Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранотропные и антиоксидантные свойства флавоноидов и их комплексов с катионами железа

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мембранотропные и антиоксидантные свойства флавоноидов и их комплексов с катионами железа"

На правах ш^описи

Яголышк Елена Андреевна

МЕМБРАНОТРОПНЫЕ И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ФЛАВОНОИДОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С КАТИОНАМИ ЖЕЛЕЗА

03.01.02. - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

005543114

Пущино-2013

005543114

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Тульский государственный университет и в лаборатории культур клеток и клеточной инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Музафаров Евгений Назибович

доктор физико-математических наук, профессор Ким Юрий Александрович

Официальные оппоненты:

Зинченко Валерий Петрович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, заведующий лаборатории внутриклеточной сигнализации

Проскуряков Иван Игоревич доктор физико-математических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, заведующий лаборатории молекулярной спектроскопии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук (ИТЭБ РАН)

Защита диссертации состоится « 19 » декабря 2013 г. в 14 ч. 00 мин. на заседании совета Д 002.038.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «_ » 2013 г.

Ученый секретарь .

диссертационного совета, —> ^ ^

X /и Iе ^ /7 ' Смолихина Татьяна Ивановна

кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы исследования. Флавоноиды - класс полифенольных соединений растительного происхождения, интерес к которым обусловлен перспективой получения синтетических аналогов этих веществ, обладающих лекарственным действием. Исследования последних лет показали, что производные некоторых флавоноидов могут успешно использоваться в лечении различных заболеваний внутренних органов, где эти вещества проявляют большую эффективность, чем известные лекарственные препараты [Garcia, A., Bocanegra-Garcia V. et al, 2012; Ferrazzano, G. F., Amato I.et al, 2011; Saleem, M., Nazir M., et al, 2010; Hemaiswarya, S., Kruthiventi A. K., Doble M., 2008] .

Важным вкладом флавоноидов в защиту организма от окислительного стресса является их способность связывать металлы переменной валентности [Perron, N. R., and J. L. Brumaghim, 2009].

Высокую антиоксидантную активность на целых животных клетках из различных органов или на субклеточных фракциях проявляют металлокомплексы рутина, кверцетина, катехина и других флавоноидов [Perron, N. R., Brumaghim J. L., 2009; Mira, L., Fernandez M. Т., et al., 2002; de Souza, R. F., De Giovani W. F., 2004], что открывает перспективы их использования в медицине [Grazul, М., Budzisz Е., 2009].

Для флавоноидов, так же как для многих других биологически-активных веществ, гидрофобность и, соответственно, способность взаимодействовать с биологическими мембранами является одним из необходимых условий проявления фармакологической активности [Hendrich, А. В., 2006]. Несмотря на большое количество исследований, проведенных в последние годы, все еще не существует ясного представления о механизмах действия этих веществ. Данная область науки находится на стадии накопления фактов, тогда как создание единой теоретической основы, объясняющей действие флавоноидов, остается делом будущего.

1.2. Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось определение степени липофильности флавоноидов и их комплексов с ионами железа и исследование мембранотропных и антиоксидантных свойств этих соединений.

В процессе исследования решались следующие задачи:

Дать характеристику комплексам флавоноидов с катионами железа, определить их стехиометрию и липофильность.

Исследовать действие свободных флавоноидов и их комплексов с катионами железа (И, III) на фазовые переходы фосфолипидов в липосомах.

Изучить антиоксидантные свойства свободных флавоноидов и их комплексов с катионами железа (II, III), в том числе:

а) показать антирадикальное действие на стабильный радикал ДФПГ в липидном бислое липосом;

б) оценить влияние на перекисное окисление липидов (определение продуктов окисления липидов по количеству образованного МДА)

Исследовать ряд физико-химических свойств липосом в присутствии флавоноидов и их металлокомплексов.

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что стехиометрия образующихся комплексов определяет характер их взаимодействия с фосфолипидным бислоем и может влиять на различные физические свойства бислоя, включая термодинамические характеристики фазовых переходов, процессы взаимодействия между мембранами и их слияние. Антиоксидантные свойства и способность к защите фосфолипидного бислоя от перекисного окисления также зависят от стехиометрии комплекса флавоноид:железо.

Обнаружено, что липосомы из фосфатидилхолина образуют агрегаты, обмениваются липидами и сливаются под действием комплексов флавоноидов с катионами железа. При соотношении молекул в комплексе флавоноид:железо равном 2:1 образуется мостик между соседними мембранами липосом. При этом молекулы флавоноидов погружаются в гидрофобную область липидов, а полярная часть комплекса, содержащая атом железа, образует мостик (скрепку) между соседними мембранами.

Результаты работы углубляют фундаментальные знания о механизмах взаимодействия растительных полифенолов с мембранными системами клетки и вносят вклад в понимание биологического действия флавоноидов на живой организм, что необходимо для научно-обоснованного применения их в медицинской практике.

1.4. Апробация работы. Основные положения работы изложены на: VII Международном симпозиуме по фенольным соединением: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 2009); VIII Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2010); 15 - 17й международных пущинских школах-конференциях молодых ученых "Биология XIX века" (Пущино, 2011 - 2013); VI Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2011); 4-й съезде биофизиков России (Н-Новгород, 2012); IX Международной научно-практической конференции "Современные проблемы науки-2013" (Прага, Чехия, 2013), Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '13» (Пущино, 2013).

1.5. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.6. Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Методической части, Изложения и обсуждения результатов, Заключения и Выводов, изложенных на 135 страницах. Диссертация содержит 35 рисунков и 6 таблиц. Список цитированной литературы состоит из 239 источников, из них 211 зарубежных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы:

Липиды: димеристоилфосфатидилхолин (l,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC), дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина (l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidyleethanolamine, POPE) и пальмитоил-олеоил-фосфатидилхолин (l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- phosphocholine, РОРС) (Avanti Polar Lipids, США), азолектин и яичный лецитин (Sigma-Aldrich, США); лиссамин-родамин-В-дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина (lissamine-rhodamine-B-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, Rh-RE) и NBD-дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина (1,2-dipalmitoy l-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl), NBD-PE) (Avanti Polar Lipids, США).

Флавоноиды: кверцетин, дигидрокверцетин (таксифолин), флоретин, рутин, катехин, морин (Sigma-Aldrich, США).

Реактивы: FeClj*6IbO (Реахим, х.ч.), FeS04*6H20 (Реахим, х.ч.), 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (Serva, Германия), диметилсульфоксид (ДМСО) (Sigma, США),

этанол (ректификат), трис-HCl (Serva, Германия), хлороформ (Реахим, для хроматографии, х.ч.), аргон (Реахим, х.ч.), бидистиллированная вода, деионизованная вода (Milli-Q, Arium 611 VF, Germany), октанол (Panreac, Испания), -гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин 1-оксил бензоат (4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl, TEMPOL) (Sigma-Aldrich, США), трихлоруксусная кислота (ТХУ) (Реахим, х.ч.), тиобарбитуровая кислота (ТБК) (Serva, Германия).

2.1. Определение коэффициента распределения флавоноидов и их металлокомплексов в системе октанол/вода В 2-х фазной системе октанол/вода, использовали деионизованную воду Milli-Q, Arium 611 VF, Германия) на которой готовили 10 мМ трис-HCl буфер (pH 7,4). Исходные растворы флавоноидов готовили в октаноле, насыщенном водой и взбалтывали на вортексе 30 мин с водой, насыщенной октанолом при их соотношении 1:1. После инкубации в течении 5-6 часов, добавляли раствор Fe2+ и Fe3+ известной концентрации, перемешивали на вортексе 30 мин. После встряхивания водную фазу отделяли от органической центрифугированием в течении 15 мин при 1500g на центрифуге Centrifuge 5414 (Eppendorf, Germany). Концентрацию флавоноидов и их комплексов с Fe3+ , Fe3+ после распределения определяли с помощью УФ-спектроскопии в каждой из фаз.

2.2. Приготовление липосом Липиды растворяли в хлороформе, высушивали в струе аргона и вакуумировали сутки для полного удаления растворителя. Далее липид гидратировали в 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4) путем механического встряхивания и нагревали до 37°С в течение 1 часа. Моноламеллярные липосомы получали методом экструзии через поликарбонатные фильтры (диаметр пор 100 нм) с помощью миниэкструдера (Avanti Polar Lipids, США), по стандартной методике [R.C.MacDonald, et al., 1991; N.K.Subbarao, et al.,1991].

Все исследуемые флавоноиды, кроме кверцетина, растворяли в 70% этаноле. Маточный раствор кверцетина готовили в ДМСО. Конечная концентрация растворителей флавоноидов в суспензии липосом была не выше 0,1%.

2.3. Определение размеров липидных агрегатов

Размер липосом и липидных агрегатов определяли методом фотоно-корреляционой спектроскопии (Dynamic Light Scattering), для чего использовали анализатор субмикронных частиц Counter N4 Plus (Beckman Coulter, США). Для измерения, в кювету, содержащую 2 мл трис-НС1, 10 мМ (рН 7.0), добавляли 20 мкл суспензии липосом. В различных экспериментах в кювету были добавлены также по 20 мкл растворов флавоноидов, Fe2+ или Са2+. Исходная концентрация каждого раствора была 10'3М.

2.4. Анализ обмена липидов между липосомами Для анализа обмена липидов методом флуоресцентной спектроскопии готовили липосомы диаметром 100 нм из пальмитоил-олеоил-фосфатидилхолина (РОРС), содержащие 0,5% NBD-дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина (NBD-RE) и 0,5% лиссамин-родамин-В-дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина (Rh-RE). Измерения проводили на спектрофлуориметре Perkin Elmer 44В (США) при постоянном перемешивании и при комнатной температуре. Для инициации обмена липидов в кювету добавляли растворы кверцетина, Fe2+ и Са2+ в тех же условиях, как и при измерении светорассеяния. Длина волны возбуждения была 500 нм. Флуоресценцию измеряли при 537 нм для NBD-RE и 590 нм для Rh-RE.

Спектры поглощения растворов флавоноидов и их комплексов с Fe2+ , Fe3+ измеряли на спектрофотометрах Specord М 40 (ГДР) и Shimadzu UV-VIS 1800 (Япония).

2.5. Спектрофотометрическое определение стехиометрии комплексов флавоноидов с Fe2+, Fe3+.

2.5.1. Метод изомолярных серий (метод Остромысленского-Жоба) Для выполнения анализа брали изомолярные растворы металла и реагента и смешивали их в антибатном соотношении (чтобы суммарный объем компонентов оставался постоянным), создавали оптимальные значения рН и измеряли оптическую плотность полученных растворов при оптимальной длине волны. Затем строили кривую зависимости выхода комплекса от соотношения реагентов в растворе и по ней находили точку максимума.

2.5.2. Метод молярных отношений (метод "насыщения") Определяли зависимость оптической плотности растворов комплекса от соотношения концентраций комплексообразующих компонентов, причем

концентрацию одного из них поддерживали постоянной, а концентрация второго являлась переменной и охватывала достаточно широкий диапазон. График зависимости величины оптической плотности от концентрации второго компонента представлял собой две прямые линии, точка пересечения которых позволяла определить стехиометрию комплекса.

2.6. Измерение светорассеяния Светорассеяние в суспензиях липосом под углом 90° измеряли на спектрофлуориметре Perkin Elmer MPF 44В (США) при длине волны X = 650 нм. В кювету, содержащую 2 мл 10 мМ буфера трис-HCl (рН 7.0), добавляли 20 мкл суспензии 100 нм липосом из РОРС. Далее в кювету добавляли растворы флавоноидов, Fe2+ и Са2 в различной последовательности. Во всех измерениях, если не указано особо, концентрация в кювете флавоноидов и Fe2+ была 1*10"5 М, липида 2*10"4 М, Са2+ 1*104М.

2.7. Электронная микроскопия замораживания-скалывания Для электронно-микроскопического анализа к 20 мкл суспензии липосом из РОРС (15 мМ) добавляли по 20 мкл 1 мМ растворов флавоноидов, Fe2+ и Са2 и быстро перемешивали пипетированием. После 10 мин выдерживания препарата при комнатной температуре криофиксацию производили в течение последующих 10-15 мин. Для этого препараты помещали между двумя листами медной фольги, толщиной 100 мкм и быстро погружали в сжиженный пропан при температуре жидкого азота. Скалывание и напыление платиной и углеродом производили при -150°С на установке JEE-4B (JEOL, Япония), модифицированной нами для этих целей, как описано ранее [Tarahovsky et al., 1995]. Реплики просматривали на микроскопе JEM-100В (JEOL, Япония) при увеличении 20000.

2.8. Измерение антирадикальной активности флавоноидов и их комплексов

с катионами железа по восстановлению ДФПГ в липосомах Антирадикальную активность флавоноидов и их комплексов с Fe3+ оценивали по уменьшению сигнала ЭПР от стабильных радикалов ДФПГ, встроенных в фосфолипидные бислои моноламеллярных липосом из DMPC, при добавлении к ним соответствующих реагентов. Измерения спектров ЭПР проводили на спектрометре ЕМХ-6 (Bruker, Германия). Спектры регистрировали с амплитудой модуляции магнитного поля 4 Гс, при СВЧ 9,47 ГГц и микроволновой мощности

20 мВт. Количество встроившегося в мембраны радикала определяли путем сравнения вторых интегралов спектров ДФПГ и 10"5 М раствора стабильного радикала TEMPOL в воде, измеренных в идентичных условиях. Концентрация липидов в образце составляла 10 мг/мл, концентрация радикала - 3,25*10"5М.

2.9. Определение концентрации веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой

кислотой

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА) в суспензии липосом проводили как описано в работе [Н. Esterbauer and К. Н. Cheeseman. 1990]. Исследуемые флавоноиды и их комплексы с Fe3+ добавляли в липосомы, которые затем подвергали спонтанному окислению, инкубируя пробы при 37 °С в течение 24 ч. Содержание малонового диальдегида (МДА) рассчитывали по формуле [В. 3. Ланкин, и др., 1975]:

С = (Dm2- D580) х V, / VL х £ х 1, где D - оптическое поглощение при соответствующих длинах волн; Vt - объем тиобарбитуровой кислоты; VL - объем липидной инкубационной среды; е -молярный коэффициент поглощения МДА (1,55 х 105 М"'-см"') [Afanas'ev IB, et al, 1989]; 1 = 1 см.

2.10. Микрокалориметрическое исследование

Температурную зависимость избыточного удельного теплопоглощения (далее термограммы) липидных мембран регистрировали с помощью дифференциального адиабатного сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (Специальное Конструкторское Бюро АН СССР, г.Пущино). Устройство, принцип работы и основные характеристики ДАСМ-4 описаны в работах [Privalov, P.L., Plotnikov, V.V., 1989]. Все измерения проведены в буфере 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) при скорости прогрева 1 К/мин.

2.11. Статистическая обработка данных

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием программного пакета Statistica 6.0 с расчетом значения выборочного среднего М и стандартной ошибки т. Достоверность различий между группами оценивали с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р < 0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Характеристика комплексов флавоноидов с ионами железа (II,III)

3.1.1. Определение липофильности комплексов флавоноидов с железом в системе вода-октанол Нами показано, что образование комплексов кверцетина с Fe2+, Fe3+ может оказывать существенное влияние на гидрофобность молекулы и ее взаимодействие с фосфолипидным бислоем. Так, расчеты коэффициента распределения молекул в системе октанол/вода (log Р) показывают, что комплекс кверцетин-железо (1:1) менее гидрофобен, чем молекула кверцетина, однако гидрофобность существенно возрастает в комплексах кверцетин-железо 2:1 и 3:1 (Табл. 1).

Таблица 1. Коэффициент распределения кверцетина и его комплексов Fe2+, Fe3+ в системе октанол/вода. Данные получены с использованием программы Chem3DUltra 9,0

Проба Log Р

кверцетин 1,3076

кверцетин-железо (1:1) 0,8663

кверцетин-железо (2:1) 3,4775

кверцетин-железо (3:2) 6,0888

Полученные данные свидетельствуют о том, что образование комплекса кверцетин-железо не препятствует взаимодействию этого флавоноида с фосфолипидным бислоем. В соответствии с расчетами, данное взаимодействие может усиливаться в комплексах с соотношением кверцетин-железо 2:1 или 3:1.

Детальное исследование комплексов кверцетин-железо, представленное в работе Оио е1 а1 [Оио,М, е1 а1, 2007] показывает, что при комплексообразовании преимущественно образуются структуры со стехиометрией кверцетин-железо 1:1, 2:1 и 3:2, в которых участвуют 4-карбонильная-5-гидроксильной и 3'-4'-гидроксильной группы. Проведенный нами расчет липофильности этих комплексов показал значительные изменения величины вычисленного коэффициента распределения в системе октанол/вода. Так, при образовании комплекса в соотношении 1:1 коэффициент распределения СЬо§Р снижается в сравнении со свободным флавоноидом, что соответствует повышению растворимости комплексов в воде. Однако комплексы 2:1 и особенно 3:2 существенно более липофильны.

Таблица 2. Вычисленные коэффициенты распределения в системе вода-октанол _(СЬодР) свободных флавоноидов и их комплексов с железом.

флавоноид соотношение комплекса CLogP

кверцетин 1:0 1,5037

1:1 0,8663

2:1 3,4775

3:2 5,5498

таксифолин (дигидрокверцетин) 1:0 0,7710

1:1 0,1103

2:1 1,9655

3:2 3,2818

3.1.2. Экспериментальное определение липофшьности комплексов кверцетин-Fe1' и таксифолин-Fe2* Экспериментально полученные величины липофильности (LogP) свободных флавоноидов и их комплексов с железом показывают возрастание этой величины при добавлении к раствору флавоноидов даже небольших количеств Fe2+ (Рис. 1). В целом, полученные экспериментально величины LogP соответствует данным литературы [Foti М, et al, 1996; Kitagawa S, et al, 2005; Rothwell JA, et al, 2005; Wolfe,KL, R H Liu, 2008], хотя они варьируют в различных работах.

2,о

о_ о

1,5

1.0

О,О 0,2 0,4 Fe / флавоноид

Рис.1.

Зависимость

величины

коэффициента распределения (Ьо£Р) от соотношения флавоноид- Ге2\ измеренная в экспериментов, системе вода/октанол для кверцетина (а) и таксифолина (б).

При добавлении катионов железа (II) липофильность кверцетина и таксифолина возрастает, хотя и не достигает высоких значений (> 2), полученных в вычислениях. Для объяснения особенностей в комплексообразования флавоноидов мы провели анализ стехиометрии комплексов в условиях наших

3.1.3. Экспериментальное определение стехиометрии комплексов кверцетин-

Fe2*

В спектре поглощения света кверцетина (Рис.2) имеется максимум около 255 нм, (полоса II) и второй максимум поглощения при 372 нм (полоса I).

Рис. 2. Определение стехиометрии комплексов кверцетин-Ре2+титрованием.

А - UV-Vis спектры поглощения кверцетина (1), и комплексов кверцетин-железо, полученных при смешивании водных растворов кверцетина (20 мкМ) и железа 2мкМ, 4мкМ, бмкМ, 8мкМ, ЮмкМ - номера 1 -6 соответственно.

Б - зависимость величины абсорбции при 470 нм от концентрации катионов Fe2'. Излом кривой приходится приблизительно на ЮцМ катионов Fe2+, что соответствует соотношению кверцетин-Fe2* 2:1.

При смешивании растворов кверцетина с Fe2+ образование комплекса завершается менее чем за минуту [Fernandez,МТ, М L Mira, 2002]. При титровании возрастающими концентрациями катионов Fe2+ максимум поглощения кверцетина при 372 нм снижается, но растет новый максимум при 425 нм, свидетельствующий о появлении комплекса кверцетина и железа (II) (Рис.2.А). Присутствие одной изосбестической точки при 398 нм свидетельствует о наличии в системе только двух хромофоров, переход между которыми находится в равновесном состоянии [Wang,G, et al, 2012]. Результат измерений зависимости величины поглощения при 425 нм от количества добавленного железа обнаруживает излом при концентрации [Fe2+] = 10 mM (Рис.2.Б). Учитывая, что в растворе присутствует 20 мМ кверцетина, мы получаем соотношение кверцетин-Ре2+ 2:1.

Набор спектров полученных при различных молярных соотношениях кверцетина и железа не имеет выраженной изосбестической точки, что характерно для данного способа смешивания компонентов. Кривые перекрещиваются и меняются местами в широком диапазоне длин волн. Измерения зависимости

о,о-

200 ЗОО 400 500 бОО 1

абсорбции от отношения компонентов дает кривую, которая имеет максимум при 6/4, что соответствует отношению кверцетин-Ре2+ 3:2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при взаимодействии кверцетина и таксифолина с Fe2+ могут образовываться комплексы флавоноид-Fe2* приимущественно в соотношении 2:1 и 3:2, гидрофобность которых существенно выше, чем комплексов 1:1. Это коррелирует с приведенным выше анализом зависимости величины LogP от соотношения количеств ионов Fe2+ и кверцетина и показывает рост липофильности при увеличении порции добавленного железа вплоть до соотношения флавоноид-Fe2* 2:1.

3.1.4. Экспериментальное определение стехиометрии комплексов кверцетин-

Fé*

Титрование возрастающими концентрациями Fe3+ позволили определить стехиометрию комплексов кверцетин-Fe3* как 1:1. Эта величина отличается от полученной ранее стехиометрии комплекса, содержащего ионы Fe2+ [M. Guo, et al, 2007; Y. A. Kim, et al, 2013].

Измерение липофильности комплексов в системе октанол-вода показали, что при избытке флавоноида липофильность комплекса падает, тогда как в комплексе с соотношением кверцетин-Ре3+ 1:1 липофильность несколько возрастает, что отличает комплексы кверцетина с Fe3+OT ранее исследованных комплексов с Fe2+.

3.2. Исследование действия индивидуальных флавоноидов на термодинамические параметры фосфолипидов 3.2.1. Плавление фосфатидилхолина (DMPC)

Флавоноиды, добавленные к липосомам в соотношении флавоноид-липид 1:10 в различной степени способны влиять на процесс плавления липида. Так, катехин в указанной концентрации, оказывал незначительное влияние на плавление липидов (термограмма на рис. ЗБ). Большие изменения формы кривой плавления наблюдались при действии таких же количеств таксифолина, кверцетина и, особенно, флоретина (рис. ЗВ-Д), который сдвигал положение температуры максимума перехода приблизительно на 4°С в низкотемпературную область, значительно увеличивал ширину и уменьшал высоту перехода (рис. ЗД).

При всех указанных концентрациях флавоноидов наблюдалось также исчезновение предперехода, который наблюдается при 14 - 15°С.

Рис. 3. Термограммы плавления липидов в липосомах из ОМРС 0,2 мг/мл (2,95*1 (У М) в присутствии флавоноидов (4*10"5М).

А - исходные липосомы (контроль) Б - в присутствии катехина В - в присутствии таксифолина СДКВ)

Г - в присутствии кверцетина Д — в присутствии флоретина

На этом и последующих рисунках пунктиром обозначены результаты деконволюции термограмм на 2 или 3 кривых Гаусса. Сумма кривых, полученных при деконволюции, совпадала с исходной кривой термограммы (Я>0,996).

3.2.2. Фазовые переходы фосфатидипэтаноламина (POPE) Действие флавоноидов на процесс плавления POPE, происходящий в температурном интервале около 25°С (рис. 4), обнаруживает некоторое сходство с процессом плавления липидов в липосомах из DMPC, представленном нами выше. Так, катехин оказывал наименьшее влияние на характеристики плавления, тогда как таксифолин и кверцетин более существенно подавляли высоту перехода a, a также в различной степени сдвигали максимумы переходов а и (5 в сторону более низких значений температур. Наибольшее влияние оказывал флоретин, который значительно снижал высоту пика и увеличивал ширину перехода. Действие флавоноидов на переход из бислоя в гексагональную Ни фазу, происходящий при температуре около 69°С, существенно отличалось от того, что мы наблюдали в температурной области плавления бислойной структуры этого липида. Здесь флоретин оказывал наименьшее влияние на плавление липида (Рис.4, панель А).

а

Д

б

г

в

е

14 16 18 20 22 24 26 28 30

66 68 70 72 74 76 78 80 Температура, °С

Рис. 4. Термограммы плавления липидов липосомах из POPE (2 мг/мл или 2,95*10'3М) в присутствии флавоноидов (4*10"4М). Даны два температурных диапазона, в которых наблюдаются фазовые переходы (А и Б).

А - исходные липосомы (первое сканирование) Б — те же липосомы (второе сканирование) Вторые сканирования липосом с добавленными флавоноидами В - катехин, Г - кверцетин, Д - таксифолин, Е - флоретин

Пунктирной линией проведены кривые Гаусса, полученные путем деконволюции термограмм. Сумма кривых Гаусса совпадает с исходными термограммами (R > 0,995). Шкалы правой и левой панелей отличаются.

Катионы железа (II) в концентрациях 10~6 М, характерных для крови человека [Kasvosve, I., and J. Delanghe, 2002], не оказывает существенного влияния на плавление димиристоил-фосфатидилхолина. В то же время, комплекс кверцетин-Fe2+ влияет на плавление липидов в липосомах из DMPC иначе, чем свободный кверцетин. Эти различия проявляются в том, что производимый кверцетином сдвиг максимума в низкотемпературную область существенно уменьшается в присутствии Fe2+. Это изменение можно наблюдать только в том случае, если в начале к суспензии липосом был добавлен кверцетин, и после выдерживания в течение нескольких десятков минут при комнатной температуре, был добавлен раствор Fe2+.

3.3. Исследование влияние комплексов флавоноид : железо на термодинамические параметры фазовых переходов липидов 3.3.1. Комплекс кеерцетин-Ре2+

Действие Fe2+ на плавление пальмитоил-олеоил-фосфатидилэтаноламина (POPE), происходящее при 25°С, мало отличается от действия кверцетина. Похожая термограмма получается также при последовательном добавлении к липосомам кверцетина, а потом железа. Предварительно сформированный комплекс кверцетина и Fe2+ также способен оказывать некоторое влияние на фазовые переходы липосом из POPE, чего не наблюдалось в случае липосом из DMPC.

Следует отметить, что кверцетин и его комплекс с Fe2+ был добавлен к уже сформированным мультиламеллярным липосомам. При этом только внешний монослой липида непосредственно мог соприкасаться с водным раствором, в который был добавлен кверцетин. Для изменения термодинамических характеристик плавления всего объема липида, наблюдаемого на представленной термограмме, необходимо проникновение кверцетина или его комплекса с железом через все бислойные структуры липида внутрь мультиламеллярных липосом.

Подобное явление уже было описано в другой работе с таксифолином [Тараховский Ю.С., и др., 2008]. В настоящей работе мы впервые показали, что кверцетин, а также его комплекс с Fe2+ способен проникать через фосфолипидный бислой.

3.3.2. Комплекс кверцетин-Fe3'

Как показано на рис. 5, наиболее существенные изменения термодинамических параметров плавления липидов в бислое наблюдались при действии на липосомы комплексов кверцетин-Ре3+ и таксифолин -Fe3+. Комплексы Fe3+ с катехином не инициировали значительных изменений. В условиях нашего эксперимента флавоноиды снижали температуру плавления липида на 1-2°С. В присутствии небольших количеств Fe3+ (величина соотношения кверцетин-Ре3+ находится в диапазоне 0,1-0,2) положение максимума плавления снижалось еще на 1-2°С в препарате липосом, содержащем кверцетин и таксифолин, однако при увеличении концентрации Fe3+ дальнейших изменений в положении максимума не наблюдалось. При этом экспериментальные точки хорошо описываются кривыми, имеющими форму ниспадающей экспоненты. Зависимость изменений энтальпии (рис.5Б) и полуширины перехода от соотношения флавоноид-Fe3* имеет сигмоидную форму. Видно, что в диапазоне соотношений флавоноид-Fe3* от 0,3 до

1,3 происходит падение энтальпии плавления липидов и рост полуширины перехода в присутствии кверцетина и таксифолина, тогда как действие катехина на термодинамические параметры плавления молекул лиида в липосомах было значительно меньшим или, как это видно по изменению энтальпии, направленность

Рис. 5. Изменение:

А - температуры максимума перехода (Т„акс)

Б - энтальпии (ДН) В - полуширины перехода (Ъш) липосом из ОМРС после добавления комплексов:

■ — кверцетин-Ре3+ • - таксифолин -Ре3+ ▲ - катехин-Ре3* по данным ДСК.

Вертикальными пунктирными

линиями отделены области: I — экспоненциального снижения Ти„с; И -скачкообразного изменения ДН и Ъщ; III — область, в которой изменения термодинамических параметров

системы незначительны.

3.4. Исследование антиоксидантных свойств комплексов квсрцетин-Ге3+

3.4.1. Действие на перекисное окисление липидов (определение продуктов окисления липидов, реагирующихся с ТБК) Способность флавоноидов препятствовать процессам перекисного окисления липидов широко известна. Одним из индикаторов перекисного окисления является малоновый диальдегид, который образуется в результате окисления ненасыщенных углеводородных цепей липидов. Кверцетин или катехин снижают содержание МДА в суспензии липосом из азолектина (рис. 6). В присутствии Бе3* концентрация МДА может уменьшаться еще сильнее.

изменений была противоположной.

Соотношение железо (Ш) : флавомоид

1. (а).

S2.....

1

i

1

I

Рис. 6. Влияние флавоноидов катехина (а) и кверцетина (б) и их комплексов с Кс3+ на содержание МДА в суспензии липосом из азолектина.

1 - контрольные препараты липосом, хранившиеся при 4°С

2 - хранившиеся при 37°С

3 - препараты липосом с добавленным флавоноидом

4-8 - препараты липосом с добавленным металлокомплексом

катехин-Ре3+ (А) и кверцетин-Ре3+(Б) при следующих молярных соотношениях флавоноид-Ре3*:

4-2:1; 5-1:1; 6-1:2; 7— 1:3; 8— 1:5.

Все препараты, кроме 1 контроля, хранились при 37°С в течение суток (М ± ш, п = 5, р < 0,05).

Наименьшее ее значение наблюдалось при соотношении флавоноид-Fe3* 2:1. При добавлении больших количеств Fe3+ антиоксидантные свойства флавоноидов ослабевали, а при пятикратном избытке Fe3+ наблюдалось ускорение реакции перекисного окисления, что свидетельствует о появлении свободных катионов железа (III), обладающих прооксидантным действием.

3.4.2. Исследование антирадикальной активности Хромоген-радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) широко используется для исследования суммарной концентрации антирадикальных антиоксидантов в различных средах и объектах, включая клеточные мембраны и липосомы [Е. Gregoris and R. Stevanato, 2010; S. Selvaraj, et al., 2011; C. Chen, et al., 2000]. Спектр ЭПР радикала ДФПГ, встроенного в липосомы (рис. 7А, 2), отличается от спектра в буфере. При добавлении флавоноидов амплитуда сигнала ДФПГ снижается (рис. 7 Б), что свидетельствует о восстановлении радикала. Антирадикальная активность флавоноидов возрастает в ряду таксифолин < кверцетин < катехин.

Рис. 7. А - Спектры ЭПР радикала ДФПГ.

1 - буферном растворе.

2 — в бислое моноламеллярных липосом из ОМРС.

Б - Влияние различных флавоноидов на спектр ЭПР липосом:

1 - контрольный образец липосом, 10 мг/мл.

2 - липосомы после добавления 10" 5 М таксифолина.

3 - липосомы после добавления 10" 5М кверцетина.

4 - липосомы после добавления 10" 5 М катехина.

(на вставке — амплитуда сигнала в присутствии этих флавоноидов, соответствен но).

В - Влияние комплексов кверцетина с катионами Ре3+ на ЭПР-сигнал радикала, находящегося в липосомах:

1 - контрольный образец липосом, 10мг/мл

2 — к липосомам добавлены катионы Ре3+

3-6 - липосомы после добавления кверцетина и катионы Ре3+в молярных соотношениях кверцетин-Ре3+: 3-1:10; 4-1:2; 5-1:1; 6-2:1

Также исследовалась зависимость антирадикальной активности комплексов кверцетина с Ре3+, в которых соотношение молекул менялось в пределах от 0 до 2. Как видно из представленного графика (рис. 7В), при образовании комплексов с катионами Ре3^ антирадикальная активность кверцетина возрастала, что приводило к уменьшению интенсивности сигнала ДФПГ. Наибольшая антирадикальная активность достигалась при соотношении кверцетин-Ре3+ 1:2. Измерения при больших концентрациях Ре3+ были затруднены в связи с образованием нерастворимого осадка и поэтому не проводились.

На основании полученных данных можно заключить, что в фосфолипидном бислое процессы комплексообразования флавоноидов с Ре3+ могут отличаться от таковых в водном растворе. Примечательно, что при увеличении содержания в

(а)

V

/

(б)

к*н. а »п.

II"«'

А I'40,

/ 1 е Е 201

12 3 4

(п)

> . 100

80

I л 60

I а 40

А = Й 20 /\ = 1 .)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-,-,-,-,-1-.-1-.-1-

3340 3360 3380 3400 3420

11,1 с

среде таких инициаторов перекисного окисления, как Fe3+, защитные свойства флавоноидов могут возрастать. Механизмы этого явления еще предстоит изучить.

3.5. Исследование влияния на физико-химические свойства суспензии липосом в присутствии флавоноидов и их металлокомплексов В экспериментах по плавлению фосфолипидов в липосомах приведенных выше нами было обнаружено, что при добавление двухвалентного железа к мультиламеллярным липосомам содержащим флавоноиды, наблюдалось быстрое помутнение суспензии и выпадение агрегатов липосом в осадок. Анализ светорассеяния суспензии липосом показал, что флавоноиды в используемых концентрациях сами не вызывали никаких изменений, однако, после добавления Fe2+ происходило увеличение светорассеяния в суспензиях, содержащих кверцетин, таксифолин, катехин и морин, тогда как в суспензиях, содержащих флоретин и рутин существенных изменений не наблюдалось. Скорости и амплитуды процесса различались при использовании различных флавоноидов. Так, в присутствии таксифолина рост светорассеяния происходил медленнее, но имел большую амплитуду, чем в присутствии кверцетина, катехина и морина.

Катионы кальция также вызывали рост светорассеяния суспензии липосом и наблюдался синергизм в действии флавоноидов и Са2+.

Методом фотонно-корреляционой спектроскопии было получено, что средний размер частиц в суспензии липосом от 87,4±25,5 возрастал до 100 нм после добавления флавоноидов и Fe2+, что очевидно было причиной наблюдаемого выше роста светорассеяния. Значительные увеличения размеров частиц до 1000 нм наблюдались после добавления к суспензии Са2+ . При этом появлялась новая фракция частиц существенно большего размера, чем исходные липосомы. В присутствии таксифолина и кверцетина размер новой фракции частиц был существенно большим, чем в присутствии катехина.

Обнаруженные нами изменения размеров частиц в суспензии липосом предполагают возможность их агрегации, в результате которой может происходить обмен липидов между липосомами и слияние бислоев, что было показано методом резонансного переноса энергии (FRET).

замораживания-скалывания -* суспензии липосом до (А) и Ц после (В, С) добавления в Щ среду квердетина, катионов

Са2+ и Fe2+. Стрелками показаны контактирующие липосомы

Рис. 8. Электронная микроскопия

На репликах с поверхности скола суспензии липосом можно видеть мембранные везикулы, диаметром около 0,1 мкм. Лишь немногие везикулы контактируют друг с другом и образуют пары или небольшие скопления. Препарат, криофиксированный через 20 - 30 мин после добавления к липосомам квердетина, Са2+ и Fe2+, содержал больше контактирующих пузырьков (Рис. 8В). Кроме того, можно было обнаружить единичные случаи образования гигантских мембранных везикул, окруженных прилипшими везикулами меньших размеров (Рис. 8С). Большие везикулы могли образоваться только вследствие слияния малых везикул. Мы полагаем, что основной вклад в быстрый рост светорассеяния вносит процесс агрегации липосом, при котором происходит сближение двух соседних бислоев. Молекулы флавоноидов способны удерживать бислои в сближенном состоянии благодаря атомам железа, служащим в качестве запонки (link, stud) между двумя молекулами флавоноидов.

Флавоноиды способны проникать в гидрофобные и интерфазные области биологических мембран, благодаря чему достигается весьма действенное влияние этих веществ на многие процессы в клетках. Антиоксидантные свойства флавоноидов определяются, как способностью этих молекул захватывать свободные радикалы, так и способностью хелатировать катионы металлов переменной валентности, участвующих в процессах окисления. Примечательно,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

J

что при образовании комплексов с металлами, антиоксидантные свойства флавоноидов усиливаются. Кроме того, при взаимодействии с металлами изменяется липофильность флавоноидов. В присутствии небольших количеств металлов их комплексы с флавоноидами липофильны и могут погружаться в липидный бислой, способствуя защите биологических мембран.

Агликоны многих флавоноидов, включая кверцетин, плохо растворимы в воде. Использование липосом может существенно повысить количество флавоноидов в крови, и увеличить их биодоступность[СЬеп ZP, et al, 2010], что может быть необходимо для профилактики и лечения различных заболеваний. При этом ДСК показывает, что кверцетин взаимодействует с фосфолипидным бислоем и может влиять на его фазовое поведение [Goniotaki М, et al, 2004; Singh D, et al, 2012] . Ранее, на основании расчетов на молекулярных моделях было предсказана возможность значительного изменения липофильности флавоноидов при хелатировании ионов железа [Tarahovsky YS, et al, 2012]. В работе мы представили экспериментальные доказательства увеличения липофильности комплексов кверцетина и таксифолина с ионами железа (II, III). Кроме того, дифференциальная сканирующая калориметрия показала, что даже небольшие количества молекул железа, при соотношении кверцетин-Ре2* 10:1 достаточны для того, чтобы оказывать воздействие на процессы плавления фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. Нами обнаружено также, что взаимодействие комплексов флавоноид-железо с липосомами зависит от последовательности смешивания компонентов. Необходимо сначала сформировать комплекс флавоноида с липосомами, а затем добавлять железо. При этом растворимость флавоноидов в липидном бислое должна возрастать вследствие увеличения липофильности комплекса флавоноида с ионами железа. Эти наблюдения важны при создании липосом, содержащих комплексы флавоноидов с ионами железа. Кроме того, необходимо учитывать возможность сильного влияния комплексов флавоноидов с ионами железа на фазовое поведение липосом, содержащих фосфатилилэтаноламин, которые особенно часто используются в генной терапии.

ВЫВОДЫ

1. При взаимодействии кверцетина и таксифолина с катионами железа (II,III) образуются комплексы флавоноид-железо преимущественно в соотношениях 2:1

или 3:2. Показано, что липофильность комплексов выше, чем свободных флавоноидов.

2. Указанные выше флавоноиды снижают температуру плавления фосфолипидов DMPC и POPE, а также повышают температуру перехода POPE из бислоя в гексагональную НИ фазу. Обнаруженное повышение температуры перехода более выражено при действии комплексов флавоноидов с Fe2+ и Fe3+.

3. Показано, что комплексы флавоноидов (кверцетин, дигидрокверцетин, катехин, морин) с Fe2+ инициируют агрегацию липосом из фосфатидилхолина. Этот эффект усиливается в присутствии ионов кальция, который инициирует также сияние липосом. Предположено, что комплексы флавоноидов с железом способны удерживать бислои в сближенном состоянии, что облегчает слияние липосом под действием ионов кальция.

4. Кверцетин и катехин препятствуют перекисному окислению липидов в суспензии липосом из азолектина и обладают антирадикальным действием. Оба свойства усиливаются в присутствии катионов Fe3+. Наименьшее значение уровня продуктов перекисного окисления, наблюдалось при соотношении флавоноид-Ре3+ 2:1. Антирадикальная активность в отношении стабильного радикала ДФПГ была максимальной при соотношении флавоноид-Fe3* = 1:2.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах:

1. Яголыщк Е.А.. Махмутов Б.Б., Тараховский Ю.С., Музавфаров Е.Н., Алексеева О.М., Ким Ю.А., «Влияние комплекса кверцитин-железо на фосфолипидные мембраны», Известия Тульского Государственного Университета (Естественные науки), вып.2, 2010, 295-305.

2. Tarahovsky Y.S., Yagolnik Е.А.. Muzafarov E.N., Abdrasilov B.S., Kim Yu. A., «Calcium-dependent aggregation and fusion of phosphatidylcholine liposomes induced by complexes of flavonoids with divalent iron», Biochim. Biophys. Acta. 1818, 3, 695702, 2012

3. Y.A. Kim, Y.S. Tarahovsky, E.A. Yagolnik. S.M. Kuznetsova, E.N. Muzafarov, «Lipophilicity of flavonoid complexes with iron(II) and their interaction with liposomes», Biochemical and Biophysical Research Communications, 431, 680-685, 2013

4. Е.А. Ягольник. Ю.С. Тараховский, И.Б. Кленина, С.М. Кузнецова, E.H. Музафаров, Ю.А. Ким, «Исследование мембранотропного и антиоксидантного действия флавоноидов и их комплексов с ионами трехвалентного железа», БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 5, 819-827

Статьи в сборниках:

1. Музафаров E.H.. Ягольник Е.А.. Ким Ю.А., «Защитный эффект экстрактов растений при воздействии УФ - излучения на коллаген, липидные мембраны и кожу», Сб. статей: «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты", издательство "Научный мир", 2010, 204-214

2. Ягольник Е.А.. Тараховский Ю.С., Кузнецова С.М. , Тулеуханов С.Т., Музафаров E.H., Ким Ю.А., «Действие растительных полифенолов на физические свойства липидного слоя биологических мембран», VIII Международный Симпозиум «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты», Материалы докладов, Москва, 2-5 октября 2012 ,201-207

3. Тараховский Ю.С., Ягольник Е.А.. Кузнецова С.М., Тулеуханов С.Т., Музафаров E.H., Ким Ю.А., «Влияние комплекса кверцетин:железо на фазовые переходы в бислойных липидных мембранах», VIII Международный Симпозиум «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты», материалы докладов, Москва, 2-5 октября 2012, 166-170

4. Yagolnik Е.А.. Tarahovsky Yu.S., Kuznetsova S.M., Muzafarov E.N., Kim Y.A., «Influence of quercetin/iron (II) complex on phase transitions of phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine containing liposomes», IX MEZINARODNI VEDECKO -PRAKTICKÁ KONFERENCE «MODERNÍ VYMOZENOSTI VÉDY - 2013», 27 января - 5 февраля, 46^19,2013

5. Muzafarov E.N.. Yagolnik E.A.. Kim Y.A., «Protective effect of plant extracts on collagen and lipid membrane under the effect of UF radiation», VII Международный симпозиум по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты, 19-23 октября, 2009, Москва

Тезисы докладов:

1. Ягольник Е.А.. Ким Ю.А., Тараховский Ю.С., Музафаров E.H., «Создание липосомальных препаратов на основе металлокомплексов флавоноидов»,

Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011», 3-4 октября 2011 г, Тула

2. Яголыщк Е.А.. Сабырбек Ж. Б., Тулеуханов С. Т., Алексеева О.М., Ким Ю.А., Тараховский Ю.С., Музафаров E.H., «Влияние флавоноидов и их комплексов с металлами на фазовое состояние фосфолипидных мембран», VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» 4-6 окт. 2010 г. Москва стр. 536-538.

3. Ягольник Е.А.. Музафаров E.H., Нарманова P.A., Тараховский Ю.С., Ким Ю.А., «Локализация молекул флавоноидов и их металлокомплексов в фосфолипидных мембранах», Сб. тезисов 15 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология XIX века", Пущино, 2011г.

4. Е.А. Ягольник. E.H. Музафаров, «Роль ионов Ca 2+ и Fe 2+ на процессы агрегации и слияния нанолипосом из фосфатидилхолина под действием флавоноидов», Сб. тезисов 16 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология XIX века", Пущино, 2012г.

5. Ягольник Е.А.. Сабырбек Ж.Б., «Исследование липофильности комплексов флавоноид-железо и их взаимодействия с фосфолипидными мембранами», Сб. тезисов 17 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология XIX века", Пущино, 2012г

6. Ягольник Е.А.. Тараховский, Ю.С. , Музафаров E.H., Махмутов Б.Б., Ким Ю.А., «Исследование агрегации и слияния фосфолипидных нанолипосом инициируемых флавоноидами в присутствии Fe2+ и Са2+», 4-й съезд биофизиков России, Н-Новгород, 2012, 20-26 августа, т. 3, стр. 253

7. Кузнецова С.М., Ягольник Е.А.. Тараховский Ю.С., Тулеуханов С.Т., Музафаров E.H., Ким Ю.А., «Исследование взаимодействия растительных полифенолов с фосфолипидными мембранами методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии», 4-й съезд биофизиков России, Н-Новгород, 2012, 20-26 августа, т. 3, стр. 253

8. Е.А. Ягольник. «Комплекс флавоноидов с катионами трехвалентного железа: стехиометрия, липофильность и антиоксидантные свойства», Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '13», Пущино, 2013, стр. 74-75.

Подписано в печать 14.11.2013 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 8 (495) 785-00-38 www.autoref.ae-print.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ягольник, Елена Андреевна, Пущино

Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Тульский государственный университет»

ЯГОЛЬНИК ЕЛЕНА АНДРЕЕВНА

МЕМБРАНОТрШШЫЕ И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ФЛАВОНОИДОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С

КАТИОНАМИ ЖЕЛЕЗА

на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Музафаров Евгений Назибович доктор физико-математических наук, профессор

Ким Юрий Александрович

04201450462

03.01.02 - биофизика

ДИССЕРТАЦИЯ

Пущино - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................7

ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..................................................................10

Флавоноиды - представители растительных полифенольных соединений 12

Классификация флавоноидов............................................................................14

Распространение флавоноидов.........................................................................16

Физико-химические свойства флавоноидов....................................................17

Антиоксидантные свойства флавоноидов.......................................................18

Флавоноиды, исследуемые в работе...............................................................24

Кверцетин и рутин..........................................................................................24

Морин...............................................................................................................26

Катехин............................................................................................................27

Таксифолин (дигидрокверцетин)..................................................................29

Флоретин..........................................................................................................32

Взаимодействие флавоноидов с фосфолипидным бислоем..........................33

Проникновение флавоноидов через мембраны эпителия кишечника.........35

Доставка флавоноидов к липидным рафтам...................................................37

Липидные рафты и кавеолы..............................................................................38

Влияние флавоноидов на рафты и кавеолы.....................................................41

Свойства металлокомплексов флавоноидов...................................................45

Биологические и медицинские аспекты.......................................................45

Физические и химические свойства металлокомплексов флавоноидов...46

ЧАСТЬ И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................48

Определение коэффициента распределения флавоноидов и их

металлокомплексов в системе октанол/вода...................................................48

Приготовление липосом....................................................................................49

Определение размеров липидных агрегатов...................................................50

Анализ обмена липидов между липосомами..................................................50

Спектральные измерения..................................................................................51

Спектрофотометрическое определение стехиометрии комплексов

флавоноидов с Fe2+, Fe3+.................................................................................51

Метод изомолярных серий (метод Остромысленского-Жоба)..................51

Метод молярных отношений (метод "насыщения")...................................52

Измерение светорассеяния................................................................................52

Электронная микроскопия замораживания-скалывания...............................52

Измерение антирадикальной активности флавоноидов и их комплексов

с катионами железа по восстановлению ДФПГ в липосомах........................53

Определение концентрации веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой

кислотой..............................................................................................................54

Микрокалориметрическое исследование........................................................54

Статистическая обработка данных...................................................................55

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................56

Характеристика комплексов флавоноидов с ионами

FeZT, FeJT.....................56

Липофильность комплексов..............................................................................56

Определение липофильности комплексов флавоноидов с железом в системе

вода/октанол........................................................................................................56

Молекулярное моделирование..........................................................................56

Экспериментальное определение липофильности комплексов кверцетин-

Fe и таксифолин-Fe .......................................................................................60

Экспериментальное определение стехиометрии............................................62

Комплексы кверцетин-

Fe2+...........................................................................62

Комплексы кверцетин- Fe3+............................................................................65

Исследование действия индивидуальных флавоноидов на

термодинамические параметры фосфолипидов..............................................66

Фазовые переходы фосфатидилхолина (DMPC).........................................67

Фазовые переходы фосфатидилэтаноламина (POPE).................................71

Исследование влияние комплексов флавоноид-железо на термодинамические параметры фазовых переходов липидов......................76

Комплекс кверцетин-Ре2+...............................................................................76

Комплекс кверцетин-Ре3+...............................................................................81

Исследование антиоксидантных свойств комплексов кверцетин-Fe3"1".....84

Действие на перекисное окисление липидов (определение продуктов

окисления липидов, реагирующихся с ТБК)...................................................84

Исследование антирадикальной активности...................................................85

Исследование влияния на физико-химические свойства суспензии липосом

в присутствии флавоноидов и их металлокомплексов.................................88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................103

ВЫВОДЫ.............................................................................................................108

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ......................................................109

БЛАГОДАРНОСТИ.............................................................................................135

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ПОЛ - перекисное окисление липидов

АОА - антиоксидантная активность

С - катехин

ЕС - епикатехин

EGC - эпигаллокатехин

CG - катехингаллат

ECG - эпикатехингаллат

GCG - галлокатехингаллат

EGCG - эпигаллокатехингаллат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ПДХ - полихлориновые дифенилы

DMPC - димиристоил фосфатидилхолин (l,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)

POPE - дипальмитоил фосфатидилэтаноламина (l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidyleethanolamine)

РОРС - пальмитоилолеоил фосфатидилхолин (l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- phosphocholine)

NBD-RE - NBD-дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина (1,2-dipalmitoyl-sn-

glycero-3 -phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3 -benzoxadiazol-4-yl))

Rh-RE - лиссамин-родамин-В-дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина

(lissamine rhodamine В l,2-dihexadecanoyl-s«-glycero-3-phosphoethanolamine)

TEMPOL - 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил бензоат (4-

hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1 -oxyl benzoate)

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ТБК - тиобарбитуровая кислота

МДА - малоновый диальдегид

ДФПГ - 2,2-дифенил-1 -пикрилгидразил

ДМСО - диметилсульфоксид

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия

FRET - величина резонансного переноса энергии

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

ВВЕДЕНИЕ

Флавоноиды - класс полифенольных соединений растительного происхождения, относящиеся к разряду вторичных продуктов метаболизма растений и являющиеся одной из наиболее заметных групп веществ, благодаря участию во многих ключевых процессах роста и развития растений (Gould and Lister, 2006). Эти вещества играют большую роль в процессах клеточной сигнализации, могут служить в качестве мессенджеров химических сигналов и участвуют в процессах репродукции растений. Наиболее заметную роль флавоноиды играют в защите растений от различных неблагоприятных факторов окружающей среды - действие ультрафиолета, температурный стресс, повышенные концентрации тяжелых металлов. Одной из наиболее важных функций флавоноидов является их участие в защите растений от окислительного стресса благодаря выраженной антиоксидантной активности (Gould and Lister, 2006).

Разнообразие флавоноидов огромно и достигает в настоящее время 8000 веществ. В клетках животных и человека флавоноиды не синтезируются и их присутствие в тканях полностью зависит от потребления в пищу растительных продуктов.

Интерес к флавоноидам обусловлен перспективой получения синтетических производных этих веществ, обладающих лекарственным действием. На основе флавоноидов возможно создание новых высоко активных лекарственных препаратов, обладающих противовоспалительной, антиканцерогенной, противовирусной, антипаразитарной или бактерицидной активностью. Создаются и испытываются новые антибиотики, а также агенты, способствующие усилению действия других лекарств, благодаря способности флавоноидов подавлять работу механизмов множественной лекарственной устойчивости. Исследования последних лет показали, что производные некоторых флавоноидов могут успешно использоваться в

лечении различных заболеваний внутренних органов, где эти вещества проявляют большую эффективность, чем известные лекарственные препараты (Ferrazzano et al., 2011; Garcia et al., 2012).

В связи с перспективами использования этих веществ в медицине, сейчас наблюдается значительный рост интереса к исследованию действия флавоноидов на организм человека. За последние два десятилетия число исследований в этой области выросло более чем в 10 раз и составляет около 5000 в год. Описание флавоноидов присутствует в большинстве работ, в которых анализируется химический состав растений традиционной медицины.

Флавоноиды хорошо связывают ионы металлов переменной валентности и образуют с ними комплексы. Поскольку многие металлы, прежде всего, металлы переменной валентности, например, ионы железа и меди, являются инициаторами перекисного окисления и способствуют образованию свободных радикалов, связывание ионов этих металлов является важным вкладом флавоноидов в защиту организма от окислительного стресса (Malesev and Kuntic, 2007; Perron and Brumaghim, 2009).

Высокую антиоксидантную активность на целых клетках из различных органов или на субклеточных фракциях проявляли металлокомплексы рутина, кверцетина, катехина и других флавоноидов (de Souza and de Giovani, 2004; Moridani et al., 2003; Perron and Brumaghim, 2009), что свидетельствует не только о большой общебиологической значимости этих комплексов, но также открывает перспективы их использования в медицине (Grazul and Budzisz, 2009).

Для флавоноидов, также как для многих других биологически-активных веществ, гидрофобность и, соответственно, способность взаимодействовать с биологическими мембранами является одним из необходимых условий проявления фармакологической активности (Hendrich, 2006).

Флавоноиды и другие растительные фенолы являются, по-видимому, наиболее распространенными биологически активными не питательными

компонентами продуктов питания, чая, вин, пива и других напитков, а также специй, эфирных масел, а также многих косметических субстанций. Пути метаболизма фенольных соединений, а также способы проявления их биологической активности еще остаются предметом оживленной дискуссии, ч Несмотря на большое количество исследований, проведенных в

последние годы, все еще не существует ясного представления о механизмах действия этих веществ. Данная область науки находится на стадии накопления фактов, тогда как создание единой теоретической основы, объясняющей действие флавоноидов, остается делом будущего. Цель:

Определить степень липофильности флавоноидов и их комплексов с ионами железа и исследовать мембранотропные и антиоксидантные свойства этих соединений. Задачи:

1. Дать характеристику комплексам флавоноидов с катионами железа, определить их стехиометрию и липофильность.

2. Исследовать действие свободных флавоноидов и их комплексов с катионами железа (II, III) на фазовые переходы фосфолипидов в липосомах.

3. Изучить антиоксидантные свойства свободных флавоноидов и их комплексов с катионами железа (II, III), в том числе:

а) показать антирадикальное действие на стабильный радикал ДФПГ в липидном бислое липосом; ^ б) оценить влияние на перекисное окисление липидов (определение

продуктов окисления липидов по количеству образованного МДА)

4. Исследовать ряд физико-химических свойств липосом в присутствии

ч

флавоноидов и их металлокомплексов.

ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Флавоноиды не способны синтезироваться в животных клетках, поэтому их присутствие в тканях напрямую зависит от потребления растительной пищи. Многочисленные эпидемиологические наблюдения на больших группах населения не выявили явной корреляции между употреблением флавоноидов и предотвращением онкогенных и сердечно - сосудистых заболеваний, тога как в лабораторных экспериментах обнаружен значительный терапевтический потенциал этих веществ (Kyle and Duthie, 2006). Поэтому вопрос о влиянии флавоноидов на здоровье человека до сих пор остается открытым. Кроме того причисление флавоноидов к классу витаминов под названием витамина Р оказалось преждевременным и впоследствии было отклонено (Kuhnau, 1976).

Интерес к флавоноидам обусловлен не только их возможным положительным влиянием на здоровье человека, но также потенциалом использования их синтетических производных в терапевтических целях, например, создание новых, более эффективных, противовоспалительных, противораковых, противовирусных противопаразитных и бактерицидных лекарственных препаратов. Кроме того, флавоноиды и их производные могут усиливать действие других препаратов путем подавления множественной лекарственной устойчивости (Ferrazzano et al., 2011; Garcia et al., 2012). Также следует отметить, что флавоноиды и их химические производные обладают низкой токсичностью и проявляют меньше побочных эффектов, чем их химические аналоги, полученные из других источников. Тем не менее, избыток флавоноидов, как и любых химических веществ, может быть вреден. Однако побочное действие их потребления мало изучено (Ebrahimi and Schluesener, 2012), поэтому следует с осторожностью относиться к большим дозам очищенных флавоноидов, применяемых в качестве биологических добавок (Egert and Rimbach, 2011).

Рис. 1.1. Число исследований флавоиоидов в различные годы по данным PubMed. Поиск производился по ключевому слову "flavonoids" с использованием программы Reference Manager. Рисунок заимствован из монографии с разрешения авторов (Тараховский Ю.С. и др., 2013).

Учитывая перспективы медицинского применения флавоноидов, в последнее время наблюдается значительный рост исследований действия этих веществ на здоровье человека. За последние два десятилетия число исследований в этой области возросло в десятки раз и в настоящее время достигает более 5000 публикаций в год (Рис. 1.1). Это примерно равно числу публикаций в области адресной доставки лекарств и вдвое больше, чем в генной терапии. Как правило, современные исследования лекарственных растений включают в себя тщательный анализ флавоноидов в их составе, как потенциально важных веществ, обладающих лечебными свойствами, и наоборот, терапевтический потенциал растительных средств часто связывают с наличием некоторых флавоноидов. Многочисленные исследования посвящены улучшению терапевтической активности и биодоступности флавоноидов, путем химической модификации и использования наноматериалов. Но, несмотря на обширные исследования флавоноидов, механизмы их действия до сих пор не ясны. На данный момент мы должны признать, что в этой области наука находиться на этапе собирания фактов, в то время как общая теория терапевтического действия флавоноидов остается делом будущего.

6000-

1990 1995 2000 2005 2010

Годы

Флавоноиды - представители растительных полифенольных

соединений

Флавоноидами называется группа природных биологически активных соединений в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С6-Сз-Сб углеродных единиц (Williams, 1995). Основные работы по раскрытию биосинтеза фенольных соединений в растениях были проведены в 60-х годах XX века. Было обнаружено, что ароматическое ядро может образовываться двумя путями. Первый путь, шикиматный, связан с конденсацией фосфоенолпирувата с эритрозо - 4 - фосфатом до образования циклического соединения, и, затем, шикимовой кислоты. Последующие реакции приводят к биосинтезу фенилаланина и тирозина, важных для образования оксикоричных кислот. Заключительная цепочка, прослеженная Нейшем в 1968 году, представляется следующим образом:

фенилаланин —» коричная кислота —» п-кумаровая кислота, кофейная кислота —» феруловая кислота —» синаповая кислота.

Другой механизм образования фенольного кольца осуществляется по ацетатно - малонатному пути. Исходным соединением в нем служит ацетил-3-КоА, содержащий макроэргическую тиоэфирную связь, который образуется при окислительнои декарбоксилированиипирувата. Три молекулы ацетил- и малонил-S-KoA, конденсируясь, образуют кольцо А в структуре флавоноида (Geissman, 1963; Grisebach, 1967). Одновременное присоединение КоА-активированной оксикоричной приводит к образованию общего предшественника флавоноидов - тетраоксихалкона.

Таким образом, структура флавоноидного соединения формируется двумя путями, из которых кольцо А образуется по ацетатно - малонатному пути, а кольцо В и трехуглеродный фрагмент гетероцикла - по шикиматному пути.

Первое бензол�