana: цитотоксинов I и II методами ЯМР и ЭПР спектроскопии. Данная цель подразумевает:

1. Получение пространственной структуры цитотоксина I из яда Naja oxiana в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ методом ЯМР высокого разрешения.

2. Измерение рКа боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков, анализ влияния липидного окружения на структуру и свойства заряженных аминокислотных остатков цитотоксина I.

3. Изучение взаимодействия цитотоксинов с мицеллой/липидной мембраной. Мониторинг связывания цитотоксинов с мицеллой методом ЯМР и с липидной мембраной методом ЭПР с использованием спин-меченого аналога цитотоксина II.

Методы исследования. В работе применяются методы гомоядерной одномерной и двумерной ]Н ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Для моделирования мембранного окружения при расчете структуры цитотоксина I использованы дейтерированные мицеллы додецилфосфа-тидилхолина (ДФХ). Отнесение сигналов белка производится методом последовательного отнесения сигналов, водородные связи выделяются на основе скоростей дейтерообмена амидных протонов. Ограничения на торсионные углы определяются из значений констант спин-спинового взаимодействия. Связанная молекула воды идентифицируется при помощи NOESY и ROESY спектроскопии, ее наличие проверяется методом молекулярной динамики в явно заданном растворителе. Структура белка рассчитывается на основе ограничений, полученных из двумерных NOESY спектров белка и констант спин-спинового взаимодействия минимизацией штрафной функции в программе CYANA.

Константы рКа депротонирования боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков определяются по изменению химических сдвигов в двумерных спектрах ЯМР.

Взаимодействие цитотоксинов с мицеллой ДФХ изучается мониторингом химических сдвигов в двумерных спектрах белка и коэффициента трансляционной диффузии белка методом градиентного спин-эха. Для анализа полученных данных разрабатывается оригинальная математическая модель, которая позволяет одновременно анализировать изменения химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белок/мицеллярного комплекса.

Взаимодействие цитотоксина II с модельной липидной мембраной изучается методом ЭПР спектроскопии с использованием спин-меченого аналога цитотоксина. Кривая связывания с липидной мембраной анализируется в рамках модели Гуи-Чапмена.

Основные задачи исследования.

1. Получить гомоядерные 'Н-ЯМР спектры высокого разрешения, произвести полное отнесение сигналов и рассчитать пространственную структуру цитотоксина I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, моделирующей мембранное окружение;

2. Провести титрование цитотоксинов I и II в диапазоне рН 2.0-7.0 и определить рКа отрицательно заряженных ионогенных групп цитотоксинов и изменения химических сдвигов Ад близлежащих атомов для обоих цитотоксинов в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ;

3. Проанализировать связывание цитотоксинов с мицеллой ДФХ по данным об изменении химических сдвигов и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов для различного соотношения белок/детергент. Выявить наличие/отсутствие кооперативное™ связывания молекул цитотоксина, определить количество молекул цитотоксина, способных связаться с мицеллой и оценить константу связывания.

4. Изучить связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с липидной мембраной методом ЭПР. Получить кривую связывания, проанализировать в рамках модели Гуи-Чапмена и определить константу связывания и эффективный заряд цитотоксина. Сравнить данные, полученные для взаимодействия с мембраной с данными по взаимодействию с мицеллой ДФХ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Все результаты, изложенные в настоящей работе, получены впервые.

1. Получена структура высокого разрешения для цитотоксина I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Обнаружена связанная молекула воды в составе второй петли цитотоксина I в водном растворе. Показано, что при связывании с мицеллой ДФХ происходит сильное изменение структуры второй петли цитотоксина. Факт существенного изменения структуры цитотоксина при связывании с мицеллой показан для цитотоксинов впервые.

2. Анализ рН—зависимостей химических сдвигов цитотоксина I показал высокую консервативность свойств заряженных остатков Азр40 и АБр57 и выявил особую роль остатка Азр29 в конформации второй петли молекулы.

3. По данным об изменении химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии построена модель связывания токсинов с мицеллой. Согласно данной модели цитотоксины связываются с мицеллой ДФХ антикооперативно, что говорит против формирования комплекса из нескольких молекул токсина. Константа связывания первой молекулы с мицеллой согласуется с константой связывания спин-меченого цитотоксина с липидным бислоем. Показано, что для корректного описания диффузионных данных необходимо учесть вытеснение части детергента из состава мицеллы при связывании молекулы цитотоксина.

4. Изучено связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с модельной липидной мембраной, кривая связывания описана моделью Гуи-Чапмена и определена константа связывания цитотоксина с липидной мембраной.

Разработанные в настоящей диссертации методики представляют самостоятельный интерес и могут быть применены к исследованию других мембраносвязывающихся белков. Модель динамического равновесия в системе белок-мицелла может быть использована при анализе ЯМР данных для определения количества молекул белка, связанного с мицеллой, выявления кооперативности/антикооперативности связывания белков с мицеллой, а так же для оценки объема белка, погруженного в мицеллу через способность белка вытеснять часть детергента при связывании с мицеллой. Несмотря на то, что изменение химических сдвигов и трансляционной диффузии традиционно используются при изучения формирования белок/белковых и белок/лигандных комплексов, изучение формирования комплекса белка с мицеллой на основе аналогичных данных является новым подходом.

Основные результаты работы опубликованы в реферируемых журналах [1,2,3,4,5,6] и тезисах конференций [7,8,9,10].

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав включая литературный обзор, заключения, выводов и списка литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дубинный, Максим Анатольевич

Выводы

1. Методом ЯМР высокого разрешения рассчитана пространственная структура цитотоксина I Naja oxiana в двух средах: в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Структуры депонированы в Банк Белковых Структур (PDB) с кодом 1RL5 (в водном растворе) и IZAD (в комплексе с мицеллой ДФХ).

2. Показано наличие связанной воды в петле II цитотоксина в водном растворе и ее отсутствие в комплексе с мицеллой ДФХ. Установлено значительное изменение конформации функционально важной петли II при переходе цитотоксина из водного раствора в липидное окружение.

3. Изучены pH-зависимости химических сдвигов цитотоксина I. Показано, что наблюдаемые изменения химических сдвигов и констант рКа, a так же их изменение при переходе из раствора в мицеллу находятся в согласии с полученными пространственными структурами, системой водородных связей и принятой моделью расположения цитотоксина на поверхности липидной мембраны.

4. Предложена математическая модель для описания химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белка при связывании с мицеллой.

5. На примере цитотоксинов I и II Naja oxiana показано, что совместный анализ химических сдвигов и коэффициента трансляционной диффузии позволяет оценить кооперативность/антикооперативность связывания белка с мицеллой, эффект вытеснения детергента из мицеллы и ожидаемую константу связывания белка с липидной мембраной.

6. При помощи спин-меченого аналога цитотоксина II Naja oxiana изучено связывание цитотоксина с липидной мембраной. Оценены значения эффективного заряда и константы связывания цитотоксина с мембраной. Последняя величина находится в согласии с константой, полученной при анализе связывания белка с мицеллой детергента.

7. На примере двух цитотоксинов из яда Naja oxiana продемонстрирована связь структуры и функции для данного класса белков.

Заключение

В первой части настоящей работы всесторонне изучена структура ЦТ I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, моделирующей мембранное окружение. Во второй петле цитотоксина обнаружена прочно связанная долгоживущая молекула воды, которая стабилизирует структуру петли II цитотоксина при помощи четырех водородных связей. Подобная структура второй петли характерна для большинства изученных цитотоксинов. Отличительной особенностью ЦТ I является «потеря» связанной воды при переходе в липидное окружение мицеллы ДФХ. Это является первым отличием от изученной ранее структуры ЦТ II [55,56]. Данное различие связано с уникальным для ЦТ I остатком Asp29, который изменяет свою конформацию, чтобы избежать неблагоприятного контакта с гидрофобным окружением мицеллы.

Неожиданным для данного цитотоксина является его связывание с мицеллой всеми тремя функциональными петлями, так как предварительные расчеты методом Монте-Карло предсказывали связывание только одной петлей цитотоксина [90]. Данное расхождение было связано с тем, что в моделировании использовалась структура цитотоксина I из яда Naja atra, полученная без учета молекулы связанной воды во второй петле. Моделирование связывания с мембраной с использованием структуры ЦТ I (PDB код 1RL5) показало [5], что ЦТ I связывается с мембраной всеми тремя петлями, хотя и с меньшим значением свободной энергии.

Анализ ионогенных групп цитотоксина I, проведенный во второй части данной работы, находится в согласии с полученными структурными данными. Остатки аспарагиновых кислот Asp40 и Asp57 присутствуют во всех цитотоксинах и стабилизируют структуру водородными связями и благоприятными электростатическими взаимодействиями. Остаток Asp29 уникален для ЦТ I. Под его влиянием структура второй петли претерпевает сильные конформационные изменения при связывании с мицеллой ДФХ. По-видимому, именно Asp29 ответственен за то, что константа связывания ЦТ I с мицеллой ДФХ на порядок меньше константы связывания ЦТ II, как установлено в третьем разделе данной представленной работы. Это второе обнаруженное отличие от цитоток-сина II, которое так же проявляет себя в меньшей цитотоксичности ЦТ I по отношению к различным группам клеток [4].

Заряженный остаток Glul6 так же отличает ЦТ I от ЦТ II, однако присутствует во многих других аминокислотных последовательностях цитотоксинов, например, в цитотоксине А5 из Naja atra, который способен связываться с aVß3 интегрином. Здесь можно выдвинуть гипотезу, что аминокислотная последовательность EGK (Glu-Gly-Lys), которая присутствует во всех цитотоксинах, содержащих остаток Glul6, является «перевернутым» RGD-мотивом, который не был обнаружен в интегрин-связывающем цитотоксине А5. Данная гипотеза требует дополнительной теоретической и экспериментальной проверки.

Метод анализа трансляционной диффузии и химического сдвига белков, разработанный в третьей части настоящей работы, является довольно сложным математическим построением. Метод учитывает сразу три явления, которые раньше никогда не рассматривались одновременно: эффект вытесненного объема, изменение размера мицеллы и изменение константы связывания белка с мицеллой. Наградой за сложность модели является не только хорошее согласие измеренных параметров с экспериментом (см. рис. 11), но и разумные значения свободных параметров модели. В частности, полученное значение константы связывания цито-токсина II с мицеллой хорошо согласуется с константой связывания токсина с липидным бислоем, измеренной в четвертой части работы. Параметр модели р > 2.5 говорит об антикооперативности связывания молекул обоих токсинов с мицеллой детергента, что опровергает гипотезу формирование комплексов из нескольких молекул цитотоксина в мицелле, по крайней мере для ЦТ I и ЦТ II Naja oxiana. Параметр ДМ характеризует вытеснение детергента связавшимся токсином и при определенных оговорках может служить мерой погруженности белка в мицеллярное окружение.

Таким образом методическая часть настоящей работы эффективно дополняет проведенные структурные исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Дубинный, Максим Анатольевич, Москва

1. М.А. Дубинный, П.В. Дубовский, Ю.Н. Уткин, Т.Н. Симонова, Л.И. Барсуков, А.С. Арсеньев, Изучение методом ЭПР взаимодействия цитотоксина II из яда кобры Naja oxiana с фосфолипидными мембранами, Биоорган, химия 27 (2) (2001) 102-113.

2. P.V. Dubovskii, D.M. Lesovoy, М.А. Dubinnyi, Y.N. Utkin, A.S. Arseniev, Interaction of the P-type cardiotoxin with phospholipid membranes., Eur J Biochem 270 (9) (2003) 2038-2046.

3. P.V. Dubovskii, D.M. Lesovoy, M.A. Dubinnyi, A.G. Konshina, Y.N. Utkin, R.G. Efremov, A.S. Arseniev, Interaction of three-finger toxins with phospholipid membranes: comparison of S- and P-type cytotoxins., Biochem J 387(Pt 3) (2005) 807-815.

4. M.A. Dubinnyi, D.M. Lesovoy, P.V. Dubovskii, V.V. Chupin, A.S. Arseniev, Modeling of 31P-NMR spectra of magnetically oriented phospholipid liposomes: A new analytical solution., Solid State Nucl Magn Reson. 29 (4) (2006) 305-311.

5. R. М. Kini, Molecular moulds with multiple missions: functional sites in three-finger toxins., Clin Exp Pharmacol Physiol 29 (9) (2002) 815822.

6. V. Tsetlin, Snake venom alpha-neurotoxins and other 'three-finger' proteins., Eur J Biochem. 264 (2) (1999) 281-286.

7. J. P. Changeux, The tiPS lecture, the nicotinic acetylcholine receptor: an allosteric protein prototype of ligand-gated ion channels., Trends Pharmacol Sci. 11 (12) (1990) 485-492.

8. G. A. Grant, V. A. Chiappinelli, kappa-bungarotoxin: complete amino acid sequence of a neuronal nicotinic receptor probe., Biochemistry. 24 (6) (1985) 1532-1537.

9. M. H. le Du, P. Marchot, P. E. Bougis, J. C. Fontecilla-Camps, 1.9-A resolution structure of fasciculin 1, an anti-acetylcholinesterase toxin from green mamba snake venom., J Biol Chem. 267 (31) (1992) 2212222130.

10. J. R. de Weille, H. Schweitz, P. Maes, A. Tartar, M. Lazdunski, Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel., Proc Natl Acad Sci USA. 88 (6) (1991) 2437-2440.

11. M. J. Dufton, R. C. Hider, Structure and pharmacology of elapid cytotoxins., Pharmacol Ther 36 (1) (1988) 1-40.

12. T. K. Kumar, G. Jayaraman, C. S. Lee, A. I. Arunkumar, T. Sivaraman, D. Samuel, C. Yu, Snake venom cardiotoxins-structure, dynamics, function and folding., J Biomol Struct Dyn 15 (3) (1997) 431-463.

13. T. Kumar, S. Pandian, G. Jayaraman, H.-J. Peng, C. Yu, Understanding the structure, function and folding of cobra toxins, Proc. Nat. Sci. Counc. (ROC) A 23 (1) (1999) 1-19.

14. A. Samson, T. Scherf, M. Eisenstein, J. Chill, J. Anglister, The mechanism for acetylcholine receptor inhibition by alpha-neurotoxins and species-specific resistance to alpha-bungarotoxin revealed by NMR., Neuron. 35 (2) (2002) 319-332.

15. E. Karlsson, M. Jolkkonen, E. Mulugeta, P. Onali, A. Adem, Snake toxins with high selectivity for subtypes of muscarinic acetylcholine receptors., Biochimie. 82(9-10) (2000) 793-806.

16. Y. Bourne, P. Taylor, P. Marchot, Acetylcholinesterase inhibition by fasciculin: crystal structure of the complex., Cell 83 (3) (1995) 503512.

17. P. Marchot, C. N. Prowse, J. Kanter, S. Camp, E. J. Ackermann, Z. Radic, P. E. Bougis, P. Taylor, Expression and activity of mutants of fasciculin, a peptidic acetylcholinesterase inhibitor from mamba venom., J Biol Chem. 272 (6) (1997) 3502-3510.

18. O. Yasuda, S. Morimoto, B. Jiang, H. Kuroda, T. Kimura, S. Sakakibara, K. Fukuo, S. Chen, M. Tamatani, T. Ogihara, FS2. a mamba venom toxin, is a specific blocker of the L-type calcium channels., Artery. 21 (5) (1994) 287-302.

19. R. M. Kini, R. A. Caldwell, Q. Y. Wu, C. M. Baumgarten, J. J. Feher,

20. K. J. Schleifer, Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2., J Comput Aided Mol Des. 11 (5) (1997) 491-501.

21. M. J. Sutcliffe, M. Jaseja, E. I. Hyde, X. Lu, J. A. Williams, Three-dimensional structure of the RGD-containing neurotoxin homologue dendroaspin., Nat Struct Biol. 1 (11) (1994) 802-807.

22. J.-P. Xiong, T. Stehle, R. Zhang, A. Joachimiak, M. Freeh, S. L. Goodman, M. A. Arnaout, Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha vbeta3 in complex with an arg-gly-asp ligand., Science. 296 (5565) (2002) 151-155.

23. B. Rees, A. Bilwes, J. P. Samama, D. Moras, Cardiotoxin VIM from Naja mossambica. the refined crystal structure., J Mol Biol 214 (1) (1990) 281-297.

24. J. F. O'Connell, P. E. Bougis, K. Wiithrich, Determination of the nuclear-magnetic-resonance solution structure of cardiotoxin CTX lib from Naja mossambica., Eur J Biochem 213 (3) (1993) 891-900.

25. A. Bilwes, B. Rees, D. Moras, R. Menez, A. Menez, X-ray structure at 1.55 A of toxin gamma, a cardiotoxin from Naja nigricollis venom, crystal packing reveals a model for insertion into membranes., J Mol Biol 239 (1) (1994) 122-136.

26. M. Dauplais, J. M. Neumann, S. Pinkasfeld, A. Menez, C. Roumestand, An NMR study of the interaction of cardiotoxin gamma from Naja nigricollis with perdeuterated dodecylphosphocholine micelles., Eur J Biochem 230 (1) (1995) 213-220.

27. W. Jahnke, D. F. Mierke, L. Beress, H. Kessler, Structure of cobra cardiotoxin CTX I as derived from nuclear magnetic resonance spectroscopy and distance geometry calculations., J Mol Biol 240 (5) (1994) 445-458.

28. R. Bhaskaran, C. C. Huang, Y. C. Tsai, G. Jayaraman, D. K. Chang, C. Yu, Cardiotoxin II from taiwan cobra venom, Naja atra. structure in solution and comparison among homologous cardiotoxins., J Biol Chem 269 (38) (1994) 23500-23508.

29. Y.-C. Sun, S.-F. Yang, I.-L. Hwang, T.-H. Wu, A 500-ps molecular dynamics simulation trajectory of cardiotoxin II from taiwan cobra venom in solution: correlation with NMR and X-ray crystallography data, J Comput Chem 20 (5) (1999) 546-562.

30. A. K. Singhal, K. Y. Chien, W. G. Wu, G. S. Rule, Solution structure of cardiotoxin V from Naja atra., Biochemistry 32 (31) (1993) 8036-8044.

31. A. G. Konshina, P. E. Volynskii, A. S. Arseniev, R. G. Efremov, interaction of cardiotoxin A5 with a membrane: role of conformational heterogeneity and hydrophilic properties., Bioorg Khim 29 (6) (2003) 577-588.

32. D. V. Dementieva, E. V. Bocharov, A. S. Arseniev, Two forms of cytotoxin II (cardiotoxin) from Naja oxiana in aqueous solution: spatial structures with tightly bound water molecules., Eur J Biochem 263 (1) (1999) 152-162.

33. P. V. Dubovskii, D. V. Dementieva, E. V. Bocharov, Y. N. Utkin, A. S. Arseniev, Membrane binding motif of the P-type cardiotoxin., J Mol Biol 305 (1) (2001) 137-149.

34. R. Bhaskaran, C. C. Huang, D. K. Chang, C. Yu, Cardiotoxin III from the taiwan cobra (Naja atra). determination of structure in solution and comparison with short neurotoxins., J Mol Biol 235 (4) (1994) 1291-1301.

35. S. C. Sue, H. C. Jarrell, J. R. Brisson, W. G. Wu, Dynamic characterization of the water binding loop in the P-type cardiotoxin: implication for the role of the bound water molecule., Biochemistry 40 (43) (2001) 12782-12794.

36. F. Forouhar, W.-N. Huang, J.-H. Liu, K.-Y. Chien, W. Wu, C.-D. Hsiao, Structural basis of membrane-induced cardiotoxin A3 oligomerization., J Biol Chem 278 (24) (2003) 21980-21988.

37. S.-C. Lee, H.-H. Guan, C.-H. Wang, W.-N. Huang, S.-C. Tjong, C.-J. Chen, W. Wu, Structural basis of citrate-dependent and heparan sulfatemediated cell surface retention of cobra cardiotoxin A3., J Biol Chem 280 (10) (2005) 9567-9577.

38. E. Grishin, A. Sukhikh, T. Adamovich., Y. Ovchinnikov, Isolation, properties and sequence determination of the two cytotoxins from the venom of the middle-asian cobra Naja naja oxiana, Bioorg Khim 2 (8) (1976) 1018-1034.

39. J. Cavanagh, W. J. Fairbrother, A. G. lii Palmer, N. J. Skelton, Experimental !H NMR methods, Academic Press, 1996, Ch. 6, pp. 301— 409.

40. A. Bax, D. Davis, MLEV-17 based two-dimensional homo-nuclear magnetization transfer spectroscopy, J Magn Reson 65 (1985) 355— 360.

41. C. Griesinger, G. Otting, K. Wüthrich, R. Ernst, Clean TOCSY for lH spin system identification in macromolecules, J Am Chem Soc 110 (23) (1988) 7870-7872.

42. L. Mitschang, J. Keeler, A. Davis, K. Oschkinat, Removal of zero-quantum interference in NOESY spectra of proteins by utilizing the natural inhomogeneity of the radiofrequency field, J Biomol NMR 2 (6) (1992) 545-556.

43. M. Piotto, V. Saudek, V. Sklenär, Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions., J Biomol NMR 2 (6) (1992) 661-665.

44. V. Sklenär, M. Piotto, R. Leppik, V. Saudek, Gradient-tailored water-suppression for !H-15N HSQC experiments optimized to retail full sensitivity, J Magn Reson, Series A 102 (2) (1993) 241-245.

45. C. Bartels, T. Xia, M. Billeter, P. Güntert, K. Wüthrich, The program XEASY for computer-supported NMR spectral analysis of biological macromolecules, J Biomol NMR 6 (1) (1995) 1-10.

46. F. Delaglio, S. Grzesiek, G. Vuister, G. Zhu, J. Pfeifer, A. Bax, NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes., J Biomol NMR 6 (3) (1995) 277-293.

47. F. Delaglio, Z. Wu, A. Bax, Measurement of homonuclear proton couplings from regular 2D COSY spectra., J Magn Reson 149 (2) (2001) 276-281.

48. K. Wüthrich, NMR of proteins and nucleic acids, John Willey & Sons, Inc, 1986.

49. K. Wüthrich, Sequence-specific resonance assignment in proteins, Ch. 8, in: 72., pp. 130-161.

50. K. Wüthrich, Polypeptide secondary structures in proteins by NMR, Ch. 9, in: 72., pp. 162-175.

51. G. Otting, К. Wiithrich, Studies of protein hydration in aqueous solution by direct NMR observation of individual protein-bound water molecules, J Am Chem Soc 111 (1989) 1871-1875.

52. A. Bundi, K. Wiithrich, Use of amide 'H-NMR titration shifts for studies of polypeptide conformation, Biopolymers 18 (2) (1979) 299311.

53. T. Szyperski, W. Antuch, M. Schick, A. Betz, S. R. Stone, K. Wiithrich, Transient hydrogen bonds identified on the surface of the NMR solution structure of hirudin., Biochemistry 33 (31) (1994) 9303-9310.

54. Ч. Кантор, П. Шиммел, Биофизическая химия. Том II. Методы исследования структуры и функции биополимеров, Мир, Москва, 1985.

55. F. Perrin, The brownien movement of an ellipsoide. the dielectric dispersion of ellipsoidal molecules., J. Phys. Radium 5 (1934) 497-511.

56. F. Perrin, Brownian movement of an ellipsoid (II). free rotation and depolarisation of fluourescences. - translation and diffusion of ellipsoidal molecules, J. Phys. Radium 7 (1936) 1-11.

57. J. J. Chou, J. L. Baber, A. Bax, Characterization of phospholipid mixed micelles by translational diffusion., J Biomol NMR. 29 (3) (2004) 299308.

58. M. Tokuyama, I. Oppenheim, Dynamics of hard-sphere suspensions., Physical Review. E. 50 (1) (1994) R16-R19.

59. M. Tokuyama, I. Oppenheim, On the theory of concentrated hard-sphere suspensions., Physica A. 261 (1-2) (1995) 85-119.

60. B. Jonsson, H. Wennerstrom, P. G. Nilsson, P. Linse, Self-diffusion of small molecules in colloidal systems, Colloid Polym. Sci. 264 (1) (1986) 77-88.

61. P. Venema, P. Struis, J. Leyte, D. Bedeaux, The effective self-diffusion coefficient of solvent molecules in colloidal crystalls, J. Colloid Interface Sci. 141 (2) (1991) 360-373.

62. H. Johannesson, B. Halle, Solvent diffusion in ordered macrofluids: A stochastic simulation study of the obstruction effect, J. Chem. Phys. 104 (17) (1996) 6807-6817.

63. C. Ferreira, J. L. Lopez, Asymptotic expansions of the Hurwitz-Lerch zeta function, J. Math. Anal. Appl. 298 (1) (2004) 210-224.

64. M. Lerch, Note sur la fonction d\{u,x,s) = ET=o e<2kmx/+ kY> Acta Math. 11 (1887) 19-24.

65. A. S. Altieri, D. P. Hinton, R. A. Byrd, Association of biomolecular systems via pulsed field gradient NMR self-diffusion measurements, J. Am. Chem. Soc. 117 (28) (1995) 7566-7567.

66. R. G. Efremov, P. E. Volynsky, D. E. Nolde, P. V. Dubovskii, A. S. Arseniev, Interaction of cardiotoxins with membranes: a molecular modeling study., Biophys J 83 (1) (2002) 144-153.

67. G. Beschiaschvili, J. Seelig, Peptide binding to lipid bilayers. binding isotherms and zeta-potential of a cyclic somatostatin analogue., Biochemistry. 29 (49) (1990) 10995-11000.

68. G. Beschiaschvili, J. Seelig, Melittin binding to mixed phosphatidylglycerol/phosphatidylcholine membranes., Biochemistry. 29 (1) (1990) 52-58.

69. J. Seelig, Titration calorimetry of lipid-peptide interactions., Biochim Biophys Acta. 1331 (1) (1997) 103-116.

70. G. Schwarz, G. Beschiaschvili, Thermodynamic and kinetic studies on the association of melittin with a phospholipid bilayer., Biochim Biophys Acta. 979 (1) (1989) 82-90.