Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния флавоноидов на окислительный стресс в аорте крыс

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния флавоноидов на окислительный стресс в аорте крыс"

На правах рукописи

Арутюнян Тамара Вагаршаковна

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ФЛАВОНОИДОВ НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫИ СТРЕСС

В АОРТЕ КРЫС

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АПР 2015

Пущино -2015

005566404

005566404

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Корыстов Юрмй Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Музафаров Евгений Назибович

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тульский государственный университет», кафедра биотехнологии, заведующий кафедрой

доктор биологических наук Любимов Валерий Юрьевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, ведущий научный сотрудник группы экологии и физиологии фототрофных организмов

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 21 мая 2015 г. в 15 час.ЗО мин.

на заседании диссертационного совета Д 002.038.01

при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки

Институте биофизики клетки Российской академии наук

по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН и сайте www.icb.psn.ru

Ученый секретарь диссертационного совета к. б. н.

Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В настоящее время основной причиной смертности в развитых странах являются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), обусловленные, главным образом, атеросклеротическими изменениями сосудов. Существуют данные, позволяющие полагать, что одним из факторов атеросклероза сосудов может быть окислительный стресс - сверхнормальная концентрация активных форм кислорода (АФК), существенный вклад в возникновение которого даёт повышенная активность ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) (Mehta P.K. et. al., 2007; Choi H. et. al., 2008). Широко распространённое мнение о важной роли окислительного стресса и повышенной активности АПФ в инициации атеросклероза основано на косвенных данных или данных, полученных методами, при которых возможно существенное искажение результатов.

Поскольку окислительный стресс рассматривается как одна из причин атеросклероза сосудов, то антиоксиданты могут быть препаратами, препятствующими атеросклерозу. Однако изученные антиоксиданты (в основном это были витамины С и Е) оказались не эффективны как в профилактике, так и в лечении патологии сосудов (Griendling К.К., 2003), что требуют поиска новых антиоксидантов. Одним из перспективных направлений в этом поиске являются такие антиоксиданты, как флавоноиды, полифенольные соединения, широко распространённые в царстве растений. В связи с перспективами использования этих веществ в медицине сейчас наблюдается значительный рост интереса к исследованию действия флавоноидов на организм человека.

Существуют экспериментальные данные, демонстрирующие вероятные механизмы, которыми флавоноиды могут обеспечить сердечно-сосудистую защиту: снижение содержания в крови липопротеинов низкой плотности, уменьшение тромбоза, улучшение эндотелиальной функции и уменьшение воспаления. В то же время влияние флавоноидов на предполагаемый основной фактор инициации атеросклероза, окислительный стресс в сосудах, экспериментально изучен мало. Не существует также ясного представления о механизмах действия этих веществ.

з

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось исследование окислительного стресса, регистрируемого по количеству АФК и активности АПФ в аорте крыс при экспериментальных моделях инициации атеросклероза и влияние на эти изменения флаво-ноидов и блокатора адгезии лейкоцитов к эндотелию. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) Исследовать изменение количества АФК и активности АПФ в аорте на моделях экспериментального атеросклероза: при старении крыс, обработке их ингибитором ЫО-синтазы, гормоном стресса (дексаметазо-ном) и после облучения. 2) Исследовать влияние таксифолина и экстракта верблюжьей колючки на количество АФК и активность АПФ в аорте, изменённые при экспериментальных моделях инициации атеросклероза. 3) Исследовать влияние блокатора адгезии лейкоцитов к эндотелию на увеличение количества АФК и активности АПФ в аорте после облучения.

Научная новизна и практическая ценность исследования.

В работе впервые методами, свободными от артефактов, было исследовано количество АФК и активность АПФ в аорте крыс на начальных стадиях общепринятых экспериментальных моделей атеросклероза (старение, стресс, дефицит окиси азота, облучение) и влияние на эти факторы флавоноидов экстракта верблюжьей колючки и таксифолина.

Впервые были получены данные о механизме инициации атеросклероза в крупных сосудах после облучения, а также о роли в пострадиационной патологии сосудов ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), являющегося основным модулятором активных форм кислорода (АФК) в сосудах. Впервые в данной работе была исследована дозовая зависимость эффекта облучения в интервале доз около 2 Гр, обычно применяемых в радиотерапии опухолей. В работе был выяснен механизм увеличения после облучения количества АФК и АПФ, заключающийся в адгезии лейкоцитов к активированному эндотелию, следовательно, блокада адгезии лейкоцитов помогает предотвратить нарушение функций сосудов и снизить повреждение тканей после облучения.

Наши данные впервые показывают, что причиной атеросклероза при стрессе, сопровождаемым увеличением концентрации глюкокортикоидных гормонов, может быть увеличение активности АПФ в сосудах.

В данной работе впервые было исследовано влияние таксифолина и экстракта верблюжьей колючки на экспериментальные модели атеросклероза и впервые были получены данные о предотвращении инициации атеросклероза этими флаво-ноидами.

Результаты работы помогают лучше понять механизмы, провоцирующие увеличение окислительного стресса при различных сердечно-сосудистых заболеваниях, что может привести к более эффективному их предотвращению и лечению. А также дают понимание о биологическом действии флавоноидов на ключевые факторы инициации атеросклероза, что необходимо для научно-обоснованного применения их в медицинской практике.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы изложены на: Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодёжи «Экотоксикология - 2010» (Тула, 2010); 16 - 17й международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых "Биология XIX века" (Пущино, 2012 - 2013). По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы (197 наименований, из них 173 зарубежных). Диссертация содержит 36 рисунков и 5 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изменение количества АФК и активности АПФ в аорте крыс при экспериментальных моделях атеросклероза

3.1.1. Изменение активности АПФ в аорте при старении Нами было показано, что с возрастом активность АПФ увеличивается от 21.8±0.9 (контрольные 11-недельные крысы) до 33.2 ± 1.1 пмоль/мин/мм2 у 44-недельных крыс.

{

Рисунок 1. Активность АПФ в аорте молодых и 44-недельных крыс. N = 3— 6 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ 11-недельных крыс

Полученные нами данные согласуются с литературными. Увеличение активности АПФ можно объяснить уменьшением продукции гормона роста при старении [San Frutos, 2007].

3.1.2. Изменение активности АПФ и количества АФК в аорте при потреблении L-

NAME

На рисунке 2 показано увеличение активности АПФ от 21.8±0.9 в контроле до 32.1 ± 1.5 пмоль/мин/мм2 после обработки крыс ингибитором NO-синтазы в течение 12 дней.

35 -i

•е с;

Рисунок 2. Активность АПФ в аорте контрольных крыс и крыс, получавших Ь-ЫАМЕ в течение 12 дней. Возраст крыс в конце эксперимента был 11 недель. N = 3 - 6 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте контрольных крыс

Увеличение активности АПФ при потреблении крысами ингибитора N0-синтазы было показано во многих работах (ТакетоШ М., 1997), однако активность АПФ определялась в гомогенате аорты, что не позволяло сохранить факторы, регулирующие активность АПФ в ткани, то есть фактически измерялось количество фермента в ткани, а не его активность. Данные артефакты были устранены в нашей лаборатории, и активность АПФ определяли в цельных сегментах аорты (Когу^оуа АЛ\,2012).

В таблице 1 представлены данные об изменении количества АФК в аорте при потреблении крысами Ь-ЫАМЕ в течение 5 дней и эффект ингибиторов различных ферментов на АФК в аорте контрольных и обработанных Ь-ЫАМЕ крыс.

Таблица 1. Количество АФК в аортах контрольных крыс (без ингибиторов), крыс, потреблявших Ь-ЫАМЕ в течение 5 дней с ингибиторами и без

АФК, - Контроль L-NAME

ДХФ, пмоль/час/см Без ингибиторов 18.4±0.5 (100) 23±0.6** (100)

Байкалеин, 0,1 мкМ 6.5±0.7* (35) 10.1±0.9* (44)

NDGA, ЗмкМ 11.4±0.6* (62) 17.7±0.7* (77)

Кофеиновая кислота, ЮмкМ 17.4±0.7 (95) 15.9±1.1* (69)

DPI, ЮмкМ 17.3±1 (94) 17.5±1* (76)

Индометацин, ЗОмкМ 20±1.5 (109) 26.3±2 (114)

NS-398, 5 мкМ 26.5±1.4* (144) 23.2±2 (101)

L-NAME, 200 15.5±1.3* (84) 23.5±0.9 (102)

мкМ

Возраст крыс в конце эксперимента был 11 недель. N = 6 - 9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с количеством АФК в аорте без ингибиторов в каждой экспериментальной группе крыс; **Р<0.05 по сравнению с количеством АФК в аорте контрольных крыс без ингибиторов

Как видно из таблицы 1, потребление крысами L-NAME увеличивает количество АФК в аорте на 25%. NDGA (3 мкМ), неспецифический ингибитор липокси-геназ (Hamberg М., 1976), вызывает наибольшее снижение количества АФК в аорте контрольных крыс и крыс, получавших L-NAME, что может быть результатом не только подавления активности липоксигеназ, но и её антиоксидантных свойств: непосредственный перехват части АФК.

Байкалеин, специфический ингибитор 12 - и 15-липоксигеназ (Deschamps J.D., 2006), существенно снижает количество АФК в аорте контрольных крыс, в то время как эффект кофеиновой кислоты, специфического ингибитора 5 - липоксиге-назы (Koshihara Y., 1984), является незначительным. В аорте крыс, получавших L-NAME, влияние этих ингибиторов является противоположным. Полученные данные показывают, что в аорте крыс, обработанных L-NAME, снижается вклад 12 - и 15-липоксигеназ в образование АФК, а вклад 5-липоксигеназы увеличивается, что можно объяснить тем, что при потреблении ингибитора NO-синтазы стимулируется прикрепление к эндотелию моноцитов с последующим превращением их в макрофаги (Koyanagi М., 2000).

DPI (ингибитор NADPH-оксидазы) слабо влияет на количество АФК в аорте контрольных крыс (снижение на лишь 6%), а в аорте крыс, получавших L-NAME, он уменьшает количество АФК на 24%. Увеличение вклада NADPH-оксидазы в образование АФК при потреблении L-NAME, по-видимому, обусловлено активацией этого фермента ангиотензином II (Landmesser U., 2002), концентрация которого возрастает при потреблении крысами L-NAME из-за увеличения активности АПФ (Korystova A.F., 2012; Takemoto М, 1997).

Ингибиторы циклооксигеназы (индометацин и N8-398) не меняют количество АФК в аорте крыс, получавших Ь-ЫАМЕ, но увеличивают его в аорте контрольных крыс на 10-40%, что может быть обусловлено формированием меньшего количества АФК после окисления арахидоновой кислоты циклоогсигеназой, чем при окислении липоксигеназой. Поскольку в аорте контрольных крыс липоксиге-назы дают больший вклад в образование АФК, то подавление активности конкурирующего с ними за субстрат фермента - циклооксигеназы, даёт увеличение общего количества АФК.

При действии на аорту контрольных крыс ингибитора ЫО-синтазы, Ь-ИАМЕ, количество АФК существенно снижается (на 16%), что указывает на то, что часть АФК в аорте контрольных крыс образует ЫО-синтаза. Как и следовало ожидать, ингибитор 1ЧО-синтазы не влияет на количество АФК в аорте крыс, потреблявших Ь-ЫАМЕ, потому что МО-синтаза была уже ингибирована Ь-ЫЛМЕ, полученным в ходе питья.

Таким образом, при потреблении крысами Ь-ИАМЕ увеличивается количество АФК в аорте крыс и изменяется вклад ферментов в образование АФК: снижается активность 12- и 15-липоксигеназ, продукты которых обладают противовоспалительным действием, и увеличивается активность 5-липоксигеназы, образующей провоспалительные продукты. Увеличивается также вклад ЫАВРН-оксидазы в образование АФК.

3.1.3. Изменение активности АПФ в аорте после введения дексаметазона

На рисунке 3 показано увеличение активности АПФ после 8-дневного введения дексаметазона с суточной дозой 30 мкг/кг в брюшную полость крыс по сравнению с контрольными 11-недельными крысами.

Рисунок 3. Активность АПФ в аорте контрольных крыс и крыс, обработанных дексаметазоном (30 мкг/кг/день, 8 дней). Возраст крыс в конце эксперимента был 11 недель. N = 3-6 для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте контрольных крыс.

Дексаметазон является аналогом глюкокортикоидных гормонов, выбрасываемых надпочечниками при стрессе (Muwei Li, 2008) и способствующих инициации атеросклероза (Meyer G., 2003; Харченко Е.П., 2006). Представленные на рисунке 3 данные впервые показывают, что причиной атеросклероза при стрессе, сопровождаемом увеличением концентрации глюкокортикоидных гормонов, может быть увеличение активности АПФ в сосудах.

3.1.4. Динамика изменения АФК и активности АПФ в аорте после облучения в дозе

2.5 Гр

Из рисунка 4 видно, что количество АФК в аорте увеличивается почти в два раза в течение 2 ч после облучения в дозе 2.5 Гр. После достижения максимума на 2 ч количество АФК несколько снижается к 4 ч и остаётся на этом уровне в течение суток. А через 2 суток после облучения количество АФК в аорте падает почти до контрольного уровня.

Рисунок 4. Зависимость количества АФК в аорте крыс, которых облучали 2.5 Гр от времени после облучения. N = 3 - 9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с количеством АФК в аорте контрольных крыс

Вреияпосле 2.5 Гр. час

Из рисунка 5 видно, что активность АПФ в аорте увеличивается почти в полтора раза в течение 2 ч после облучения в дозе 2.5 Гр. После достижения максимума на 2 ч активность АПФ несколько снижается к 4 ч и в течение суток падает незначительно. А через 2 суток после облучения количество АПФ в аорте падает почти до контрольного уровня.

Рисунок 5. Зависимость активности АПФ в аорте крыс, которых облучали 2.5 Гр от времени после облучения. N = 3-9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 & , по сравнению с активностью

«: 24 АПФ в аорте контрольных

" крыс

Времяпосле 2,5 Гр, час

3.1.5. Дозовая зависимость изменения АФК и активности АПФ в аорте через 2 ч

после облучения

Из данных, представленных на рисунке 6 видно, что количество АФК в аорте увеличивается до дозы 2.5 Гр, а при дозах 5 и 7.5 Гр количество АФК существенно ниже, чем при дозе 2.5 Гр и лишь незначительно превосходит контрольный уровень.

22 "Я 20

«= 16 е-"

М К

Рисунок 6. Дозовая зависимость количества АФК в аорте крыс через 2 часа после облучения. N = 3 -9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с количеством АФК в аорте контрольных крыс

Доз^ Гр

Из данных, представленных на рисунке 7 видно, что активность АПФ в аорте увеличивается до дозы 2.5 Гр, а при увеличении дозы существенно снижается.

"з

£ 30^

та

в 26

е

с

< 24 |2 о о £ 22

Рисунок 7. Дозовая зависимость активности АПФ в аорте крыс через 2 часа после облучения. N = 3 - 9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте контрольных крыс

Доза. Гр

3.2. Влияние флавоноидов на количество АФК и активность АПФ, увеличенных в аорте крыс при экспериментальных моделях атеросклероза

3.2.1. Влияние таксифолина и экстракта ВК на активность АПФ при старении Как видно из рисунка 8, после двух недель приема таксифолина, активность

АПФ снизилась у 44-недельных крыс от 33.2 ± 1.1 до 18.5 ±1.1 пмоль/мин/мм2, что

ниже, чем активность АПФ у 11-недельных крыс и типична для ещё более молодых

(4-недельных) крыс (Когу^оуа А.Р., 2012).

£

| 20-

Е 25 -<

Рисунок 8. Зависимость активности АПФ в аорте 44-недельных крыс при поении такси-фолином (100

мкг/кг/день). N = 3 - 6 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ 44 - недельных крыс.

Из рисунка 9 видно, что активность АПФ в аорте пожилых крыс (возраст более 1 года) увеличивается на 61% по сравнению с юными 10-11 недельными крысами. Потребление крысами экстракта верблюжьей колючки в течение 14 дней в концентрациях 0.01 - 0.03% мало влияет на активность АПФ. Снижение активности АПФ становиться заметным с концентрации 0.1%, а при концентрации 0.2% активность АПФ у пожилых крыса снижается до уровня юных крыс.

36 -3* -

1 "Н 1 »4

С

0

1

н

о X

| 22 -< 20-

Рисунок 9. Влияние 14 дневного потребления экстракта ВК на активность АПФ в аорте пожилых (52 недели) крыс. Активность АПФ в аорте 10-11 недельных крыс равна 20.8±0.9

пмоль/мин/мм2. N=3-9 на каждый вариант опыта.

0.СВ 005 0.10 0.15

Концентрация экстракта ВК в воде. %

3.2.2. Влияние таксифолина и экстракта ВК на активность АПФ и количество АФК при потреблении Ь-КАМЕ Как видно из рисунка 10, увеличение дозы таксифолина вызывает снижение

активности АПФ, увеличенное за счёт 12-дневного потребления Ь-ЫАМЕ, и уже в

дозе 30 мкг/кг в день она снижается до 19.9 ± 0.7 пмоль/мин/мм2, что ниже, чем

значение, характерное для 11 -недельных крыс, не получавших L-NAME (21.8 ± 0.9 пмоль/мин/мм2).

Рисунок 10. Зависимость активности АПФ в аорте крыс, получавших Ь-ИАМЕ в течение 12 дней от дозы таксифолина. Возраст крыс в конце эксперимента был 11 недель. N = 3 - 6 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте крыс, получавших только Ь-ЫАМЕ

*

= :!

Из таблицы 2 видно, что в аорте крыс, получавших L-NAME в течение 5 дней, количество АФК увеличилось на 25% по сравнению с контрольными. Такси-фолин (100 мкг/кг в день) уменьшил количество АФК до уровня на 33% ниже, чем в аорте крыс, которые получали только L-NAME и на 16% ниже, чем в аорте контрольных крыс. Для изучения действия таксифолина на индуцированные L-NAME изменения вклада ферментов в производство АФК в аорте, мы выбрали кофеиновую кислоту и DPI в качестве ингибиторов, поскольку их эффекты наиболее отличаются в аортах контрольных и обработанных L-NAME крыс.

Таблица 2. Количество АФК в аортах контрольных крыс, крыс, потреблявших L-NAME в течение 5 дней, и крыс, получавших L-NAME и таксифолин (100 мкг/кг/день) в течение 5 дней без ингибиторов и в их присутствии

Условия определения АФК Контрольные крысы (ДХФ, пмоль/ч/см2) L-NAME обработанные (ДХФ, пмоль/ч/см2) L-NAME и ТФ обработанные (ДХФ, пмоль/ч/см2)

Без ингибиторов 18.4±0.5 (100) 23±0.6** (100) 15.4±0.6**

Кофеиновая кислота, 10 мкМ 17.4±0.7 (95) 15.9±1.1*(69) 15.1±1 (98)

DPI, 10 мкМ 17.3±1 (94) 17.5±1* (76) 15.2±1 (99)

Прием L-NAME в сочетании с таксифолином (100 мкг/кг) нормализует действие кофеиновой кислоты и DPI на формирование АФК в аорте крыс и, следовательно, вклады 5-липоксигеназы и NADPH-оксидазы в образование АФК в аорте.

Хотя антиоксидантные свойства флавоноидов хорошо известны, сомнительно, что таксифолин при таких низких дозах может конкурировать за АФК с эндогенной антиоксидантной системой. Более вероятно, что эффект снижения количества АФК в аорте крыс, потреблявших L-NAME с таксифолином обусловлен инги-бированием производства АФК. Снижение вклада 5-липоксигеназы и NADPH-оксидазы в образование АФК и, следовательно, их активности таксифолином (таблица 2) подтверждает это предположение.

На рисунке 11 показано, что при потреблении крысами L-NAME в течение 12 дней активность АПФ возрастает с 20.8±0.9 пмоль/мин/мм2 (контрольные 10-недельные крысы) до 37±1.3 пмоль/мин/мм2. Добавление в питьевую воду возрастающих доз экстракта ВК вместе с L-NAME снижает увеличение активности АПФ, обусловленное L-NAME, и при концентрации экстракта в воде 0.2% эффект L-NAME отменяется полностью.

0,00

0,05 0,10 0,15

Концентрация экстракта ВК в воде, %

0,15

Рисунок 11. Влияние экстракта ВК на активность АПФ в аорте крыс, потребляющих Ь-ЫАМЕ 12 дней (1); 2 - уровень активности АПФ в аорте 10 недельных контрольных крыс. N=6 на каждую экспериментальную точку. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте контрольных крыс

3.2.3. Влияние таксифолина на активность АПФ после введения дексаметазона На рисунке 12 приведены данные о снижении таксифолином (100 мкг/кг) до

нормального уровня активности АПФ крыс, которые получали дексаметазон в дозе

30 мкг/кг в день в течение 8 дней.

Рисунок 12. Активность АПФ в аорте контрольных крыс и крыс, обрабатывавшихся дексаметазо-ном (30 мкг/кг/день, 8 дней) или дексаметазоном с таксифолином (100 мкг/кг/день, 8 дней). Возраст крыс в конце эксперимента был 11 недель. N = 3 - 6 для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте контрольных крыс

3.2.4. Влияние таксифолина на активность АПФ и количество АФК после

облучения

На рисунке 13 показано, что добавление в питьевую воду таксифолина (100 мкг/кг в сутки) в течение 1 суток до облучения достоверно снижает активность АПФ, увеличенную у облучённых дозой 2.5 Гр крыс через 2 ч после облучения, а его потребление в течение 3 суток снижает активность АПФ у облучённых крыс практически до уровня контроля.

Рисунок 13. Активность АПФ в аорте контрольных крыс, крыс, облучённых дозой 2.5 Гр, крыс, потреблявших таксифолин (100 мкг/кг в сутки) до облучения 1 или 3 дня. Активность АПФ была определена через 2 часа после облучения. N = 3 - 9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте облучённых крыс

На рисунке 14 представлено влияние фракционированного облучения с интервалом 48 ч (по 2,5 Гр во фракции) на активность АПФ в аорте крыс, которую определяли через 2 ч после последней фракции. Активность АПФ возрастает с увеличением количества фракций до трёх (увеличение примерно в 2 раза), снижается после четвёртой фракции, а с дальнейшим увеличением числа фракций до шести практически не меняется.

е- зо

2 3 4 5

Число фракций по 2.5 Гр

Рисунок 14. Зависимость активности АПФ от числа фракций облучения (2.5 Гр в каждой фракции). Активность АПФ была определена через 2 часа после облучения. N = 3 - 9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте облучённых крыс

При облучении крыс тремя фракциями по 2.5 Гр, когда увеличение активности АПФ максимально (см. рис. 14) потребление таксифолина (за 3, 6 дней до начала облучения и в течение фракционированного облучения в дозе 100 мкг/кг в день) существенно снижает активность АПФ (рис. 15). При этом разница между 3 и 6 сутками потребления таксифолина перед облучением не значительна.

Рисунок 15. Влияние таксифолина (100 мкг/кг в день) на активность АПФ после трёх фракций облучения по 2.5 Гр. Активность АПФ была определена через 2 часа после облучения. N = 3 - 9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте облучённых крыс

Снижение активности АПФ таксифолином после однократного и фракционированного облучения указывает на то, что данный флавоноид может снизить и повреждение сосудов после облучения.

На рисунке 16 показано снижение таксифолином (1 мкг/мл) в течение 1 и 3 суток количества АФК в аорте контрольных и облучённых дозами 2.5 Гр крыс через 2 ч после облучения. Трёхсуточное потребление таксифолина даёт более выраженный эффект: в 3.3 раза при 3-суточном и в 2.1 раза при односуточном потреблении. В контрольных крысах 3-суточное потребление таксифолина также снижает количество АФК в аорте в 1.6 раза.

Рисунок 16. Количество АФК в аорте контрольных крыс, крыс, облучённых дозой 2.5 Гр и крыс, потреблявших таксифолин до облучения 1 или 3 дня. АФК были определены через 2 часа после облучения. N = 3 - 9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с количеством АФК в аорте контрольных крыс; **Р<0.05 по сравнению с количеством АФК в аорте облучённых крыс 3.3. Влияние фукоидина на увеличение активности АПФ и количества АФК

после облучения

Для выяснения роли адгезии лейкоцитов в увеличении количества АФК и активности АПФ после облучения мы исследовали влияние блокатора адгезии лейкоцитов к эндотелию фукоидина на образование АФК и активность АПФ после облучения.

Из рисунка 17 видно, что фукоидин практически отменяет увеличение активности АПФ в аорте облучённых крыс дозой 2.5 Гр через 2 ч после облучения.

^ 15 -8

{г £

1

о

с

е

с <

а 20-

р

3

15

Рисунок 17. Активность АПФ в аорте контрольных крыс, крыс, облучённых дозой 2.5 Гр и крыс обработанных фукоидином перед облучением. Активность АПФ была определена через 2 часа после облучения. N = 3 - 9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с активностью АПФ в аорте контрольных крыс

Из рисунка 18 видно, что фукоидин мало влияет (отличие не достоверно) на количество АФК в аорте контрольных крыс, но в аорте облучённых дозой 2.5 Гр через 2 часа после облучения снижает АФК до уровня контроля.

Рисунок 18. Количество АФК в аорте контрольных и крыс, облучённых дозой 2.5 Гр без фукоидина и обработанных фукоидином. АФК были определены через 2 часа после облучения. N = 3 - 9 крыс для каждой экспериментальной точки. *Р<0.05 по сравнению с количеством АФК в аорте контрольных крыс.

**Р<0.05 по сравнению с количеством АФК в аорте облучённых крыс

Отмена увеличения количества АФК и активности АПФ в аорте блокатором адгезии лейкоцитов к эндотелию показывает, что увеличение количества АФК и активности АПФ в аорте после облучения обусловлено адгезией к эндотелию лейкоцитов, являющихся эффективными продуцентами АФК. Прикрепление к эндотелию лейкоцитов может увеличить активность АПФ в сосуде, по крайней мере, по двум причинам: увеличением количества АПФ в сосуде за счёт АПФ, привнесён-

ного лейкоцитами (Fleming I., 2006) и активацией сосудистой АПФ снижением концентрации N0. Известно, что при снижении концентрации NO в сосудах активность АПФ возрастает. Эти факты являются ключом к интерпретации динамики изменения АФК и АПФ в аорте после однократного облучения и дозовой зависимости с экстремумом. Снижение количества АФК в аорте со временем после облучения дозой 2.5 Гр (рис. 4) и активности АПФ (рис. 5) обусловлено, по-видимому, как миграцией лейкоцитов вглубь сосуда, так и смывом с эндотелия повреждённых лейкоцитов, поскольку доля повреждённых лейкоцитов возрастает с дозой (Lemon J. А., 2008).

При фракционированном облучении активность АПФ возрастает до суммарной дозы 7.5 Гр, а с дальнейшим увеличением дозы снижается, но продолжает оставаться на высоком уровне, примерно, в полтора раза, превышающем контрольное значение (рис. 14). Различие в дозовых зависимостях увеличения активности АПФ при однократном и фракционированном облучении можно объяснить тем, что за время между фракциями облучения по 2.5 Гр (48 ч) лейкоциты мигрируют в интиму (Rao R.M., 2007) дифференцируются в макрофаги и становятся гораздо более устойчивыми к последующим дозам облучения. В результате, при фракционированном облучении, несмотря на увеличение дозы, лейкоциты в трансформированном виде накапливаются в аорте.

Таким образом, полученные в работе данные показывают, что облучение увеличивает количество АФК и активность АПФ в аорте и эти изменения обусловлены адгезией лейкоцитов к активированному эндотелию. Следовательно, блокада адгезии лейкоцитов может предотвратить нарушение функций сосудов и снизить повреждение тканей после облучения.

выводы

1. Во всех исследованных моделях экспериментального атеросклероза (старение, потребление ингибитора 1чЮ-синтазы, введение гормона стресса, облучение) в аорте регистрируется окислительный стресс (увеличение количества АФК и активности АПФ), что указывает на то, что окислительный стресс является существенным фактором инициации атеросклероза.

2. При инициации атеросклероза увеличивается не только количество АФК в аорте, но и изменяется вклад различных ферментов в образование АФК: вклад 12 и 15-липоксигеназ в образование АФК снижается, а 5-липоксигеназы и ЫАОРН-оксидазы возрастает.

3. Флавоноид таксифолин и флавоноиды экстракта верблюжьей колючки снижают активность АПФ и количество АФК, увеличенные при различных способах инициации атеросклероза.

4. Таксифолин нормализует вклад ферментов в образование АФК, изменённый потреблением ингибитора 1чЮ-синтазы.

5. Фукоидин, блокатор адгезии лейкоцитов к эндотелию, отменяет увеличение активности АПФ и количества АФК в аорте облучённых крыс. Этот результат показывает, что одной из причин окислительного стресса при инициации атеросклероза может быть адгезия к эндотелию лейкоцитов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи:

1. Arutvunvan T.V.. Korystova A.F., Kublik L.N., Levitman M.Kh., Shaposhnikova V.V. and Korystov Y.N. Effects of taxifolin on the activity of angiotensin-converting enzyme and reactive oxygen and nitrogen species in the aorta of aging rats and rats treated with the nitric oxide synthase inhibitor and dexamethasone. Age 2013. V. 35. P. 2089 -2097.

2. Арутюнян T.B.. Корыстова А.Ф., Кублик Л.Н., Левитман М.Х., Шапошникова В.В., Корыстов Ю.Н. Действие гиперсолевой диеты на активность ангиотензин-превращающего фермента и образование активных форм кислорода в аорте крыс. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2013 Т. 156. №12. С. 723-727.

3. Арутюнян Т.В.. Корыстова А.Ф., Кублик Л.Н., Левитман М.Х., Шапошникова В.В., Аппазов И.О., Нарманова Р.А., Ибадуллаева С.Ж., Корыстов Ю.Н Экстракт верблюжьей колючки снижает активность ангиотензин-превращающего фермента в аорте крыс, увеличенную при старении животных и потреблении ими ингибитора NO синтазы. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2014. Т. 158. №8. С. 186-189.

4. В печати: Арутюнян Т.В.. Корыстова А.Ф., Кублик Л.Н., Левитман М.Х., Шапошникова В.В, Корыстов Ю.Н. Таксифолин и фукоидин нормализуют увеличение активных форм кислорода в аорте крыс после облучения. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2015

Тезисы:

1. Арутюнян Т.В.. Ким Ю.А., Корыстов Ю.Н., «Исследование окислительного стресса в клетках аорты крысы флуоресцентным методом, Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Экотоксиколо-гия-2010», 18-19 октября 2010 г, Тула, стр. 49.

2. Арутюнян Т.В.. Корыстов Ю.Н., «Влияние таксифолина на активность ан-гиотензин-превращающего фермента и количество активных форм кислорода в аорте крыс», Сб. тезисов 16 Международная Пущинская школа-

конференция молодых ученых "Биология XIX века", 16 - 21 апреля 2012 г., Пущино, стр. 401 - 402.

3. Арутюнян Т.В.. Корыстов Ю.Н., «Влияние таксифолина на активность ан-гиотензин-превращающего фермента и количество активных форм кислорода в аорте старых крыс и крыс, обработанных Ь-ЫАМЕ и дексаметазоном», Сб. тезисов 17 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология XIX века", 21-26 апреля 2013г, Пущино, стр. 92 - 93.

Подписано в печать 19.03.2015г. Печать лазерная

Заказ № 4899 Тираж: 75 экз.

Типография «1ЧхРг\ги» ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 18а (4967) 75-97-84 www.fix-print.ru