Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПИЩЕВЫХ АНТИОКСИДАНТОВ НА СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПИЩЕВЫХ АНТИОКСИДАНТОВ НА СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ"



На правах рукописи

ПЕРЕСАДИЛА ВИКТОРИЯ РАФАИЛОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПИЩЕВЫХ АНТИОКСИДАНТОВ НА СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ

03.00.04 —Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в ГУ НИИ питания РАМН

(директор - академик РАМН, профессор Тутельян Виктор Александрович)

Научные руководители:

доктор биологических наук Васильев Андрей Валериевич доктор медицинских наук, профессор Погожева Алла Владимировна

Офи ц и а л ьн ые о п пол енты:

доктор медицинских наук, профессор Сапрыгин Дмитрий Борисович кандидат медицинских наук, доцент Ройтман Александр Польевич

Ведущая организация:

ГУ НИИ биомедицинской химии им, В.Н. Ореховича РАМН.

Зашита состоится 2004 г. в « » часов на заседании

Диссертационного совета Д.001.002.01 при ГУ НИИ питания РАМН по адресу: 109240, г.Москва, Устьинский проезд, д. 2/14

С диссертацией можно ознакомиться в ('чбтиотеке ГУ НИИ питания РАМН Автореферат разослал • __ _ _2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного со.-'..;. доктор биологических н^

профессор В.М. Коденцова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из важнейших защитных систем организма является антиокислительная, предохраняющая от токсического действия активных метаболитов кислорода. Система антиокислительной защиты (АОЗ) обеспечивает механизм контроля над протеканием окислительно-восстановительных процессов и метаболизмом побочных продуктов окисления в организме, а также коррекцию нарушений, вызванных свободнорадикальным окислением [Забров-ская И.А. и др., 1995, Владимиров Ю.А., 1998, Hogg N.. 1998, Frei В., 1999, Дубинина Е.Е., 2001]

Установлено, что при воздействиях внешних прооксидантных факторов (радиация, УФ-излучение, гипоксия, гипо- и гипердннамня, действие ксенобиотиков и т.д.) и активации эндогенных механизмов образования активных форм кислорода (воспалительные, сердечно-сосудистые, онкологические заболевания, стрессы любого происхождения и др.) интенсивность свободнорадикальных процессов в организме повышается (Бурлакова Е.Б. и др., 1997, Кулннский В.М., 1999, Ланкин В.З., 2000]. Это приводит к нарушению в системе АОЗ, дисбалансу окислительных - антиокислительных процессов и развитию окислительного стресса [Меерсон Ф.З., 1988, SiesH., 1991,Зенков и др., 2001].

Обеспеченность организма пищевыми антиоксидантами в значительной степени определяет функциональное состояние системы АОЗ. Наиболее известными экзогенными пишевыми антиоксидантами являются флавоноиды [Cook N.C. et а!., 1996, Ciarkson Р. et al., 2000, Sealbert A,, Williamson G., 2000, Дадалн B.A., 2001, Тюкавкина H.A., 2002J. Особое внимание исследователей среди соединений этого класса в настоящее время привлекают изофлавоны, основными представителями, которых являются даидзеин и генистеин из соевых бобов [Ту-тельян В.А. и др„ 2002, Setcheil К.., Cassidy А., 1999, Anderson J.W. et al., 1999, S etch ell К. et al., 2001, Rishi R., 2002, Ciarkson Т., 2002]. Эти соединения обладают эстрогенной активностью и способностью оказывать эффекты подобные эндогенным эстрогенам, В ряде исследований in vitro выявлены антиоксидантные

свойства изофлавонов com-непосредственное действие в качестве ловушек сво-

i цНБ мс^ .

бодных радикалов ил и хдлатйро§: метшийиГпеременной валентности [Ruiz-Larrea

M. et al., 1997, DiSilvestro R., 1999, Пивоваренко В.Г. и др., 1997, Сукманский О.И., 2002]. Особый интерес представляет сведения о повышении резистентности к окислительной модификации ЛПНП при воздействии изофлавонов сои [Meng G. et al,, 1999, Wiseman H. et al., 2000, Helisten H. et al., 2001]. Важно отметить, что окислительная модификация липопротеинов рассматривается как один из основных механизмов атерогенеза [Орехов А.Н., 1998, Тихазе А.К., 1999, Би-леико М.В., 2001, Holvoet Р., Collen D., 1998]. Среди известных пищевых антиок-сидантов существенная роль в коррекции окислительного стресса отводится также селену, участвующему в регуляции ключевого неспецифического глута-тионового звена в системе АОЗ и рассматриваемого в настоящее время в качестве эссенциального микроэлемента [Golubkina N.A, Alfthan G.t 1999, Гмошинский И.В., Мазо В.К., 1999, Кудрин A.B. и др., 2000, Тутельян В.А, 2002].

Вместе с тем сведения по сравнительной оценке биохимической специфичности и комплексного антиоксидантного действия данных микронутриентов на различных экспериментальных моделях и в клинических исследованиях весьма ограничены. Исходя из этого, важной и актуальной задачей представлялось проведение многоуровневого исследования влияния изофлавонов сои и селена на состояние системы АОЗ организма и интенсивность процессов ПОЛ с целью разработки эффективных подходов в профилактике окислительного стресса.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось многоуровневое изучение особенностей влияния пищевых антиоксидантов на состояние системы антиокислительной защиты организма.

В соответствии с этим предполагалось решить следующие задачи:

1, Исследовать антиоксидантные и антиатерогенные свойства комплекса изофлавонов сои и селена in vitro на моделях культур клеток интимы аорты и макрофагов человека,

2. Оценить состояние системы АОЗ в различных органах крыс при экспериментальной алиментарной гиперлипидемии с включением в рацион комплекса изофлавонов сои.

3. Изучить эффективность комплексного клинического применения изофлавонов сои, селена, витаминов Е и С в коррекции нарушений системы АОЗ и показателей липидного обмена у больных ИБС.

4. Провести изучение содержания метаболитов изофлавонов (гени-стеина, даидзеина) в сыворотке и в суточной моче с целью оценки обеспеченности изофлавонами больных ИБС под влиянием анти-атерогенной редуцированной диеты.

5. Провести изучение содержания селена в сыворотке с целью оценки обеспеченности селеном больных ИБС под влиянием антиате-рогенной редуцированной диеты.

Научная новизна работы. Впервые предложена схема многоуровневой оценки антиоксидантного и антиатерогенного действия комплекса изофлавонов сои и органических соединений селена, включающая первичный скрининг на клеточных культурах, вторичный скрининг в эксперименте на животных с последующим клинико-биохимическим исследованием.

Впервые проведена комплексная оценка содержания продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид) и ферментов (суперокеиддисмутаза, глутатионпероксидаза, каталаза, глутатионредуктаза) системы антиокислительной защиты в различных органах и тканях (плазма, эритроциты, печень, кишечник, аорта) крыс, получавших комплекс изофлавонов на фоне высокожирового рациона и выявлена специфичная реакция су пероксидд нему тазы в печени, слизистой кишечника н аорте при развитии окислительного стресса.

Проведено комплексное сравнительное исследование состояния липидного обмена и системы ПОЛ-АОЗ с целью изучения сочетанного эффекта различных пищевых антиоксидантов - изофлавонов сои, селена, витаминов Е и С в составе антиатерогенной редуцированной диеты у больных ИБС.

Научно-практическая значимость. Предложенная схема многоуровневого исследования может быть использована в качестве дополнительного Крите-

рия оценки антиатеро генных и антиоксидантных свойств биологически активных веществ при разработке новых специализированных продуктов питания.

Теоретические выводы и практические результаты выполненного исследования, изложенные в работе, могут использоваться в научно - исследовательской работе и медицинской практике.

Апробация работы состоялась 5 декабря 2003 г. на расширенной научной конференции отделов фундаментальных исследований, клинико-инструментальных методов исследования и лечебного и профилактического питания ГУ НИИ питания РАМН. Основные положения работы доложены и обсуждены на VI Международной конференции " Б иоантиоксидант" (Москва, 2002), научно-практической конференции "Биологически активные добавки в профилактике заболеваний» (Москва, 2002), научно-практической конференции "Современные аспекты оздоровительного питания" (Днепропетровск, 2СЮ2), VI международном симпозиуме "Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания" (Сочи, 2002), научно-практической конференции «Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине» (Улан-Удэ, 2003), VII Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (г. Пушкин, 2003), Всероссийской конференции «Актуальные проблемы профилактики неинфекционных заболеваний {Москва, 2003), заседании секции лечебного питания Московского городского научного общества терапевтов (Москва, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура н объем диссертации. Работа состоит из введения, трех глав обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трех глав раздела «Результаты исследований и их обсуждение», заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего источника. Работа изложена на страницах, включает 21 таблицу и 17 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Культивирование клеток интимы аорты человека. Аутогтсийный материал был получен из аорт мужчин и женщин в возрасте 40-65 лет в течение 1,5-2 часов после внезапной смерти. Причиной смерти в большинстве случаев была острая сердечно-сосудистая недостаточность. Субэндотелиальные гладкомышечные клетки выделяли из непораженных участков интимы аорты человека путем обработки коллаген азой и культивировали в соответствии с методом Орехова А.Н. и сотр. (1985), Суспензию ¡теток вносили в пластиковый стерильный 48-гнездный микротест для тканевых культур (Nuclon, Дания) из расчета 2-4x10' клеток/см", Клетки культивировали при 37"С в насыщенной водяными парами атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% углекислого газа, в COj-инкубаторе (Forma Scientific, США). Смену среды проводили через день. Для экспериментов использовали 7-дневную первичную культуру клеток.

Культивирование макрофагов человека. Материал получали из крови здорового донора и культивировали в соответствии с методом М. Brown (1983). Суспензию клеток вносили в пластиковый стерильный 48-гнездный микротест для тканевых культур (Nuclon, Дания) с плотностью 1-2x10s. Инкубировали в С02-инкубаторе при 100 % влажности и 37°С в течение 14 суток со сменой инкубационной среды через каждые 48 часов. В экспериментах использовали культуру на 14-й день кул ьтивирования.

Содержание продуктов ПОЛ в макрофагах и клетках интимы аорты оценивали по уровню ТБК-реагирующих субстанций по методу Yagi (1984). После отмывки внутриклеточные липиды трижды экстрагировали смесью гексана и изопропано-ла (3:2), каждая экстракция продолжалась по 30 мин. Экстракт переносили в чистые пробирки и высушивали при комнатной температуре под током воздуха. К полученному сухому осадку добавляли 2 мл 50мМ раствора ТБК в 20% ТХУ. Смесь инкубировали в закрытых пробирках на кипящей водяной бане в течение 30 минут. В качестве стандарта использовали 50 мкМ раствор бисмалондиальде-гида. По окончании инкубации интенсивность флюоресценции измеряли на

спектрофлуориметре F- 4010 (Hitachi, Япония) при длине волны возбуждения 515 нм и длине волны испускания 553 нм.

Определение внутриклеточного холестерина. Внутриклеточные липиды трижды экстрагировали смесью гексана и изопропанола (3:2, объем/объем) по методу Нага and Radin (1978). Каждая экстракция продолжалась по 30 мин. Экстракт переносили в чистый 96-шездный микротест и упаривали при комнатной температуре в токе воздуха. Полученный сухой осадок растворяли в 25 мкл раствора, содержащего 15 мМ холат натрия н 0,05% Тритон Х-100 (Sigma Chemical Company, США), добавляли по 25 мкл изопропанола и по 100 мкл раствора "Monotest" (Boehringer Mannheim, ФРГ) для определения общего холестерина, содержащего 0,2 Ед/мл холестеринэстеразы, 0,1 Ед/мл холестеринокс и дазы, 0,1 Ед/мл перок-сидазы хрена, 1 мМ 4-аминофеназон, 3 мМ фенол и 2 мМ 3,4-дихлорфенол в 50 мМ Трис-буфере, pH 7,7. В качестве стандарта использовали стандартный раствор холестерина в изопропаноле, 1 мг/мл (Boehringer Mannheim, ФРГ). Смесь инкубнровали при 37°С в течение 30 мин, после чего измеряли оптическую плотность проб при длине волны 492 нм на Muhiskan Bichromatîc (Labsystems OY, Helsinki, Финляндия) и рассчитывали содержание общего холестерина в каждой пробе (Orekhov et al., 1986).

Определение внутриклеточного белка. Фиксированные в микротесте клетки после экстракции липидов растворяли в 50 мкл 0,2 N NaOH при комнатной температуре в течение 12-16 часов, после чего определяли содержание клеточного белка в каждой пробе по методу Lowry et al (1951).

Экспериментальные животные и условия опытов. Исследования проведены на 45 крысах-самцах популяции Вистар с исходной массой тела 180±15 г. Животные были разделены на 3 группы по 15 крыс. Крысы контрольной группы (контроль) получали полноценный полусинтетический рацион. Для моделирования алиментарной гиперлипидемии крысы получали изо калорийный высокожировой рацион, где содержание жира составляло 42% по калорийности (ВЖ-группа). Остальные животные на фоне высокожирового рациона получали per os комплекс изо-флавонов сои в дозе 1,4 мг/кг массы тела (группа ВЖ+ИФ).

Методы клинического исследования. Наблюдения проводились в контролируемых условиях в отделении сердечно-сосудистой патологии клиники лечебного питания ГУ НИИ питания РАМН. Было обследовано 84 больных ИБС в возрасте от 44 до 67 лет (65 мужчин и 19 женщин) со стабильной стенокардией напряжения, с избыточной массой тела в 75-85% случаев. Все пациенты обследовались с использованием клинических, биохимических и специальных методов исследования, которые проводились дважды - до и после 4-недельного периода стационарного наблюдения.

Все больные в зависимости от задач исследования были разделены на сопоставимые по полу, возрасту и структуре заболеваний группы. В течение всего периода лечения пациенты получали антиатерогенную редуцированную по калорийности диету Ар, включавшую 75 г белка, 65 г жира, 190 г углеводов при калорийности рациона 1600 ккал. На фоне базисной диеты 15 больных получали комплекс изофлавонов (ИФ) сои в количестве 80 мг в день; 20 - витаминно-минеральный комплекс (ВМК), содержащий селен — 90 мкг в составе селенопи-рана, витамин Е - 15 ME и витамин С -105 мг; 14 - комплекс изофлавонов сои и ВМК. Группу сравнения составили 35 человек.

Биохимические методы исследования. Исследования биохимических показателей крови выполнялись на автоматическом анализаторе «Спектрум» фирмы ABBOTT (США). Уровень аполипопротеина А (апо А) и аполипопротеина В (апо В) определяли с помощью иммуноферментного анализа, активность церулоплаз-мина - спектрофотометр и чески в клинико-диагностической лаборатории «Uni-med Laboratories». Активность супероксиддисмугазы (СОД) и каталазы определяли методами M.Niashikimi et al. (1972) и N.Oshino (1987), соответственно, в модификации Мальцева Г.Ю., Васильева А.В (1994), Активность глутатионпе-роксидазы (ГП) - методом G.Milte (1959); глутатионредуктазы (ГР) - методом J.Tilbotson et al. (1971). Все ферментные методы были адаптированы для полуавтоматического анализатора открытого типа ФП-901 фирмы "Лабсистемс" (Финляндия). Содержание продуктов ПОЛ определяли следующими методами: малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах - по методу L.Ernster et ai. (1967);

s

МДА в плазме - по методу M.Michara (1980); диеновых конъюгатов (ДК) в эритроцитах и в плазме - по методу Z.Placer в модификации Владимирова Ю.А. и со-авт. (1983). Содержание МДА в гомогенатах печени, слизистой тонкой кишки и аорты определяли по методу Косткж В .А. и соавт. (1987). Уровень ДК в гомогенатах печени, слизистой тонкой кишки и аорты определяли по методу Ушкало-вой В.Н. и др. (1993). На основании данных по содержанию продуктов ПОЛ и активностей антиокислительных ферментов был рассчитан общий антиокси-дантный индекс (АОИ), который является разностью двух частных индексов -индекса перекисного окисления липидов (АОИпол) и индекса ферментной анти-оксидантной защиты (АОИ ферм.) (Мальцев Г.Ю., 1999). Для определения содержания глутатиона в гемолизатах эритроцитов был использован метод Tietze в модификации Мальцева Г.Ю. и Тышко Н.В. (2002). Определение токоферолов в сыворотке крови проводили флуоресцетным методом (Спиричев В.Б. и др., 2001). Аскорбиновую кислоту определяли методом титрования CJFanner (1936). Определение содержания изофлавонов в сыворотке и в моче проводили методом аналитической обращен но-фазовой ВЭЖХ (М, Piskula, 1998) на базе ГУ НИИ органической химии и технологии МО РФ. Исследование обеспеченности селеном больных проводили в лаборатории физиологии и биохимии пищеварения ГУ НИИ питания РАМН/ Содержание селена определяли в сыворотке крови с помощью микрофлуориметрического метода (G. Alfthan, 1984).

Для решения поставленных задач были использовали следующие пищевые антиоксиданты: диметилпирасолил селенид (ООО "Ареал", Ростов-на-Дону); витамин но-минеральный комплекс "СеленЕС" представляет собой таблетирован-ную смесь лактозы, витаминов С, Е и селенопирана (производитель ООО «Био-кор» г. Пенза). Состав одной таблетки: витамин С - 17,5 мг (22% РНП), витамин Е -2,5 ME (17% РНП), селен в составе селенопирана - 15 мкг. Комплекс изофлавонов сои "NOVASOY" содержит гликозидные формы (соотношение генистина, даидзинаи глицитина 1,3:1,0:0,3) (производитель «ADM Nutraceutical», США).

Статистическая обработка результатов проводилась на ПЭВМ с помощью пакета «STATISTICA», версия 6.0. Для выявления сопряженности показателей

применялся коэффициент линейной корреляции Пирсона. Степень достоверности отличий значений определяли с помощью двустороннего 1-теста Стьюдента; отличия считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследований н их обсуждение I, Исследование аитиоксидантных и антиатерогенных свойств комплекса изофлавонов сои и соединений селена на моделях культур клеток интимы аорты и макрофагов человека. Исследования проводили на первичной культуре клеток интимы аорты и культуре макрофагов человека. Данные модели используются как тест-системы для выявления антнатерогенных и антиатеросклероткческих свойств биологически активных веществ. Нами также на данных моделях отработана методика по оценке антиоксидантных свойств. Данный этап исследования проводился в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе Минздрава России в лаборатории экспериментального атеросклероза.

Дня изучения антиоксидантного и антиатерогенного эффектов использовали атерогенную сыворотку (контроль АС) больных ИБС, Сыворотка считалась атерогенной, если за 24 часа инкубации с клетками, она вызывала статистически значимое накопление внутриклеточного холестерина. В день эксперимента куль-туральную среду заменяли свежей средой 199. Готовили образцы нзофлавонов сои, селенопирана, диметилпирасолил селенида в концентрациях Юмкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, вместе с атерогенной сывороткой добавляли в культуру клеток и спустя 24 часа определяли содержание продуктов ПОЛ, суммарного внутриклеточного холестерина и внутриклеточного белка.

При оценке антиоксидантных свойств исследуемых веществ (табл. 1), было выявлено, что при внесении органических соединений селена (диметилпирасолил селения и селенопиран) в культуру клеток интимы аорты в концентрациях [ и 10 мкг/мл происходило достоверное снижение ТБК-продуктов на 20-27% по сравнению с контролем АС. При внесении изофлавонов сои в минимальной концентрации антиоксидантный эффект не проявлялся, в концентрациях 1 и 10 мкг/мл снижение ТБК-продуктов составило 20%. В культуре макрофагов у всех

исследуемых веществ при внесении в максимальной концентрации происходило

достоверное снижение продуктов ПОЛ на 48-54%.

Таблица 1. Влияние изофлавонов сои и селеноорганических соединений на содержание продуктов ПОЛ в клеточных культурах

Исследуемые вещества Содержание ТБК-продуктов, мкг/мг белка

Культура клеток интимы аорты Культура макрофагов

контроль 55Д±7,7 280±34

контроль АС 104±8* 460±42*

диметилпирасолил селенид 0,1 мкг/мл 88,3±13,8 -16% 3394:14 -26%

диметилпирасолил селенид 1 мкг/мл 82,8±5,5** -21% 311±36** -32%

диметилпирасолил селенид 10 мкг/мл 76,2±1,1** -27% 238±67** -48%

Селенопиран 0,1 мкг/мл 90,5±9,4 -14% 401±25 -13%

СеленопИран 1 мкг/мл 83,4±6Д** -20% 350±42 -24%

СеленопИран 10 мкг/мл 77,8±б,6** -26% 224±3** -51%

Изофлавоны 0,1 мкг/мл 104±11 -1% 378±6** -18%

Изофлавоны I мкг/мл 83,4±9,4 -20% 367±31** -20%

Изофлавоны 10 мкг/мл 82,3±8,2 -21% 210±34** -54%

Примечание: * достоверное накопление ТБК-продуктов, р< 0,05 ** достоверное снижение содержания ТБК-продуктов, р< 0,05

При сравнении антиатерогенных свойств (рис. 1) в культуре макрофагов человека дозозависимый эффект был получен у селенопирана: в минимальной концентрации (0,1 мкг/мл) снижение содержания внутриклеточного холестерина составило 13% по сравнению с контролем АС, в концентрациях I и 10 мкг/мл содержание внутриклеточного холестерина достоверно снизилось на 20% и 24% соответственно. В свою очередь диметилпирасолил селенид в концентрации 0,1

Рис. 1. Концентрационная зависимость антиатерогенного эффекта

антиоксида нтов:

а) селена в культуре макрофагов

б) изофлавонов в культуре макрофагов

б) изофлавонов и селена в культуре клеток интнмы аорты

ХС, мкг/ иг белка 54 52 50 48 46 44 ' 42 40

ХС, мкг/мг белка 230

210

190

170

ОД 1 10 '£

Концентрация препарата, мкг/мг

—•—селенопирзн —динетилгифасолил с ел ем и,

ХС, мкг/ мг белка

120 т

110 1

100

•>0

0,1 1 ю

Концентрация препарата, и кг/мл

— изофлавоны сои (водный раствор) - изофлавоны сои (спиртовой раств<

0,1

1

10

Концентрация препарата, ккг/нл

—•—селенопирэн - И - изофлавоны сои —А 'Дииетиллирасопил селенид

мкг/мл снижал содержание внутриклеточного холестерина на 14%, однако анти-атерогенное действие при его внесении в концентрации 1 мкг/мл снизилось и составило 7%, при концентрации 10 мкг/мл проявлялся токсический эффект, который характеризовался резким снижением содержания внутриклеточного белка. При исследовании антиатерогенного эффекта комплекса изофлавонов сои были получены следующие результаты: уже при внесении в концентрации 0,1 мкг/мл (спиртовой раствор) обнаружилось снижение содержания внутриклеточного холестерина на 22% при сравнении с контролем АС, однако при увеличении концентрации препарата дозозависимого эффекта выявлено не было и снижение внутриклеточного холестерина оставалось на том же уровне.

В культуре клеток интимы аорты человека наибольший эффект выявлен у комплекса изофлавонов сои: при внесении в культуру в концентрации 0,1 мкг/мл антиатерогенный эффект составил 10%, в концентрациях 1 мкг/мл и 10 мкг/мл происходило достоверное снижение содержания внутриклеточного холестерина по сравнению с контролем АС на 21% и 27% соответственно. При внесении се-ленопирана в минимальной концентрации (0,1 мкг/мл) снижение содержания внутриклеточного холестерина составило П%, в концентрациях 1 мкг/мл и 10 мкг/мл на 23% и 27%. Диметилпирасолил селенид в концентрациях 0,1 мкг/мл и 1мкг/мл снижал содержание суммарного внутриклеточного холестерина в культуре на 13% и 27% соответственно, в концентрации 10 мкг/мл оказывал выше описанный токсический эффект.

Таким образом, в данной серии исследований у изофлавонов сои и органических соединений селена выявлены антиоксидантные и антиатерогенные свойства.

2. Исследование влияния изофлавонов сои на состояние липидного обмена и системы ПОЛ-ЛОЗ у крыс при разбалансировании пищевого ращона.

Показателем обеспеченности крыс изофлавонами являлась обнаруженная концентрация генистеина в сыворотке крови, которая составила 0,27 мкг/мл.

Как видно из результатов, представленных в табл. 2, содержание крыс в течение двух недель на высокожировом рационе приводило к нарушениям липид-

ного обмена. Так уровень общего холестерина был достоверно выше на 30%, триглицеридов - на 100% (в 2 раза) по сравнению с контрольной группой животных. Показатели белкового обмена незначительно отличались от контроля, что характеризует адекватность выбранной модели для оценки гиполипидемических и антиоксидантных свойств .изофлавонов сои. В группе животных, получавших изофлавоны на фоне высокожирового рациона содержание холестерина, триглицеридов было достоверно ниже иа 31% и 64% соответственно, чем в ВЖ- группе.

Таблица 2. Биохимические показатели крови крыс, получавших высокожировой рацион и изофлавоны (М ± т)

Показатели Контроль ВЖ-группа группа ВЖ + ИФ

Холестерин, ммоль/л 2,31 ±0,11 2,9±0,11* 2,06±0,13***

Триглицериды, ммоль/л - 0,84±0,11 1,68±0,24* 0,б±0,12***

Альбумин, г/л 26,6±0,4 27,9±0,7 27,1 ±0,6

Общ. белок, г/л б6,4±1,1 69,3±1,1 66,1 ±0,7 ***

Примечание: * - различие между контролем и ВЖ-груттой, ** - различие между контролем и группой ВЖ+ИФ, *** - различие между ВЖ-группой и группой ВЖ+ИФ, р<0,05.

При оценке интенсивности процессов ПОЛ (рис. 2), выявлено, что у крыс, получавших высокожировой рацион, уровень МДА в плазме и эритроцитах на 35% и 114%, ДК в эритроцитах на 100%, а также суммарный АОИ на 77% были достоверно выше, чем в контроле. У крыс, получавших комплекс изофлавонов сои на фоне высокожирового рациона, суммарный АОИ пол в крови был ниже на 34%, чем у животных ВЖ-группы.

При исследовании компонентов неферментной системы АОЗ (рис. 3), отмечено, что у крыс ВЖ-группы содержание мочевой кислоты и витамина Е было выше на 30% и 16%, соответственно, по сравнению с контролем, и связанно с избыточным содержанием жиров в рационе. Содержание общего глутатиона было выше на 18%, чем в контроле, за счет окисленной формы глутатиона. А у крыс, получавших комплекс изофлавонов сои на фоне высокожирового рациона,

уровень глутатиона был выше на 22% за счет восстановленной формы. Рас, 2. Содержание продуктов ПОЛ в крови крыс, получавших высокожировой рацион и изофлавоны (% от контрольной группы)

□ ВЖ-грулпа □ ЕЖ + ИФ

*- достоверное различие между контролен к ВЖ-группой, ** - между контролем н группой ВЖ+ИФ;

- между ВЖ-группой и группой ВЖ+ИФ, р<0,03 Рис. 3. Показатели неферментного звена системы АОЗ у крыс, получавших высокожировой рацион и изофлавоны (в % от контроля)

□ ВЖ-групп» □ ВЖ + НФ

При оце!1ке ферментного звена системы АОЗ достоверных отличий суммарного АОИ ферм между группами не выявлено. У крыс, получавших высокожи-

ровой рацион, активность глутатионредуктазы на 46% была достоверно выше, супероксиддисмутазы - на 57% ниже (р<0,05) по сравнению с контролем.

Особый интерес представляла оценка содержания продуктов ПОЛ и активности СОД и ГП (рис. 4) в тканях (печени - центральном органе всех метаболических процессов; слизистой тонкой кишки - первый уровень контакта с экзогенными веществами; аорты — ткань-мишень). Полученные результаты показали, что у крыс ВЖ-группы в печени содержание ДК и МДА было достоверно выше на 38% и 70%, соответственно, по сравнению с контрольной группой животных. У крыс, получавших комплекс изофлавонов сои на фоне высокожирового рациона, данные показатели незначительно отличались от контроля. В слизистой тон-кон кишки и аорте эти изменения были незначительны. При экспериментальной алиментарной гиперлипидемии, т.е. у крыс ВЖ-группы, выявлено тканеспеци-фичное изменение активности СОД - индукция активности в печени на 62% и снижение активности в кишечнике и аорте в среднем на 57%, что характеризуется не только особенностями распределения изоферментов в органах (Анисимов В.Н. и др., 1999, Плюха В.А., 2001), но и, по-видимому, является специфичной реакцией активации ферментного звена на начальных этапах окислительного дисбаланса.

Рис. 4 Содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов АОЗ в тканях крыс, получавших высокожировой рацион и изофлавоны (в % от контроля)

У животных, получавших комплекс изофлавонов сои в дозе 1,4 мг/кг массы тела на фоне высокожирового рациона изменение активности фермента было выражено в существенно меньшей степени (не более 9-33%). В печени у них отмечалась индукция активности ГП на 28% по сравнению с контролем.

Таким образом, результаты, полученные в исследованиях in vitro и in vivo, убедительно доказали антиоксидантные и антиатерогенные свойства селена и изофлавонов сои, что явилось обоснованием для оценки их клинической эффективности.

3. Исследование состояния липидного обмена и системы ПОЛ-А 03 при комплексной диетотерапии с включением пгш(евых антиоксидантов у

больных ИБС.

Результаты клинико-биохимических исследований показали, что все пациенты хорошо переносили антиатерогенную редуцированную по калорийности диету Ар с включением пищевых антиоксидантов. Под влиянием комплексной диетотерапии в стационаре у наблюдаемых пациентов отмечалась положительная динамика клинической симптоматики заболевания.

У всех больных до и после курса диетотерапии изучалось содержание метаболитов изофлавонов (генистеина и даидзеина) в сыворотке крови и в суточной моче (табл. 3).

Таблица 3. Содержание генистеина и даидзеина в плазме и суточной моче больных ИБС на фоне комплексной диетотерапии с включением пищевых _антиоксидантов (М±т)_

Показатели Группа сравнения ИФ ИФ+ВМК

Плазма крови

Генистеин, ДО следы4 следы Л следы 4

мкмоль/мл после следы 4 1,24±0,27 0,96±0,1

Даидзеин, ДО следы 4 следы 4 следы 4

мкмоль/мл после следы 4 0,82±0,1 0,64±0,12

Моча

Генистеин, ДО 0,39±0,11 0,41 ±0,14 0,3б±0,09

мкмоль/л после 0,43+0,16 3,70±0,9* 2,46±0,98*

Даидзеин, ДО 0,26±0,05 0,31 ±0,11 0,28+0,14

мкмоль/л после 0,23 ±0,06 1,97±0,6* 1,53±0,34*

Примечание: * • р < 0,05, 11 - ниже предела обнаружения по данному методу

Как видно из представленных данных, у всех наблюдаемых больных в начале исследования (а в группе сравнения и в конце лечения) в сыворотке крови обнаруживались следовые значения генистеина и даидзеина. Результаты подтверждают, что пациенты не потребляли продукты, содержащие изофлавоны. При анализе содержания метаболитов в моче выявлено значительное статистически достоверное увеличение в основных группах: так у пациентов дополнительно с рационом получавших изофлавоны уровень генистеина увеличился в 9 раз, даидзеина в 6,4 раза; в группе, получавшей комплекс изофлавонов и ВМК в 6,8 раз и 5,5 раз соответственно.

Проведенный корреляционный анализ выявил наличие отрицательной корреляции между содержанием генистеина и даидзеина и уровнем ОХС, ХС ЛПНП сыворотке крови {¡=-0,42 и г=-0,63 соответственно, р<0,05); между содержанием генистеина и даидзеина и уровнем ДК пл (г=-0,46, р<0,05), ДК эр (г=-0,51, р<0,05), АОИ пол (г=-0,57, р<0,05), что подтверждает важную роль изофлавонов в регуляции липидного обмена и процессов ПОЛ, и подчеркивает целесообразность оптимизации рационов этими антиоксидантами.

При сравнительном анализе динамики показателей липидного обмена (рис. 5) наиболее выраженное улучшение было отмечено у пациентов основных групп. Оптимизация диетотерапии с использованием ВМК в качестве источника селена, витаминов Е и С приводила к достоверному снижению уровней ОХС и ХС ЛПНП на 20% и 38%, КА снизился 46% (р<0,05), уровень ТГ на 19% от исходного уровня. Обогащение рациона изофлавонами сои и комбинированное применение изофлавонов и ВМК сопровождалось достоверным снижением ОХС на 21% и 22%, ХС ЛПНП - 22% и 32%, КА - 48% и 40% (р<0,05), соответственно. У пациентов данных групп отмечена тенденция к увеличению уровня ХС ЛПВП -33% и 18%. Соотношение апобелков апо-В/апо-А1 достоверно снижалось на 23% у больных, получавших комплекс изофлавонов и ВМК.

Рис, 5. Показатели липидного обмена у больных ИБС на фоне комплексной диетотерапии с включением пищевыхантиоксидантов (* - р<0,05)

А1

□ Группа сравнения □ ВМК □ ИФ В ИФ+ВМК

Включение в комплексную диетотерапию антиоксидантов приводило к более выраженному снижению интенсивности процессов ПОЛ у пациентов основных групп по сравнению с таковым в группе сравнения {таблица 4), В группах, получавших ВМК, изофлавоны, изофлавоны и ВМК, уровень ДК в плазме снизился на 24%, 35% и 29% от исходного уровня, соответственно; ДК в эритроцитах — 23%, 20% и 37 %, МДА в эритроцитах - 36%, 15%, 13%, АОИ пол - 22%, 18% и 22%.

Таблица 4. Содержание продуктов ПОЛ в плазме крови и эритроцитах у больных

ИБС на фоне комплексной диетотерапии с включением пищевых __антиоксидантов (М±т)__

Показатели Группа сравнения ВМК ИФ ИФ+ВМК

Ж пл., нмоль/мл до после 4,52+0,16 4,24±0,2 6,1±0,22 4,61 ±0,26* 4,6±0,5 3,0±0,4* 4,5+0,4 3,2±0,2*

ДК эр., нмоль/мл ДО после 4,37±0,23 3,96+0,45 4,84±0,25 3,75±0,13* 3,5+0,7 2,И±0,5 3,5+0,4 2,2±0,4*

МДА пл., до 2,84±0,24 3,15±0,22 3,Ш,2 3,0±0,2

нмоль/мл после 2,б±0,3 2,01±0,П* 2,б4±0,2 2,6±0,(

МДА эр., пмолъ/мл до после 4,13±0,2 4,08±0,24 3,49±0,19 3,4±0,14 3,б±0,1 3,46±0,1 3,8±02 3,34±0,1

АОИ пая ДО после 5,04±0,3 4,75±0,5 5,46±0,12 4,27±0,10* 4,71 ±0,2 3,87±0,5 4,73 ±0,2 3,69+0,1*

При исследовании активности ферментного звена системы АОЗ отмечено незначительное изменение общего АОИф,рм во всех группах. В группе пациентов, дополнительно получавших изофлавоны сои, выявлено достоверное увеличение активности СОД на 19% (р<0,05), что рассматривается как один из механизмов их антиоксидантного действия (М. 11шг-Ьаггеа е1 а1., 1997). Можно предположить, что выявленное специфическое изменение активности СОД может определяться достаточно коротким периодом полужизни фермента (85 ч), а также возможно связано с влиянием изофлавонов на экспрессию генов, контролирующих синтез данного фермента (Ь. Магк1шк1 е1 а!., 2001), Комбинированное применение изофлавонов и ВМК приводило к увеличению на 28% активности селенза-висимой ГП. Общий интегрированный индекс АОИобщ имел тенденцию к нормализации (нормальное значение АОИобщ около 0) у пациентов всех групп. Однако достоверные изменения отмечены в группе больных, получавших комбинацию изофлавонов и ВМК, где общий АОИ изменялся с -0,64 до +0,72.

Исследование неферментного звена АОЗ, которое в плазме представлено низкомолекулярными веществами экзогенного и эндогенного происхождения выявлено следующее (рис. 6). При оценке обеспеченности витамином С у больных до лечения дефицит выявлен: в группе сравнения у 28%, в группах, получавших ВМК, изофлавоны, изофлавоны и ВМК у 35%, 32%, 26% соответственно. В ходе проводимой диетотерапии средний уровень витамина С в сыворотке больных в наблюдаемых группах не менялся. Индивидуальная оценка с помощью частотного метода выявила, что содержание витамина С повысилось у 2642% пациентов основных групп против 18% в группе сравнения. При исследовании содержания витамина Е отмечено, что средний уровень суммарных токоферолов у пациентов всех изучаемых групп как до, так и после лечения, превышал верхнюю границу нормы. В процессе диетотерапии уровень витамина В в группе сравнения изменялся незначительно, тогда, как в основных группах выявлена тенденция, не подтвержденная статистически, к снижению этого показателя на 415%, что, по-видимому, объясняется более значительным снижением уровня триглицеридов и липопротеинов у пациентов основных групп. При анализе со-

держания селена в сыворотке в динамике выявлено, что до лечения у всех больных уровень Эе находился в пределах субоптимальной обеспеченности. В ходе проводимой терапии у пациентов в группах, не получавших дополнительный источник селена, на фоне диеты Ар снижалось содержание данного микроэлемента в сыворотке крови, В группе, получавшей изофлавоны и ВМК, эта тенденция обращалась, и уровень Бе увеличился на 14% по сравнению с исходным.

Рис. 6. Показатели иеферментного звена системы АОЗ у больных ИБС на фоке комплексной диетотерапии с включением пищевых антиоксидаитов

30% ■/

у

10%-'

н

I

5 X

"-20%--"''

00% [-...........1.............■■■■!■.....■■■■-■-г—---,

В|гтпннм£ Ссяск Цсрулоллазчнп Мочсэм кнслага

□ Группа сравнения О ВМК ОИФ ИИФ+ВМК

У наблюдаемых больных исследовались и анализировались эндогенные ан-тиоксиданты плазмы. Так, во всех группах отмечена тенденция к нарастанию содержания церулоплазмина на 14-22%. Однако более значимые изменения наблюдались в группе сравнения. Вероятно, это вызвано компенсаторной реакцией организма в ответ на снижение активности СОД, т.к. данный антиоксидант плазмы также обладает супероксиддисмутазной активностью (Закирова А.Н. и др., 1994, А1апазш Я.Ь. е! а!.,1998). Содержание мочевой кислоты в группе сравнения снизилось на 29%, а в основных группах - на 4%-7%. По-видимому, это связано с тем, что у пациентов группы сравнения она расходовалась в качестве перехватчика радикалов кислорода и способствовала подавлению процессов ПОЛ. У пациентов основных групп эти функции выполняли экзогенные пищевые антиок-сиданты.

Полученные результаты свидетельствуют, что сочетанное использование пищевых антиоксидантов с различным механизмом действия приводило к коррекции большего числа биохимических показателен.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в многоуровневом исследовании, проведенном на культурах клеток, экспериментальных животных и у больных ИБС установлены антиок-сидантнын и антиатерогениый эффекты комплекса изофлавонов сои (гени-стин, даидзин, глицитин) и органического соединения селена (селенопира-на).

2. В культуре клеток интимы аорты и макрофагов человека у органических соединений селена устаноалены преимущественно антиоксидантные свойства, что выражалось в снижении внутриклеточного содержания ТБК-продуктов в среднем на 26-51%. Изофлавоны сои проявляли преимущественно антиате-рогенные свойства, что выражалось в снижении содержания внутриклеточного холестерина в среднем на 20-27%.

3. Выявлено, что у крыс, получавших комплекс изофлавонов сои в дозе 1,4 мг/кг массы тела при экспериментальной алиментарной гиперлипидемии, интенсивность процессов ПОЛ была ниже, чем у животных, получавших высокожировой рацион. Суммарный АОИ ПОЛ в крови был ниже на 34%, содержание ДК и МДА в печени было ниже на 27% и 36%, соответственно, по сравнению с группой животных, содержащихся на высокожировом рационе.

4. При экспериментальной алиментарной гиперлипидемии выявлено тканеспе-цифичное изменение активности супероксиддисмутазы — индукция активности в печени на 62% и снижение активности в слизистой тонкой кишки и аорте в среднем на 57%. У крыс, получавших комплекс изофлавонов сои в дозе 1,4 мг/кг массы тела на фоне высокожирового рациона изменение активности фермента было выражено в существенно меньшей степени (не более 9-32%).

5. У больных ИБС, получавших курс диеты Ар с включением комплекса изо-флавонов сон в количестве 80 мг в день содержание метаболитов в сыворотке крови увеличилось со следовых значений и составило: генистеина - 0,961,24 мкмоль/мл, даидзеина - 0,64-0,82 мкмоль/мл. Содержание генистеина в суточной моче увеличилось в 6,8 - 9 раз, даидзеина - в 5,5 - 6,4 раза, что свидетельствует о способности данных антиоксидантов включаться в метаболические процессы в организме.

6. Использование изофлавонов сои в количестве 80 мг в день и витаминно-минерального комплекса, содержащего селен - 90 мкг, витамин Е - 15 МЕ и витамин С - 105 мг, на фоне антиатерогенной редуцированной по калорийности диеты Ар у больных ИБС способствовало нормализации показателей липидного обмена. Прием витамин но-минерально го комплекса и изофлавонов, как отдельно, так и в комбинации приводил к снижению ОХС на 20%, 21% и 22% от исходного уровня, соответственно, ХС ЛПНП - 38%, 22% и 32%, ТГ - 19%, 30% и 13%, КА - 46%, 48% и 40%; увеличению уровня ХС ЛПВП — 5%, 33% и 18%. Соотношение апобелков апо-В/апо-Al достоверно снижалось на 23% у больных, получавших комбинацию изофлавонов и витамин но-минерального комплекса.

7. Включение пищевых антиоксидантов в комплексную диетотерапию приводило к снижению суммарного содержания продуктов ПОЛ в среднем на 1822%. Комбинированное применение изофлавонов и витаминно-минерального комплекса способствовало более выраженному достоверному изменению общего АОИ с -0,64 до +0,72.

8. В группе сравнения выявлено снижение обеспеченности селеном в процессе 4-недельного лечения антиатерогенной редуцированной по калорийности диетой. Дополнительное включение источника селена на фоне диетотерапии сопровождалось повышением обеспеченности селеном до оптимального уровня.

Список работ, опубликованных по теме диссертации;

1. Хачатурова В.Р., Орехов А.Н Васильев A.B. «Сравнительная оценка антиокси-дантного и антиатеро генного действия ряда препаратов биоорганического происхождения» // Тезисы докладов VI Международной конференции "Биоантиок-сидант" - Москва - 2002 - С. 596-597

2. Хачатурова В.Р., Супрун И.В., Орехов А.Н., Васильев A.B. «Антиатерогенное действие изофлавонов сои и селенопирана» Н Тезисы докладов научно-практической конференции "Биологически активные добавки в профилактике заболеваний" - Москва - 2002. - С.67-68

3. Хачатурова В.Р., Шимановская Н.П. «Эффективность использования БАД "СеленЕС" в диетотерапии больных ишемической болезнью сердца» // Тезисы докладов научно-практической конференции "Современные аспекты оздоровительного питания» -Днепропетровск - 2002. - С. 115-117

4. Хачатурова В.Р. «Экспериментальная оценка эффективности БАД на основе изофлавонов сои» // Тезисы докладов VI международного симпозиума " Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания" — Сочи -2002. - С. 279-280

5. Хачатурова В.Р., Супрун И.В-, Васильев A.B. «Сравнительная оценка антиок-сидантного и антиатерогенного действия препаратов природного и селеноргани-ческого происхождения» И Би о медицинская химия. - 2003. - Том 49. - №2. - С. 201-207

6. Васильев A.B., Шимановская Н.П., Хачатурова В.Р., Мальцев Г.Ю. «Исследование влияния БАД "СеленЕС" на состояние антиоксидантной системы у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями» Н Биомедицинская химия. - 2003. -Том 49. - №3. - С. 291-296

7. Хачатурова В.Р., Мальцев Г.Ю., Варсанович Е.А., Васильев A.B. «Исследование эффектов БАД содержащей изофлавоны сои в эксперименте и клинике» Н Тезисы докладов научно-практической конференции «Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине» - Улан-Удэ - 2003 - С. 24-26

8. Хачатурова В.Р., Васильев A.B. «Исследование эффектов селенсодержащих БАД в эксперименте и клинике» // Тезисы докладов VII Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» - Пушкин - 2003 - С. 118-122

9. Хачатурова В.Р., Варсанович ЕЛ., Мальцев Г.Ю., Погожева A.B., Васильев A.B. «Исследования эффективности биологически активных добавок, содержащих, изофлавоны сои и селен в диетотерапии больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями» // Тезисы докладов всероссийской конференции «Актуальные проблемы профилактики неинфекционных заболеваний» - Москва - 2003 - С.86-87

10. Хачатурова В.Р., Дмитриевская М.Н., Мальцев Г.Ю., Погожева A.B., Васильев A.B. «Использование природных антиоксидантов в коррекции метаболических нарушений у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями» // Вопросы питания. -2004. - №2i - С. 38-42

Служба множитель но И техники ГУ РОНЦ им, H.H. Блохнна РАМН

Пол писана к печати 01.04 г. Заказ № 5 Тираж 1ВД Экз.