Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Резонансное комбинационное рассеяние в ультрафиолетовой области спектра и его применение для структурно-функционального анализа белков и нуклеиновых кислот

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Резонансное комбинационное рассеяние в ультрафиолетовой области спектра и его применение для структурно-функционального анализа белков и нуклеиновых кислот"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152.361*37 543.424

ФЕОФАНОВ Алексей Валерьевич

РЕЗОНАНСНОЕ КОМБИНАЦИОННОЕ РАССЕЯНИЕ В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ ОБЛАСТИ СПЕКТРА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТРУКТУРНО- ФУНКЦИОНАЛЬНОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

03.00.02- Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва- 1991

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени инженерно-физическом институте.

Научный руководитель доктор физико-математических наук, профессор Э. А. Маныкин Научный консультант доктор химических наук И. Р. Набиев

Официальные оппоненты доктор биологических наук А. Д. Каулен,

кандидат физико-математических наук А. В. Баранов

Ведущая организация Институт молекулярной биологии АН СССР

Защита диссертации состоится << >> _ 199.ДГ.

в на заседании специализированного совета по биофизике

К.053.05.68 в Московском государственном университете

им. М. В. Ломоносова по адресу 119899, Москва, Ленинские горы,

биологический

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан _ ¿Г/ _ 199^ Г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

В.Л. Гуляев

Актуальность. Физические методы исследования являются одним из важнейших источников получения информации о структуре и функциональных свойствах биологических молекул. Появление новых методов позволяет расширить возможности анализа и ведет к созданию более достоверных моделей основ функционирования живой материи. С этой точки зрения разработка метода резонансного комбинационного- рассеяния с возбуждением в ультрафиолетовой области (УФ РКР) применительно к исследованиям биологических молекул позволит: селективно изучать состояние и характер микроокружения отдельных хромофорных групп в составе сложных биополимеров, мембранных систем► надмолекулярных комплексов и клеточных структур в процессе их функционирования in vitro и In vivo; определять содержание канонических типов вторичных структур в белках и нуклеиновых кислотах, а также изучать изменения вторичной структуры при функционировании биополимеров и их взаимодействиях; исследовать механизмы фермент-субстратных и нуклеотид-белковых взаимодействий; изучать электронно-колебательную структуру основного и возбужденных электронных состояний хромофоров; измерять скорости излучательной релаксации молекул из возбужденного электронного состояния, а также изучать с колебательным разрешением процессы безызлучательного переноса энергии в многокомпонентных системах.

Цели и задачи диссертационной работы.

- конструирование экспериментальной установки для спектроскопии УФ РКР биологических молекул и оптимизация es параметров;

- разработка на основе этой установки новых методов изучения пространственной структуры мембранно-связанных белков, надмолекулярных комплексов при высокой избирательности анализа состояния отдельных, входящих в состав комплексов, компонентов.

- применение разработанных методов для исследования взаимо-

- г -

действия аденозинтрифосфата (АТР) в активном центре Ыа.К-АТРазы, а также для структурно-функционального изучения бактериального и зрительного родопсинов.

Научная новизна. В настоящей работе впервые:

1. На базе созданной экспериментальной установки разработаны методики получения спектров УФ РКР от негомогенных растворов мембранно-связанных белков и надмолекулярных комплексов при полном сохранении функциональной активности исследуемых молекул, а также предложен комбинированный программно-инструментальный подход к регистрации и анализу слабых изменений в спектрах УФ РКР биополимеров.

2. Методом УФ РКР изучено связывание АТР в активном центре Na,K- АТРазы и па основе анализа полученных спектров и модельных экспериментов предложена модель взаимодействия аденинового кольца АТР с белковыми группами в активном центре фермента.

3. Продемонстрирована применимость спектроскопии УФ РКР для изучения светозависимых изменений в состоянии остатков тирозина и триптофана зрительного родопсина. При фотолизе родопсина обнаружены депротонирование остатка тирозина, изменение микроокружения остатка триптофана, а также конформационные изменения в липидном матриксе.

4. На основе измеренных профилей возбуждения РКР изучена

% %

электронно-колебательная структура n->it (280 нм) и %->% (266 нм) электронных переходов АТР. Рассчитаны параметры возбужденного состояния, позволяющие моделировать спектры УФ РКР, а также геометрию и распределение зарядов в возбужденном состоянии АТР.

5. Обнаружен эффект возрастания сечений РКР триптофана при увеличении гидрофобности его локального окружения. На основании этого эффекта предложена методика изучения локализации и

- 3 -

состояния триптофанилов в белках.

Практическая ценность диссертационной работы заключается в создании нового метода исследования пространственной структуры мембранно-связанных белков, и надмолекулярных комплексов, характеризующегося высокой избирательностью анализа состояния отдельных компонентов, входящих в их состав.

Созданная экспериментальная установка для спектроскопии УФ РКР будет использована для решения широкого класса задач структурно-функционального исследования биологических молекул.

Основные положения, выносимые ка защиту. Автор выносит на защиту

1. Конструкцию и параметры экспериментальной установки для спектроскопии УФ РКР биологических молекул, позволяющие регистрировать спектры в диапазоне 400-211 нм за 3-15 минут и обеспечивающие сохранение структуры и функциональной активности исследуемых молекул.

2. Метод структурно-функционального изучения мембранных белков при селективной регистрации спектров ароматических аминокислотных остатков (триптофана и тирозина), а также результаты исследования с помощью этого метода процессов фотопревращений в бактериальном и зрительном родопсинах.

3. Структурную модель взаимодействия пуринового кольца АТР с группами активного центра Ыа,К-АТРазы, осуществляемого через атом азота N1 и экзоциклическую NHg-rpynny субстрата.

4. Результаты измерения детальных профилей возбуждения РКР колебательных мод АТР в области 242-292 нм, а также параметры возбужденного состояния, рассчитанные на основании анализа этих профилей.

Апробация результатов работы. Основные результаты работы

докладывались на III Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Римини, 1989), XII Международной конференции по Раман спектроскопии (Колумбия, 1990), III Международной конференции по спектроскопии лазерного рассеяния и диагностики биологических объектов (Москва, 1990), V Еврофизической летней школе по структуре и конформационной динамике биомакромолекул (Высокие Татры, 1990), II Всесоюзном семинаре по лазерной биофизике и применениям лазеров в медицине (Тарту 1989), семинарах отдела инструментальных методов анализа ИБХ им.М.М. Шемякина АН СССР.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.-Объём и структура работы. Диссертация содержит 129 страниц машинописного текста, включая список литературы (98 наименований), 6 таблиц и 31 рисунок. Диссертационнная работа состоит из введения, трех глав, первая из которых - обзор литературы, выводов и списка литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Экспериментальная установка для спектроскопии УФ РКР Для экспериментов по спектроскопии УФ РКР на базе коммерческих блоков создана экспериментальная установка, включающая в себя лазерную систему с плавной перестройкой длины волны излучения в диапазоне 650-211 нм, многоканальный КР-спектрометр и микрокомпьютер (рис.1 ).

Лазерная система реализована на базе лазера накачки (ХеС1-эксимерный лазер, \рен=308 нм, частота следования импульсов до 200 Гц), лазера на красителе, системы удвоения частоты с использованием нелинейных кристаллов дигидрофосфата калия (350-260 нм) и ß-бората бария (280-211 нм). Для разделения первой

ЭКСИМЕР XeCl Л=308 НМ 170 мдж/имп ЛАЗЕР НА КРАСИТЕЛЕ 6i0 1320 НМ 17 мдж/имп НЕЛИНЬЙНЫЙ КРИСТАЛЛ

2 мджДамп

Рис.1 Схема экспериментальной установки для спектроскопии УФ РКР (см. текст).

и второй гармоник применена система призм Пелина - Брока. Согласование плоскости поляризации излучения между лазерной системой и спектрометром осуществляется с помощью ромба Френеля. Система позволяет получать на выходе 2 мДж в импульсе в диапазоне длин волн 350-211 нм. Однако при регистрации спектров УФ РКР энергию в импульсе ослабляли до 50 мкДж. Длительность импульса определяется эксимерным лазером и составляет 17 не.

Спектры УФ РКР регистрируются с использованием многоканального КР-спектрометра (предмонохроматор: 2 голографические решётки в режиме вычитания дисперсии, длина волны блеска 300 нм, 1800 штрих/мм; спектрограф: одна голографическая решбтка, длина волны блеска 250 нм, 2400 штрих/мм). Лазерное излучение фокусируется на образце с помощью линзы (F-100 мм). Рассеянное излучение собирается сферическим зеркалом, фокусируется линзой и через предмонохроматор направляется в спектрограф. Предмонохроматор,

таким образом, используется в качестве фильтра для устранения Рэлеевской компоненты рассеяния. Многоканальный детектор представляет собой диодную линейку (512 диодов) с усилителем изображения, работающую в режиме счета фотонов. Детектор охлаждается до -30°С и с помощью электронной системы синхронизации и стробирования включается-только на время импульса.

Данная конструкция экспериментальной установки позволяет плавно перестраивать длину волны возбуждения, что обеспечивает оптимальные условия для селективного возбуждения хромофоров в составе многокомпонентных смесей;- Использование многоканальной системы детекции на порядок, снижает время накопления спектра. Стробирование обеспечивает улучшение . отношения сигнал/шум в спектрах в 2 раза.

Для калибровки спектрографа в УФ-области используются линии ртутной лампы низкого давления. Ошибка в линейности сканирования спектрографа составляет 1 см-' на Ю^ОО.см-*. Расчет частот в спектре в многоканальном режиме выполняли с использованием стандартной программы по измеренным, параметрам углу падения излучения на решетку в "О" порядке и фокусному расстоянию спектрографа. Ошибка расчета на краях спектра - 1 см-1. Согласование предмонохроматора и спектрографа по передаче сигнала составляет Э0%. Регистрируемый детектором спектральный диапазон равен 1000 см-1 в обл. 300 нм, 1500 см-1 в обл. 250 нм, 1900 см-1 в обл. 225 нм. Спектральное разрешение, определяется шириной входной щели спектрографа (100-130 мкм) и наличием взаимодействия между соседними фотодиодами детектора и составляет в области 250 нм 10 см-1, в области 230 нм 17 см-1 и в области 220 нм 24 см . Спектральное пропускание прибора измеряли с помощью дейтериевой лампы. Длину волны лазера корректировали с точностью

до 3 см-1 по линии КР 981 см-1 водного раствора Ыа^БОд.

2. Регистрация и обработка спектров УФ РКР. Контроль за

сохранением структуры и функциональных особенностей молекул.

Основными критериями при разработке методики получения спектров от негомогенных растворов биологических молекул были сохранение структурно-функциональных особенностей молекул, снижение количества вещества, необходимого для анализа, и регистрация спектров с высоким отношением сигнал/шум. Сохранение структуры исследуемых молекул тестировали по отсутствию изменений в спектрах поглощения до и после УФ облучения, кроме того путем сравнения "сканов" в процессе накопления спектров РКР, а также с помощью биохимических тестов на сохранение функциональной активности. Предотвращение фоторазложепия молекул под действием лазерного УФ излучения обеспечивали циркуляцией исследуемого раствора под лучем, термостатированием образца при оптимальной температуре, созданием азотной атмосферы. Методика регистрации спектров на основе данных критериев была оптимизирована по следующим параметрам; 1. выбор концентрации и объема препарата;

2. длительность отдельного накопления и число повторных сканов;

3. условия фокусировки лазерного излучения на образце, энергия и частота следования импульсов; 4. контроль за флуктучциями сигнала в случае негомогенных образцов. В результате оптимизации влияние фотонасыщения на спектры сведено к минимуму, нелинейные эффекты, и вклад фотопродуктов в спектрах не проявляются. Кроме того, практически полностью сохраняются структура и функциональные особенности исследуемых молекул.

Разработанный подход к выбору условий для получения спектров

является общим и может быть использован как для негомогенных, так н для гомогенных растворов биологических соединений. При этом для получения спектров при мощности излучения 2,5-5 мВт (частота следования импульсов 80-120 Гц) требуется 3-15 минут (в зависимости от спектрального диапазона).

Для улучшения разрешения и увеличения отношения сигнал/шум в спектрах нами были использованы методы цифровой обработки сигналов: Фурье самодеконволюции (ФСД), метод максимальной энтропии (ММЭ) и комбинированный метод Фурье самодеконволюции и максимальной энтропии (МЭ-ФСД). Показано, что наилучших результатов позволяет добиться метод МЭ-ФСД. Метод МЭ-ФСД сохраняет для перекрывающихся линий информацию о числе и параметрах полос КР и значительно улучшает отношение сигнал/шум в случае слабых сигналов без появления артефактов.

3. Селективность в спектрах УФ РКР.

Селективная регистрация спектра хромофора в составе смеси основана на возбуждении спектра в области максимального по отношению к другим компонентам сигнала данного хромофора. В результате многочисленных экспериментов показано, что анализ нуклеотид-белковых взаимодействий методом УФ РКР возможен при селективной регистрации спектра нуклеотидного (возбуждение в области 245-260 нм) либо белкового компонента комплекса (возбуждение в области 218-235 нм). Для мембранных белков и их комплексов с нуклеотидами обнаружено сужение областей селективности если липида в составе мембран имеют двойные связи, то предрезонансный сигнал валентных колебаний С=С может стать помехой для получения спектра белка. Кроме того, положение

максимума спектра флуоресценции триптофана в гидрофобных средах сдвигается в коротковолновую область и мешает регистрации спектров нуклеотидного компонента при \возб>254 нм. Изложенное выше справедливо также для регистрации спектров белков и нуклеиновых кислот в составе клеток.

4. Результаты модельных экспериментов и их анализ.

Для интерпретации спектров УФ РКР мембранных белков были проведены моделирование изменений при депротонировании (протони-ровании) боковой цепи тирозина, а также исследование влияния гидрофобности локального окружения на спектры УФ РКР остатков триптофана в белках.

Депротонирование (протонирование) боковой цепи тирозина в растворе моделировали путем изменения величины рН раствора. В спектрах УФ РКР депротонирование тирозина приводит к сдвигам частот колебаний а>8а от 1617 к 1601 см-1 и Тда от 1182 к 1175 см-1. Кроме того, при \возб=230 нм сечение РКР наиболее интенсивной моды VQa тирозината уменьшается в два раза по сравнению с тирозином, а при Явозб=242 нм- наоборот, возрастает почти в 7 раз. Значительное изменение сечений рассеивающего центра является причиной, по которой в дифференциальном спектре УФ РКР присутствуют линии только одного знака и отсутствуют характерные для сдвигов линий "бабочки". Модельнне эксперименты позволяют сделать вывод о том, что при депротонировании остатка тирозина в белке в дифференциальном спектре <А.возб=230 нм) должна присутствовать интенсивная линия 1617 см-1, а в дифференциальном спектре при \возб=242 нм- линия 1601 см-1. Причем знак разностного сигнала (Туг- Туг-) при этих длинах волн возбуждения

должен быть различным: "+" при \возб=230 нм и при \возб=242 нм. Наиболее интенсивные изменения при переходе Туг<=>Туг~ наблюдаются в спектрах УФ РКР белков при возбуждении в области 240 нм, поскольку сечения РКР всех белковых хромофоров, кроме тирозината, имеют в этой области минимум.

Для того, чтобы выяснить влияние гидрофобности окружения на спектры УФ РКР триптофана, мы исследовали спектры нескольких триптофан- содержащих молекул. Уровни гидрофобности локального окружения триптофанилов в этих моделях сравнивали, основываясь на известной корреляции между полярностью окружения триптофанилов и параметрами их спектров флуоресценции (положением максимума и полушириной полосы). В растворах триптофана и этилового эфира Ы-ацетил триптофана ШАИЕЕ) боковая цепь полностью доступна воде. В лизоциме и самоассоциированном мелитине боковые цепи триптофанилов частично экранированы от водной фазы белковыми группами и находятся в неполярном белковом окружении. Триптофанил белка азурина полностью недоступен воде и находится в сильно гидрофобном белковом окружении. Влияние лшидного окружения оценивали по спектрам мелитина, встроенного в искусственные липосомы,и бактериородопсина (БР). Все спектры были получены при возбуждении 230 нм, что обеспечивало селективное усилзние мод триптофана и снижало вклад в спектры колебаний боковых цепей фенилаланина, тирозина и пептидных групп. Показано, что возрастание гидрофобности приводит к увеличению сечений РКР всех колебательных мод Тгр без значительных изменений относительных интенсивностей и частот линий. Величина этого эффекта позволяет регистрировать изменения микроокружения отдельного остатка триптофана в белках, содержащих несколько остатков триптофана. Кроме того, обнаруженный эффект может быть успешно использован

- 11 -

Таблица 1. Сечения РКР колебательных мод триптофана в составе некоторых молекул.

Молекула Сечения колебательных мод а

1620см"1 1552см"1 1357см"1 1011см"1 876см"1 761см"1

Тгр 100 280 160 310 110 400

NAWEE 140 390 220 420 170 510

Мелитин 260 750 380 1030 390 1130

Me ли тин в липосомах 420 1130 550 1350 460 1400

Лизоцим б 630 390 - 690 320 780

Азурин б 1 510В 1 070В 1250 470 1220

БР б 1690 1000 1940 780 2220

а- миллибарн/(остаток Тгр стерадиан); б- линии Тгр и Туг перекрываются; в-значительный вклад амидных колебаний.

для локализации положения триптофанилов в белках: на поверхности глобулы, в белковом окружении, а также в контакте с липидами для мембранных белков.

5. Исследования мембранно-связанных белков методом спектроскопии УФ РКР.

Разработанные методики регистрации и обработки спектров УФ РКР были успешно применены для изучения мебранно-связанных белков и надмолекулярных комплексов в исследованиях: 1) фоточувствительных белков бактериального и зрительного (Р) родопсинов на отдельных стадиях фотоцикла; 2) связывания АТР в активном центре мембранного белка - ИаД-АТРазы.

5.1. Исследование свето- и темно- адаптированной форм БР.

Бактериородопсин- ретинальсодержащий интегральный мембранный

белок из пурпурных мембран клеток H.halobium- осуществляет светозависимый перенос протонов, поддерживая градиент концентрации протонов между цитоплазматической и внешней поверхностями клеточной мембраны.

В данной работе методом УФ РКР исследовали темно- (ТА) и свето- адаптированные (СА) формы БР при возбувдении 242 и 230 нм. В СА БР рзтиналь находится в полностью транс конфигурации. При темновой адаптации приблизительно в половине молекул ретиналь переходит в 13-цис, 15-син конформацию [Harbison и др. 1984]. В соответствии с изменением конформации хромофора, в белке могут происходит конформационные перестройки; обнаружить которые по спектрам УФ РКР и было целью исследований.

УФ РКР-спектры БР при возбуждении 230 нм (рис.2,а) представляют собой суперпозицию сигналов Тгр и Туг. При А.возб=242 нм остатки Phe дают вклад в спектр сравнимый по величине с вкладом остатков Туг и Тгр.

Сравнение спектральных отличий, зафиксированных для БР, с модельными экспериментами по депротонированию тирозина позволяет сделать однозначный вывод о том, что в СА БР по крайней мере один остаток тирозина находится в депротонированном состоянии и протонируется при переходе СА->ТА. Этот вывод согласуется с моделью, согласно которой изомеризация ретиналя приводит к протонированию остатка тирозина, находящегося в активном центре ретиналя [Bralman и др. 1988].

Проявление в разностном спектре при А,шзб=230 нм всех линий триптофана может быть объяснено на основе модельных экспериментов по влиянию на спектры УФ РКР гидрофобности локального окружения этого аминокислотного остатка. Из этих экспериментов следует вывод, что при темновой адаптации БР происходят значительные

Рис. 2. УФ РКР-спектры СА БР (а,1) и Р <6,1 ). а также дифференциальные спектры ТА минус СА БР (а,2), Р минус Р* (6,2). Длина волны возбуждения 230 нм.

изменения в полярности окружения одной или нескольких боковых цепей Тгр - переход остатков в более гидрофобное окружение. Однако, нельзя полностью исключить и проявление более специфического влияния (например, заряженных групп) при изменении состояния боковых цепей трилтофанов в БР, на что указывает высокая относительная интенсивность линии 763 см-1 в разностном спектре.

- 14 -

5.2. Исследование зрительного родопсина в нативном и обесцвеченном (опсин плюс ретиналь) состояниях.

Зрительный родопсин- это светочувствительный интегральный мембранный белок фоторецепторных клеток сетчатки (палочек), который в результате поглощения кванта света формирует ответ, составляющий первый шаг в цепи событий, приводящих к передаче зрительного импульса. В изолированных фоторецепторных дисках фотоцикл заканчивается гидролизом комплекса ретиналь/белок. Полностью обесцвеченный родопсин (Р*) представляет собой смесь свободного (или неспецифически связанного) ретиналя и белковой матрицы- опсина.

Впервые полученные спектры УФ РКР (\возб=230 нм) нативного (Р) и обесцвеченного родопсина (рис.2,б) представляют собой суперпозицию сигналов от боковых цепей Туг и Тгр. Интенсивная линия 1660 см (валентные колебания С=С) отражает значительное содержание ненасыщенных липидов в фоторецепторной мембране Р. Присутствие в разностном спектре (Р минус Р*) полосы липидов (1663 см-1) указывает на то, что переход Р->Р* сопровождается конформационными изменениями в липидной матрице. Одной из причин может быть уменьшение плотности мембраны [1ато1а и др. 1974], что ведет к понижению степени гидрофобности окружения С=С связей и уменьшению сечений РКР подобно тому, как это наблюдалось в модельных экспериментах по влиянию гидрофобности окружения на спектры УФ РКР триптофана. Положительная линия тирозина 1617 см-1 свидетельствует о том, что при засветке Р один или нескольких остатков тирозина депротонируются. Параметры линий триптофана (2030, 1555, 1015 см-1) в разностном спектре свидетельствуют о том, что окружение одного или нескольких остатков Тгр в Р

отличается от их состояния в Р*. Поскольку в разностном спектре отсутствуют линии 761, 1351 см"1, можно заключить, что изменения в состоянии Тгр не связаны с изменением полярности микроокружения, а являются проявлением более специфических взаимодействий, природа которых пока неясна.

Проведенные исследования отдельных стадий фотоцикла бактериального и зрительного родопсинов методом УФ РКР позволяют утверждать:

1. Возможно получение спектров УФ РКР светочувствительных мембранных белков при минимальном изменении состояния хромофоров этих белков под воздействием УФ света;

?,. Спектроскопия УФ РКР чувствительна к состоянию и микроокружению боковых цепей ароматических аминокислотных остатков (триптофана и тирозина) в мембранных белках и позволяет изучать изменения в состоянии отдельных остатков на стадиях светозависимых превращений фоточувствителькых белков.

Таким образом, метод УФ РКР может быть использован для изучения фоточувствительных белков и позволяет уточнить и расширить имеющиеся представления о механизмах их функционирования.

5.3. Изучение связывания АТР в активном центре Na.K-ATPasa.

Интегральный мембранный, белок - Na.K-ATP-asa представляет собой универсальную систему АТР-зависимого активного транспорта ионов Ма+ и К+ через мембрану, обеспечивая постоянство неравновесного распределения этих ионов между клеткой и средой. В данной работе исследовано связывание адениновго кольца АТР в активном центре Na,K- АТРазы, что необходимо для установления взаимного пространственного расположения субстрата и групп белка,

Рис.3. Разностные РКР-спектры АТР в комплексе с АТР-азой при ^036=252 (а), 254 нм (б) и мольном отношении АТР/АТРаза 1:1 (а1,61 ) и 2;1 (а2,аЗ,б2). а4,бЗ-спектры свободного ATP, а5,б4-разностные спектры АТР, в смеси с ферментом, инактивированным длительным УФ-облучением взаимодействия.

Рис.4. Модель взаимодействия АТР с Na.K-АТРазой.

входящих в нуклеотидсвязывавдий центр, выяснения природы их взаимодействия.

Сравнение спектров АТР в связанном и свободном состояниях (рис.3) позволяет заключить, что при образовании комплекса

АТР-белок наблюдается значительное возрастание интенсивности

-1 -1 -1 колебания 1305 см , линия 1486 см сдвигается к 1470 см при

возрастании ее относительной интенсивности. Эти особенности надежно воспроизводятся при различных длинах волн возбуждения и коррелируют с соотношением свободного и связанного нуклеотида и активностью фермента. Доля молекул АТР, взаимодействующих с ферментом, составляет ~70Ж, и спектр комплекса представляет собой суперпозицию спектров связанного и свободного субстрата.

В качестве причин, вызывающих зарегистрированные спектральные изменения, могут выступать: влияние степени гидрофобное™ окружения субстрата в активном центре; сдвиг равновесия между анти- и син- конформерами АТР при взаимодействии с Иа.К-АТРазой; образование водородных связей с участием АТР или протонирование аденинового кольца.

На основе модельных экспериментов и анализа данных литературы сделан вывод, что изменение степени гидрофобности окружения аденинового кольца не вызывает спектральных изменений, характерных для связывания АТР с ферментом. Переход аденинового кольца из анти- в син-конформацию также не оказывает значительного влияния на распределение электронной плотности в кольце, и поэтому не влияет на УФ РКР-спектр АТР.

Для анализа взаимодействий субстрата с Na+,K+-ATP-a3ofl нами были получены спектры водных растворов модельных соединений при различных-значениях рН. АТР, протонированный по атому N1 (рН<3), служил моделью связывания с ферментом через положение N1. а З-Ме-аденин использовали для исследования взаимодействия пуринового кольца через атом N3 (рН7), а также через атомы N3 и N1 одновременно (рН<3). Участие в связывании экзоциклической Ш2-грушш (рН7), а также взаимодествие через положения N1 и NH2 аденинового хромофора (рН<3) моделировали с помощью 6-MeNH-аденина и 6-(CHg)2N- аденина. Анализ взаимодействий АТР через

атом N7 был проведен с использованием субстрата, бронированного по положению С8, поскольку при этом происходит изменение силовой постоянной связи C8-N7, как и в случае частичного протонирования имидазольного кольца по положению N7.

Наблюдаемое при связывании АТР с ферментом возрастание

-1 ' -1 интенсивности линии 1305 см относительно полосы 1332 см

зарегистрировано только в спектрах 6-МеЩ-аденина и 6-(СНд)2Н-

аденина при рН<3, когда пуриновое кольцо, протонировано по

положению N1. Эта особенность также проявлялась при 8-Вг-замеще-

нии АТР, но в значительно мевьщей степени. Известно, что в

результате взаимодействия с «участием, имидазольного кольца

способность к протонированию атомор азота N1 и N3 снижается, что

может указывать на невозможность протошфования или' водородного

связывания одновременно по - положениям •Ы1 и • . . Тем не менее,

выполненные модельные эксперименты не позволяют сделать

однозначный вывод о роли пятичлешого „кольца в образовании

комплекса АТР с белком..

На основании анализа экспериментов с использованием аналогов аденина сослан вывод о том, что взаимодействие.пуринового кольца с группами активногр центра Na,К-АТРазы осуществляется в основном через атом азота N1 и NH^-rpynny субстрата. При этом связывание АТР с АТРазой происходит либо за счет протонирования положения N1, либо за счет образования более сильной, чем в растворе водородной связи. Ifflg- группа АТР не образует водородных связей и находится в контакте с алифатическими группами белка (гидрофобное окружение).

Предложена следующая модель состояния аденинового кольца в активном центре Na, К- АТРазы. Адениновая часть АТР (по меньшей мере экзоциклическая NHg- группа) при связывании оказывается в

гидрофобном окружении, а атом азота Nj протонируется за счет контакта с -NH3+ группой лизина либо -NHg* группой аргинина (рис.4). При этом избыточная электронная плотность на Nj и положительный заряд боковой группы остатка взаимно компенсируются. Компенсация зарядов ведет к уменьшению полярности окружения аденинового кольца в области контакта. Наличие в активном центре фермента остатка лизина или аргинина облегчает гидрофобному участку полипептидной цепи контакт с молекулами воды и проникновение АТР к сайту связывания со стороны водной фазы.

Остатками,' боковые цепи которых могут служить донорами протона для образования связи с адениновым кольцом субстрата и которые расположены в консервативных областях всех известных ион-транспортирующих АТРаз, являются Ьуз 370, 501, 691, 736; Arg 221, 589, 759. Все выявленные' остатки (за исключением Ъуз 501, 736), находятся на конформационно лабильных участках неупорядоченной структуры, что является характерным для нуклеотидсвязы-вающих центров белков. Это ' позволяет . активному центру осуществлять своеобразную конформационную "подстройку" при взаимодействии с субстратом.

Как показали наши эксперименты, основной трудностью применения спектроскопии ;УФ РКР к исследованию мембранных белков помимо резких флуктуаций сигнала, вызванных - негомогенностью образца, является конкурентный вклад в спектры РКР сигнала ненасыщенных липидов, "величина которого пропорциональна числу связей С=С и резко возрастает при более коротковолновом возбуждении за счет предрезонансного усиления. Так, в случае Na,K-ATP- азы невозможно получить спектр белка при возбуждении с длиной волны менее 240 нм, в то время как для Р при \возб=230 нм интенсивность линии KP липидов ( 1660 см-1) сравнима по величине

с сигналом белка, а спектр БР свободен от полос липидов. Выбор длины волны возбуждения для конкретного объекта позволяет в ряде случаев решить эту проблему. По этой же причине изучение белков, встроенных в искусственные мембраны крайне затруднено при значительном содержании ненасыщенных липидов. В то же время насыщенные липиды даже при концентрациях порядка 2 мг/мл заметного вклада в спектры (^возб=230 нм) не дают.

Таким образом, в качестве перспективных направлений в изучении мембранных белков методом спектроскопии УФ РКР можно выделить', исследования пространственной структуры нуклеотид-связывающих активных центров и геометрии связывания субстратов; изучение состояния боковых цепей ароматических аминокислотных остатков на различных стадиях функционирования белков; расчет на основе спектров УФ РКР вторичной и элементов третичной структуры белков и установление распределения этих структур по вне- и вяутркмембранным областям.

6. Измерение детальных РКР-профилей возбуждения АТР.

Аня таз и моделирование.

Развитие метода спектроскопии УФ РКР, глубокое понимание механизма КР и успешное применение этого метода к исследованию молекул требуют изучения профилей возбуждения (ПВ), т.е. измерений и анализа зависимостей сечений КР от длины полны возбуждения. Полный анализ ПВ интенсивных колебательных мод АТР и расчет параметров возбужденного состояния, позволил бы промоделировать экспериментальные данные спектров УФ 1 КР и поглощения наилучшим образом.

УФ РКР- спектры АТР были получены при возбуждении в пределах

длинноволновой полосы поглощения (242-290 нм). Резонансное усиление претерпевают только колебательные моды аденинового кольца. Их относительные интенсивности значительно отличаются в областях 290-270 нм и 270-242 нм. При длинноволновом возбуждении все пики имеют сравнимые интенсивности. При коротковолновом возбуждении наиболее интенсивные полосы- 1333, 1482, 1510 см-1, в то время как вклад в спектры линий 1615, 1582 и 1424 см-1 значительно снижается. При этом линия 1302 см-1 проявляется как плечо полосы 1333 см-1 (при \03q= 290-270 нм она видна как отдельная линия). Профили имеют максимумы в области 259-261 нм и плечо около 246 нм, хотя спектр'поглощения АТР в воде широкий и не имеет тонкой структуры. ПВ для мод 1302 и 1582 см-1 имеют также слабое плечо около .280 нм. Главные максимумы ПВ сдвинуты в красную область относительно максимума спектра поглощения. Полуширина измеренных ПВ меньше, чем полуширина спектра поглощения АТР в воде.

Анализ измеренных профилей и оценку параметров возбужденного состояния проводили, используя два принципиально различных подхода: прямое моделирование профилей методом суммирования по колебательным уровням РКР активных мод в приближении одного электронного перехода, а также метод преобразования. Расчетные кривые (рис.5) хорошо воспроизводят основные особенности экспериментальных ПВ.

В результате расчета определены смещения минимумов поверхностей потенциальной энергии колебательных мод при возбуждении, т.е. параметры, которые могут быть использованы для уточнения матрицы силовых постоянных аденина, расчета геометрии и порядков связей возбужденного электронного состояния. Определены также энергия основного электронного перехода, гомогенная ширина

Рис. 5. Эксперимент ("+") и расчет ("-") ПВ РКР для мод 1. 1302 см-1; 2. 1333 см-1; 3.1482 см-1; 4. 1510 см-1; 5. 1582 см-1; 6. расчет ПВ моды 1333 см-1 методом преобразования.

колебательных уровней в растворе, оценено влияние негомогенного ^ уширения на ПВ и спектр поглощения АТР в растворе. Показано, что АТР в растворе характеризуется двумя электронными переходами интенсивным в обл. 254 вы и слабым в области 280 нм.

Показано, что причиной тонкой структуры всех ПВ РКР является проявление резонанса на колебательных уровнях моды 1333 см-*, а также взаимодействия между системами колебательных уровней различных мод в возбужденном состоянии. Полученная информация об электронно- колебательной структуре, позволяет успешно расчитывать УФ РКР- спектры, что будет использовано для моделирования спетральных изменений, происходящих при

взаимодействии АТР с другими биомолекулами.

Выводы.

1. Создана экспериментальная установка для спектроскопии УФ РКР, конструкция и параметры которой оптимизированы для изучения биологических молекул и позволяют регистрировать спектры в диапазоне 400-211 нм за 3-15 минут при сохранении структуры и функции исследуемых молекул.

2. Впервые разработан метод структурно-функционального изучения мембранных белков при селективной регистрации спектров ароматических аминокислотных остатков (триптофана и-тирозина) и определения их степени гидрофобности и зарядового окружения, а также комбинированный подход к регистрации и анализу слабых изменений в спектрах УФ РКР биополимеров на основе созданной экспериментальной установки и методов цифровой обработки сигналов (деконволюции и метода максимальной энтропии).

3. Впервые получены УФ РКР-спектры АТР в комплексе с функционально- активной N8,К- АТРазой и на основе их анализа и моделирования предложена модель взаимодействия пуринового кольца АТР с группами активного центра ИаД-АТРазы, осуществляемого через атом азота N1 и экзоциклическую М^-группу субстрата.

4. Впервые получены спектры УФ РКР фоточувствительных мембранных белков бактериального и зрительного родопсинов (\возб=230 нм). Обнаружено, что при фотолизе зрительного родопсина депротонируется остаток тирозина, наблюдается увеличение полярности окружения остатка триптофана, а также происходят конформационнне изменения в липидной матрице. Показано, что при темновой адаптации бактериального родопсина происходит протонирование остатка тирозина и возрастание

гидрофобности окружения остатка триптофана.

5. Впервые измерены детальные профили возбуждения УФ РКР колебательных мод АТР в обл. 242-292 нм и рассчитаны параметры возбужденного состояния АТР, позволяющие моделировать спектры УФ РКР этой молекулы.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях

1. Eiremov R.G., Feofanov A.V., Dzhandzhugazyan K.N., Nabiev I.R. UV resonance Raman spectroscopy study of ATP- binding site in Na.K- ATPase. - In: Spectroscopy oi Biological Molecules. State oi the Art/ Eds. A. Bertoluzza, C. Fagnano, P.Monti. Bologna: SEE, 1989, p.191- 192.

2. Eiremov E.G., Feofanov A.V., Dzhandzhugazyan K.N., Modyanov N.N., Nabiev I.R. Study oi ATP binding in the active site of Na.K- ATPase as probed by ultraviolet resonance Raman spectroscopy.- FEBS Lett., 1990, vol.260, N 2, p,257-260.

3. Feofanov A.V., Eiremov R.G., Nabiev I.R. UV resonance Raman spectroscopy of membrane proteins. 2. Involvement of Туг and Trp residues in the photochemical processes in visual and bacterial rhodopsins.- In: Proc. of the 12-th international conference on Raman spectroscopy/ Eds. J.R. Durig, J.F. Sulivan. Chichester- N.Y.- Brisbane- Toronto- Singapore: Wiley,' 1990, p.544- 545.

4. Eiremov R.G., Feofanov A.V., Dzhandzhugazyan K.N., Nabiev I.R. UV resonance Raman spectroscopy of membrane proteins. 1. Microenvironment oi ATP in the active site of Na.K- ATPase.- In: Proc. of the 12-th international conference on Raman spectroscopy/ Eds. J.R. Durig, J.F. Sulivan. Chlchester-N.Y.Brisbane- Toronto- Singapore: Wiley, 1990, p.6T0- 671.

5. Feofanov A.V., Eiremov R.G., Nabiev I.R. Probing structure-functional relations in proteins with UV resonance Raman spectroscopy and digital processing of weak signals.- In: Europhyslcs conference abstracts/ Eds. K. Bethge, G. Thomas. EPC, 1990, V.14H, p.49- 50.

6. Eiremov R.G., Feofanov A.V., Nabiev I.R. Calculations of the excited 3tate parameters of ATP based on detailed resonance

Raman excitation profiles in the 242-290 nm region.- In: Europhysics conference abstracts/ Eds. K. Bethge, G. Thomas. PPC. 1990, V.14H, p.46- 4?.

7. Efreraov R.G., Feofanov A.V., Nabiev I.E. Quantitative treatment oi UV resonance Raman spectra of biological molecules. Application to study of membrane-bound proteins.-Appl. Spectrosc., 1991, v.45, N 2, p. 272-278.

8. Elremov R.G., Feoianov A.V., Nabiev I.R. UV гезопапсе Raman spectroscopic study of Trp residues in hydrophobic environment.- baser Applications in Life Sciences/ Eds. S.A. Akhmanov, M.Yu. Poroshlna, N.I.Koroteev, B.N.Toleutaev. Proc. SPIE 1403, 1991, p. 161-163.

9. Феофанов А.В., Ефремов P.Г., Джанджугазян K.H., Набиев И.Р. Спектроскопия резонансного комбинационного рассеяния мембранных белков с возбуждением в ультрафиолетовой области. Микроокружение аденинового кольца АТР в комплексе с Na,K- АТР-азой.- Биол. мембраны, 1990, т.7, J6 4, с. 341- 351.

10. Ефремов Р.Г., Феофанов А.В., Набиев И.Р. Программно-инструментальные средства анализа слабых сигналов биологических молекул в спектрах резонансного КР с возбуждением в УФ области.- Ж. прикладной спектроскопии, 1991, т.54, № 5, с.717-724.

11. Efremov R.G., Feofanov A.V., Nabiev I.R. Effect of hydrophobic environment on the resonance Raman spectra of tryptophan residues in proteins. - J. Raman Spectrosc., 1992, v.23, in press.

Подписано к печати Z9> 11 91.

Формат 60x90/16. Усл. печ, л. Уч.-изд.л.

Тираж 100 экз. Заказ № 1691

Эрдена "Знак Почета' издательство Московского университета. 103009, Москва, ул. Герцена, 5/7. Типография ордена "Знак Почета* издательства МРУ. 119899, Москва, Ленинские горы.