Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение вязкости мембран нерва с помощью РКР спектроскопии при ритмическом возбуждении

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение вязкости мембран нерва с помощью РКР спектроскопии при ритмическом возбуждении"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ 1! ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имвии М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологачвский факультет

На правах рукописи УДК 577.3

ЧОХАРАДЗЕ Тейиураз Ашгранович

ИЗУЧЕНИЕ ВЯЗКОСТИ МЕМБРАН НЕРВА С ПОМОЩЬЮ ИСР СПЕКТРОСКОПИИ ПРИ РИТМИЧЕСКОМ ВОЗБУЖДЕНИИ.

(ОЗ.СО.02.- биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации но соискание ученой степени

кандидата фазико-матоматичаских наук

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического -факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

Доктор фаз.-чат. наук» профессор В.З. Паценко Кандидат биологических наук Г.В. Макашов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук

академик РАНЦ,профессор С.И. Орлов,

Доктор физ.ниат. наук и.П. Цвирко

Ведущее учреждение: НИИ общей патологии и патологической физиологии АМН.

Защита состоится " £■) ." кО^М 1992г. в {6

ъо

часов на заседании специализированного совета К. 053.05.68 в Московском государственном университете имени Ы.В. Ломоносова по адресу: ПЭ8Э9, Москва. Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

" 1992 года

Учений секретарь сто циализированного совета, . Доктор биологических наук В.Л. Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящей Еремя большое распространение в биофизике клетки полутали оптические метода исследования (светорассеяние, двойное лучепреломление, флуорометрия, Рамзп и Ш- спектроскопия). Одним из перспективных методов исследования возбудимых клеток при функционировании является спектроскопия комбинационного рассеяния, которая позволяет регистрировать изменения состояния ряда молекул (Левин,1976, 57,а1сг^а1 сЬ.а!, 1977) и позволяет характеризировать изменения в мембранных, белках и липидах. (Кэри, 1985). Первые эксперимента, выполненные на различных нервах с использованием РКР-спектроскопии, показали наличие в первую очередь спектра, характерного для С^-каротиноидов, а также других компонентов клеточных комбран. Вместе с том оказалось, что при изучении методом спектроскопии КР изменений вязкости возбудимой мембраны аксона, с помощью регистрации с-Н колебания жирных кислот липидов, возникают определенные трудности: сигнал от с40-каротиноидов столь велик, что исключает возможность регистрации колебаний других компонентов мембраны. Однако, на наш взгляд, исследование изменений состоянии собственно каротиноидов, минорного компонента лшщдного мвтрикса мембраны, макет служить природной РКР-меткой и позволит судить о состоянии мембраны. До настоящего времени систематических исследовании .спектров РКР . каротиноидов в нервах ш . проводилось, но отдельные работы в этой области указывали на такую возможность. Так, Залонтай и др. показал! что ритмическое возбуждение приводит к изменению состоянии молекулы каротиногда (8га1опЪа1 еЬ а1, 1977). В работах Максимова и др. было показано, что изменение состоянии каротиноидов коррелирует ссг степенью активации потенциалозависишх На- и Са- каналов (Максимов и др,1985, Мах Злю V е-Ь а1, 1990 ). О другой стороны обнаружено, что состояние каротиноидов зависит так же и от уровня бглок-липидных взаимодействий и, в первую очередь, связанных с изменением нонфоргации БН- группы поверхностных белкоЕ аксолемы и

- 2 -

мшровязкости ллпидов (Мусурзлиева, 1989).

Таким образом, гыявлекиз степени зависимости вязкости возбудимой мембраны с помощью природной РКР-метки при функционировании норва представляется актуальным в изучении механизмов ионного транспорта.

Целью работы являлось развитие метода спектроскопии РКР клетки для определения характера изменения состояния липидной фазы аксолеммы при проведении возбуаздения.

В работе били поставлены следующие задачи:

1. С помощью КР спектроскопии установить распределение молекул каротиноидов в нервном волокне.

2. С целью опродолоиия места локализации молекул каротиноидов в липидном бислоэ исследовать температурную зависимость ЭПР сигнала спин-маток жирной кислоты и РКР спектров каротиноидов.

3. Изучить изменение - состояния каротиноидов в нерве при про-водеши ритмического возбуждения с разной длительностью стимулирующего импульса.

4. Изучить профили возбуждения основных, линий спектра РКР каротиноидов при проведении ритмического возбуждения и блоке натриевого канала.

5. Установить зависимость между характером изменений спектров РКР каротиноидов (состояние молекул) от уровня микровязкости мембраны (действие изопропанола, ДОСО, п-ХМБ и НЯЙ).

Научная новизна работы. Впервые в прямом эксперименте на клетке показано, что основная часть молекул каротиноидов сосредоточена в аксолемме нервного волокна. Методами ЭПР и РКР спектроскопии показано, что в ексолэмме каротиноиды локализованы в неполярной фазе. Установлена двухфазная зависимость изменения состояния каротиноидов при возбуждении нерва от длительности стимулирующего импульса (от 0,1 до 0,5 мсек). При крайних зна- . чениях выбранных длительностей .импульса выявлены составляющие компоненты данных изменений. Впервые показана возмокность регистрации изменения вязкости мембраны по изменению спектров РКР каротиноидов. Модификаторы микровязкости липидов (изопропвнол, ДМСО) или БН-групп поверхностных белков (п-ХЫБ) приводят к из-

- з -

менениям состояния каротиноидов таким же, как и при проведении ритмического возбуждения.

Практическое значение работа. Установлена возможность контроля направленного изменения проводимости нерва агентами, модифицирующими вязкость мембрана по изменениям спектров РКР ка-ротииокдов. Результата работы могут быть использовали с экспериментальной и клинической медицине для диагностики Еозбудкмос-ти нервных клеток в корма и при патологии.

Публикация результатов работ». По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на заседаниях секции биофизики МОИП (Москва, 1939, 1991), из первом международном конгрессе биофизики и биотехнологии ГАП (Диарбакир, 1991) и на первой Арабской конференции по медицинской физике (Каир, 1991).

Объем и структура работы. Диссортация изложена па ЦЭ страницах машинописного текста, включает 35 рисунков и состоит та введения, 4 глав, и списка цитируемой литературы из 15$ наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИЙ

Во введении обоснована актуальность теш, определона цель работы, сформулированы.положения, выносимые на защиту, показана научная новизна и приведено краткое содержание диссертации.

Первая глава является обзором литературы. В параграфе 1.1. рассмотрена морфология и электрофизиология нервного волокна. В параграфе 1.2. представлены современные данные, характеризующие состояние проблемы о физико-химиче ских изменениях в нерЕе при РВ. В параграфе 1.3. анализируется результаты исследований возбудимых мембран с помощью различных методов и функциональная роль каротиноидов в клетке. В параграфе 1.4. расмотрены общие принципы спектроскопии комбинационного рассеяния света. В параграфе 1.5. обсувдается роль каротиноидов в нервных волокнах. В параграфе 1.6. представлены исследования вязкости липидов мембран с помощью ЭПР и ЯМР спектроскопии.

■ - 4 -

Во второй главе описаны методики приготовления образцов, проведо1шя эксперимента и обработки результатов. В параграфе 2.1. описаны объекта исследования и обоснован их выбор.

Объектом исследования слукили изолированные седалишние нервы травяной лягушки (Rima temporaria) и нейроны виноградной улитки (Helix pomatia). Перед экспериментом нервы лягушки выдерживали не менее-30 минут в физиологическом растворе следующего состава (мМ): HaCl-111,2; К01-1.88; OaOlg-1,08; рН-7,2; t=18-200, а нейроны в среде.содержащей (MM):NaOl-80; К01-4; CaOlg-IO; MgOlg-5; Trio-HOl-5; pH- 7.8.

В опыт отбирали нервы, дающие при внеклеточном отведении потенциала действия приблизительно одинаковой амплитуда. ПД наблюдали на экране катодного осцилографа С1-19.

НерЕЫ раздражали ео влажной камере прямоугольными электрическими импульсами от стимулятора ЭСЛ-2. Длительность импульса от 0,1мсек до 0,5мсек, амплитуда 0,4-I,5V, частота 100иш/с8К.

'Згллттогмгмюитчт ттт-^ол тп\» тп* тгпт* Фокл-гл-потчта ТЙ_996П unuiiu^/iuiiumu 4 i~/w ,4^111/11 ж áí^JÜ Л uimíu^/U A jr yu АС/ W

■В параграфе 2.2. приведен метод регистрации мембранного потенциала (МП) и потенциала действия (ПД).

Для регистрации изменений МП и ГЩ использовали модифицированную методику воздушного мостика ( Тасаки, 1957 ). В первую ячейку камеры была встроена пара серебренных электродов. Вторая ячейка содержала раствор Рингера, а-третья служила воздушным мостиком. В четвертую ячейку помещался проксимальный участок iiopija размощонный в растворе 0,1 М КС1. Цепь замыкали агаровыми ■ мостиками, соединяющими 2 и 4 отсеки камеры с хлорсерэбрянными электродами, подключенными к усилителю У5-11. О усилителя сигнал поступал на самописец Н-306 и цифровой вольтметр B7-I6, или на осцилограф 01-74 в случае регистрации ПД.

В параграф© 2.3. описан метод изотопного анализа, с помощью которого регистрировали изменения связивания нервами 3н-оуабаина, %-фэсфатидшшэлинб и поглощения450а. При изменении температуры среда в ячейке в диапазоне от 0 до 30"о (О, 5, 10, 15, 20, 25, 30°С) нервы в течение 30 минут инкубировали, затем в течение 15 сек отмывали в растворе Рингера, не содержащем меченые соединения от внешне

радиоактивна* загрязнений, сушили и взвешивали. Определенно радиоактивности в нервах проводили методом жидкостной сщштиляции (Сцинтилятор КС-IOS) на установках Mark-2 и Interteohnique (Франция).

Установка для регистрации комбинационного рассеяния подробно описана в параграфе 2.4.. Для возбуждения спектров КР использовали различные типы газовых лазеров, генерирующих излучение с к= 441,6; 457,9; 488; 496,5; 501,7 и 514,5 нм. Рассеянное излучение собирали системой линз на входную щель монохроматора. Сканирование спектра РКР осуществляли двойным монохроматором ' ДФС-24, регистрацию сигналов РКР - фотоэлектронным умножителом типа ФЭУ-79, работающим в режиме счета фотонов. Накопление спектров проводили с помощью многоканального анализатора импульсов типа NÎA-1024 (Венгрия), спектры выводили на двухкоорди-натный графопостроитель. При исследовании РКР нерва лягушки использовали камеру, позволяющую одновременно регистрировать РКР и контролировать величину потенциала действия, которая в течение 3-4 часов эксперимента практически не изменялась.

В параграфе 2.5. приведен метод микроспектроскопии комбинационного рассеяния.

Спектра КР от отдельных участков нервного волокна исследовали с помощью КР-спектрометра "DILOR z-24" (Франция) с тройным0 монохроматором и фотоэлектронной регистрацией сигнала. Запись и обработку спектров проводили с помощью компьютера "EEQNAKD . PC/AT" (Франция). Источником возбуздения служиливргоновый лазер фирмы "SPECTRA-PHYSICS" модель 164-03 (США). С целью устранения плазменных линии, лежащих вблизи от возбуждающей, линии, перед ответным отделением помещали предмонохроматор "auaspî3-300S" (Франция) или интерференционный фильтр.Для получения спекров с пространственным разрешением, КР- спектрометр был состыкован с оптическим микроскопом "OIBEPüs вн-2" (Япония). При работа о нервами устанавливали водоиммерсионный объектив 100 х с числовой апгортурой 0,95 фирмы "ошмриз" (Япония), фокусируя лазерный луч в плоскости до размеров Л ыкм2. Установка диафрагмы диаметром 200 мкм позволяла достичь пространственного разрешения ¡го оси z примерно 4мкм. Таким обрвзом достигалось простран-

- 6 -

ствешгое разрешение около 4МКМ3.

В параграфе 2.6. описан метод ЭПР спектроскопии. Для регистрации структурных перестроек использовали спин- меченые производные зхирних кислот: 1-оксш-4; 4-даметил-2; 3- методи-карбонил; ОКСОЗОЛИДИН /МеГА51 10,3/ и /МеРА31 12,1/ в концентрациях 20 цмоль/л. Измерения проводили в стеклянном капилляра диаметром около I мм. Клетки помещали в капилляр после 30-45 минутной инкубации в растворе содержащем спин-метку. Спектры регистрировали на ЭПР-сшкгромвтре фирмы "Уагйап Е-9. Темпврату-

ги* г» г/омот~ю нонато х» ттиаттсюгчиа пт* *? ттгл 1Л ^пипшлпттлпатп| п

и 1 ч ич V) 111^, м суй и «1 О

помощью контактной термопары.

Для изучения состояния воды в нервных волокнах использовали метод ЯМР (параграф 2.7.). С помощью установки ЯМР-спиновоа эхо с цифровой регистрацией амплитуды эхо-сигналов (рабочая частота 17 мгц) и системой накопления, позволяющей суммировать и усреднять результаты отдельных измерений, регистрировали Еремя гаюн-сгашовой релаксации (Т^) протонов воды нервов (Аксенов и др., 1971). Для измерении т2 использовали импульсную последовательность: 90? 1, 180°; из зависимости амплитуды сигнала от а находили т2

В третьей главе изложены результаты оригинальных исследований. В параграфе 3.1. представлены результаты по исследованию распределения молекул каротиноидов в нерве с помощью микроспектроскопии КР. Спектры КР каротиноидов были обнаружены в мембране, но не в цитоплазме нервного волокна. На'Рис. (I А,Б) представлен участок спектра РКР каротиноидов (полоса 1522 см-1), при изменении положения фокуса поперек и вдоль волокна. Показано, что каротиноидц в аксолемме Еолокна могут быть локализованы либо е плазматической мембране, либо в миелиш. В облаете закрытого перехвата Ранвье, где миелин отсутствует, уровень сигнала снижался более чем на 20-25 %.

. Для выяснения механизмов изменения состояния каротиноидов, локализованных в аксолемме нервного волокна при РВ, было проведено исследование температурной зависимости ряда параметров характеризующих проведение РВ волокна (Колье, Максимов 1987). Наш проводились оценка микровязкости различных участков липид-

ного бислоя с помощью спин- меток жирной кислоты, а также процессов, характеризующих ионный транспорт мембраны - поглощение

ртэаоитэоиио гчта1Т1»'Тп»т7 п ЛПШГОФППП и а V _ ЛФЛа»э1т Зц

ии, Н ишшииылли и ми| 11 11

оуабаина. В ряде 'экспериментов проводили ингибиторный анализ

изменений РКР-спектра каротиноидов, модифицируя состояние

рио.1. Йзменения интенсивности полосы 1Б22 ом-1 спектра РКР каротиноидов нерва при изменении положения фокуса поперек (А) и вдоль (Б) волокна.

I, Миелин; 2. Аксоплазма; 3. Закрытый перехват Ранвье.

- в -

В параграфе 3.2. представлены результата исследований температурных зависимостей изменений спин-меток и РКР - параметров каротиноидов нерЕЭ. Для оценки состояния полярной и нетолярной фазы липидов плазматических мембран нервного волокна использовали метилированную пальмитиновую кислоту с локализацией док-сильной группы на 5-ом атоме углерода (МеРА311П -5) и 14-ом втоме углерода (КеГЛЬ!^ Т9). Изменения характерных параметров данных спин- меток (2А,. и 1пт) продставленные в Аррениусовских координатах, изображены на Рис.2 (1,2). Видно, что при увеличении температуры величина параметра 2Й„ МеГА31)0 д снижается, а на графики тошюратурной зашюимости наблюдается точка перегиба, которая свидетельствует о наличии при температуре около 20°С фазового перехода упорядоченности липидного микроокружения мотки, локализованную в более полярной фазе липидного бислоя. Увеличение экстраклеточной концентрации Са2+ до 5 мМ приводило к снижению величины 21«, температура перехода наблюдалась уже при более низких' величинах (14°С). Этот результат свидетельствует о снижении упорядоченноисти в "полярной " фазе липидного бислоя при повышавши в 4 раза вкстраклеточной концентрации Са2+.

Использование спин-матки МеРА3112.з позволило обнаружить так же снижение величины 1ш, характеризущей упорядоченность микроокружения липидной фазы при увеличении температуры, а также наличие температуры фазового перехода в области 10°0.' В дан-' ном случае увеличение экстраклеточной концентрации Са2+ не приводило к достоверному изменению температуры фазового перехода, но' вызывало некоторое снижение величин амплитуды 1пх, особенно в области высоких температур. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в более гидрофобной фазе липидного бислоя плазматических мембран нервного волокна фазошй переход происходит при более низких температурах и не зависит от изменения , концентрации экстраклеточного Са2+.

В следующей серии экспериментов было проведено исследование температурозависимых изменений локализованных в гидрофобной фазе липидов плазматических мембран Одо-каротиноидов с помощью метода комбинационного рассеяния. На Рис.2(3), представлен« из-

менания отношения интенсивности основных полос спектра РКР в

1аЯР1?г*тж*<Л*п'т'т* г>ф ^oimarioTimu о тооттоолио г>п> П пг» Vprrount) vio

но, что при увеличении температуры амплитуда интетсивностей и их соотношение снижаются, а на графике температурной зависимости изОлздзется точка гтзрегнба (I0°G), характеризуйся, по-видимому, изменение фазового состояния мембранных липидов. Полученные результаты свидетельствуют по-видимому о связи между да локализацией тс-електронов полиеновой цепочки молекулы кароти-ноидов, локализованной в гидрофобной фазе липидов плазматической мембраны нервной клетки, и уровнем упорядоченности окружающих ее жирнокислотных "хвостов" липидов. Тот факт, что температура фазового перехода, регистрируемая по изменению состояния молекулы каротиноида, близка к температуре фазового перехода для гидрофобной области бислоя, свидетельствует о возможности регистрации вязкости аксолеммы с помощью РКР-каротиноидов.

х ю~3С°к~г)

Рис. 2. Температурная зависимость изменения параметров 2A« спин-метки МеГ/SljQ g (I), Int спин-метки . HePASl-j-g j (2) и отношения величины интенсивности полос I526/II60 спектра комбинационного раосеяния ка-ротиновдов нерва (3).

В работах. Залантаи и соавторов (Sealontai в. et al, 1977) было обнаружено, что при электростимуляции нерва интенсивность полос 1526 см-1 и 1160 см-1 снижаются.'Эти результаты были подтверждены и в наших экспериментах, изложенных в параграфе 3.3. На Рис. 3 представлены кинетики изменения соотношения интенсивности полос - 1526 см-1, 1160 см-1 при проведении ритмического возбуждения и после его выключения. Было показано, что интенсивности обеих полос спектра по мере стимуляции снижается различно, а изменения соотношении характеризуются двухфазной зависимостью. Установлено, что по мере проведения возбуждения величина соотношения полос сначала растет, а затем падает (Рис.3 (2)). Важно, что этот результат указывает на двухфазное изменение вязкости мембраны при провдении ритмического возбуждения и с востоновлением исходного уровня вязкости после его выклвче-ния. Исследованы так же кинетики изменений интенсивности основных полос и их соотношения в зависимости от длительности стимулирующего импульса (0,1; 0,35;0,3; 0,5 мс.). Показано, что при

врвия, НИН.

Рис. 3. Кинетика изменения величины отношения полос 1526/1160 спектра РКР каротиноидов нерва в зависимости от длительности стимулирующего импульса. I. 0,1 мсек; 2. 0,3 мсек; 3. 0,15 мсек; 4. 0,5 мсек.

стимуляции с малой длительностью импульса (0.1 мсек.) происходит возрастание отношения интенсивности полос спектра FKP. При .длительности импульсов 0.15 мсек. и 0.3 мсек. выявлены две фазы изменений этого соотношения: в первом случае происходит увеличение соотношения, а во втором - снижение. Однако при большой длительности импульса (0,5мсек) наблюдается уменьшение отноше-шя *152б^П60 ^ Рис* 3 ' ■ Получешше результаты свидетельствуют о том, что изменения состояния каротиноидов в мембране зависит от параметров возбуждающего импульса. Это, по-видимому, свидетельствует о том, что при разных длительностях стимулирующего импульса вязкость мембраны меняется по разному. Изменения , длительности стимулирующего импульса позволяет разделить две фазы процесса изменений состоянии каротиноидов в нерве.

Известно, что каротиноидн обладают электрохромннм эффектом, который проявляется в смещении спектра помещения молекулы. Для выяснения вклада этого эффекта в изменении состоянии каротиноидов нерва при FB в связи с данными о возможности электрохромно-го сдвига спектров РКР этих молекул в нерве (Koyama 1979, Вершинин и др. 1990), мы исследовали изменения профиля возбуждения основных полос спектра РКР при РВ и блоке (параграф 3.4.). Профиль ЕозОуздения полос 1525 см-1 и II6Q-1 см~* и их соотношение для нерва в состоянии проведения ритмического возбуждения и при действии тетродотоксина (ТТХ) на фоне стимуляции представлены на рис. 4(А,Б,). Установлено, что ритмическое возбуждение приводит к смещений максимума профиля возбуждения от 496,5 ни до 501,7 на, только для полосы 1150 см-1, обусловленной колебаниями С-0 связей полиеновой цепочки молекулы.

О точки зрения теории электрохромного эффекта обнаруженные изменения в спектре РКР могут быть обусловлены изменением гео-MQ' рии молекулы каротиноида при изменении упорядоченности окружающих его молекул. Для проверки этого предположения мы сопоставили соотношения интенсивности полос I526/II60 при возбук--" дении и блоке (рис. 4 В). Показано, что величина отношения этих полос при стимуляции нерва преобретает немонотонный характер, а при блоке возбуждения за счет действия специфического блокатора Na-кянала ТТХ, величина максимальных изменений соотношении зна-

чительно возрастает. Таким образом смещение профиля или значительное увеличение соотношения полос могут свидетельствовать об изменении состояния молекулы карогиноидов в мембране нерва за счет изменения микровязкости липидов, а вклад влектрохромного эффекта в наших экспериментах не выявлен.

Следующая серия экспериментов ( параграф З.Б.) была посвяще-

Рис. 4. Зависимость изменении величины интенсивности полосы 1525 см-1 и 1160 см"1 (А) и соотношения 1526/1160 (Б) спектра РКР каротиноидов нерва от длины волны возбуждения в норме (I),-при,стимуляции (2) и действий тетродотоксинв (ТТХ) (3).

на изучению изменений параметров, характеризующих состояния мембраны и некоторые свойства ионного транспорта нервной клетки .при изменении температуры. В качестве параметров использовали специфическое связывание блокатора ^Н-оуабаина, включение . •%-фосфот1{дилхол11нз к погдоцениз 45Са.

Опыты по исследованию температурной зависимости включения •^н-фосфйтадшходина выявил; соответствие результатам исследования температурной зависимости параметров спин-меченой жирной кислоты (Ме?А511П ,). Показано, что при повышении температуры неупорядоченность липидного микроокружения жирной кислоты в полярной фазе увеличивается и при этом возрастает уровень включе-

гп*а п'ктчпуп.О : * г.о'^ т(Лт". 1 гтг;И'Гоат\"«пау\Ф о\гтг*п«грг>—

ванне корреляции между изменениями в полярной фазе мембран нерва и микровязкости неполярной фазы.

Таким образом нами показано, что в аксолемме нерва при изменении микровязкости за счет варьирования температуры модифицируется поглощение Са2+ и связывание ^-оуабаина, т.е. изменения числа активных форм N9, к - АТФ - азы. Эти процессы непосредственно определяют состояние возбудимой мембраны нерва. Следовательно, РКР спектроскопия каротиноидов позволяет судить не только о- микровязкости липидного бислоя аксолеммы, но и харак-теризировать некоторый стадии ионного транспорта при РВ.

Для исследования первичных механизмов, вызывающих изменения состояния каротиноидов й'мембране, в параграфе 3.6. представлены результаты исследования изменения состояния спектра РКР-каротиноидов в нервах лягушки при действии агентов, меняющих белок-липидные взаимодействия мембраны и объем волокна (п-ХМБ, Са2+, изопропанола, ДОСО и сахарозы).

Установлено; что действие п-ХМБ, изопропанола и ДМСО на нервна э волокно и нейроны сопровождается изменением состоянии молекулы каротиноидов, аналогичным действию температуры. О другой стороны, такие изменения состоянии молекулы каротиноида на- • ' поминают те, что выявлены при возбуждении нерва.

При использовании специфических агентов обнаружена зависимость сигнала РКР каротиноидов нврва от воздействий, модифицирующих поверхностный заряд и объем (сахароза и п-ХМБ). (Рис. 5).

- 14 -к

2 6 8 10 12 14

время, ыии.

_1-1-I-1_I_I_I

2 Ь 8 10 С.»

время, ник.

Рис. 5. Кинетика изменения интенсивности полосы 1526 см"1 (1,я I*) 1160 см""1 (2 к г) и та соотношения 1526/1160 (3 и 3 ) спектра РКР каротикоидов нерва при действии (ЮТ Н) п-ХМБ (А) и (ЗООмМ) сахарозы (Е).

Выбранные специфические агенты приводят к изменению уровня SH-rpymi мембранных белков, поверхностного заряда, а также .состояние окружающей мембрану еоды (Аксенов 1990). Эти агенты специфически меняют и характер ритмического возбуждения нервных клеток. Тот факт, что при данном воздействии величина соотношения полос I5Z6/II60 возрастает, может свидетельствовать о увеличении вязкости в следствии сжатия либо мембраны при изменении объема, либо самой молекулы каротиноида, встроенной в мембрану при изменении состояния балка (п-ХМБ).

В параграфе 3.7. представлены результаты исследований спектра FKP каротиноидов нерва при действии низкоинтенсивного лазерного излучения. Воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения (\= 632,8нм и Л= 8Э0нм), как при одиночном, так и совместном их действий, сопровождается изменением спектра РКР каротиноидов, отражающим модификацию состояния каротиноидов. Обнаруженные изменения состоянии каротиноида близки к тем, что выявлены при возбуждении нерва и- при действии мембранотропных агентов (Са2+, п-ХМБ, изопропанол, ДМСО и сахороза). Вероятно, действие низкоинтенсивного лазерного излучения красной и инфа-красной области спектра приводит к генерализованным изменениям структуры липидной фазы аксолеммы, что и проявляется в изменении состояния микроокружения каротиноидов.

В параграфе 3.8. с помощью модели Ходжкина-Хаксли представлена математическая модель, связывающая изменения спектра РКР каротиноидов при FB с параметрами характеризующими проводимость калиевого канала. Сопоставления зависимости изменения параметра п (переменная активации калиеЕой проводимости) от МП при Е=0, с динамикой изменении вязкости мембраны при FB создает предпосылку для математического описания изменений в липидной фазе с пг гощью уровнения Ходакина-Хаксли. . ■

В" четвертой главе дается анализ данных литературы и полученных результатов по изменению состояния липидного бислоя воз-' будимой мембраны при проведения ритмического возбуждения. Обсуждается возможность генерализованного перехода в неголярной фазе липидов аксолеммы в качестве фактора регуляция активности ион-транспортирупцих систем. . •

выводы

1. Методом микро РКР спектроскопии установлено, что практически все молекулы каротиноидов сосредоточены в поверхностной мембране нерва. При этом в аксолемме содержится около 7556, в миелине

- 25% количества молекул каротиноидов.

2. Сравнительные исследования сигналов ЭПР спин-меток пальмитиновой кислоты и РКР спектров каротиноидов позволило установить, что температурные зависимости этих сигналов коррелируют с изменением состояния молекул каротиноидов, локализованных Биполярной фазе лигадного бислоя мембраны.

3. В экспериментах по регистрации микровязкости мембраны и соотношения интенсивности характерных полос в спектре РКР каротиноидов впервые установлена-прямая связь между состоянием каротиноидов в мембране и ее микровязкостью.

4. Обнаружены две фазы изменения состояния каротиноидов при РВ

- быстрая и медленная. Соотношение этих'фаз зависит от параметров возбуждающих импульсов: при увеличении длительности превалирует медленная фаза, отражающая снижение микровязкости мембраны.

Б. Специфические модификаторы вязкости липидной среды мембраны ( температура, изопропанол, ДМСО ) и конформации белков (п-ХМБ) изменяют состояние каротиноидов, регистрируемое методом РКР спектроскопии, что свидетельствует о влиянии этих агентов на «полярную фазу липидного бислоя возбудимой мембраны. 6. Изменения, наблюдаемые вадолярной фазе- лишдов, коррелируют с поступлением ионов Ca в нерв и числом Na-нзсосов, что может -■ указывать на существование прямой зависимости активности ионного транспорта в возбудимой мембране от состояния еенаголярной фазы.

7-. Полученные экспериментальные данные показали, что регуляция активности ряда ион-транспортирупцих систем нервного волокна (Na, К-АТФазы, Na-, Са-каналы) мокет осуществляться за счет генерализованного перехода в неполярной фазе липвдов аксолеммы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО TIME ДИССЕРТАЦИИ

1. Чохарадзе Т.А., Максимов Г.В., Чурин A.A., Пащенко В.З. Профиль возбуждения каротиноидов нерва при стимуляции и блоке. //Биофизика. 1991. В печати.

2. Максимов Г.В., Еремич М., Чохарадзе Т.А., Чурин A.A. Шара М., Раденович Ч.Н., Пащенко В.З. Использование Раман-спектроскопии для скрининг-анализа состояния гибридов кукурузы. - Доклады МОИП за 1939 г. Общая биология. М.: Наука, 1ЭЭ2 г. С.34-36.

3. Максимов Г.В., Еремич М., Чохарадзе I.A., Чурин A.A., Шара М., Раденович Ч.Н., Пащенко В.З. Исследование белок-лшшдшх взаимодействии в биологических мембранах с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния. 1.Раман-спектроскопия клеток водорослей. - Доклады МОИП за 1989 г. Общая биология. М.: Наука, 1992 г. 0.36-37.

4. Максимов Г.В., Еремич М., Чохарадзе Т.А., Чурин A.A., Шара М., Раденович Ч.Н., Пашич М., Де Сафари Л., Пыцвнко В.З. Исследование белок-липвдшх взаимодействий в биологических мембранах с помощь» спектроскопии комбинационного рассеяния. II. Раман-спектроскопи нервных клеток. - Доклады МОИП за 1989 г. Общая биология. М.: Наука, 1992 г. С.38-39

5. Борисова Ю.Э., Чохарадзэ Т.А., Кондратов В.Е., Максимов Г.В. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения на возбудимость нерва. - Доклады МОИП за 1991 г. Общая биология. М.: Наука, 1992. В печати.

6. Кондратов В.Е., Свердлова Е.А., Максимов Г.В., Чохарадзе Т.А. Механизм ионного транспорта эритроцитов при действии лазерного излучения. - Доклада МОИП за 1991 г. Общая биология. ■М.: Наука, 1992 г. В печати.

7. Чохарадзе Т.А., Максимов Г.В. Спектроскопия комбинационного рассеяния нервного волокна. - Доклада МОИП за 1991 г. Общая биология. М.: Наука, 1992 г. В печати.

8. Paachenko Y.Z., Maxlwav G.V., Kondratov V.E., Cliokharadze T.A. Low power laoor irradiation and excitability of nerve. -Cairo, Egypt. 1991. Middle East Biophysics Journal, Abstracts

9. Paachenko V.Z., Maximov G.V., Kondratov V.E., Chokharadze T.A. Application of low power laser irradiation in the investigation of nerve excitability and state of the blood erythrocytes. Turkiye. 1991 The ferst International biophysics congress and biotechnology at GAP, Abstracts, P.31.

/

Подписано в печать 15.04.92. Заяаз 572 Формат 60x84/16 Тиран 100 .

Москва. Типография РАСШ