Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение трансдуцирующих свойств умеренных бактериофагов 59 и 49 Erwinia carotovora 268

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение трансдуцирующих свойств умеренных бактериофагов 59 и 49 Erwinia carotovora 268"

г, НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ’' “ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

і і і.. ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

РОМАНЮК ЛЮДМИЛА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 579.842.24.254.4:578.81

ВИВЧЕННЯ ТРАНСДУКУЮЧИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ПОМІРНИХ БАКТЕРІОФАГІВ 59 та 49 ЕНМШІА САЯОТОУОЯА 268

03.00.06 - вірусологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ -

998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі вірусів мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник - академік АТН України, доктор біологічних наук, професор

Кішко Ярослав Григорович, завідувач відділом вірусіЕ мікроорганізмів ІМВ НАН України.

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор Малюта СтаніслаЕ

Провідна організація - Київський університет імені Тараса Шевченка, кафедр:

вірусологи, м.Київ.

Захист відбудеться 16 вересня 1998 року о 10 годинні на засіданні спеціалізс ваної вченої ради Д 26. 233. 01 при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Забс лотного НАН України (252143, Київ, вул. Заболотного, 154, Інститут мікробіології вірусології НАН України, зал засідань).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології НАН України.

Автореферат розісланий „ 40 “ 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Станіславович, завідувач відділом молекулярної генетикі ІМБІГ НАН України;

доктор біологічних наук, професор Менджул Михайпс Іванович, завідувач відділом вірусів водоростей ІМВ НАЬ України.

кандидат біологічних наук

Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Віруси мікроорганізмів широко застосовуються як модельні об’єкти при вирішенні фундаментальних проблем сучасної генетики та молекулярної біології в силу своєї відносно простої фізико-хімічної та структурно-функціональної організації. Досягнення генетичної інженерії і розвиток біотехнології дозволили по-новому підійти до питання про практичне значення вірусів бактерій. По-перше, на основі бактеріофагів створюються вектори, які, маючи ряд переваг порівняно з плазмідними, відкривають нові перспективи в створенні штучних суперпродуцентів біологічно-активних речовин. По-друге, розвиток мікробіологічної промисловості висуває важливу проблему - запобігання фаголізису штамів бактерій-продуцентів. Вирішення проблеми фаголізису корисних штамів мікроорганізмів перш за все вимагає грунтовного вивчення фагів, які зумовлюють екзо- та ендогенний лізис клітин.

Серед переліченних аспектів особливу зацікавленість викликають помірні фаги, що здатні вступати в міжгеномні взаємовідносини з бактеріальними клітинами. Бактерії рода Erwinia викликають захворювання сільськогосподарських культур, пошкоджують готову продукцію / Chatterjee, Starr, 1980 /. Клітини деяких видів цих бактерій продукують біологічно активні речовини /Hugouvieux-Cotte-Pattat et.al., 1996/. Практичне значення цих мікроорганізмів, особливо у фітопатології, стимулювало дослідження, які пов’язані з вивченням їх генетичних властивостей. Основні дані про генетичні та молекулярно-біологічні особливості вірусів мікроорганізмів були одержані при вивченні досить обме-женного набору об’єктів - фагів Е.соїі та Bac.subtilis /Margolin, 1987; Kokjohn, 1989/. Однак, недивлячись на те, що ервінії філогенетично близькі до Е.соїі, у генетичному відношенні вони та IX бактеріофаги вивчені недостатньо.

Мета і завдання досліджень. Основна мета даної роботи полягала в одержанні доказів можливості помірних фагів Е. carotovora здійснювати передачу генетичного матеріалу шляхом трансдукції.

Для виконання роботи необхідно було вирішити такі задачі:

1. Виявити трансдукуючу активність помірних бактеріофагів 59 та 49 Е. carotovora 268 (по відношенню до хромосомних та плазмідних генів).

2. Вивчити динаміку та залежність процесу трансдукції від деяких факторів, яка здійснюється цими фагами.

3. Визначити пакувальну ємність головки бактеріофага 59 шляхом трансдукційного аналізу тіснозчеплених генів.

4. Оцінити величину фрагмента ДНК, що може трансдукуватися фагом 59.

Наукова новизна роботи. В результаті проведеної роботи вперше було виявлено,

що помірні бактеріофаги 59 та 49 Е. carotovora 268 здійснюють передачу хромосомних та плазмідних генів у бактерій роду Erwinia за типом загальної трансдукції.

Встановлена залежність явища трансдукції у ервіній від множинності інфекції, Уф-опромінення лізатів трансдукуючих фагів та досліджена динаміка цього процесу.

Визначено розмір фрагмента трансдукуючої ДНК фага 59, який оцінюється в межах 39000 пар нуклеотидів.

Вперше встановлено (на підставі математичного обчислення), що геном трансду-куючого фага 59 представлений на 84% ДНК бактеріального походження.

Практичне значення роботи. Отримані результати дають можливість застосовувати метод трансдукції при генетичному картувані хромосоми бактерій роду Erwinia, використовувати помірні фаги 59 та 49 у генно-інженерних дослідженнях для вивчення експресії окремих генів, а також міжгеномних взаємовідношень у полілізогенних системах ервіній.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота виконана у відділі вірусів мікроорганізмів Інституту мікробіології' та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України у відповідності з планом науково-дослідних робіт Інституту (тема: "Вивчити молекулярно-генетичні основи взаємодії помірних вірусів з Е. carotovora 268"; № державної реєстрації 0182.8910970 та "Вивчити фізико-хімічні властивості поза-хромосомних факторів (плазмід і фагів) бактерій роду Erwinia та їх експресію в лізогенній клітині", № державної реєстрації 01.86.0.0726467).

Особистий внесок здобувача. Робота виконана особисто автором під керівництвом акад. АТН України, д.б.н., професора Я.Г. Кішка. Особиста участь дисертанта полягала у проведенні лабораторних досліджень, аналізі, узагальненні одержанних експериментальних данних, співставлення їх з літературними матеріалами. Отримання біохімич-них мутантів здійснено спільно з к.б.н. М.С. Муквичем. Виділення ппазмідної ДНК проведено разом з інж. А.Г. Малюком та інж. Т.В. Шевченко.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на конференції „Вирусы микроорганизмов7Пущино,1981/; Международном Вирусологическом Конгресе /Сендай,Япония,1984/; VI съезде УМО / Донецк, 1984/; Всесоюзной конференции „фитонциды. Бактериальные болезни растений" /Ужгород,1985/; VI съезде ВМО У Алма-Ата, 1985/; научно-практическом совещании “Вирусология - народному хозяйству , /Киев,1987/; V съезде ВОГиС им. Вавилова / Москва, 1987/; VII съезде УМО /Черновцы, 1989/; Всесоюзной конференции „ Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства „ /Алма-Ата, 1990/.

Публікації. По темі дисертації опубліковано 16 наукових робіт.

Структура та об’єм дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, обговорення, висновків і списку цитованої літератури, який включає 208 найменувань. Робота викладена на 102 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 15 малюнками і 10 таблицями.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

В роботі були використані штами бактерій рода Erwinia, отримані з колекції музеїс відділу фітопатогенних бактерій ІМВ НАН України. Штами бактерій Escherichia сої

з

C600(S-a) та Pseudomonas putida(R 68.45) були люб'язно надані В.Г.Пилипенком та С.М.Столяром (ІМВ НАН України).

Штоки помірних фагів 59 та 49 дикого типу отримані від ф.І.Товкача (ІМВ НАН України).

В роботі використовували повноцінне середовище - м’со-пептонний агар (МПА), рідке поживне середовище - амінопептидний бульон (АПБ), для ауксотрофних мутантів застосовували мінімальне середовище (МС) / Клаус, Хейс, 1970/.

Отримання ауксотрофних мутантів здійснювали за допомогою нггрозогуанідину (НГ) та Уф-променів /Миллер,1976/, ідентифікацію проводили згідно ауксонограми, запропонованої Марковим /1975/.

Препаративні кількості бактеріофагів 59 та 49 отримували методом зливного лізису. Метод Yamamoto et al. /1976/ був залучений з метою концентрування вірусних часток в лізаті. Очищення препаратів фагів проводили у ступінчатому градієнті хлористого цезію /Миллер, 1976/.

Титр фагів визначали за методом агарових шарів /Адамс, 1961/.

Отримання специфічної антифагової сироватки і визначення константи нейтралізації здійснювали стандартними методами/Адамс,1961/.

Препарати трансдукуючих фагів були отримані за методом Gratia /Адамс, 1961/, а також шляхом обробки Уф-променями лізогенізованої культури клітин за методом Borek, Ryan /1973/.

Постановку трансдукційних схрещувань здійснювали, на першому етапі роботи методом спот-тесту /Rosenfeld, Brenchley, 1979/, в подальшому - згідно Клаус, Хейс /1970/.

Частоту трансдукції виявляли відношенням числа трансдуктантів до числа бляш-коугворюючих часток в 1 мл.

Частоту трансдукції' зчеплених генів виявляли як відношення трансдуктантів, се-лектованих одночасно за двома маркерами, до загального числа трансдуктантів, виявлених в 1 мл трансдукуючої суміші. Відстань між зчепленими маркерами обчислювали за формулою, запропонованою Kemper /1974/.

С = 1 -1 -1 In t, де С - частота котрансдукції; t - відстань між маркерами.

Розмір фрагмента трансдукуючої ДНК виявляли за допомогою рівняння Wu

/Bachman et al., 1976/. t

С = (1 —), де С - частота котрансдукції; t - відстань між селективним та неселек-

L тивним маркерами, хв; L - розмір фрагмента трансдукційної ДНК, хв.

Виділення плазмідної ДНК здійснювали за методом лужного лізису / Маниатис с соавт., 1984/.

Результати досліджень і їх обговорення

1 ■ Дослідження частоти трансдукиійного переносу хромосомних маркерів Фагами 59 та 49 Е. carotovora 268

З метою виявлення здатності помірних фагів 59 та 49 Е. carotovora 268 здійснювати трансдукційний перенос генів у індикаторного штаму Е. horticola 450 була отримана серія з 217 ауксотрофних біохімічних мутантів. Ефективний мутагенез був зафіксований після дії [\І-мєтил-М-нітро-М-нітрозогуанідину (НГ) в концентрації 300 мкг/мл на протязі ЗО хв. Після ідентифікації була відібрана серія з 27 ауксотрофних біохімічних мутантів, залежних тільки по одному ростовому фактору. Спектр потреб, по яких мутанти проявляли залежність, включав arg", his', ііе', leu', lys', met", thr', trp', thy'та ura'. Такий спектр мутацій даної серії відповідав загальноприйнятим вимогам для наступного випробування тран-сдукційних властивостей досліджуваних бактеріофагів.

Мал.1 .Виявлення можливості трансдукційного переносу генів фагом 59 модифікованим методом спот-тесту а) РК- реципієнтні культури; б) ДК- донорні культури; в) 59- фагоаий лізат; г) 59хРК- трансдукційні схрещування; д) 59ДхРК- трансдукційні схрещування,в яких фаг був обробленний ДНК-азою

Здатність помірних фагів 59 та 49 до трансдукції спочатку виявляли шляхом спот-тесту. Подальші досліди по трансдукції методом спот-тесту були модифіковані нами наступним чином: інфікування клітин реципієнтних штамів трансдукуючими фагамк здійснювали безпосередньо у лунках регшікаторів, а після періоду інфекції трансдукуюч^ суміш переносили на селективне середовище. Паралельно на цій же чашці Петрі стави-

пи всі необхідні контролі. Можлива поява трансформантів, як і в першому випадку, була попереджена обробкою трансдукційної суміші ДНК-азою. Вказана модифікація дозволяла поєднати дослідні та контрольні схрещування на одній чашці (мал.1). Всі отримані та ідентифіковані ауксотрофні мутанти були перевірені методом спот-тесту.

Процес трансдукції прийнято характеризувати такою величиною як частота. Для ряду хромосомних маркерів була визначена частота трансдукції', опосередкована фагами 59 га 49 (табл.1). Можна пересвідчитись, що трансдукуюча ефективність бактеріофагів 59 і 49 змінюється в межах двох порядків для різних маркерів. Можливо, що різниця у ефективності трансдукції, яку ми спостерігали, зумовлена тим, що гени, які переносяться фатом, локалізовані в різних ділянках хромосоми бактерії, і тому їх доступність для пакування в фагову головку є неоднакова. Величини частоти трансдукції, які ми отримали для фагів 59 та 49 Е. сагоЬуога 268, можна порівняти з такими для фага Р22. Це дозволило, як робочу гіпотезу, висунути припущення, що вирізання хромосомних маркерів, їх інтеграція у фаговий геном та передача до реципієнтних клітин відбувається за механізмом, який нині описано для фага Р22 /Бсіітіедег, 1984/.

Таблиця 1

Частота трансдукції хромосомних маркерів Е. Ьсгіісоїа 450 помірними фагами 59 та 49

Реципієнт Селекційни й маркер Частота зворотніх мутацій Частота трансдукції фагом 59 Частота трансдукції фагом 49

Е. Ііогіісоїа: 450-12 Іеи+ 3,2 х ю-8 2,5 х ю-6 не визначали

450-36 ііе+ 1,0 х Ю-8 2,6 х 10'8 2,4 х 10'7

450-38 ига+ 1,0 х 10* 7,0 х 10 е 1,8 х 10"*

450-67 №у+ 2,1 х 10'9 6,2 х 10 е 1,1 х 10-8

450-70 І1ІЗ+ 1,0 х 10'9 4,4 х 10'8 00 о X о &

450-71 їгр+-1 1,6 х 109 8,6 х Ю-® 6,7 X 10'7

450-96 Ігр+-2 1,6 х 10® 9,9 х 10-8 не визначали

450-110 теІ+ 2,3 х 10-9 5,0 х 10-8

450-126 агд+ 1,0 х 10'9 7,8 х 10'7

450-156 №г+ 1,0 х 10* 2,3 х 10‘7 6,0 X 10'7

Здатність фагів 59 і 49 Е. сагойуога 268 переносити широкий спектр хромосомних маркерів з досить -таки змінною частотою трансдукції дозволило віднести ці фаги до за-гапьнотрансдукуючих.

Визначення частоти трансдукції генетичних маркерів логічно було доповнити аналізом виявлених при цьому трансдуктантів. Такий аналіз показав, що трансдуктанти добре ростуть на мінімальному середовищі і стабільні при повторних пересівах на середовище того ж складу. Більшість із трансдуктантів виявилися імунними до свого тран-сдукуючого фага. Імунні трансдуктанти продукували фаг як і спонтанно, так і після дії

деяких індукторів профага. На мал.2 показано, що обробка лізогенних трансдуктантів мітоміцином С та Уф-променями збільшувала вихід фагів 59 і 49 на 100 - 200% в порівнянні зі спонтанним рівнем. Серед отриманих таким чином препаратів фагів 59 і 49 не було виявлено лізатів з підвищеною частотою трансдукції'.

Мал.2. Вплив мітоміцину С (а) і Уф-променів (б) на вихід фагів 59 і 49

з лізогенних клонів та трансдуктантів: вихід фага -1) спонтанний; 2) - Е. ііогіісоїа 450 (59); 3) Тр (59); 4) Е. Иогіісоїа 450 (49); 5) Тр (49)

При аналізі можливості помірних бактеріофагів 59 і 49 здійснювати передачу генетичних маркерів за методом спот-тесту було помічено, що проявлення "плям" трансдуктантів було візуально більш демонстративним при використанні індукованих лізатів, ніж літичних. Очевидно, частота появи трансдуктантів у першому випадку була вищою, ніж у другому. Такий сформульований висновок було підтверджено в подальших дослідах по трансдукції (табл 2). Необхідно зазначити, що частота трансдукції №г+ -маркера була в 7,5 раз більшою при використанні трансдукуючих лізатів фага 49, отриманих при індукції профага, ніж у випадку лізатів, отриманих літичним шляхом (мал. 3).

Таблиця 2

Частота трансдукції хромосомних маркерів в залежності від способу отримання лізатів фага 59

Реципієнт Трансдукуючий маркер Частота трансдукції

„літичний” лізат „індукований" лізат

1 450-67 Шу" 2,0 хІО-* 1,1 хЮ'7

2 450-17 1гр+ -1 1,0x10'" 2,7x10'7

3 450-96 1гр+ - 2 2,2x10-9 9,9x10"®

4 450-110 теґ 7,8x10'9 5,5x10-®

5 450-126 агд+ 1,3x10® 7,8x10'7

6 450-156 «1Г+ 9,8 x10е 2,3x10'7

Мал.З. Вплив способу отримання трансдукуючого лізата фага 49 на частоту трансдукції ЇИҐ маркера:

I - „індукований" лізат;

II - „лггичний" лізат

В системах загальної трансдукції в однаковій мірі звичайно використовують як літичні, так і індуковані лізати фагів. Можна припустити, що передача хромосомних генів ервіній фагами 59 та 49 , як це було у випадку застосування нами індукованих лізатів, здійснюється вегетативним фагом. Геном вегетативного фага, а не тільки профаг, може рекомбінувати з бактеріальною хромосомою, і таким чином, можливо, відбувається включення трансдукуючого гена у ДНК фагової частки. Альтернативно можна припустити, що трансдукуючі частки фага можуть бути сформовані у результаті процесу рекомбінації між синтезованою фаговою ДНК de novo та хромосомою клітини. Більш того, у таких частках хромосомний матеріал складений з бактеріальної ДНК і фагової /Schmieger, 1970/.

Аналіз експериментальних даних дозволив зробити висновок, що спосіб отримання трансдукуючих лізатів фагів 59 та 49 суттєво впливає на частоту трансдукції. Використання "індукованих" лізатів найчастіше збільшувало частоту передачі генетичних маркерів в порівнянні з "літичними" лізатами. Зважуючи на останнє, у подальших схрещуваннях були використані тільки "індуковані" лізати.

При вивченні результатів трансдукційного аналізу у системі клітин Е. horticola 450 було встановлено, що ефективність трансдукції залежить від множинності інфекції. Така залежність характерна для обох бактеріофагів (Мал.4,5). При цьому, як виявилось, зниження частоти трансдукції при збільшенні МІ у наших дослідах не залежало від способу отримання лізатів трансдукуючих фагів (Мал.5).

Значення такого параметру як МІ відоме при характеристиці трансдукуючих властивостей фагів. Отримані нами результати вказують на те, що оптимальна частота трансдукції спостерігається при значенні МІ £1 БУО на реципієнту клітину. Вказані величини МІ були базовими для подальшої роботи; цілком ймовірно, що при високих значеннях МІ у трансдукційних схрещуваннях це призводить до загибелі трансдуктантів, тоді як при низких значеннях МІ можливість формування останніх також зменшується із-за малої

<fy) vtutnpoiwdu muotujD/f

вірогідності адсорбції.

Мал.4. Залежність частоти трансдукції leu+ (a), thr+ (б), thy+ (в), trp+(r) - маркерів Е. horticola 450 від множинності інфекції помірним фагом 59

------------- ■ ■ І І І

-із -1 -as о as їй IS

-2

Мап.5. Залежність частото трансдукції №г+-маркера Е. Ьогіісоїа 450 від множинності інфекції різними лізатами фага 49:

I - "індукований" лізат;

II - "літичний" лізат.

Одним із засобів підвищення частоти трансдукції' є Уф-опромінення лізатів тран-сдукуючих фагів безпосередньо перед постановкою трансдукційних схрещувань. При вибраних нами параметрах УФ-опромінення (інтенсивність опромінення - 120 ерг/с х мм2, час експозицГі’ - 2 хв) фаг 59 інактивувався на 87 - 97%. При цьому було відмічене значне збільшення частоти переносу arg+, met+, thr+, trp+ та ura+- маркерів незалежне від природи отриманих лізатів фагів (мал.6). Таким чином, обробка лізатів фага 59 фіксованою в часі дозою УФ-променів призводила до чітко вираженого ефекту збільшення частоти трансдукції.

Відомо, що застосування Уф-опромінених лізатів викликає посилення трансдукую-чої здатності деяких фагів, а в деяких випадках використання Уф-опромінених фагових лізатів є обов’язковою умовою формування трансдуктантів. При використанні Уф-опромінених лізатів трансдукуючих фагів число стабільних трансдуктантів збільшується по відношенню до числа абортивних. У випадку вірулентних фагів Уф-опромінення Ь лізатів призводить до зменшення “кіперного" ефекту фагових часток, і відповідно де

збільшення виживання трансдуктантів / Toth, Mulholland, Cooper et al., 1997/.

Мал.6. Частота трансдукції хромосомних маркерів Е. Иогіісоїа 450 в залежності від УФ-опромінення та природи трансдукуючого фага 59:

а) "літичний лізат*;

б) "індукований" лізат.

Необхідно зазначити, що Уф-опромінення у мікроорганізмів опосередковано посилює генетичну рекомбінацію. По-перше, ті пошкодження бактеріальної ДНК, які виникають, полегшують рекомбінацію за типом розрив - з’єднання а, по-друге, в бактеріальній клітині синтезується надлишок продукту гена гесА, який приймає участь у процесі рекомбінації. Що стосується безпосередньо фагових часток, то частота рекомбінації ДНК останніх також підвищується. Такий еффект пояснюється непрямою стимуляцією або "телеактивацією"/ Golub, Low, 1983/.

2. Вивчення частоти трансдукційного переносу генів позахпсмосомного походження помірним бактеріофагом 59

Випробування можливості трансдукції генів екстрахромосомного походження помірним бактеріофагом 59 вимагало в першу чергу отримання відповідних штамів індикаторної культури Е. horticola 450, які б несли в собі ту чи іншу плазміду.

В дослідах були використані дві ппазміди - R68.45 (молекулярна маса 37,5 МД), яка виявляла стійкість до Am, Km та Тс, і S-a (молекулярна маса 23 МД), гени якої кодували стійкість до Cm, Km, Sm та Su. В результаті кон'югаційного переносу плазміда R68.45 була передана від Ps. putida BS228, а плазміда S-a від Е. coli С600 клітинам Е. horticola 450. Необхідно зазначити, що у випадку переносу R68.45 реципієнтним штамам використовували штам Е. horticola 450-8, резистентний до стрептоміцину. Останній був отриманий шляхом спонтанного мутагенезу і служив для ефективної контрселекції клітин донорного штаму (табл.З).

Кон’югаційний перенос плазмід й 68.45 та Э-а

Таблиця З

Донор Реципієнт Частота кон’югації Новий штам (кон’югант)

Рэ. ріЛісІа Вв228 (Я68.45) Е. Иоііісоїа 450-8 5,0 х Ю-® Е. ЬоПісоІа 450-8

Рв. putida ВБ228 (Р68.45) Е. соїі НВ101 7,5x10-3 Е. соїі НВ101

Е. соїі С600 (Б-а) Е. ЬоЛісоІа 450 2,0 хЮ-6 Е. ИоПісоІа 450

У випадку переносу плазміди Я63.45 виявлені кон'юганти після багаторазових пересівів зберігали здатність до росту в присутності антибіотиків ампіциліну, канаміцину та тетрацикліну, а при передачі плазміди Б-а - в присутності канаміцину, хлорамфеніколу та стрептоміцину. Виходячи із вище наведених даних по антибіотикорезистентності отриманих кон’югантів, плазміди (368.45 та в-а переносяться і спадкуються реципієктними штамами стабільно. Це знайшло своє відображення і в результатах електрофорезу ДНК вказаних плазмід у агарозному гелі (мал. 7)

1 2 3 4 5

Мал.7. Електрофорез ДНК плазміди Я68.45 (І) та Є-а (II) в агарозному гелі: а - плазмідна ДНК; 6 - хромосомна ДНК.

1 - Е.МоПісоІа 450-8;

2-4 - кон’юганти Е.ИоіІісоІа 450-8(Н68.45); 5 - Рэ. риіісіа В5228(В68.45); 6 - Е. соїі С600; 7 - Е. Иогіісоїа 450(3-а) - кон’югант

Таким чином, в результаті кон’югаційних схрещувань були отримані нові донорські штами. Ці штами були чутливими до фага 59, що надалі дозволило використовувати їх при отриманні лізатів трансдукуючих фагів.

При вивченні трансдукційного переносу плазміди Я68.45 помірним бактеріофагом 59 реципієнтними культурами були ауксотрофні мутанти Е. ііоііісоїа 450: -71 Ігр', -96 Ігр , -126 агд", -156 Ніг". В результаті проведених трансдукційних схрещувань було встановлено, що фаг 59 здійснює передачу тільки окремих генів плазміди Я68.45 (табл. 4).

Частота передачі тетрациклінового маркера змінювалась в межах від 9,2 х 10'8 до 5,2 х 10'7 і спостерігалась тільки у двох реципієнтних штамах Е. ґюПісоІа 450-126 агд' та 450-96 Ігр". У штамів Е. ІюНісоІа 450-71 ^р'і 450-156 ^г'передачі Тс-маркера не було виявлено. Передача іншого маркера - канаміцинового - була виявлена тільки у одного мутанта - 450-96 Ігр'. В результаті проведених дослідів було показано, що клітини індикаторної культури Е. Ііоііісоїа 450-8 є резистентними до досліджуваних концентрацій ампіциліну, тому аналіз цієї ознаки в трансдукційних схрещуваннях не проводили. Ознаки стійкості до тетрацикліну і канаміцину, отримані реципієнтними клітинами, були нестабільними і втрачались при наступних пересівах відповідних культур.

Таблиця 4

Трансдукційний перенос плазміди Р.68.45 бактеріофагом 59

гш Реципієнт Трансдукуючий Частота трансдукції

маркер „літичний" лізат УФ - індукований лізат

і 450-7Пгр‘ Кт < 2,0 х 10"® < 2,0 х 10"®

Тс < 2,0 х 10‘8 <2,0 х 10"®

2 450-961гр ‘ Кт 6,0 х 10* 1,0 х 10"'

Тс 9,2 х 10* 2,0 X 10'7

3 450-12агд' Кт < 1,0 х 10 ® < 1,0 х 10"8

Тс 5,2 х 10'7 1,6 хЮ"5

4 450-156№г" Кт < 2,0x10-* < 2,0 х 10"8

Тс <2,0x10"® <2,0x10"®

Фаг 59 може трансдукувати фрагменти ДНК, які не перевищують величину його геному (31 МД). Низьку частоту трансдукції окремих генів плазміди И68.45, а також нестабільність Тс- та Кт-маркерів у отриманих трансдуктантів можна пояснити тим, що розмір геному цієї плазміди (37 МД) занадто великий для пакування його у фагову головку. Можна вважати, що саме тому фаг 59 не може перенести усі гени, які необхідні для реплікації плазмідної ДНК. Ймовірно, що при трансдукції плазміди Я68.45 фагом 59 йдеться про зменшення молекулярної маси плазміди, відбувається передача окремих генів, а не інтактної плазміди.

В проведених нами дослідах певний інтерес представляло вивчення процесу переносу плазміди, молекулярна маса якої менша, ніж така ДНК трансдукуючого фага 59. Згідно з

метою досліджень була використана плазміда Б-а з молекулярною масою 23 МД. Гени цієї плазміди контролюють стійкість до Ст, Кт, Эт і Эи. У трансдукційних схрещуваннях мутант Е. іюгіісоіа 450-71 Ігр' був використаний як реципієнтний штам. Відбір трансдук-тантів здійснювали на середовищі із одним з антибіотиків, стійкість до якого детермінується генами даної плазміди. У виявлених трансдуктантах перевіряли зчепленість селектованої ознаки з іншими маркерами плазміди Б-а (табл 5).

Більшість - 93 - 100% трансдуктантів, сформованих фагом 59 незалежно від типу антибіотика, який входив до складу селективного середовища, отримували повний набір детермінант резистентності. Такі трансдуктанти були стабільними до фага 59. Подальший аналіз плазмідної ДНК кон’югантів та трансдуктантів Е. Иогіісоїа 450 методом електрофорезу у агарозному гелі показав, що плазміда Э-а передається повністю як інтактна одиниця (мап.8).

Таблиця 5

Трансдукційний перенос плазміди Б-а* бактеріофагом 59

Селективний Характеристика трансдуктантів

маркер Частота трансдукції Кількість перевірених трансдуктантів Кількість трансдуктантів із зчепленням маркерів Ст, Кт, Эт Зчеплення маркерів, %

Ст 4,8 х 10'7 165 165 100

Кт 1,2x10* 14 13 93

Эт 1,0x10* 19 13 95

Плазміда в-а, м.м. 23 МД, контролює гени стійкості до Ст, Кт, Бт та Эи.

12 3 4

Мал.8. Електрофорез плазмідної ДНК в-а у агарозному гелі:

1 - Е. соїі С600 - донорний штам;

2 - Е. ИоПісоІа 450(3-а) - кон’югант;

3 - Е. Иогіісоїа 450-71 (Б-а) - трансдуктант, відібраний на селективному середовищі МПА + Ст;

4 - Е. 1тогйсо1а 450-71 (Э-а) - трансдуктант, відібраний на МПА + КтСтЭт

Таким чином, проведені досліди продемонстрували можливість трансдукції' фагом 59 ДНК екстрахромосомного походження на прикладі плазмід (368.45 та Э-а. Була встановлена залежність переносу плазмідних генів від молекулярної маси ДНК плазмід. Зазначенний процес пов’язаний з пакувальною ємністю головки трансдукуючого фага і властивостями його ДНК. Виходячи з наведених матеріалів можна стверджувати, що при трансдукції плазміди 1^68.45 фагом 59 переносяться окремі плазмідні гени, тоді як при трансдукції плазміди Э-а, молекулярна маса якої менша від такої ДНК трансдукуючого фага 59, спостерігається передача Б-а як інтактної одиниці.

3. Тонке картування генів Е.НоіИсоІа 450 трансдукуючим Фагом 59

Для отримання поліауксотрофних мутантів Е. Иогйсоїа 450 як вихідні для мутагенезу штами були обрані 450-71 Ігр' та 450-126 агд', які попередньо були виділені після дії НГ. При рівні виживання 0,1 -1,0% після Уф-опромінення згаданих штамів були отримані мутанти, залежні від двох та трьох ростових факторів (табл. 6).

Наявність поліауксотрофних реципієнтних штамів Е. Иогіісоіа 450 дозволило нам вивчити можливість трансдукційного переносу тіснозчеплених генів. В результаті тран-сдукційного схрещування фагом 59 появу на селективному середовищі трансдуктантів можна пояснити лише за рахунок спільного переносу генів. Необхідно зазначити, що одночасно реверсій двох мутацій до прототрофності нами не було виявлено. Співвідношення кількості селектованих одночасно за двома маркерами трансдуктантів до їх загального числа, виявлених у 1 мл трансдукуючої суміші, було визначено як величину ко-трансдукції. Отримані в згаданих експериментах результати наведені в табл. 7.

Таблиця 6

Поліауксотрофні мутанти Е. horticola 450

N/N Штам Характеристика штамів Походження та спосіб отримання мутантів

E. horticola 450: Дикий тип, прототроф Отриманий від проф. Р. 1. Гвоздяка ІМВ НАН України

1 71 -03 Trp, Arg НГ-, УФ - мутагенез

2 71-05 Trp, Ade НГ-, УФ - мутагенез

3 71-16 Trp, His НГ-, УФ - мутагенез

4 71 -020 Trp, Thr-2 НГ-, УФ - мутагенез

5 71 - 032 Trp, Thr-3 НГ-, УФ - мутагенез

6 71-020-52 Trp, Thr-2, Ser НГ-, УФ - мутагенез, Уф-мутагенез

7 126-4 Arg, llv НГ-, УФ - мутагенез

Встановлено, що окремі пари генів, а саме thr2 - ser, trp - ser, thr2 - trp у штама E. horticola 450-71-020-52, при трансдукції фагом 59 передаються разом, а частота зчеплення при цьому складає відповідно 0,10; 0,27 та 0,38. Але при використанні як реципієнтних штамів поліауксотрофних мутантів Е. horticola 450-71-16 trp', his', Е. horticola 450-71-03 trp ,

arg', E. horticola 450-126-4 arg\ ilv" у трансдукційних схрещуваннях зчеплення між марке-

рами trp і his, trp і arg, arg і ilv не виявлено.

Таблиця 7

Аналіз зчеплення хромосомних маркерів Е. horticola 450 фагом 59

N/N Реципієнт Пари маркерів Частота зчеплення маркерів Відстань між маркерами, t

1 71-020-52 trp - ser 0,27 0,36 - 0,37

thr2 - ser 0,10 0,59 - 0,60

trp - thr2 0,33 0,27

2 71-16 trp - his не виявлено -

3 71 -03 trp - arg не виявлено -

4 126-4 arg - ilv не виявлено -

Отримані значення частот трансдукції зчеплених генів були в подальшому використані для визначення відносного розміщення цих генів на хромосомі бактерії. При цьому була використана формула, запропонована Kemper /1974/. За допомогою отриманих табличних значень були вираховані конкретні значення відстані між маркерами (табл. 7). Наведені розрахунки дозволяють твердити про фланкуюче розміщення thr та ser маркерів по відношенню до trp локусу. Порядок цих генів виявився наступним: thr2' - trp' -ser'. Оскільки генетична карта Е. horticola 450 не побудована і невідомо де початок реплікації, полярність розташування треонінового І серінового локусів може бути протилежна тій, що наведена в роботі.

Розмір фрагмента трансдукуючої ДНК був визначений за допомогою рівняння Wu /Bachman,1976/. Детальний аналіз наведених втабл.8 матеріалів дозволив зробити висновок про те, що розмір фрагмента трансдукуючої ДНК складає біля 1 хвилини. Керуючись даними Bachman /1976/] про те, що 1 хвилина генетичної карти Е. соїі складає 38 -39 тисяч пар нуклеотидів, а бактерії Escherichia та Erwinia відносяться до однієї родини Enterobacteriaceae, а також враховуючи невеликі відмінності в структурі і розмірах бактеріальних клітин цих видів, ми припустили, що 1 хвилина генетичної карти Erwinia horticola вміщує таку ж саму кількість пар основ.

Таблиця 8

Визначення величини трансдукуючого фрагмента фага 59

N/N Пари маркерів С Чс t L

1 trp - ser 0,27 0,646 0,36 - 0,37 1,03

2 thr2 - ser 0,10 0,464 0,59 - 0,60 1,10

3 trp - thr2 0,38 0,724 0,27 0,98

Згідно з даними Товкача /1987/, молекулярна маса ДНК фага 59 складає 46,5 тисяч пар нуклеотидів. Взявши за основу ці дані, можна зробити висновок, що трансдукуючий фрагмент бактеріальної ДНК у складі частки фагу 59 займає приблизно 84% від його молекулярної маси.

висновки

1. Встановлено, що помірні бактеріофаги 59 та 49 здійснюють передачу генетичної інформації' у бактерій роду Erwinia за типом загальної трансдукції. Доведено, що здійснюється трансдукція 10 хромосомних маркерів ( arg+, his+, ilv+, leu+, met+, thr+, thy+, trp-1+, trp-2+, ura+ ) з частотою 1.8x1 O'8-6.2x10 е.

2. Показано, що трансдукуюча ефективність фагів 59 та 49 посилюється:

а) при використанні лізатів трансдукуючих фагів, отриманих індукцією профага;

б) після Уф-опромінення лізатів трансдукуючих фагів безпосередньо перед постановкою схрещувань;

в) оптимальну частоту трансдукції спостерігали при значенні МІ £1.

3. Доведено, що фаг 59 може трансдукувати спільно тіснозчеплені гени на хромосомі E.horticola 450: thr2-ser, trp-ser, thr2-trp.

4. Величина трансдукуючого фрагменту ДНК фага 59 оцінюється в 39000 пар нуклеотидів.

5. Встановлено ( на підставі математичного обчислення ), що геном трандукуючого фа-га59 на 84% представлений ДНК бактеріального походження.

6. Показано, що фаг 59 може трансдукувати гени екстрахромосомного походження. Головним критерієм при трансдукції плазмідних генів є пакувальна ємність фага 59, яка оцінюється за м.м. його ДНК.

Список публікацій по темі дисертації

1. Романюк Л.В., Муквич Н.С., Кишко Я.Г. Особенности трансдукции клеток эрвиний фагом 59// Молекул, генетика, микробиол. и вирусология.- 1985. - №10. - С. 34 - 38.

2. Муквич Н.С., Романюк Л.В., Кишко Я.Г. Генетический перенос хромосомальных маркеров Erwinia horticola 450 умеренными фагами 49 и 59// Микробиол.журн,- 1987. - Т. 49, №4,- С.31 - 35.

3. Романюк Л.В., Муквич Н.С., Шапамай А.С., Дашевская Т.А., Гладкая В.А. Влияние некоторых факторов на индукцию профага у Erwinia horticola и ее лизогенных тран-сдуктантов// Микробиол. журн.-1988. - Т. 50, №1. - С. 29 - 32.

4. Муквич Н.С., Романюк Л.В., Малюк А.Г., Шевченко Т.В., Кишко Я.Г. Трансдукция плазмид R68.45 и S-a умеренным бактериофагом 59 Erwinia carotovora 268// Микробиол. журн.-1991. - Т.53, №1. - С. 28 - 33.

5. Муквич Н.С., Романюк Л.В., Дидык О.А.// Факторы, влияющие на трансдукцию у микроорганизмов // Микробиол. журн. -1992. - Т.54, №3. - С. 75 - 86.

6. Муквич Н.С., Романюк Л.В. Отрансдукции Erwinia horticola 450 умеренным фагом 59 // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Вирусы микроорганизмов". - Пущино. -1981. - С. 55 - 56.

7. Mukvich N.S., Romanyuk L.V., Yagovdik M.V. Study of Erwinia carotovora 268 polylysogenic culture: phage 59 munagenesis and transduction of some markers // Sum.

of papers VI International Congress of Virology. - Sendai (Japan). -1984. - P. 115.

8. Муквич H.C., Романюк Л.В. Индукция профага у некоторых штаммов Erwinia // Тез. докл. VI съезда УМО. - Киев: Наукова думка. -1984. - 4.2. - С.167

9. Романюк Л.В., Яговдик М.В., Муквмч Н.С. Мутагенез фага 59 Erwinia carotovora 268 и трансдукция некоторых маркеров у эрвиний // Тез. докл. VI съезда УМО. Киев: Наукова думка. - 1984. - 4.2. - С. 169 -170.

10. Муквич Н.С., Романюк Л.В. Трансдукция фагом 59 Erwinia carotovora 268 и свойства трансдуктантов // Труды Всесоюз. конф. "Актуальные вопросы бактериофагии и прикладной иммунологии. - Тбилиси : Мецниереба. -1984. - С.74.

п. Романюк Л.В. Перенос общетрансдуцирующим фагом 59 тесносцепленных маркеров Erwinia horticola 450 // Тез. докл. Всесоюз. конф. "фитонциды. Бактериальные болезни растений." - Киев: Наукова думка . -1985. - 4.2. - С.27.

12. Романюк Л.В., Муквич Н.С. Трансдуцирующие свойства умеренного бактериофага 59 Erwinia carotovora 268 // Труды VI съезда ВМО. - Алма-Ата: Наука. -1985. - 4.5. - С. 29.

13. Романюк Л.В. Трансдукция у Эрвиний // Тез. докл. науч.-практ. совещания "Вирусология - народному хозяйству". - Киев: КГУ. -1987. - С.20-21.

14. Муквич Н.С., Романюк Л.В. Трансдукция плазмиды S-a умеренными фагами 49 и 59 // Тез. докл. Усъезда ВОГиС им.Вавилова. - Москва. -1987.- Т.5. - С.55.

15. Романюк Л.В. Трансдуцирующие фаги Эрвиний // Тез. докл. VII съезда УМО. - Киев-Черновцы. -1989. - 4.2. - С.163.

16. Романюк Л.В., Муквич Н.С.. Кишко Я.Г. Перенос генетической информации у эрвиний умеренными ■ бактериофагами // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Микробиол. и био-технол. основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства". - Алма-Ата. -1990.-С.88.

Романюк Л.В, Вивчення трансдукуючих властивостей помірних бактеріофагів 59 та 49 Erwinia carotovora 268. • Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ, 1998.

Дисертація присвячена вивченню нових властивостей помірних бактеріофагів 59 і 49 E.carotovora 268. Результати досліджень показали, що фаги 59 і 49 здійснюють передачу генетичної інформації у бактерій роду Erwinia за типом загальної трансдукції. Доведено факт переносу 10 хромосомних маркерів (arg+, his+, ilv+, !eu+, met+, thr+, thy+, trp-1+, trp-2+, ura+ ) з частотою 1.8 x 10'8 - 6.2 x 10'6, яка залежить від множинності інфекції, Уф-опромінення трансдукуючих бактеріофагів, природи фагових лізатів. Показано, що пари маркерів thr2 - ser, trp - ser, thr2 - trp зчеплені на хромосомі E.horticola 450 і при трансдукції фагом 59 переносяться разом. При цьому величина трансдукуючогс фрагмента ДНК фага оцінюється в 39000 пар нуклеотидів. На підставі математичних

розрахунків встановлено, що геном трансдукуючого фага 59 на 84% представлений ДНК бактеріального походження. Наведені результати досліджень трансдукції помірним бактеріофагом 59 ДНК екстрахромосомного походження , а саме плазмід R68.45 та S-a. Показано, що фаг 59 здійснює трансдукцію окремих маркерів плазміди R 68.45, тоді як плазміда S-a переноситься фагом як інтактна одиниця. Головним критерієм при трансдукції плазмідних генів є пакувальна ємність фага 59, яка оцінюється за молекулярною масою його ДНК.

Ключові слова: трансдукція, помірний бактеріофаг, хромосомні маркери, фрагмент ДНК, геном.

Романкж Л.В. Изучение трансдуцирующих свойств умеренных бактериофагов 59 и 49 Erwinia carotovora 268. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 1998.

Диссертация посвящена новым свойствам умеренных бактериофагов 59 и 49 E.carotovora 268. Результаты исследований показали, что фаги 59 и 49 осуществляют передачу генетической информации у бактерий рода Erwinia по типу общей трансдук-ции. Установлен факт переноса 10 хромосомных маркеров ( arg+, his+, ilv+, leu+, met+, thr+, thy+, trp-1+, trp-2+, ura* ) з частотой 1.8 x 10'8 - 6.2 x 10'6, которая зависит от множественности инфекции, Уф-облучения трансдуцирующих бактериофагов, природы фаговых лизатов. Показано, что пары маркеров thr2 - ser, trp - ser, thr2 - trp сцеплены на хромосоме E.horticola 450 и при трансдукции фагом 59 переносятся совместно. При этом величина трансдуцируемого фрагмента ДНК фага оценивается в 39000 пар нуклеотидов. На основании математических расчетов установлено, что геном трансду-цирующего фага 59 на 84% представлен ДНК бактериального происхождения. В работе приводятся результаты исследований трансдукции бактериофагом 59 ДНК экстрахро-мосомного происхождения, а именно, плазмид R 68.45 и S - а. Показано, что фаг 59 осуществляет трансдукции отдельных маркеров плазмиды R 68.45,тогда как плазмида S - а переносится фагом как интактная единица. Главным критерием при трансдукции плазмидных генов есть упаковочная ёмкость фага 59, которая оценивается по молекулярной массе его ДНК .

Ключевые слова: трансдукция, умеренный бактериофаг, хромосомные маркеры, фрагмент ДНК, геном.

Romanyuk LV. Study of transductional properties of temperate bacteriophages 59 and 49 Erwinia carotovora 268. - Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of biological sciences on a speciality 03.00.06 -virology. - Institute of microbiology and virology Nati.Acad.Sci.of Ukraine, Kyiv, 1998.

The dissertation is devoted to the study of new properties of temperate bacteriophage: 59 and 49 E.carotovora 268. The results of researches have shown, that phages 59 and 4! carry out transfer of the genetic information at bacteria of a Erwinia genery as genera transduction . The fact of transferring of 10 chromosomal markers (arg +, his +, ilv +, leu + met +, thr +, thy +, trp-1 +, trp-2 +, ura +) by frequency 1.8 x Iff® - 6.2 x ICT6, is establishec which depends on plurality of infection, UV-irradiation of transducing bacteriophage, naturi of phage lysates. Is was shown, that pairs of markers thr2 - ser, trp - ser, thr2 - trp were linkec on chromosome E.horticola 450 and for want of phage 59 are transferred in common. Fo want of it the size of transducing fragment ДНК phage was evaluated in 39000 pairi nucleotides. On the basis of mathematical accounts was established, that by a genome transducing bacteriophage 59 on 84 % was submitted DNA bacterial of an origin. In work the results of researches transduction of bacteriophage 59 DNA extrachromosomal of an origin namely, plasmid R 68.45 and S - a were resulted. Was found, that phage 59 carries ou transduction of separate markers plasmid R 68.45, whereas plasmid S - a unit was transferrec phage as an intact. By main criterion for want of transduction plasmid of genes was packinc phage 59, which were evaluated on molecular weight of it DNA.

Key words: transduction, temperate bacteriophage, chromosomal markers, DNA of fragment genome.