Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение транслокации секреторных белков через мембрану

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение транслокации секреторных белков через мембрану"

1 5 ДЕК 1996

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ імені ОБ. ПАЛЛАДІНА

На правах рукопису

БОРИСОВА Тетяна Олександрівна

Вивчення транслокації секреторних білків крізь мембрану

03.00.04 - Біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1996

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі нейрохімії Інституту біохімії їм. О.В.Палладіва Національної Академії Наук України.

Науковий керівник

доктор біологічних наук, академік НАН України Лівію В.К.

Офіційні опоненти

доктор біологічних наук, академік НАН України Єльсьна Г.В. доктор біологічних наук Маишеяа М.К.

Провідна установа

Інститут фармакології та токсикології АМН України.

Захист відбудеться "23" грудня 1996 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.84.01 в Інституті біохімії ім.О.В.Падладіна НАН України (252Б01, Київ-30, вул.Леонтовича,9)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії НАН України.

Автореферат розісланий "22" листопада 1996 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

О.В.Кірсенко

Актуальність проблеми. Транслокація попередників секреторних білків крізь мембрану - фундаментальний процес життєдіяльності клітини, про універсальність якого свідчить його суттєва схожість в різних організмах від бактерії до людини. Складність проблеми та експериментальних підходів до її вирішення до цього часу не дозволили розв'язати питання про те, яким чином великі гідрофільні молекули білку перетинають гідрофобну зону фосфоліпідного бі-шару. На поточний час немає загальноприйнятої точки зору відносно механізму та рушійних сил цього процесу.

Існує декілька гіпотез щодо механізмів трансмембранного переносу білків, але жодна з них не пояснює усіх аспектів трансло-кації. Сигнальна гіпотеза припускає існування складного білкового апарату, що приймає участь в розпізнаванні сигнального пептиду (рибонуклеопротеїновий комплекс, який отримав назву SRP) та руху поліпептиду , що синтезується, крізь мембрану [Blobel, 19753. Вважають, що SRF мсше виконувати роль шалєрона [Li, 1S95; Wick-пег W, 19953. Але потрібно відзначити, що як у еукаріотів, так і у прокаріотів існують білки, які досягають місця своєї внутріклітинної локалізації, не маючи сигнальної послідовності, котра відщеплюється протеазою [Cramer, 1983; Krieg, 19843. В останні роки з'явилось багато експериментальних даних , які не знаходять пояснення в межах жодної концепції [ Meyer, 1985; Hann, 1992.3. Одержані експериментальні факти, які безпосередньо або побічно проти-річать моделі SRP-залежної транслокації С Wickner, 19953.

Гіпотезам автономної трзяслокації, які передбачають відсутність транслокатора білкової природи, протирічать результати експериментів по моделюванню процесу транслокації за участю різнома-

нітних білків мембрани ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) [Gorlich, 1993].

Остаточно не визначено також, значення рибосом під час транслокації поліпептиду, то синтезується. Моделі, які розглядають процес котрансляційної транслокації, передбачають, що зв’язок рибосом з мембраною відбувається за допомогою спеціального рецептора. На роль потенційного рецептора було запропоновано декілька різних мембранних білків ЕПР. А.Севітс і Д.Мейер ідентифікували та очистили білок 180 кДа, та показали, що його присутність необхідна [Savitz, 1993; Wanker, 19953 і достатня [Savitz, 19903' для зв'язування рибосом с мембраною ЕПР in vitro . Інші автори вважають EOhsumi, 1993; Ichirnura, 1993 3, що функцію рибосомного рецептора може виконувати білок 34 кДа. Як відмічають К.Каліс, Д.Герліх та Т.Раппопорт, зв’язок рибосоми з мембраною здійснює білковий комплекс Sec61p CKalies, 1994; Mothes, 1994; Nicahitta, 19953.

Хоч на теперішній час і виявлені мембранні білки, здатні зв’язуватися з рибосомами, природа взаємодії рибосом з мембраною ЕПР залишається нез’псованою. Проведений аналіз дозволяє зробити висновок, що проблема транслокації білків ще дуже далека від остаточного рішення, незважаючи на значну кількість робіт, присвячених як безпосередньо експериментальним дослідженням, так і спробам теоретичного узагальнення.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було вивчення впливу фізико-хімічних властивостей мембран на процес їх взаємодії з рибосомами та на власне процес транслокації секреторних білків in vitro.

У завдання дослідження входило:

1. Розробити методичний підхід для дослідження процесу взае-

модії рибосом в мембранами, що базується на використанні "індикатора злиття" - флуоресцентного амфіфіда октадецила Родаміна В хлорида.

2. Дослідити залежність процесу взаємодії рибосом з мембранами від заряду та розміру ліпосом, наявності розчинних білкових факторів, а також pH, концентрації іонів магнію та іонної сили середовища.

3.Дослідити можливість транслокації еукаріотичних секреторних білків (продуктів трансляції полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур) крізь штучну ліпідну мембрану.

4.Дослідити вплив фіаико-хімічяих властивостей мембрани лі-посом на рівень транслокації продуктів трансляції полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур.

Наукова новизна. Розроблена модель для дослідження процесу взаємодії рибосом з штучними та біологічними мембранами. Вперше застосовано флуоресцентний амфіфіл октадецш Родамін В хлорид в експериментах по вивченню впливу фізико-хімічних властивостей мембран на процес їх взаємодії з рибосомами. Встановлено, що між еукаріотичними 805 рибосомами , що входили до складу безклітинної білоксинтезуючої системи, та мембранами (як біологічними, так і штучними) існує безпосередня взаємодія, про що свідчить перерозподіл флуоресцентного зонду. Швидкість взаємодії рибосом з мембраною залежить від заряду мембрани ліпосом, pH, концентрації іонів магнію та іонної скли середовища. Доведена можливість транслокації попередників еукаріотичних секреторних білків (продуктів трансляції шжЦА^-мРНК з яйцеводу кур) крізь штучну ліпідну мембрану.Рівень транслокації залежить від фізика-хімічних властивостей мембрани ліпосом (заряду та рідинних властивостей).

Практична значимість роботи. Одержані результати розширюють існуючі уявлення щодо механізму транслокації білків, як основного процесу життєдіяльності клітини, а також впливу фізико-хімічних властивостей мембран на цей процес. Розуміння молекулярного механізму транслокації поліпептидів крізь мембрану є необхідним етапом на шляху розробки методів керування секрецією білків. Встановлення ролі фосфоліпідів у цьому процесі створює можливість для регулювання рівня секреції шляхом впливу на мембрану, що може знайти своє використання в біотехнології.

Положення,що виносяться на захист.

1.Показана можливість використання флуоресцентного амфіфіла октадецила Родаміна В хлорида для вивчення взаємодії рибосом з штучними і біологічними мембранами. Проаналізована залежність швидкості взаємодії еукаріотичних 80S рибосом з мембраною від заряду мембрани ліпосом, pH, концентрації іонів магнію та іонної сшш середовищ.

2.Встановлена можливість транслокації попередників еукаріотичних секреторних білків крізь штучну фосфоліпідну мембрану in vitro, з використанням системи, яка моделює процес транслокації (система містить полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур, безкдітинну бідок-синтезуючу систему із зародків пшениці та ліпосоми різного фосфо-ліпідного складу).

3.Показана залежність рівня транслокації продуктів трансляції полх(А)+-ыРНК в яйцеводу кур в безкяітинній білоксинтезуючій системі із зародків пшениці від фізико-хімічних властивостей мембрани ліпосом (заряду та рідинних властивостей).

- Б -

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на щорічних звітних конференціях по космобіодогії ( Інститут ботаніки їм.М.Г.Холодного НАН України, грудень 1994, грудень 1995 рр), наукових семінарах Інституту молекулярної біології та генетики НАН України та Інституту біохімії ім.О.В.Паддадіна НАН України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу , огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів та їх обговорення, заключения, висновків, переліку літератури (168 джерел). Робота викладена на 120 сторінках машинопису, містить 24 рисунка.

Особистий внесок дисертанта. Експериментальна частина роботи виконана дисертантом особисто. Аналіз та обговорення проведено спільно з науковим керівником. Друковані праці підготовані за безпосередньою участи автора.

ШЕР1ДШ ТА мегом дослідтшя.

Для дослідження вшшву фізико-хімічних властивостей мембран на процес їх взаємодії з рибосомами була використана безклітинна білоксинтезуюча система із зародків пшениці (ЕБС) [Marcus, 19743. Електрофоретичний аналіз білків, які входять до складу ББС, проводили за методом Лєшлі [Laeimli, 19703. Очищені рибосоми одержували шляхом виоокошвидкіоного центрифугування [Marcus, 1974]. В роботі були використані ліпосоми двох типів: великі, що готувалися методом "звернення фаз" [Szoka, 19781, та маяі, які були одержані шляхом диспергування фосфоліпідів у буфері [ Марголис, 1986; Трикаш, 19873. Діаметр ліпосом визначався методами електронної мікроскопії та спектроскопії оптичного змішування [Трикаш, 19873. Мікросоми одержували з печінки шура [Мэдди, 1979; Финдлей, 19903. Флуоресцентний амфіфіл октадецил Родамін В хлорид (R18) включали

до ліпосом згідно а методом та експериментальними даними Д.Хекс-тра [Hoekstra, 1984; Hoekstra D, 1985; Vidal, 1995], з використанням запропонованого ним співвідношення R18:ліпід. Включення R18 у ББС та мікросоми здійснювали з використанням співвідношення R18:білок, рекомендованого Д.Хекотра [Hoekstra, 19843. Вимірювання флуоресценції препаратів проводили на флуоресцентному спект-рофлуориметрі Hitachi 650-10S.

До складу системи, яка моделювала процес транслокації, входили: ББС, ліпосоми, тр були одержані шляхом "звернення фаз", та полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур. Полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур виділяли за допомогою модифікованого методу фенольної екстракції [Rosen, 1975; Auffray, 19803, та афінної хроматографії на полі (U) сефарозі-4В [Рачков, 1984; Стародуб, 19863. Електрофоретичний аналіз препаратів РНК для оцінки якості отриманих препаратів виконували по Лоенінгу [Loaning-, 19763, з використанням рекомендації Роузена [Rosen, 19753, в 4% поліакріламідному гелі. Визначення біологічної активності отриманих препаратів РНК здійснювали в EEC з зародків пшениці [Стародуб, 19863. Визначення кількості

продукту, вбудованого в ліпосоми котрансляційно, проводили згідно [Валков, 19883. Радіоактивність протеолітично (проназа Е) нероз-щепленого білку після осадження трихлороцтовою кислотою (ТСА) визначали на фільтрах в толуоловій сцинтиляційній рідині ЖС-1. Для встановлення кількості зрілого білку, що зв'язувався з лїпо-сомами, в модельну систему замість мРНК додавали [1Z5І3-мічений овальбумін [McLonahay, 1980].

Бішарову ліпідну мембрану (БЛМ) формували в розчину фосфати-ділходіну та холестерину в співвідношенні 2:1 в n-гептані згідно з методом, запропонованим П.Моллером [Mueller, 1962; Zhukareva, 19923. Ємнісний ефект БЛМ фіксували як короткочасне збільшення

току крізь мембрану під чао подачі постійної напруги +50 мВ.

Статистична обробка даних проводилась загальноприйнятими методами варіаційної статистики Шлохинский, 19803.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Дослідження впливу фізико-хімічних властивостей мембран на процес їх взаємодії з рибосомами.

Було встановлено, що препарат ББС при введенні в комірку з пласкою бішаровою ліпідною мембраною збільшував її провідність (ркс.1), тобто в ньому були присутні мембраноактивні елементи. Було досліджено ємнісний ефект пласкої бішарової ліпідної мембрани до та після введення рибосом, що були отримані з ББС методом високошвидкісного центрифугування. Після додавання рибосом в комірку (0,55 мкг/мл) величина ємнісного ефекту мембрани знизилася на 10Z. Можливо, товщина мембрани збільшилася за рахунок осідання на ній рибосом. Можна припустити, шр рибосоми здатні до взаємодії з мембраною без залучення у цей процес рецепторів білкової природи.

При дослідженні взаємодії-рибосом, що входили до складу ББС, з штучними та біологічними мембранами був використаний флуоресцентний амфіфіл октадецил Родамін В хлорид (R18), який раніше використовувався виключно при дослідженні злиття мембран. Метод базувався на здатності "індикатора злиття" мембран - флуоресцентного зонду R1B до самогашення. Як показано Д.Хекстра [Hoekstra, 19843 при злитті К18-мічєного та неміченого мембранних препаратів спостерігається збільшення флуоресценції внаслідок зниження самогашення зонду, що викликано зменшенням поверхневої густини. Перенос R18 з однієї мембрани до іншої мав місце виключно при їх злитті. Вихід зонду з мембрани і його спонтанна дифузія крізь

Рис.1.Ступінчасте підвищення тока крізь БЛМ при постійній напрузі *50мВ. Препарат ББС додавали а цис сторони БЛМ, кінцева концентрація дорівнювала 0,5 мкг/шт. Роачкн, що знаходився з обох сторін мембрани, містив 40 мМ Нереэ pH 7,4, 110 мМ хлорида ка-

лія, 1 мМ ацетата магнія.

гине»]__

ш

jm

Рис.2. Зміна флуоресценції Й18 при взаємодії КШ-мічених рибосом (50 мкт/мл) і малих лі гіосом: 1,2 від"єм-но заряджених (о), 3,4-нейтральних (х) при концентрації ліпіда в середовищі інкубації: 1,3 - 20 мнг/мл, 2,4 -40 мкг/мл.

Рис.З. Зміна флуоресценції R1B при взаємодії RlB-мічених рибосом (50 мкг/мл) і великих ліпосом : А,Б,В-від"ємно заряджених (о), Г,Д-нейтральних (х) при концентрації ліпіда в середовищі інкубації: А-20 мкг/кл,

Б,Г-40 флуоресценція (%) мкг/мл, В,Д- 60 мкг/мл.

t (хв)

Рис.4. Зміна флуоресценції К18 при взаємо дії И8-и1чених рибосом (50 мкг/кл) з ліпо-сомами (60 мкг/мл) : малими від"ємно зарядженими (лівий рисунок) і великими ВІД"БМНО зарядженими (правий рисунок):А-в звичайних

умовах експерименту; Б- в присутності 20 мкл ЇМ №РЗ (pH середовища інкубації Б,0), Вв присутності 50 мкл 2М ацетата магнія.

(ее)

і (хв)

водну фазу, а також перерозподіл флуоресцентного амфіфілу при агрегації мембран виключені [Hoekstra, 1984; Hoekstra, 1985; Vidal, 19953.

В межах цієї роботи флуоресцентний зонд вводили як в рибосоми, так і в мембрани. При включенні зонду в рибосоми була підібрана оптимальна концентрація R18, при якій величина самогашення флуоресцентного зонду (Q) була в межах від 0,88 до 0,92. Значення Q визначалося ва формулою Qb1-f0/Eo, де F0 та відповідно флуоресценція зразку до і після додавання Тритону Х-100 до кінцевої концентрації 0,5 % v/v. (Тритон Х-100 не впливає на інтенсивність флуоресценції зонду) [Hoekstra, 19843 . Ефективність включення флуоресцентного зонду в рибосоми , що входили до складу ББС з зародків пшениці, за нашою оцінкою складала близько 100%, при цьому кінцева концентрація зонду складала 13 нмоль на мг РНК.

Взаємодія між RlS-міченими і неміченими рибосомами не приводили до зміни інтенсивности флуоресценції. Додавання ацетату магнію (0,ЇМ) також не призводило до зміни флуоресценції, незважаючи на те, що високі концентрації М£2+ сприяли димеризації рибосом, а також подальшій агрегації димерів [Спирин, 19713. Це свідчило про те, що між рибосомами не відбувався перерозподіл флуоресцентного зонду.

Досліджена взаємодія рибосом з малими ліпосамами ( діаметр 20-30 нм) як нейтральними, гак і від’ємнозарядженими. При додаванні до И8-міченого препарату рибосом нейтральних лецитинових ліпосом флуоресценція зростала (рис.2). Де свідчило про існування взаємодії між мембраною та рибосомою, внаслідок якої відбувалося розбавлення флуоресцентного амфіфілу R18 . Як видно з рис.2, процес взаємодії залежав від кількості внесених ліпосом. За нульовий рівень приймали залишкову флуоресценцію Ю.8-міченого препарату.

За 100 X- значення флуоресценції після розведення зонду в присутності детергенту (Тритону Х-100).

При додаванні до RlQ-міченого препарату рибосом від'вмноза-рнджених ліпосом (одержаних шляхом включення до смаду ліпосом фосфатидилетаноламіну та від'ємяозарядженого кардіоліпіну у молярному співвідношенні фосфатидилхолін:фосфатидилетаноламін :кар-діоліпін 2:3:5) зростання флуоресценції відбувалось з більшою швидкістю. Можливо, ефективність взаємодії рибосом в від’ємноза-рядженими ліпосомами більше, ніж в нейтральними (рис.2).

Досліджена також взаємодія рибосом з великими нейтральними та від’ємноварядженими ліпосомами діаметром більше, ніж 80 нм (рис.З). Процес взаємодії у цьому випадку також залежав від кількості ліпосом та заряду на їх поверхні. Можна припустити, що ліпідний склад мембран робить свій внесок в процес взаємодії рибосом в мембраною ЕПР як при акумуляції рибосом на мембрані ЕПР, так, імовірно, і в процесі транслокації білку. Не виключена можливість того [Adelman, 1973; Wanker, 1995], що існують два функціонально різних типи взаємодії рибосом з мембраною при трансло-кації білку та без неї.

Як видно з рис. 2 і 3, рибосоми взаємодіють з малими ліпосомами більш ефективно, ніж в великими. Дійсно, флуоресценція збільшувалась на 20 % після 90 хв. інкубації мічених рибосом (5D мкг/мл) і великих лецитинових ліпосом (40 мкг/мл). Таке ж саме збільшення флуоресценції спостерігалося при використанні малих лецитинових ліпосом вже після 4,5 хв інкубації. Можна припустити, що на швидкість взаємодії рибосом з мембранами впливала різниця кривизни поверхні ліпосом. Проте, імовірно, при однаковій концентрації ліпіду препарати великих та малих ліпосом мали різну площу поверхні везикул.

При підкисленні середовища інкубації до pH 6 флуоресценція зростала приблизно в 2 рази, тобто швидкість взаємодії рибосом з від'ємнозарядженими ліпосомами залежала від pH (рис.4). Очевидно, під впливом низьких значень pH середовища змінювалась електростатична взаємодія між рибосомами та мембранами. Зміна pH середовища інкубації не впливала на взаємодію рибосом а лецитиновими ліпосо-мами.

Дослідження взаємодії рибосом з біологічними мембранами проводили на мікросомах. На рис. 5 представлена зміна флуоресценції РЛ.8 при взаємодії К18-мічених рибосом та мікросом.

Відомо, що високі концентрації хлористого калію від 100 до 1000 мМ викликають часткову дисоціацію рибосом з мембрани ЕПР. В експериментах присутність в інкубаційному середовищі КСІ знижувала швидкість взаємодії рибосом як з ліпосомами, так і з мікросо-мами (рис.6).

Була досліджена можливість взаємодії рибосом э ліпосомами в присутності ОДМ ацетату магнію. Як видно з рис. 4 та Б, швидкість взаємодії в цьому випадку менше, ніж в звичайних умовах експерименту. Зниження швидкості взаємодії спостерігалося також і при відсутності іонів магнію, що досягалося додаванням у середовище інкубації ЕБТА до кінцевої концентрації 11ыМ, тому шр магній є обов'язковим низькомолекулярним компонентом рибосом.

Таким чином, процес взаємодії рибосом з мембраною залежить від заряду мембрани ліпосом, концентрації іонів магнію та іонної сили середовища.

Для вивчення ролі білків в процесі взаємодії рибосом з ліпосомами була проведена протеолітична обробка препарату рибосом (проназа Е). Виявилось, що після протеолізу рибосоми також взаємодіють а ліпосомами, але з меншою швидкістю. Тож, взаємодія ри-

§ 4 : 6 і(ХВ)

Рис. 5. Зміна флуоресценції И8 при взаємодії КШ-нічених рибо сом (50 мкг/мл) і мікросом прн концентрації иікросомного білку: А - 5 мкг/мл, В, Б-20 мкг/мл. А,Б - в звичайних умовах експерименту, В - в присутності 50 іікл 2И адетаїа иагнія.

Рис.6. Залежність флуоресценції R18 від концентрації KCL в середовищі інкубації. Вивчали взаємодій R18-мічених рибосом (50 мкг/мл) і :

А- малих нейтральних ліпосои (40 мкг/мл) ,Б-великшс нейтральних ліпосоа (40 икг/ил), В-иікросам (20 икг білку на мл).

W

W

1-Й

£?

о

ш

в.

о

10

J г~'

7 5

6

UXB)

2 4

Рис.7. Зміна флуоресценції R18 прн взаємодії ЮВ-нічених великих від'ємно заряджених ліпосом : А,Б- а препаратом рибосои

(250 мкг/кл), В- з очкщениші рибосомами (82 икг/ил) прн концентрації ліпіда в середовищі інкубації: А,Б-9 мкг/кл,

Б-18 мкг/мл.

Рис.8. Зміна флуоресценції И.8 при взаємодії препарата рибосом (50 мкг/мл) і Юй-мічеюш мікросом прн концентрації мікросомно-го білку: А-2,1 мкг/ил, Б-6,3 мкг/мл.

босом з фосфоліпідними мембранами може проходити і після деградації доступних для протеази білкових компонентів.

Як відмічалося , при включенні зонду в мембрану не спостерігається його спонтанна диффузія крізь водну фазу і перерозподіл при агрегації мембран. Таким чином , збільшення флуоресценції при взаємодії RlS-міченого мембранного препарату з рибосомами підтвердило б зроблене вище припущення про існування такої взаємодії між мембраною та рибосомою, що призводить до розбавлення флуоресцентного амфіфілу R18. Дослідження, проведені на від’ємнозаряд-жених ліпосомах, що містили флуоресцентний зонд R18 (кінцева концентрація - 2 моль % по відношенню до загального вмісту ліпіду) , та немічених рибосомах , що входили до складу ББС, підтверджують це припущення. R18 включали до діпосом згідно з методом та експериментальними даними Д.Хекстра [Hoekstra, 1984; Hoekstra D, 1985; Vidal, 1995] з використанням запропонованого ним співвідношення R18: ліпід. S рисунка 7 видно, ща при додаванні рибосом до мічених ліпосом флуоресценція збільшувалась. При заміні препарата рибосом очищеними рибосомами, одержаними методом високошвидкісно-го центрифугування, також спостерігалося збільшення флуоресценції при взаємодії з ліпосомами. Таким чином, рибосоми, як очищені, так і ті, що входили до складу ББС, взаємодіяли з від'ємнозаряд-жєними ліпосомами. Є підстави вважати, що саме рибосоми визначали здатність препарату ББС взаємодіяти з фосфоліпідними мембранами.

Вивчена взаємодія RlS-мічєких мікросом з рибосомами, що входили до складу ББС. Включення флуоресцентного зонду в мікросоми проводили за методом Д.Хекстра [Hoekstra, 1984; Hoekstra, 1985, Vidal, 1995] із співвідношенням R18:білок, рекомендованим автором. При цьому самогашєння флуоресценції було 0,92, а кінцева концентрація зонду 94 нмоль на мг мікросомного білку. Було вияв-

лею, що при взаємодії ї?18-мічених мі кросом з рибосомами також мав місце збільшення флуоресценції (рис.8). Збільшення флуоресценції при взаємодії И18-міченого мембранного препарату з неміче-ними рибосомами було свідоцтвом існування контакту між мембраною та рибосомою, достатнього для того, шрб відбулося розбавлення флуоресцентного амфіфілу И8.

Імовірно рибосоми, як рибонуклеопротеіди дуле окладної структури, здатні взаємодіяти з фосфоліпідною мембраною. Можливо, процес взаємодії супроводжується зміною бішарової структури мембрани. Взаємодія рибосом з фосфоліпідними мембранами може мати місце і після деградації доступних для протеази білкових компонентів. Процес взаємодії рибосом з мембраною може відігравати ключову роль при котрансляційній транслокації. Але не виключена можливість того, що він має місце дише при взаємодії з мембраною тик рибосом, які на даний момент не залучені до процесу трансляції, тобто тією частиною пула рибосом, котра акумулюється на мембрані незалежно від того, має місце транслокація білку чи ні.

Взаємодія продуктів трансляції мРНК секреторних білків з штучними фосфоліпідними везикулами.

Не виключена можливість того, що рибосоми приймають активну участь, а можливо і відіграють головну роль в процесі транслокації білку. В зв'язку з цим припущенням здавалось доцільним дослідити принципову можливість котрансляційной транслокації секреторних білків в штучні фосфоліпідні везикули з використанням модельної системи.

Була вибрана фракція полі(А)+-мРНК з яйцевод/ кур, котра кодує синтез кількох секреторних білків (овальбумін, кональбумін, овомукоід, лізоцим). З цих білків особливий інтерес може маги овальбумін. Це секреторний білок, сигнальна амінокислотна послі-

довність якого локалізована міх залишками 22 і 41 СКгієє, 1984], не відщеплюється в процесі транслокації. Використана фракція полі (А) +-мРНК з яйцеводу кур являла собою гетерогенний препарат. Відомо, що така РНК кодує як білки яйця, котрі секретуються з клітини, так і власні внутрішньоклітинні білки яйцеводу, що не секретуються. Трансляцію мРНК проводили в еукаріотичній системі трансляції -ЕЕС із зародків пшениці. Додавання Імкг полі(А)+-мРНК в ББС стимулювало включення в ТСА-осаджєні білки 2 пмоля [353]-метіоніна. Як модель мембрани були використані ліпосоми, фосфоліпідний бішар яких первісно не містив ніяких білкових компонентів.

Трансляція фракції полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур відбувалася як в присутності мембран, так і без них. Електрофоретичний аналіз продуктів трансляції показав наявність широкого спектру білків, характерних для даної тканини. Він був таким самим, як при трансляції з ліпосомами (котрансляційний зв’язок), так і без ліпосом. Таким чином, відсутність мембран під час синтезу білку не була фактором селективного пригнічення, або навпаки, селективної стимуляції трансляції індивідуальних мРНК. Це дало можливість порівняти результати котрансляційкої та посттрансляційної взаємодії продуктів трансляції з ліпосомами.

Для визначення кількості зрілого білку, що може зв’язатися з ліпосомами, був використаний мічений овальбумін, який в одним з основних продуктів трансляції мРНК з яйцеводу кур. Як показав електрофоретичний аналіз, препарат авальбуміна містить не більше 10 % домішок інших білків яйця. Виявлено, щр практично всі білки, що зв'язувались з ліпосомами, видалялися при обробці проназою. Отже, зрілі білки не здатні перетинати ліпідний бішар за умов модельної системи. Крім того, можна вважати, що в процесі проведен-

ня експерименту не мали місця захоплення білків ліпосомами (при центрифугуванні та інших методичних процедурах), а також взаємодія везикул з продуктами протеолітичного розщеплення білків.

Для дослідження шжливости транслокації еукаріотичних секреторних білків крізь мембрану були використані ліпосоми різного ліпідного складу. При використанні електронейгральніх везикул, одержаних з яєчного лецитину ( концентрація ліпіду 5 мг/мл), недоступними дії пронази виявилися 5 % и 2,4 % від вихідного синтезованого білку при котрансляційній та посттрансляційній взаємодії з ліпосомами відповідно. Ді величини до деякоі міри є заниженими, бо, як відмічалося вище, використана мРНК кодувала не тільки секреторні білки, а й власні внутрішньоклітинні білки яйцеводу, які не є секреторними. S метою оптимізації модельної системи була збільшена концентрація ліпіду до 10 мг/мл. При цьому котрансля-ційно з ліпосомами з'вязувалось 10 %, а посттрансляційно - 4 % синтезованого білку. Ді результати відображені на рис.9. Подальше збільшення кількості ліпосом було неможливим, тому що спостерігався негативний вплив ліпіду на рівень синтезу білків.

З літератури відомі дані, які свідчать про вплив кислих фос-фсліпідів на процеси транслокації у бактерій [Несмеянова, 1987]. Показано, що введення кислих фосфоліпідів, наприклад кардіоліпі-на, до складу фосфоліпідного бішару створює на його поверхні від’ємний заряд, а також викликав деякі структурні зміни, наприклад утворення гексагональної фази.

Для виявлення ролі заряду на поверхні мембрани ліпосом до складу лецитинової літсомадьної мембрани включили кардіоліпін в молярному співвідношенні лецитин: кардіоліпін 9,5:0,5. При цьому

виявлено, що кількість білків, недоступних дії пронази, збільшилась до 7 Z - при котрансляційній взаємодії та до 2,7 % - при

Рис.9. Залежність рівня включення продук тів трансляції полі(А)"-мРНК а яйцєводу кур в ліпосопи а яєчного лецитину від концентрації ліпіда: А- при котрансля-ційній взаємодії з ліпосоиаии, Б- при постгрансляційній взаємодії з ліпосома-ми. В- включення в ліпосоми овальбуміна. За 1002 приймали кількість первісна екн-теааванаго в БЕС білку. *р< 0,05

Рис.10. Залежність рівня включення продуктів трансляції полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур в ліпосоми, приготовані з лец»-тіну морських організмів, від концентрації ліпіда: А- при котрансляційній взаємодії з ліпосоиаии, В' при пссттрансля-ційній взаємодії з ліпосомами. В- вшт-чення в ліпосоми овальбуміна. *р< 0,05

Рис.11. Авторадіограма електрофоретичного аналізу продуктів трансляції полі (А)*-«РНК з яйцєводу кур, недоступних дії прокази:

1) при котрансляційній взаємодії з ліпо-соиами,

2) при постгрансляційній взаємодії а ліпосомами.

посттрансляційній (при концентрації ліпіду у системі 5 мг/мл). Отже, введення кардіоліпіну суттєво впливало на досліджуваний процес. Дей ефект зростав із збільшенням кількості кардіоліпіну у мембрані. Якщо до складу лецитинової ліпосомальної мембрани включити вказаний фосфоліпід в малярному співвідношенні лецитин:кар-діоліпін 9:1, то кількість білку , на який не діє прояага, збільшилась при котрансляційній взаємодії до 10 %, а при посттрансляційній - до 3,3 % .

Показано, що ліпід-білкові взаємодії в значній мірі визначаються станом ліпідного бішару. Можливо, що in vivo ліпідний склад мембран також впливав на процес транслокації.

Включення кардіоліпіну до складу мембрани призводить не лише до зміни заряду на її поверхні, але й структури фосфоліпідного бішару. Для визначення ролі останньої в досліджуваному процесі використовували ліпосоми, виготовлені з лецитину, виділеного з морських організмів. Е препараті цього лецитину ненасичені жирні кислоти складали 70 7. (моноєнові 14 %, а полієнові 55 %) [Терехова, 1981]. Препарат, що використовувався (яєчний лецитин), містив близько 60 % ненасичених жирних кислот [Трикаш, 1987]. Ліпосоми, виготовлені з лецитину, виділеного з морських організмів, відрізняються від везикул з яєчного лецитину рідинними властивостями бішару, але при цьому зберігають нейтральний заряд на своїй поверхні. Відомо [Марголис, 1986], що на температуру основного фазового переходу ліпідів впливає довжина та ступінь ненасиченості жирнокислотних ланцюгів.

Як свідчать дані, наведені на рис.10, при застосуванні ліпо-сом, виготовлених з лецитину, що виділяли з морських організмів, доля білків, на які не діє проназа, така ж, як і у випадку, коли ліпосоми були виготовлені з суміші яєчний лецитин:кардіоліпін

9:1, тобто 10 X та 3,3 X відповідно. При збільшенні концентрації цього лецитину до 10 мг/мл, ці величини зростали до 20 % та 6,2 % відповідно.

Треба відмітити, що в модельній системі кількість котрансля-ційно включеного в ліпосоми білку знаходилась в прямо пропорційній залежності від кількості внесених ліпосом.

Здаються цікавими результати, отримані на ліпосомах з лецитину морських організмів при трансляції поді(А)+-мРНК з ретикуло-цитів кролів, яка кодувала переважно один білок- глобін, що не є секреторним [Лшборская, 19763. При концентрації ліпіду 10 мг/мл кількість синтезованого в системі білку, що недоступний дії прокази, зменшувалась до 2,2 % при когрансляційній та до 1,2 X при посттрансляційній взаємодії з ліпосомами ( для білків яйцеводу за таких самих умов 20 % та 6,2 % відповідно). Згідно з отриманими даними секреторні та несекрегорні білки по різному взаємодіють з ліпосомами, це свідчить про адекватність використаної модельної системи. Компетентність до ко- та пострансляційної транслокації визначається наявністю сигнальної послідовності у поліпептидного ланцюга.

Для вивчення питання про те, чи вбудовуються лише короткі фрагменти в фосфоліпідний бішар, або має місце повне проникнення синтезованих поліпептидів у внутрішній об'єм везикул, були проаналізовані білки, недоступні дії пронази, як при ко-,так і при посттрансляційній взаємодії з ліпосомами. При аналізі результатів котрансляційної взаємодії можно бачити зони, що відповідають білкам з молекулярною масою 79,43 та 32 кДа. Після пострансляційної взаємодії чітко наявна лише одна полоса з молекулярною масою 43 кДа (рис.11).

В системі, що використовувалась, трансдокація синтезованого

продукту крізь ліпідну мембрану здійснювалась переважно котранс-ляційно. Не вшдазчена можливість, що посттрансляційно взаємодіє з ліпосомаш овадьбумін - секреторний білок, що не має сигнальної послідовності, що відщеплюється. На користь цього свідчать дані разрахунків щодо можливості трансдокації овальбуміну крізь мембрану шляхом спонтанного вбудовування CFidelio, 19873, Тому не можно виключити також, шр деяка кількість овальбуміна здатна до посттрансляційного включення в ліпосоми при вивченні котрансля-ційної взаємодії продуктів трансляції полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур з везикулами.

На підставі наведених вище даних можна зробити висновок, що рівень трансдокації секреторних еукаріотичних білків крізь штучну фосфоліпідну мембрану суттєво залежить від її фізико-хімічних властивостей.

Було показано, що за умов модельної системи має місце вбудовування еукаріотичних позаклітинних білків в штучні фосфоліпідні везикули, які первісно не містили ніяких білкових компонентів. Отже, відсутність мембранних білків не є перешкодою для подолання новосинтезованим поліпептидом фосфоліпідного бішару. Таким чином, дослідження, проведені з використанням модельної системи трансдокації, узгоджуються є наведеними вище експериментальними даними, одержаними за допомогою флуоресцентного зонду R18, щодо впливу фізико-хімічних властивостей мембран на процес їх взаємодії з рибосомами.

Імовірно рибосома, як клітинна органела.за своїми фізико-хі-мічніаш властивостями здатна до взаємодії в мембраною, змінюючи її структуру і таким чином створюючи можливість новосинтезованому поліпептіду долати фосфоліпідний бішар, використовуючи енергію елонгації при котрансднційній трансдокації.

висновки

1.Розроблено методичніш підхід, що дозволяв вивчати вплив фізико-хімічних властивостей мембран на процес їх взаємодії з рибосомами. Він базується на використанні флуоресцентного амфіфіла октадецила Родаміна В хлорида (R18), що включався як в мембрани (штучні та біологічні), так і в рибосоми, що входили до складу безкдітинної білоксинтезуючої системи із зародків пшениці.

2. В експериментах in vitro а використанням R18 показано, що між еукаріотичними 80S рибосомами та мембранами як штучними (ліпосоми різного фосфоліпідного складу), так и біологічними ( мік-росоми) існує безпосередня взаємодія, про шр свідчить перерозподіл флуоресцентного зонду.

3. Швидкість взаємодії еукаріотичних 80S рибосом з мембраною залежить від заряду мембрани ліпосом, pH, концентрації іонів магнію та іонної сили середовища.

4. В експериментах in vitro з використанням системи, що моделює процес транслокації ( система містить полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур, безклітинну білоксннтезуючу систему із зародків пшениці та ліпосоми різного фосфоліпідного складу), показана можливість транслокації попередників еукаріотичних секреторних білків крізь мембрану, що первісно не містила у своєму складі білкових компонентів. Гранслокація продуктів трансляції мРНК крізь фосфоліпідну мембрану здійснюється переважно когрансляційно.

5. Рівень транслокації продуктів трансляції полі(А)+-мРНК з яйцеводу кур в Сезклітинній білоксіштезуючій системі із зародків пшениці суттєво залежить від фізико-хімічних властивостей мембрани ліпосом (заряду та рідинних властивостей).

- 22 -

ПЕРЕЛІК РОБІТ,ШР ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ-

1. Борисова Т.А.,Лось Г.В.,Лишко В.К. Связывание продуктов трансляции мРНК сегрегируемых белков с искусственными фосфолипид-ными везикулами // Биохимия.-1994.- 59, вып.10.- С.1483-1489.

2. Борисова Т.А.,Лишко В.К.,Блюм Н.О. Дось Г.В. Езашодействие предшественников севретируемых белков и компонентов бескле-точной белоксинтезирущей системы с фосфолипидными мембранами // Укр.биохим.журн.-1996.- 68, N 5.- С.34-40.

3. Борисова Т.А., Трикаш И.О., Липко В.К. Взаимодействие рибосом с мембранами in vitro // Укр.биохим.журн.-1996.- 68, N S.-

С. 41-47.

Borisova T.A. Studing of the translocation of secretory protein precursors across membrane (manuscript).

The dissertation work on the degree of candidate of biological sciences (speciality 03.00.04.-biochemistry). Palladin institute of biochemistry of UKrainian NAS,Kiev,1995.

Using the fluorescent indicator of fusion- octadecyl Rhodamine B-chloride the direct interaction between eukaryotic 80S ribosomes and membranes (as artificial as biological) has been shown. It has been studied the dependence of interaction process on charge and size of liposomes, proteins,pH,

concentration of Mg2+ iGns and ionic strength of the medium.

The opportunity of translocation of eukaryotic secretory proteins ( the products of translation poly (A)+-mRNA from chicken oviduct ) through membrane , that initially does not contain any protein components, has been established. The level of translocation of the products of translation in weat germ cell-free system substantially depends on the physical and chemical properties of the liposome membranes.

Борисова Т.А. Изучение грзнслокации секретируемых белков через мембраны (рукопись).

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04--биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладзша НАН Украины, Киев,1995.

Используя флуоресцентный амфкфил октадецил Родамин В хлорид, было показано, что между эукариотическими 803 рибосомами и мембранами как искусственными, так и биологическими существует непосредственное взаимодействие. В работе было изучено влияние заряда и размера лгагосом, белков, а также pH .концентрации ионов магния и ионной силы среды на процесс взаимодействия рибосом с мембранами.

Исследована возможность тракслокации эукариотических секретируемых белков (продуктов трансляции поли(А)+-мРНК из яйцевода кур) через мембрану лкпосом, изначально не содержзиую в своем составе никаких белковых компонентов. Показана зависимость уровня

трансдокации продуктов трансляции в бескдеточной белоксинтезирую-щей системе из зародышей пшеницы от физико-химических свойств мембраны липосом (заряда и жидкоотности).

Ключові слова: ліпосоми, мікросоші, рибосоми, білок, трансляція,

транслокація.